專利名稱：木瓜蛋白酶分離純化方法和其固定化方法,以及所得產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種木瓜蛋白酶分離純化方法和其固定化方法，以及所得產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
木瓜蛋白酶(Papain)是一種重要的植物來源蛋白酶，應(yīng)用范圍非常廣泛。它不僅能夠催化蛋白質(zhì)的水解，在特定條件下還具有酰胺酶活力、酯酶活力、轉(zhuǎn)氨酶活力、轉(zhuǎn)酯酶活力和海因酶活力等諸多活性。木瓜蛋白酶能水解抗體制備Fab片段，合成肽、酯氨基酸類表面活性劑、氨基酸酯等化合物，已廣泛應(yīng)用于食品、生物、化工、洗滌劑、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域。木瓜蛋白酶是從木瓜中提取而得。將木瓜漿液直接或稍加精制后干燥得到的產(chǎn)品即木瓜蛋白酶粗品，一般含有木瓜蛋白酶(Papain，EC 3. 4. 22. 2)、甘氨酸內(nèi)肽酶(Glycyl endopeptidase, EC 3. 4. 22. 25)、木瓜凝乳蛋白酶(Chymopapain，EC 3. 4. 22. 6)、木瓜蛋白酶Ω (Carcain, EC 3. 4. 22. 30)、以及其它一些還未被鑒定出來的酶類、雜質(zhì)等等。隨著技術(shù)的進(jìn)步，市場(chǎng)上也出現(xiàn)了簡單精制的噴霧干燥木瓜蛋白酶粗酶粉，這種噴霧干燥的木瓜酶粗粉在生產(chǎn)過程中應(yīng)用了較為先進(jìn)的膜過濾技術(shù)和噴霧干燥技術(shù)，以除去木瓜漿液中的不溶性雜質(zhì)而制得的可以完全溶解的粗酶粉。但是，由于在粗酶中各種酶的催化性質(zhì)有異， 不適于在一些要求較高的精細(xì)催化反應(yīng)中應(yīng)用，阻礙了木瓜蛋白酶的應(yīng)用拓展。例如，水解抗體 IgG 制備 Fab 片段(fragment that having the antigen binding site，抗原結(jié)合片段)就需要使用高純度的木瓜蛋白酶，具體如現(xiàn)有的單克隆抗體藥物阿西單抗(Reopro，抗血小板凝聚單克隆抗體)就是一個(gè)Fab片段，它正是利用木瓜蛋白酶水解人-鼠嵌合單克隆抗體7E3制備而得。對(duì)于木瓜蛋白酶的分離提純，由于木瓜蛋白酶與木瓜粗酶中的其他蛋白酶的理化性質(zhì)十分相似，分離純化較為困難，因而市面上銷售并廣泛使用的木瓜蛋白酶基本上是粗酶；而已有傳統(tǒng)的高純度木瓜蛋白酶，市售常見為sigma公司的二次結(jié)晶木瓜蛋白酶，純度 95 %左右，其制備方法是通過多步鹽析后再結(jié)晶的方法，此提純方法步驟多，成本高，對(duì)酶活影響大，會(huì)使酶中灰分增加，并且采用結(jié)晶的方法來提高酶的純度，不利于工業(yè)生產(chǎn)試驗(yàn)放大。因此，采用新型的簡單高效的分離純化方法制備高純度的木瓜蛋白酶就顯得尤為必要，該現(xiàn)狀亟待解決。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服了現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)于木瓜蛋白酶的分離提純方法存在步驟多，成本高，對(duì)酶活影響大，會(huì)使酶中灰分增加，并且該方法不適于工業(yè)生產(chǎn)試驗(yàn)放大等的缺陷，提供了一種生物相容性好，操作步驟簡單，操作條件溫和，過程易于放大， 產(chǎn)品酶活性損失少，無有機(jī)溶劑殘余的木瓜蛋白酶分離純化方法，以及固定化步驟大為簡化的木瓜蛋白酶固定化方法和所得產(chǎn)品。本發(fā)明的木瓜蛋白酶分離純化方法包括如下步驟
(1)將含木瓜蛋白酶的原料溶解，除去不溶物，之后調(diào)節(jié)蛋白濃度為10mg/ml 20mg/ml，得初始粗酶溶液；(2)將初始粗酶溶液與聚乙二醇、無機(jī)鹽和水混合、溶解，待各成分混合均勻后分相，其中，初始粗酶溶液的含量為30 % 40 %，聚乙二醇的含量為10 % 30 %，無機(jī)鹽的含量為10% 25%，pH值為5. 5 6. 5，百分比為各成分占初始粗酶溶液、聚乙二醇、無機(jī)鹽和水總量的質(zhì)量百分比；(3)取分相后得到的聚乙二醇相以離子交換法回收富集在其中的木瓜蛋白酶，即可。下面，進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明的木瓜蛋白酶分離純化方法進(jìn)行詳細(xì)介紹(1)將含木瓜蛋白酶的原料溶解，除去不溶物，之后調(diào)節(jié)蛋白濃度為10mg/ml 20mg/ml，得初始粗酶溶液。本發(fā)明中，所述的含木瓜蛋白酶的原料可按本領(lǐng)域常規(guī)條件選擇，可以是各種木瓜乳汁、漿液、粉、木瓜蛋白酶粗酶粉以及其它任何含木瓜蛋白酶的材料，較佳的為木瓜蛋白酶粗酶粉。目前的各種商品木瓜蛋白酶粗酶粉的木瓜蛋白酶含量約在5% 8%，均可為本發(fā)明所用。本發(fā)明中，所述的將含木瓜蛋白酶的原料按本領(lǐng)域常規(guī)方法溶解可按本領(lǐng)域常規(guī)操作進(jìn)行選擇；所述的溶解的溶液較佳的為含有0. 5mM 5mMEDTA且pH為5. 5 6. 5的 IOmM 50mM半胱氨酸溶液。本發(fā)明中，所述的除去不溶物為本領(lǐng)域常規(guī)操作條件選擇，可為板框過濾或離心， 較佳的為離心，更佳的為20，OOOXg離心15min。本發(fā)明中，所述的步驟(1)的溫度可按本領(lǐng)域常規(guī)條件選擇，一般4°C左右均可。(2)將初始粗酶溶液與聚乙二醇、無機(jī)鹽和水混合，溶解，待各成分混合均勻后分相，其中，初始粗酶溶液的含量為30 % 40 %，聚乙二醇的含量為10 % 30 %，無機(jī)鹽的含量為10% 25%，pH值為5. 5 6. 5，百分比為各成分占初始粗酶溶液、聚乙二醇、無機(jī)鹽和水總量的質(zhì)量百分比；本發(fā)明中，所述的聚乙二醇可按本領(lǐng)域常規(guī)條件選擇，較佳的為聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000或聚乙二醇8000。本發(fā)明中，所述的無機(jī)鹽為本領(lǐng)域常規(guī)雙水相分離體系使用的無機(jī)鹽，可按本領(lǐng)域常規(guī)條件選擇，較佳的為硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、甲酸鈉和酒石酸鉀鈉中的一種或多種。本發(fā)明中，所述的PH值的調(diào)節(jié)可按本領(lǐng)域常規(guī)pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)，如氫氧化鈉或鹽酸。本發(fā)明中，所述的水可按本領(lǐng)域常規(guī)條件選擇，一般為去離子水。本發(fā)明中，所述的混合、溶解的溫度可按本領(lǐng)域常規(guī)條件選擇，室溫20°C左右均可。本發(fā)明中，所述的混合均勻可按本領(lǐng)域常規(guī)操作進(jìn)行，較佳為振蕩。本發(fā)明中，所述的分相可按本領(lǐng)域常規(guī)操作進(jìn)行，較佳的為靜置分相或離心分相。 其中，所述的離心分相的條件較佳的為10，OOOXg離心15min。(3)取分相后得到的聚乙二醇相以離子交換法回收富集在其中的木瓜蛋白酶，即
5可。本發(fā)明中，所述的離子交換法可按本領(lǐng)域常規(guī)操作選擇進(jìn)行，較佳的包括如下步驟在pH為4. 0 6. 0的條件下，將聚乙二醇相上離子交換柱，木瓜蛋白酶吸附于離子交換介質(zhì)上，之后再將木瓜蛋白酶洗脫即可。其中，所述的聚乙二醇相上樣的蛋白濃度可按本領(lǐng)域常規(guī)條件選擇，較佳的為 0. 5mg/mL·其蛋白濃度可用去離子水適當(dāng)調(diào)節(jié)。其中，所述的離子交換介質(zhì)可按本領(lǐng)域常規(guī)選擇，較佳的為陽離子交換介質(zhì)，更佳的為強(qiáng)陽離子交換介質(zhì)，進(jìn)一步更佳的為快流速SP-瓊脂糖凝膠，英文名kpharose SP Fast Flow0其中，所述的離子交換柱的平衡緩沖液可按本領(lǐng)域常規(guī)條件選擇，較佳的為pH值 5. 0的50mM NaAC緩沖液。按本領(lǐng)域常規(guī)一般所述的平衡緩沖液先平衡離子交換柱，之后上樣，再洗脫目標(biāo)樣品。其中，所述的洗脫木瓜蛋白酶時(shí)的洗脫液可按本領(lǐng)域常規(guī)條件選擇，較佳的為pH 值5. 0的50mM NaAC與230mM NaCl的混合液。本發(fā)明中，所述的洗脫得到的木瓜蛋白酶溶液一般還可按本領(lǐng)域常規(guī)操作，將該木瓜蛋白酶溶液透析，收集透析液并干燥即可得木瓜蛋白酶酶粉。其中，所述的透析溫度可按本領(lǐng)域常規(guī)，一般4°C左右均可。其中，所述的透析使用的透析袋可按本領(lǐng)域常規(guī)條件選擇，較佳的為截留分子量 3500Da的透析袋。其中，所述的透析操作可按本領(lǐng)域常規(guī)操作進(jìn)行，較佳的為去離子水中透析M小時(shí)，期間換水2 3次。所述的去離子水的用量無特別限定，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，可使用大體積水進(jìn)行透析。其中，所述的干燥可按本領(lǐng)域常規(guī)操作，較佳的為真空冷凍干燥。本發(fā)明還涉及前述木瓜蛋白酶分離純化方法獲得的木瓜蛋白酶。本發(fā)明還涉及一種木瓜蛋白酶的固定化方法包括如下步驟在如前所述木瓜蛋白酶分離純化方法步驟( 分相后得到的富集木瓜蛋白酶的聚乙二醇相中進(jìn)行木瓜蛋白酶固定化即可。本發(fā)明中，所述的木瓜蛋白酶固定化的方法可按本領(lǐng)域常規(guī)方法選擇，可為載體固定化法或交聯(lián)酶聚集體制備法。其中，所述的載體固定化法一般包括吸附法、共價(jià)結(jié)合法或交聯(lián)法。本發(fā)明中，所述的木瓜蛋白酶固定化的方法為載體固定化法時(shí)，所述的木瓜蛋白酶固定化較佳的包括如下步驟向如前所述木瓜蛋白酶分離純化方法步驟( 分相后得到的聚乙二醇相中加入固定化酶載體進(jìn)行固定化反應(yīng)，之后分離獲得固定化酶即可。其中，所述的固定化酶載體可從本領(lǐng)域常規(guī)固定化使用的固定化酶載體中選擇，包括各種無機(jī)載體，如硅藻土 ；各種天然有機(jī)載體，如葡聚糖及其衍生物、纖維素及其衍生物、殼聚糖及其衍生物等；各種合成載體，如氨基載體類如ZH-HA、MANAE agarose, Sepabeads EC-EA、LH-HA、BB_A 等，環(huán)氧基載體類如 Eupergit C,Amberzyme, ZH-EP,LH-EP, BB-2等；各種介孔材料，如SBA15、MCM41等均可使用。所述的固定化酶載體的用量本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員公知，可按照具體載體的負(fù)載能力適當(dāng)調(diào)整。
其中，所述的固定化反應(yīng)操作條件按本領(lǐng)域常規(guī)操作，一般為攪拌或振蕩，溫度為常規(guī)室溫，一般25°C左右均可。其中，所述的分離可按本領(lǐng)域常規(guī)操作，較佳的為過濾，更佳的為抽濾。本發(fā)明中獲得固定化木瓜蛋白酶之后一般按本領(lǐng)域常規(guī)操作，用去離子水清洗， 抽干，并于4°C左右保存。本發(fā)明中，所述的木瓜蛋白酶固定化的方法為交聯(lián)酶聚集體制備法時(shí)，所述的木瓜蛋白酶固定化較佳的包括如下步驟將如前所述木瓜蛋白酶分離純化方法步驟( 分相后得到的聚乙二醇相中加入有機(jī)溶劑沉淀劑，木瓜蛋白酶沉淀聚集，之后再加入交聯(lián)劑溶液均勻混合，交聯(lián)即可。本發(fā)明中，所述的有機(jī)溶劑沉淀劑可按本領(lǐng)域常規(guī)所述選擇，較佳的為丙酮、乙腈、二氧六環(huán)、甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、異丁醇、叔丁醇、戊醇和己醇中的一種或多種。本發(fā)明中，所述的有機(jī)溶劑沉淀劑的用量可按本領(lǐng)域常規(guī)條件選擇，較佳的為有機(jī)溶劑沉淀劑與聚乙二醇相體積比為1 1 5 1。本發(fā)明中，所述的交聯(lián)劑可按本領(lǐng)域常規(guī)所述選擇，一般為雙功能試劑戊二醛或碳化二亞胺，較佳的為戊二醛。其中，當(dāng)交聯(lián)劑為戊二醛，一般使用為市售25%戊二醛水溶液。本發(fā)明中，所述的交聯(lián)劑的用量可按本領(lǐng)域常規(guī)條件選擇，較佳的為交聯(lián)劑最終濃度為質(zhì)量百分比0.5% 1.5%。本發(fā)明中，所述的交聯(lián)的反應(yīng)時(shí)間可按本領(lǐng)域常規(guī)條件選擇，較佳的為1 10小時(shí)，更佳的為2小時(shí)。本發(fā)明中，所述的交聯(lián)的反應(yīng)溫度可按本領(lǐng)域常規(guī)條件選擇，一般室溫25°C左右。本發(fā)明中，所述的均勻混合可按本領(lǐng)域常規(guī)操作進(jìn)行，一般攪拌即可。本發(fā)明中，所述的固定化的方法為交聯(lián)法時(shí)獲得固定化木瓜蛋白酶(又稱交聯(lián)酶聚集體)，一般可按本領(lǐng)域常規(guī)操作進(jìn)行后處理，較佳的為將所述交聯(lián)后含有固定化木瓜蛋白酶的溶液離心，取固定化木瓜蛋白酶，去離子水清洗，之后干燥即可。其中，所述的后處理溫度可按本領(lǐng)域常規(guī)，一般4°C左右。其中，所述的離心可按本領(lǐng)域常規(guī)操作進(jìn)行，較佳的為20，OOOXg離心15min。其中，所述的干燥可按本領(lǐng)域常規(guī)，一般真空冷凍干燥即可。本發(fā)明還涉及前述木瓜蛋白酶的固定化方法獲得的固定化木瓜蛋白酶。本發(fā)明木瓜蛋白酶分離純化方法獲得木瓜蛋白酶，以及固定化方法獲得的固定化木瓜蛋白酶可按本領(lǐng)常規(guī)用途，用于蛋白酶、酰胺酶、酯酶、轉(zhuǎn)氨酶、轉(zhuǎn)酯酶及海因酶等應(yīng)用。本發(fā)明所用試劑和原料除特殊說明外均市售可得。在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明中上述的各技術(shù)特征的優(yōu)選條件可以任意組合得到本發(fā)明較佳實(shí)例。本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于本發(fā)明的木瓜蛋白酶分離純化方法生物相容性好，成本低，操作步驟簡單，操作條件溫和，萃取效率高，萃取率在90%以上，過程易于放大，產(chǎn)品酶活性損失少，無有機(jī)溶劑殘余；制得的產(chǎn)品木瓜蛋白酶純度高約至96% 100% ；木瓜蛋白酶固定化方法避免了使用其它的分離純化手段將木瓜蛋白酶從聚合物相中分離出來，可直接“原位”進(jìn)行固定化，使得固定化步驟大為簡化，固定化率>90%，酶活回收率>40% ；該方法不僅制得了固定化酶，而且起到了從聚合物相中回收目的酶蛋白的作用，克服了傳統(tǒng)上使用凝膠過濾、超濾、 離子交換、反萃等方法存在操作復(fù)雜，成本較高并且難于放大等缺陷。


圖1為實(shí)施例1 4的木瓜蛋白酶分離純化的過程中聚乙二醇相與無機(jī)鹽相中木瓜蛋白酶的堿性蛋白非變性電泳圖。圖2為實(shí)施例1制備的木瓜蛋白酶的凍干粉外觀圖。圖3為實(shí)施例7制備的殼聚糖小球固定化木瓜蛋白酶外觀圖。圖4為實(shí)施例10制備的固定化木瓜蛋白酶外觀圖。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下述實(shí)施例中，木瓜粉和木瓜蛋白酶粗酶(廣西南寧杰沃利生物制品有限公司)； 木瓜蛋白酶標(biāo)品為二次結(jié)晶的木瓜蛋白酶(Sigma公司產(chǎn)品)；木瓜乳汁(木瓜漿液)為自制，以鮮木瓜為原料榨汁即可。木瓜蛋白酶的分離純化實(shí)施例11、在4°C下，將40g木瓜乳汁溶解于100ml 50mM半胱氨酸溶液(含有5mM EDTA, PH 6.5)中，離心O0，000Xg，4°C，15min)除去不溶物，測(cè)定上清蛋白濃度(常規(guī)的考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定)，用50mM半胱氨酸溶液調(diào)節(jié)上清的蛋白濃度為10mg/ml，再調(diào)節(jié)溶液的pH 為6. 5 (用6MNaOH或HCl溶液調(diào)節(jié))，即為初始粗酶溶液；同時(shí)，配置40%聚乙二醇2000溶液；配置40% (w/w)硫酸銨溶液，調(diào)節(jié)pH為6. 5 ；在20°C下，將初始粗酶溶液、聚乙二醇溶液、硫酸銨溶液和去離子水混合溶解在一起，其中初始粗酶溶液的質(zhì)量百分含量為40%，聚乙二醇2000的質(zhì)量百分含量為30%，硫酸銨的質(zhì)量百分含量為25%、去離子水的質(zhì)量百分含量為5%;將配置好的雙水相體系放入 20°C搖床中充分混合2h，將混合均勻溶液離心(20°C，10，OOOXg, 15min)，以使兩相(上相為聚乙二醇相，下相為無機(jī)鹽相)充分分離；將聚乙二醇相吸出，即得到了富含高純度木瓜蛋白酶的聚乙二醇溶液。其中，測(cè)定上、下相體積，分取上、下相樣品，測(cè)定蛋白濃度和酶活力，將樣品進(jìn)行堿性蛋白非變性電泳(Basic Protein Native-PAGE，可參考文獻(xiàn)Dekeyser P. Μ.，De Smedt S. , Demeester J. , Lauwers Α. , Journal of Chromatography B !Biomedical Sciences and Applications, 1994,656(1) :203-208)和快速蛋白液相色譜(FPLC, Azarkan Μ·， Dibiani R. , Baulard C. , Baeyens-Volant D, International Journal of Biological Macromolecules, 2006，38 (3-5) :216-224)檢測(cè)，經(jīng)檢測(cè)，聚合物相中的木瓜蛋白酶純度 (FPLC測(cè)定)為96. 1%，其分離純化效果見圖1 (la為聚合物相、Ib為無機(jī)鹽相)。
2、離子交換填料采用S印harose SP Fast Flow 2Oml (柱子型號(hào)Amersham Biosciences XK 16，內(nèi)徑16mm)；離子交換柱平衡緩沖液為A :50mM NaACpH 5.0，洗脫緩沖液為 B :50mM NaAC 230mM NaCl pH 5. 0 ；將上述富含高純度木瓜蛋白酶的聚乙二醇相用水稀釋蛋白濃度至0. 5mg/ml，用A 液平衡離子交換柱后，將稀釋液通入50ml，待流穿物完全流過柱子后，用B液洗脫，收集洗脫峰，裝入截留分子量為3500Da透析袋中，4°C在4L去離子水中充分透析Mh，期間更換3 次水，收集透析液即為高純度木瓜蛋白酶液，進(jìn)一步將透析液凍結(jié)后進(jìn)行真空冷凍干燥即可得到高純度的木瓜蛋白酶酶粉，其外觀可如圖2所示。實(shí)施例2在4°C下，將30g木瓜漿液溶解于200ml 25mM半胱氨酸溶液(含有3mM EDTA, pH 6. 0)中，離心(20，000Xg，4°C，15min)除去不溶物，測(cè)定上清蛋白濃度，用25mM半胱氨酸溶液調(diào)節(jié)上清的蛋白濃度為10mg/ml，再調(diào)節(jié)溶液的pH為6. 0 (6M NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié))，即為初始粗酶溶液；配置40%聚乙二醇4000溶液；同時(shí)，配置40% (w/w)硫酸鈉溶液，調(diào)節(jié) PH 為 6. 0 ；在20°C下，將初始粗酶溶液、聚乙二醇溶液、硫酸鈉溶液和去離子水混合溶解在一起，其中初始粗酶溶液的質(zhì)量百分含量為35%，聚乙二醇4000的質(zhì)量百分含量為25%，硫酸鈉的質(zhì)量百分含量為19%、去離子水的質(zhì)量百分含量為21% ；將配置好的雙水相體系放入20°C搖床中充分混合2h，將混合均勻溶液離心(20°C，10，000Xg, 15min)，以使兩相充分分離；將聚乙二醇相(上相)吸出，即得到了富含高純度木瓜蛋白酶的聚乙二醇溶液；其中，同實(shí)施例1方法對(duì)聚合物相中的木瓜蛋白酶純度(FPLC測(cè)定)為96.8%，其分離純化效果見圖1 ( 聚合物相、2b無機(jī)鹽相)。之后，將上述富含高純度木瓜蛋白酶的聚乙二醇相按同實(shí)施例1方法處理即可得高純度木瓜蛋白酶液，進(jìn)一步將透析液凍結(jié)后進(jìn)行真空冷凍干燥即可得到高純度的木瓜蛋白酶酶粉。實(shí)施例3在4°C下，將20g木瓜粉溶解于100ml 30mM半胱氨酸溶液(含有0. 5mM EDTA, pH 5. 8)中，離心(20，000Xg，4°C，15min)除去不溶物，測(cè)定上清蛋白濃度，用30mM半胱氨酸溶液調(diào)節(jié)上清的蛋白濃度為15mg/ml，再調(diào)節(jié)溶液的pH為5. 8 (6M NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié))，即為初始粗酶溶液；同時(shí)，配置40%聚乙二醇6000溶液；pH 5. 8的40% (w/w)磷酸鹽溶液， 由 40% (w/w) K2HPO4 和 40% (w/w) NaH2PO4 配制而得。在20°C下，將初始粗酶溶液、聚乙二醇溶液、磷酸鹽溶液和去離子水混合溶解在一起，其中初始粗酶溶液的質(zhì)量百分含量為30%，聚乙二醇6000的質(zhì)量百分含量為18%，磷酸鹽的質(zhì)量百分含量為10%、去離子水的質(zhì)量百分含量為42% ；將配置好的雙水相體系放入20°C搖床中充分混合2h，將混合均勻溶液離心(20°C，10，000Xg, 15min)，以使兩相充分分離；將聚乙二醇相(上相)吸出，即得到了富含高純度木瓜蛋白酶的聚乙二醇溶液；其中，同實(shí)施例1方法對(duì)聚合物相中的木瓜蛋白酶純度(FPLC測(cè)定)為98.4%，其分離純化效果見圖1 (3a聚合物相、北無機(jī)鹽相)。之后，將上述富含高純度木瓜蛋白酶的聚乙二醇相按同實(shí)施例1方法處理即可得高純度木瓜蛋白酶液，進(jìn)一步將透析液凍結(jié)后進(jìn)行真空冷凍干燥即可得到高純度的木瓜蛋白酶酶粉。實(shí)施例4在4°C下，將IOg木瓜蛋白酶粗酶粉溶解于100ml IOmM半胱氨酸溶液(含有0. 5mM EDTA，pH 5. 5)中，離心(20，000Xg，4°C，15min)除去不溶物，測(cè)定上清蛋白濃度，用IOmM半胱氨酸溶液調(diào)節(jié)上清的蛋白濃度為20mg/ml，再調(diào)節(jié)溶液的pH為5. 5 (6M NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié))，即為初始粗酶溶液；配置40%聚乙二醇8000溶液；同時(shí)，配置40% (w/w)酒石酸鉀鈉溶液，調(diào)節(jié)PH為5. 5。在20°C下，將初始粗酶溶液、聚乙二醇溶液、酒石酸鉀鈉溶液和去離子水混合溶解在一起，其中初始粗酶溶液的質(zhì)量百分含量為30%，聚乙二醇8000的質(zhì)量百分含量為 10%，酒石酸鉀鈉的質(zhì)量百分含量為13%、去離子水的質(zhì)量百分含量為47%;將配置好的雙水相體系放入20°C搖床中充分混合2h，將混合均勻溶液離心(20°C，10，000Xg, 15min)，以使兩相充分分離；將聚乙二醇相(上相)吸出，即得到了富含高純度木瓜蛋白酶的聚乙二醇溶液；其中，同實(shí)施例1方法對(duì)聚合物相中的木瓜蛋白酶純度(FPLC測(cè)定)為100%，其分離純化效果見圖1 ( 聚合物相、4b無機(jī)鹽相)。之后，將上述富含高純度木瓜蛋白酶的聚乙二醇相按同實(shí)施例1方法處理即可得高純度木瓜蛋白酶液，進(jìn)一步將透析液凍結(jié)后進(jìn)行真空冷凍干燥即可得到高純度的木瓜蛋白酶酶粉。木瓜蛋白酶的原位固定化實(shí)施例5預(yù)準(zhǔn)備氨基載體的活化稱取3g ZH-HA載體(購自香港GeneRad Biotech Laboratory有限公司)加入 12ml 0. IM的磷酸鉀緩沖液(pH 8.0)中，在搖床上200rpm清洗15min，測(cè)定pH，維持pH在 7. 8-8. 2之間，Ih后用3#砂芯過濾抽干，將載體加入12ml 2% (w/v)的戊二醛0. 02M磷酸鉀緩沖液(PH 8.0)中，在25°C下200rpm活化lh，活化后的載體用去離子水充分清洗，抽干后保存于4°C (在Mh內(nèi)使用)。氨基載體原位固定化木瓜蛋白酶取0. 5g活化的ZH-HA載體加入5ml酶溶液(聚乙二醇相，實(shí)施例1)中，裝入25ml 具塞錐形瓶。將錐形瓶放入25°C搖床200rpm固定化48h，固定化結(jié)束后通過抽濾得到固定化酶，先將固定化酶先用去離子水清洗，再用IM的NaCl溶液(用pH 7. 0的0. 02M磷酸鉀緩沖液配置)漂洗，最終用0. 02M的磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)充分清洗，抽干后，4°C保存。 該方法固定化木瓜蛋白酶，固定化率達(dá)到90. 2%，酶活回收率達(dá)到52. 5%。實(shí)施例6介孔材料原位固定化木瓜蛋白酶取0.7g SBA15(購自上海百瑞生物技術(shù)有限公司)載體加入5ml酶溶液(聚乙二醇相，實(shí)施例3)中，裝入25ml具塞錐形瓶。將錐形瓶放入25°C搖床200rpm固定化48h，固定化結(jié)束后通過抽濾得到固定化酶，再將固定化酶用去離子水清洗，最終用0. 02M的磷酸鉀緩沖液(PH 7.0)充分清洗，抽干后，4°C保存。該方法固定化木瓜蛋白酶，固定化率達(dá)到 93.4%,酶活回收率達(dá)到64. 3% ο實(shí)施例7
預(yù)準(zhǔn)備殼聚糖小球的制備將200ml 1. 5% (ν/ν)的乙酸溶液加熱至70_80°C，稱取2g殼聚糖粉末在不斷攪拌下緩慢加入，直至殼聚糖完全溶解，超聲除氣。采用注射器配上針頭(5號(hào))，在室溫下將 1% (ν/ν)的殼聚糖溶液滴加入緩慢攪拌的IL IMNaOH 30% (ν/ν)甲醇的固化溶液中。固化后，用去離子水清洗小球，直至洗液為中性。將制備的殼聚糖小球放入去離子水中，4°C保存待用。殼聚糖小球原位固定化木瓜蛋白酶取0. 4g殼聚糖小球加入5ml酶溶液(聚乙二醇相，實(shí)施例4)中，裝入25ml具塞錐形瓶，再加入戊二醛溶液(25%，W/v)使其終濃度為1%。將錐形瓶放入25°C搖床200rpm 固定化48h，固定化結(jié)束后通過抽濾得到固定化酶，先將固定化酶用去離子水清洗，再用IM 的NaCl溶液(用pH 7. 0的0. 02M磷酸鉀緩沖液配置)漂洗，最終用0. 02M的磷酸鉀緩沖液(PH 7.0)充分清洗，抽干后，4°C保存，其產(chǎn)品外觀可如圖3所示。該方法固定化木瓜蛋白酶，固定化率達(dá)到90. 4%，酶活回收率達(dá)到40. 3%。固定化木瓜蛋白酶(交聯(lián)酶聚集體)制備實(shí)施例8向20ml聚乙二醇相(實(shí)施例幻中加入20ml丙酮，在4°C下靜止沉淀15min ；接著將戊二醛溶液(25%，w/v)加入懸濁液中使其終濃度為1. 5%，然后在25°C下200rpm交聯(lián) Ih ；在交聯(lián)結(jié)束時(shí)，將整個(gè)懸濁液在4°C、20，000X g下離心15min，將離心下來的固定化木瓜蛋白酶用去離子水清洗3遍；最后，將固定化木瓜蛋白酶進(jìn)行真空冷凍干燥以制備干粉。實(shí)施例9向20ml聚乙二醇相(實(shí)施例4)中加入IOOml 丁醇，在4°C下靜止沉淀15min ；接著將戊二醛溶液(25%，w/v)加入懸濁液中使其終濃度為1%，然后在25°C下200rpm交聯(lián) 5h ；在交聯(lián)結(jié)束時(shí)，將整個(gè)懸濁液在4°C、20，OOOXg下離心15min，將離心下來的固定化木瓜蛋白酶用去離子水清洗3遍；最后，將固定化木瓜蛋白酶進(jìn)行真空冷凍干燥以制備干粉。實(shí)施例10向20ml聚乙二醇相(實(shí)施例2、中加入50ml乙醇，在4°C下靜止沉淀15min ；接著將戊二醛溶液(25%，w/v)加入懸濁液中使其終濃度為0. 5%，然后在25°C下200rpm交聯(lián) IOh ；在交聯(lián)結(jié)束時(shí)，將整個(gè)懸濁液在4°C、20，000 Xg下離心15min，將離心下來的固定化木瓜蛋白酶用去離子水清洗3遍；最后，將固定化木瓜蛋白酶進(jìn)行真空冷凍干燥以制備干粉， 其外觀可見如圖4所示。該固定化方法固定化木瓜蛋白酶，固定化率達(dá)到99.3%，酶活回收率達(dá)到47.8%。
權(quán)利要求
1.一種木瓜蛋白酶分離純化方法，其特征在于其包括如下步驟(1)將含木瓜蛋白酶的原料溶解，除去不溶物，之后調(diào)節(jié)蛋白濃度為10mg/ml 20mg/ ml，得初始粗酶溶液；(2)將初始粗酶溶液與聚乙二醇、無機(jī)鹽和水混合、溶解，待各成分混合均勻后分相，其中，初始粗酶溶液的含量為30% 40%，聚乙二醇的含量為10% 30%，無機(jī)鹽的含量為 10% 25%，pH值為5. 5 6. 5，百分比為各成分占初始粗酶溶液、聚乙二醇、無機(jī)鹽和水總量的質(zhì)量百分比；(3)取分相后得到的聚乙二醇相以離子交換法回收富集在其中的木瓜蛋白酶，即可。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中，所述的含木瓜蛋白酶的原料為木瓜蛋白酶粗酶粉；所述的溶解的溶液為含有0. 5mM 5mM EDTA且pH為5. 5 6. 5的 IOmM 50mM半胱氨酸溶液；所述的除去不溶物為板框過濾或離心，較佳的為20，OOOXg離心 15min ；和/或，步驟O)中，所述的聚乙二醇為聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000 或聚乙二醇8000 ；所述的無機(jī)鹽為硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、甲酸鈉和酒石酸鉀鈉中的一種或多種；所述的混合均勻?yàn)檎袷帲凰龅姆窒酁殪o置分相或離心分相，其中，所述的離心分相的條件較佳的為10，OOOXg 離心15min ；和/或，步驟(3)中，所述的離子交換法包括如下步驟在pH為4. O 6. O的條件下， 將聚乙二醇相上離子交換柱，木瓜蛋白酶吸附于離子交換介質(zhì)上，之后再將木瓜蛋白酶洗脫即可。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的聚乙二醇相上樣的蛋白濃度為 0. 5mg/ml ；所述的離子交換介質(zhì)為陽離子交換介質(zhì)，較佳的為強(qiáng)陽離子交換介質(zhì)，更佳的為快流速SP-瓊脂糖凝膠；所述的離子交換柱的平衡緩沖液為pH值5. O的50mM NaAC緩沖液；所述的洗脫木瓜蛋白酶時(shí)的洗脫液為PH值5. O的50mM NaAC與230mM NaCl的混合液。
4.一種如權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的木瓜蛋白酶分離純化方法獲得的木瓜蛋白酶。
5.一種木瓜蛋白酶的固定化方法，其特征在于其包括如下步驟在如權(quán)利要求1 4任一項(xiàng)所述木瓜蛋白酶分離純化方法步驟( 分相后得到的富集木瓜蛋白酶的聚乙二醇相中進(jìn)行木瓜蛋白酶固定化即可。
6.如權(quán)利要求5所述的固定化方法，其特征在于所述的木瓜蛋白酶固定化的方法為載體固定化法時(shí)，所述的木瓜蛋白酶固定化包括如下步驟向聚乙二醇相中加入固定化酶載體進(jìn)行固定化反應(yīng)，之后分離獲得固定化酶即可。
7.如權(quán)利要求6所述的固定化方法，其特征在于所述的固定化酶載體為硅藻土類無機(jī)載體、葡聚糖及其衍生物、纖維素及其衍生物、殼聚糖及其衍生物、氨基載體類合成載體、 環(huán)氧基載體類合成載體和介孔材料中的一種或多種；所述的固定化反應(yīng)操作條件為攪拌或振蕩；所述的分離為過濾。
8.如權(quán)利要求5所述的固定化方法，其特征在于所述的木瓜蛋白酶固定化的方法為交聯(lián)酶聚集體制備法時(shí)，所述的木瓜蛋白酶固定化包括如下步驟向聚乙二醇相中加入有機(jī)溶劑沉淀劑，木瓜蛋白酶沉淀聚集，之后再加入交聯(lián)劑溶液均勻混合，交聯(lián)即可。
9.如權(quán)利要求8所述的固定化方法，其特征在于所述的有機(jī)溶劑沉淀劑為丙酮、乙腈、二氧六環(huán)、甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、異丁醇、叔丁醇、戊醇和己醇中的一種或多種；所述的有機(jī)溶劑沉淀劑的用量為有機(jī)溶劑沉淀劑與聚乙二醇相體積比為1 1 5 1 ；所述的交聯(lián)劑為戊二醛或碳化二亞胺；所述的交聯(lián)劑的用量為交聯(lián)劑最終濃度為質(zhì)量百分比0. 5% 1. 5% ；所述的交聯(lián)的反應(yīng)時(shí)間為1 10小時(shí)，較佳的為2小時(shí)。
10. 一種如權(quán)利要求5 9任一項(xiàng)所述的固定化方法獲得的固定化木瓜蛋白酶。
全文摘要
本發(fā)明公開一種木瓜蛋白酶分離純化方法和其固定化方法，以及所得產(chǎn)品。該分離純化方法包括如下步驟(1)將含木瓜蛋白酶的原料溶解，除去不溶物，之后調(diào)節(jié)蛋白濃度為10mg/ml～20mg/ml，得初始粗酶溶液；(2)將初始粗酶溶液與聚乙二醇、無機(jī)鹽和水混合、溶解，待各成分混合均勻后分相，其中，初始粗酶溶液的含量為30％～40％，聚乙二醇的含量為10％～30％，無機(jī)鹽的含量為10％～25％，pH值為5.5～6.5；(3)取分相后得到的聚乙二醇相以離子交換法回收木瓜蛋白酶，即可。該固定化方法為在富集著木瓜蛋白酶的聚乙二醇相中進(jìn)行木瓜蛋白酶固定化即可。該分離純化方法生物相容性好，操作步驟簡單，操作條件溫和，過程易于放大，產(chǎn)品酶活性損失少，無有機(jī)溶劑殘余，且固定化步驟大為簡化。
文檔編號(hào)C12N9/50GK102250860SQ20111008891
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月8日
發(fā)明者李明亮, 蘇二正, 魏東芝, 龔翔宇 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)