專利名稱：一種林木外生菌根真菌彩色豆馬勃的分子檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物的分子檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種林木外生菌根真菌 (Ectomycorrhizal fungi, EMF)彩色豆馬勃 O0Z1So^iiAw1S iiflciori^As)的分子檢測方法。
背景技術(shù)：
外生菌根是真菌與植物根系相互作用形成的互惠共生體，是森林植物正常生長必不可少的部分，具有重要的生態(tài)環(huán)境效益和經(jīng)濟價值。準(zhǔn)確描述和鑒定外生菌根真菌 (Ectomycorrhizal fungi, EMF)是研究外生菌根在自然森林生態(tài)系統(tǒng)中功能的最基本要求之一，特別是在進行外生菌根種類和分布狀況的野外調(diào)查時，對菌根真菌的監(jiān)測也需要鑒別EMF。同時，對EMF鑒定也可應(yīng)用于檢測接種了外生菌根食用真菌的植物質(zhì)量，以確保被接種的植物在生產(chǎn)過程中沒有被其它真菌污染。彩色豆馬勃iPisolithus tinctorius ) 是一種地理分布廣泛、寄主范圍廣、對林木有益的EMF，分布于世界三十多個國家，能夠與松樹iPinus、、職(^/ca斤/7 ^5)、櫟樹(ft/ercm )、樺木(Metula )等多種林木形成菌根，在苗圃育苗、樹木移栽和人工造林時具有提高幼苗成活率、促進樹木營養(yǎng)吸收、提高樹木抗病和抗逆境脅迫的能力。傳統(tǒng)的EMF鑒定是通過真菌子實體顏色、形狀和其它的宏觀特征進行鑒定，后來輔以菌索和真菌細胞的顯微結(jié)構(gòu)等進行鑒定。但是，由于大多數(shù)EMF種類在野外或離體培養(yǎng)時不易形成子實體，因此對EMF進行形態(tài)學(xué)描述及鑒定存在一定困難。另外，相近種的EMF所形成的菌根往往具有相似的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，容易混淆，所以探尋合適的檢測EMF 的方法是目前亟待解決的一個重要問題。真菌核糖體rDNA的ITS區(qū)是一段中度或高度保守序列，其保守性表現(xiàn)為種內(nèi)相對一致，種間差異比較明顯，因此為真菌的分子檢測提供了理想的靶序列，再加上分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，許多真菌的rDNA ITS區(qū)序列被測定并且向GeneBank等三大數(shù)據(jù)庫提交，為通過ITS區(qū)序列來研究EMF的分子檢測提供了方便。一系列基于rDNA ITS區(qū)的分子生物學(xué)檢測外生菌根的方法應(yīng)運而生，主要的分子生物學(xué)方法如限制性片段長度多態(tài)性 (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)、簡單重復(fù)序列(Simple Sequence R印eat，SSR)、序列擴增特征區(qū)(Sequence Characterized Amplified Region，SCAR)，還有設(shè)計特異性引物擴增ITS區(qū)和設(shè)計專一性探針進行分子雜交檢測和鑒定EMF，這使得對EMF 的檢測脫離了對形態(tài)學(xué)的依賴。但是這些方法也存在一些不足，如費用比較昂貴、檢測對象 DNA質(zhì)量不高或DNA濃度太小時難于分析等。而且，土壤中存在多種PCR擴增抑制劑，如腐殖酸等，會對PCR擴增產(chǎn)生嚴重影響，另外，從植物菌根中只能獲得少量的真菌DNA，這些因素給EMF的分子檢測帶來了不便。同時，對EMF分子檢測時，設(shè)計出特異性引物也是技術(shù)的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種林木外生菌根真菌彩色豆馬勃的分子檢測方法，以期為林木EMF彩色豆馬勃的檢測和評估提供一種準(zhǔn)確、快速的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種林木外生菌根真菌彩色豆馬勃的分子檢測方法，以待測樣品DNA為模板，以通用引物ITSl-F/ ITS4-B、引物PtF和引物PtR為特異性引物，分別進行巢式PCR的第一、二輪反應(yīng)，產(chǎn)物進行電泳檢測，即可快速檢測松樹外生菌根中的彩色豆馬勃；所述的引物PtF序列為 5，-GGGACCTGTGCGTTTCGT-3，；引物 PtR 序列為5，-CATGCCCACCCGCTAATG-3，。一種林木外生菌根真菌彩色豆馬勃的分子檢測方法，具體步驟如下
(1)采用CTAB法提取待測樣品的DNA，在進行組培苗和實生苗菌根DNA提取時，當(dāng)DNA 溶于IOOul TE溶液后，再次加入200ul CTAB重復(fù)提取一次；
(2)巢式PCR反應(yīng)，巢式PCR第一輪PCR反應(yīng)的引物為通用引物ITS1-F/ITS4-B，反應(yīng)體系 20ul 10XPCR buffer (Mg2+ Free)2ul ；MgCl2 (25mM)l. 3ul ；dNTP Mixture (各 2. 5mM) 1.6ul ；引物各Iul ；rTaq酶(5U/ul)0. Iul ；模板DNA 2ul ；加無菌去離子水至20ul ；PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min ；94°C變性lmin，57. 8°C退火30s，72°C延伸lmin，共35個循環(huán)；72°C延伸IOmin ；巢式PCR第二輪反應(yīng)以特異性引物PtF/PtR為引物，巢式PCR第一輪 PCR產(chǎn)物稀釋50倍，取2ul作為第二輪反應(yīng)模板，PCR反應(yīng)體系與第一輪相同，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min ；94°C變性lmin，60°C退火30s，72°C延伸lmin，共35個循環(huán)；72°C 延伸IOmin ；
(3 )取巢式PCR產(chǎn)物進行瓊脂凝膠電泳檢測，電泳圖中出現(xiàn)347bp條帶即為檢測出彩色
豆馬勃。步驟(1)中，采用CTAB法提取待測樣品的DNA時，在進行組培苗和實生苗菌根DNA 提取時，當(dāng)DNA溶于IOOul TE溶液后，再次加入200ul CTAB重復(fù)提取一次。本發(fā)明利用真菌通用引物ITS1-F/ITS4-B擴增了彩色豆馬勃的核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)并進行了序列測定。通過序列比較，設(shè)計了一對彩色豆馬勃引物PtF / PtR，將所設(shè)計的特異性引物放回GeneBank中的I^rimer-Blast比對，并用該對引物對所有供試菌株進行巢式PCR擴增以驗證所設(shè)計引物的特異性。為了評估巢式PCR的靈敏度，將彩色豆馬勃DNA稀釋為10個梯度，20ul PCR反應(yīng)體系中分別含 DNA 模板 IOOng, IOng, lng、lOOpg、10pg、lpg、lOOfg、10fg、Ifg 和 IOOag,分別用特異性引物進行常規(guī)PCR和巢式PCR。為了評價本發(fā)明的EMF彩色豆馬勃巢式PCR檢測在實際應(yīng)用中的效果，以施用彩色豆馬勃的組培苗和四年生菌根化盆栽馬尾松實生苗進行巢式PCR檢測。巢式PCR是基于內(nèi)部引物，進行兩輪PCR擴增，能增加DNA擴增片段的濃度，對PCR 抑制物質(zhì)起到稀釋作用，因此可以避免低DNA濃度和PCR抑制化合物對檢測的影響。有益效果本發(fā)明以待測樣品DNA為模板，以引物PtF和引物PtR為特異性引物， 進行巢式PCR反應(yīng)，產(chǎn)物進行電泳檢測后即可以快速檢測外生菌根真菌彩色豆馬勃。該方法為林木EMF彩色豆馬勃的檢測和評估提供一種準(zhǔn)確、快速的途徑，引物PtF和引物PtR具有很強的特異性，本方法的檢測靈敏度能夠達到常規(guī)PCR的1000倍。


圖1是彩色豆馬勃巢式PCR引物特異性分析的1.5%瓊脂凝膠電泳圖；其中，電
4泳條件，IOOv, 57mA,電泳30min ；圖中，泳道M為DNA Marker ；泳道廣10為彩色豆馬勃菌株DNA ；泳道11為黃色須腹菌iHhizopogon luteolus)mk ；泳道12為紫金蠟?zāi)?Zaccaria amethystea )DNA ；泳道 13 為劣味乳菇 Uactarius insulsus)mk ；泳道 14 為紅菇(Mussula sp. )DNA ；泳道 15 為裂WM QSchizophylIum commune ) Μ ；泳道 16 為小馬勃 Uycoperdon pusillus )mk ；泳道17為雙蒸水；
圖2是特異性引物PtF / PtR常規(guī)PCR擴增彩色豆馬勃DNA靈敏度檢測的1.5%瓊脂凝膠電泳圖；其中，電泳條件，100v，57mA，電泳30min ；圖中，泳道M為DNA Marker ；泳道廣10 為 20ul PCR 反應(yīng)體系中分別含 DNA 模板 lOOng、10ng、lng、lOOpg、10pg、lpg、lOOfg、10fg、 Ifg和1 OOag，泳道11為雙蒸水；
圖3是特異性引物PtF / PtR巢式PCR擴增彩色豆馬勃DNA靈敏度檢測的1.5%瓊脂凝膠電泳圖；其中，電泳條件，100v，57mA，電泳30min ；圖中，泳道M為DNA Marker ；泳道廣10 為 20ul PCR 反應(yīng)體系中分別含 DNA 模板 100ng、10ng、lng、100pg、10pg、lpg、100fg、10fg、 Ifg和1 OOag，泳道11為雙蒸水；
圖4是巢式PCR檢測兩種松樹組培苗菌根中彩色豆馬勃的1. 5%瓊脂凝膠電泳圖；其中，電泳條件，IOOv, 57mA,電泳30min ；圖中，泳道M為DNA Marker,泳道1為IOOng DNA的陽性對照，泳道2飛均為菌根化濕地松(/ ^ elliottii)根DNA，泳道6、為菌根化赤松 (Pinus densifIoraH DNA，泳道10為未菌根化濕地松根DNA，泳道11為未菌根化赤松根 DNA,泳道12為濕地松松針，泳道13為赤松松針DNA，泳道14為雙蒸水；
圖5是巢式PCR檢測盆栽馬尾松實生苗菌根中彩色豆馬勃的1. 5%瓊脂凝膠電泳圖；其中，電泳條件，IOOv, 57mA,電泳30min ；圖中，泳道M為DNA Marker,泳道1為IOOng DNA的陽性對照，泳道2飛均為菌根化馬尾松QPims massoniana )根DNA，泳道6為未菌根化馬尾松根DNA，泳道7為馬尾松松針DNA，泳道8為雙蒸水。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的解釋。以下實施例所使用的材料和方法詳情如下
供試彩色豆馬勃O0^Wiife1S tinctorius) Γ Ο菌株，其中，廣2號2個菌株由南京林業(yè)大學(xué)森林病理實驗室保存，3 10號8個菌株購自中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心；黃色須腹菌(Mhizopogon A/teo^As)、紫金蠟?zāi)?Zaccaria a eiAj^iea)、劣味乳菇 {Lactarius lnsulsus)> ^If {Schizophyllum commune)純培養(yǎng)菌禾中禾口紅 (Afessw/a sp.)和小馬勃Uycoperdon /^1SiWM)子實體作為參考菌株，其中除紅菇、小馬勃子實體采自江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院馬尾松林，其余菌種均由南京林業(yè)大學(xué)森林病理實驗室保存。供試彩色豆馬勃2號(代號Pt2)是本實驗室篩選出的對松樹具有較好促生、抗病作用的優(yōu)良菌株，因此以Pt2作為檢測的陽性菌株。選取經(jīng)Pt2 菌根化處理的濕地松 OdZzw1S elliottii、、獄k QPinus dens i flora) 組培苗，以及馬尾松(/ ^^ massoniana)四年生菌根化盆栽實生苗為供試松樹菌根化苗。TaKaRa DNA Fragment Purification Kit, Ε. Ζ. N. Α. CycIe-Pure Kit、DNA 聚合酶、dNTP、pMD19-T載體、DNA Marker等購自大連寶生物公司，引物由南京金斯瑞公司合成。實施例1供試菌株及松苗DNA的提取和ITS擴增
5采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法進行供試菌株及松苗DNA提取，在進行組培苗和實生苗菌根DNA提取時，當(dāng)DNA溶于IOOul TE溶液后，再次加入200ul CTAB重復(fù)提取一次。所提取DNA經(jīng)紫外分光光度計和0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測都符合PCR的要求。以 Pt2 DNA為模板，用真菌通用引物ITSl-F / ITS4-B對Pt2進行PCR擴增，反應(yīng)體系20ul 10XPCR buffer (Mg2+ Free)2ul ；MgC12 (25mM)l. 3ul ；dNTP Mixture (各 2. 5mM) 1. 6ul ； 引物各Iul ；rTaq酶(5U/ul)0. Iul ；模板DNA 2ul ；加無菌去離子水至20ul。PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性 ^iin ；94°C變性 lmin，57. 8°C退火 30s，72°C延伸 lmin，共 35 個循環(huán)；72°C 延伸 lOmin。其中，ITSl-F 的序列為5，-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3，，ITS4-B 的序列為 5’-CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG-3’ 。將Pt2 的 ITS 區(qū) PCR產(chǎn)物經(jīng) Ε. Z. N. A. TMCycle-Pure Kit 回收，連接 pMD19_T 載體， 轉(zhuǎn)化JM109，挑選陽性克隆經(jīng)插入片段驗證后送上海美吉公司測序。Pt2的ITS序列如說明書序列表中的NO. 1所示。實施例2彩色豆馬勃巢式PCR特異性引物設(shè)計
在GeneBank上獲得彩色豆馬勃及其同屬其余種的ITS序列16條，連同供試Pt2的 ITS序列進行Clustal W多重序列比對，利用Primer premier 5.0設(shè)計了一對彩色豆馬勃的特異性引物:PtF / PtR, PtF序列為5' -GGGACCTGTGCGTTTCGT-3'，PtR序列為 5，-CATGCCCACCCGCTAATG-3，，擴增產(chǎn)物大小為!347bp。實施例3彩色豆馬勃巢式PCR引物的特異性分析
巢式PCR第一輪PCR反應(yīng)的引物為通用引物ITSl-F / ITS4-B，按照實施例1中的體系和步驟進行PCR擴增。常規(guī)PCR和巢式PCR第二輪反應(yīng)以特異性引物PtF / PtR為引物， 巢式PCR第一輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍，取2ul作為第二輪反應(yīng)模板，PCR反應(yīng)體系與第一輪相同，PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性^iin ；94°C變性lmin，60°C退火30s，72°C延伸lmin，共 35個循環(huán)；72°C延伸IOmin。將所設(shè)計的特異性引物PtF / PtR放回GeneBank中的I^rimer-Blast比對，只有彩色豆馬勃的兩個基因登陸序列AF374717、AF374710能產(chǎn)生347bp的片段，說明了該對引物在目前GeneBank中的特異性。此外，采用該對引物對供試10株彩色豆馬勃，4種松林中常見EMF黃色須腹菌、紫金蠟?zāi)ⅰ⒘游度楣?、紅菇，以及2種松林中常見真菌裂褶菌、小馬勃進行巢式PCR，結(jié)果如圖1所示，所有彩色豆馬勃菌株擴增結(jié)果都為陽性，獲得大小為347bp 的擴增產(chǎn)物，其他EMF和非EMF擴增結(jié)果為陰性。采用真菌ITS通用引物對所有供試真菌 DNA進行PCR，都獲得了 SOObp左右大小的產(chǎn)物。結(jié)果表明該對巢式PCR引物只能對彩色豆馬勃進行特異性擴增，其他真菌DNA不能獲得相應(yīng)擴增產(chǎn)物。為了進一步確認 PCR 產(chǎn)物的特異性，用 TaKaRa DNA Fragment Purification Kit (購自大連寶生物公司)將巢式PCR電泳產(chǎn)物進行切膠回收，連接PMD19-T載體，轉(zhuǎn)化JM109， 挑選陽性克隆經(jīng)插入片段驗證后送上海美吉公司測序，測序后與目的序列比對來確認擴增產(chǎn)物的正確性。巢式PCR產(chǎn)物凝膠回收測序結(jié)果表明，347bp大小的擴增產(chǎn)物與Pt2 ITS區(qū)中的一段序列完全匹配。結(jié)果表明，引物PtF / PtR能特異性地擴增出EMF彩色豆馬勃ITS 區(qū)347bp的片段，而對其他真菌沒有擴增產(chǎn)物。347bp大小的擴增產(chǎn)物的序列如說明書序列表中的NO. 6所示。實施例4彩色豆馬勃巢式PCR檢測的靈敏度分析為了評估巢式PCR的靈敏度，將彩色豆馬勃DNA稀釋為10個梯度，20ul PCR反應(yīng)體系中分別含 DNA 模板 IOOng, IOng, lng, IOOpg, IOpg, lpg、lOOfg、10fg、lfg、IOOag,分別用特異性引物進行常規(guī)PCR和巢式PCR，常規(guī)PCR以特異性引物PtF / PtR為引物，Pt2 DNA為模板，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同實施例3中巢式PCR第二輪反應(yīng)，巢式PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同實施例3。結(jié)果顯示常規(guī)PCR只能檢測到IOpg的DNA，如圖2所示，常規(guī)PCR只能檢測到 IOpg的DNA，如圖3所示，巢式PCR最低能檢測到IOfg的DNA，巢式PCR檢測靈敏度是常規(guī) PCR 的 1000 倍。實施例5
為了評價本試驗所開發(fā)的EMF彩色豆馬勃巢式PCR檢測在實際應(yīng)用中的效果，首先以培育的施用Pt2的組培苗進行巢式PCR檢測，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同實施例3。結(jié)果如圖 4所示，菌根化的濕地松和赤松根都能獲得陽性擴增結(jié)果，而未施用Pt2的組培苗根及松針和陰性對照都沒有擴增產(chǎn)物。實施例6巢式PCR檢測盆栽松苗菌根中彩色豆馬勃
為了進一步研究本試驗所設(shè)計特異性引物的檢測效果，對施用Pt2的四年生菌根化盆栽馬尾松實生苗進行巢式PCR檢測，巢式PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同實施例3。結(jié)果如圖5 所示，施用Pt2的馬尾松菌根檢測結(jié)果為陽性，未施用Pt2的馬尾松根、松針以及陰性對照都沒有擴增產(chǎn)物。
權(quán)利要求
1.一種林木外生菌根真菌彩色豆馬勃的分子檢測方法，其特征在于以待測樣品DNA為模板，以通用引物ITS1-F/ITS4-B、弓丨物PtF和引物PtR為特異性引物，分別進行巢式PCR的第一、二輪反應(yīng)，產(chǎn)物進行電泳檢測，即可快速檢測松樹外生菌根中的彩色豆馬勃；所述的引物PtF序列為5' -GGGACCTGTGCGTTTCGT-3'；引物PtR序列為 5，-CATGCCCACCCGCTAATG-3，。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的林木外生菌根真菌彩色豆馬勃的分子檢測方法，其特征在于，具體步驟如下(1)采用CTAB法提取待測樣品的DNA，在進行組培苗和實生苗菌根DNA提取時，當(dāng)DNA 溶于IOOul TE溶液后，再次加入200ul CTAB重復(fù)提取一次；(2)巢式PCR反應(yīng)，巢式PCR第一輪PCR反應(yīng)的引物為通用引物ITS1-F/ITS4-B，反應(yīng)體系 20ul 10XPCR buffer (Mg2+ Free)2ul ；MgCl2 (25mM)l. 3ul ；dNTP Mixture (各 2. 5mM) 1.6ul ；引物各Iul ；rTaq酶(5U/ul)0. Iul ；模板DNA 2ul ；加無菌去離子水至20ul ；PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min ；94°C變性lmin，57. 8°C退火30s，72°C延伸lmin，共35個循環(huán)；72°C延伸IOmin ；巢式PCR第二輪反應(yīng)以特異性引物PtF/PtR為引物，巢式PCR第一輪 PCR產(chǎn)物稀釋50倍，取2ul作為第二輪反應(yīng)模板，PCR反應(yīng)體系與第一輪相同，PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性4min ；94°C變性lmin，60°C退火30s，72°C延伸lmin，共35個循環(huán)；72°C 延伸IOmin ；(3 )取巢式PCR產(chǎn)物進行瓊脂凝膠電泳檢測，電泳圖中出現(xiàn)347bp條帶即為檢測出彩色豆馬勃。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的林木外生菌根真菌彩色豆馬勃的分子檢測方法，其特征在于步驟(1)中，采用CTAB法提取待測樣品的DNA時，在進行組培苗和實生苗菌根DNA提取時，當(dāng)DNA溶于IOOul TE溶液后，再次加入200ul CTAB重復(fù)提取一次。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測外生菌根真菌(Ectomycorrhizalfungi,EMF)彩色豆馬勃(Pisolithustinctorius)的分子檢測方法及其應(yīng)用，所述的引物包括引物PtF和引物PtR，引物PtF序列為5′-GGGACCTGTGCGTTTCGT-3′；引物PtR序列為5′-CATGCCCACCCGCTAATG-3′；所述應(yīng)用為特異性引物在快速檢測林木外生菌根真菌彩色豆馬勃中的應(yīng)用。引物PtF和引物PtR具有很強的特異性，巢式PCR檢測靈敏度能夠達到常規(guī)PCR的1000倍。本發(fā)明以待測樣品DNA為模板，以引物PtF和引物PtR為特異性引物，進行巢式PCR反應(yīng)，產(chǎn)物進行電泳檢測后即可快速檢測外生菌根真菌彩色豆馬勃。該方法為林木EMF彩色豆馬勃的檢測提供了一種準(zhǔn)確、快速的途徑。
文檔編號C12Q1/68GK102181544SQ20111008876
公開日2011年9月14日 申請日期2011年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月11日
發(fā)明者葉建仁, 吳小芹, 周愛東 申請人:南京林業(yè)大學(xué)