專利名稱：用基因工程菌合成6－甲基嘌呤－2′－脫氧核苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以DNA重組技術(shù)構(gòu)建基因工程菌，并利用該基因工程菌合成6-甲基嘌呤-2′-脫氧核苷(6-Methylpurine-2′-Deoxyriboside，MePdR)的方法。
背景技術(shù)：
MePdR是大腸桿菌PNP/6-甲基嘌呤-2′-脫氧核苷(ePNP/MePdR)抗腫瘤治療系統(tǒng)的前體藥物，MePdR本身無毒，可被大腸桿菌的嘌呤核苷磷酸化酶(EC 2.4.2.1，purinenucleoside phosphorylase，PNP)分解成6-甲基嘌呤(6-Methylpurine，MeP)，MeP會抑制RNA和蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致細(xì)胞死亡；哺乳動物來源的PNPase則不能分解MePdR。向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)入E.coli PNP基因使之表達(dá)E.coli PNP，當(dāng)藥物前體MePdR存在時，E.coli PNP會把它分解成有毒的MeP從而高效殺傷腫瘤細(xì)胞。
ePNP/MePdR抗腫瘤治療系統(tǒng)相對其它自殺基因/前體藥物抗腫瘤治療系統(tǒng)而言具有以下優(yōu)點(diǎn)1.高效的旁觀者效應(yīng)。人細(xì)胞膜上含有核苷和堿基載體，這使MePdR經(jīng)E.coliPNP轉(zhuǎn)化生成的MeP的雙向跨膜擴(kuò)散十分容易，因此，在細(xì)胞內(nèi)部形成的MeP會順濃度梯度跨膜擴(kuò)散直到達(dá)平衡為止，對于MeP的跨膜運(yùn)輸而言，細(xì)胞間的間隙連接或者細(xì)胞-細(xì)胞接觸并非必須。而HSV-TK/甘昔洛韋和CD/5-氟尿苷自殺基因系統(tǒng)產(chǎn)生的甘昔洛韋磷酸鹽和5-氟尿嘧啶則不能透過脂質(zhì)膜，其旁觀者效應(yīng)的發(fā)揮必須依賴細(xì)胞連接。體外實驗中已經(jīng)證實，只需要0.1％-1％的培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)E.coli PNP基因，在藥物前體存在的情況下，全部培養(yǎng)細(xì)胞都可以被殺死。2.新的細(xì)胞殺傷機(jī)制。HSV-TK/甘昔洛韋和CD/5-氟尿苷自殺基因系統(tǒng)只是抑制DNA合成，而MeP是細(xì)胞毒性的ATP類似物，可以摻入到細(xì)胞RNA中，抑制RNA和/或蛋白質(zhì)的合成。3.靶向非增殖細(xì)胞。無論細(xì)胞是否處于增殖期，RNA和蛋白質(zhì)的合成對細(xì)胞代謝都很重要，由于MeP獨(dú)特的細(xì)胞殺傷機(jī)制以及高水平的旁觀者效應(yīng)，使得PNP/MePdR治療系統(tǒng)可以殺滅分裂期和靜止期的腫瘤細(xì)胞，在實體瘤治療中，由于瘤體中只有很少一部分細(xì)胞處于分裂期，這種對抗非增殖細(xì)胞的活性就顯得格外重要。4.長時藥效。向小鼠腹腔內(nèi)注射一次藥物前體MePdR(134mg/kg)，可以使轉(zhuǎn)染了E.coliPNP的D54(人神經(jīng)膠質(zhì)瘤)腫瘤持續(xù)消退超過70天。5.藥效高。與傳統(tǒng)自殺基因治療系統(tǒng)產(chǎn)生的毒素5-氟尿嘧啶相比，MeP的療效高出10倍。6.藥物起效快。藥物前體MePdR在很短的治療期內(nèi)就表現(xiàn)出對抗表達(dá)E.coli PNP的細(xì)胞的效果。甚至，體內(nèi)抗腫瘤實驗已經(jīng)證實，僅一劑MePdR就有突出的療效。7.對大型腫瘤有效。體內(nèi)實驗中，證實MePdR對表達(dá)E.coli PNP的大型腫瘤(700mg以上)也有效，從而通過了這一嚴(yán)峻的考驗。
E.coli PNP/MePdR這一腫瘤治療方案，因其高效的旁觀者效應(yīng)、新的細(xì)胞殺傷機(jī)制、靶向非增殖細(xì)胞等特性，在實體瘤治療上具有極大的應(yīng)用前景。目前國際上對ePNP/MePdR抗腫瘤治療系統(tǒng)的研究方興未艾，國內(nèi)也部分研究機(jī)構(gòu)正開展此方面的研究，如復(fù)旦大學(xué)遺傳學(xué)研究所，同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南京鐵道醫(yī)學(xué)院等，鑒于此，急需一種高效廉價合成MePdR的方法。
MePdR主要通過化學(xué)法和酶法來制備。
化學(xué)法1996年，Janet E等報道了一種通過化學(xué)方法由MeP合成MePdR的方法，經(jīng)兩步反應(yīng)后產(chǎn)率為13％，此法的缺點(diǎn)是合成過程中產(chǎn)生大量異構(gòu)體，難以分離，且化學(xué)催化劑對人員和環(huán)境毒害大，所以至今仍不能形成規(guī)?；a(chǎn)，滿足科研和臨床需要。
酶法2007年，本實驗室高彤等(付印中)以過表達(dá)外源PNP基因工程菌為酶源，以15mmol/L MeP和60mmol/L 2′-脫氧尿苷(2′-Deoxyurdine，dU)為底物成功合成了MePdR，使用2％菌體55℃反應(yīng)2h，轉(zhuǎn)化率達(dá)到83.78％。
嘧啶核苷磷酸化酶包括尿嘧啶核苷磷酸化酶(EC2.4.2.3，uridine phosphorylase UP)和胸腺嘧啶核苷磷酸化酶(EC 2.4.2.4，Thymidine phosphorylase，TP)。此兩者都能可逆地催化嘧啶(脫氧)核苷與磷酸離子生成游離的嘧啶堿基和(脫氧)核糖-1-磷酸。聯(lián)合利用嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶共同催化轉(zhuǎn)核苷反應(yīng)，前者催化嘧啶脫氧核苷轉(zhuǎn)化為嘧啶堿基和脫氧核糖-1-磷酸，后者催化脫氧核糖-1-磷酸與MeP反應(yīng)生成MePdR。單獨(dú)使用二者之一催化的轉(zhuǎn)核苷反應(yīng)，生成的堿基會競爭性抑制堿基受體與酶的結(jié)合而使得反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率不高，而使用雙酶共同催化轉(zhuǎn)核苷反應(yīng)，生成的嘧啶堿基不會對PNP產(chǎn)生抑制作用而使得反應(yīng)更有利于向嘌呤核苷合成的方向進(jìn)行。聯(lián)合利用兩種酶的作用，理論上可以高效的由一種嘧啶(脫氧)核糖與嘌呤堿基作用生成嘌呤(脫氧)核糖與嘧啶堿基。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡單，高效，周期短，低成本，符合環(huán)保要求的合成MePdR的方法。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下(A)利用重組DNA技術(shù)，構(gòu)建嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)，得到高效表達(dá)嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的基因工程菌。
用于本發(fā)明中的嘧啶核苷磷酸化酶可以是尿嘧啶核苷磷酸化酶也可以是胸腺嘧啶核苷磷酸化酶。
嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的來源不做限制，只要能可逆的催化相應(yīng)的核苷在磷酸緩沖液中生成相應(yīng)堿基與脫氧核糖一磷酸即可，例如大腸桿菌(Escherichiacoli)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)等，在特別推薦的方案中，本發(fā)明使用得自大腸桿菌中的嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶。
構(gòu)建重組質(zhì)粒的載體也不做限制，只要能高效表達(dá)外源的嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶即可，在特別推薦的方案中，本發(fā)明使用溫度誘導(dǎo)型的表達(dá)載體pBV220，此載體不需使用化學(xué)誘導(dǎo)劑，只須提高溫度到42℃誘導(dǎo)4h即可誘導(dǎo)外源蛋白的大量表達(dá)，相對于通常所用的由化學(xué)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)的表達(dá)質(zhì)粒(如攜帶由IPTG誘導(dǎo)的lac啟動子的質(zhì)粒)而言，可以節(jié)約大量成本。
培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基不受特別限制，為可以獲得含有一般碳源，氮源，無機(jī)離子和可選的有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)的普通培養(yǎng)基，在特別推薦的方案中，本發(fā)明使用的是LB培養(yǎng)基，配方如下蛋白胨10g、酵母抽提物5g和NaCl10g，使用10mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH為7.2，定容至1L。固體培養(yǎng)基只需在液體培養(yǎng)基內(nèi)加入2％瓊脂即可。
培養(yǎng)微生物的條件也不特別限制，例如可以在需氧條件下培養(yǎng)12-48小時，同時將pH和溫度適當(dāng)?shù)目刂圃趐H5-8和25-40℃的范圍。對于需要誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白質(zhì)的微生物的培養(yǎng)，可以在上述的培養(yǎng)之后再根據(jù)相應(yīng)表達(dá)載體選擇相應(yīng)的誘導(dǎo)表達(dá)條件，例如使用pBV220表達(dá)載體時，可在30℃培養(yǎng)16小時后，將溫度提高到42℃的方法誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白質(zhì)。
(B)以嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶催化嘧啶脫氧核苷和6-甲基嘌呤合成6-甲基嘌呤2′-脫氧核苷。
使用的嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶的來源不做限制，只要能催化嘧啶脫氧核苷和6-甲基嘌呤合成6-甲基嘌呤2′-脫氧核苷即可。比如可以是經(jīng)過初步抽提的粗酶，也可以是源自細(xì)菌的非增殖的完整細(xì)胞作為酶源。在特別推薦的方案中，本發(fā)明使用表達(dá)外源嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶的基因工程菌作為酶源。
用于本發(fā)明中的嘧啶脫氧核苷不做限制，只要能被嘧啶核苷磷酸化酶催化由相應(yīng)的核苷生成相應(yīng)堿基與核糖一磷酸即可，比如可以是尿嘧啶脫氧核苷(2’-Deoxyuridine，dU)、胸腺嘧啶脫氧核苷(thymidine，dT)，也可以包括其他非天然型的嘧啶脫氧核苷。在特別推薦的方案中，考慮到目前國內(nèi)生產(chǎn)dT的技術(shù)比較成熟，已形成規(guī)?；a(chǎn)，成本相對較低，實施例中使用dT作為提供脫氧核糖一磷酸的底物。
反應(yīng)的緩沖液為終濃度為10-100mM的磷酸鹽溶液，其溶液配制的pH值為6.0-8.0之間。
反應(yīng)的溫度為40-70℃。
反應(yīng)底物濃度為10-400mM，嘧啶脫氧核苷與6-甲基嘌呤物質(zhì)的量之比為1∶1～3∶1。
反應(yīng)可以在靜止的條件下進(jìn)行，也可以在適當(dāng)?shù)膿u速下進(jìn)行。
反應(yīng)時間在1-10小時之間。
(C)6-甲基嘌呤2′-脫氧核苷的分離與純化。
反應(yīng)完成后，可以使用合成樹脂吸附的方法，使用沉淀劑沉淀的方法或者使用其他常規(guī)收集和分離方法，從混合物中收集和分離由此生成的MePdR。
利用本發(fā)明的方法催化合成MePdR，具有簡單，高效，周期短，低成本，符合環(huán)保要求等特點(diǎn)，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的特點(diǎn)是1.應(yīng)用兩種酶共同催化轉(zhuǎn)脫氧核苷反應(yīng)，從而高效合成MePdR。
2.選用溫度誘導(dǎo)型的表達(dá)載體表達(dá)外源蛋白，節(jié)約大量成本。
3.直接以基因工程菌菌體催化轉(zhuǎn)核苷反應(yīng)，無需破細(xì)胞提純酶。


圖1不同基因工程菌催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率隨時間變化曲線。
圖2MePdR核磁共振圖譜。
具體實施例方式
一.基因工程菌的構(gòu)建。
根據(jù)GeneBank中提供的E.coli的PNP及TP基因序列設(shè)計引物如下PNP5′引物5’-catgccatggctaccccacacattaa-3’(NcoI)3′引物5’-atgtcgacttactctttatcgcccagcag-3(SalI)TP5′引物5’-ttttgtcgaccatgtttctcgcacaa-3’(SaI)3′引物5’-aaaactgcagttattcgctgatacgg-3’(PstI)以E.coli DH5α的染色體DNA為模板做PCR95℃ 5min，30×(95℃ 40s，62℃ 40s，72℃ 1min)，72℃ 10min。PCR產(chǎn)物和pBV220載體經(jīng)限制性酶切并用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。用pBV220載體通用引物PCR及限制性酶切鑒定轉(zhuǎn)化子得到基因工程菌pBV220-PNP和pBV220-TP。DNA測序發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒中外源基因序列與GeneBank中發(fā)表的相應(yīng)序列完全相同。
二.酶源的制備。
重組菌活化后接種于含100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)到OD6000.6時立即升溫至42℃培養(yǎng)4h，離心后的菌體用10mmol/L pH7.0磷酸鹽緩沖液洗滌，再離心得濕菌體。
三.酶催化合成MePdR。
反應(yīng)體系如下緩沖液40mmol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液底物100mmol/L MeP和300mmol/L dT菌體量1‰(濕重)于55℃水浴搖床上反應(yīng)，搖速150r/min，反應(yīng)結(jié)束后100℃煮沸5min，12000r/min離心5min得上清液HPLC定量。
HPLC各參數(shù)如下HP C-18柱，250mm×4mm，孔徑5μm，流動相為7％乙腈+93％50mmol/L(NH4)H2PO4，流速1mL/min，進(jìn)樣量10μL，溫度25℃，檢測波長254nm，MePdR的保留時間為9.2min。采用外標(biāo)法，即根據(jù)不同濃度的MePdR的峰面積所做的標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量。根據(jù)以下公式計算轉(zhuǎn)化率。
分別以單獨(dú)的pBV220-PNP和pBV220-TP以及同時用兩種菌株細(xì)胞(pBV220-PNP和pBV220-TP菌量分別為0.5‰)催化反應(yīng)，隨著時間的推移，測定產(chǎn)生的MePdR的量，結(jié)果示于圖1中。
在圖1中，縱坐標(biāo)表示MePdR的濃度(克/升)，而橫坐標(biāo)表示反應(yīng)時間(分鐘)，對于相應(yīng)的菌株細(xì)胞測定的反應(yīng)進(jìn)程，pBV220-PNP用實心圓表示，pBV220-TP用實心方塊表示，而pBV220-PNP和pBV220-TP混合菌株用實心三角形表示。
在用不同的基因工程菌株催化的由MeP合成MePdR的反應(yīng)中，單獨(dú)使用過表達(dá)PNP的基因工程菌株pBV220-PNP和單獨(dú)使用過表達(dá)TP的基因工程菌株pBV220-TP都不能高效的合成MePdR，而混合使用pBV220-PNP和pBV220-TP菌株共同催化反應(yīng)，可以高效的合成MePdR，反應(yīng)1小時即達(dá)到平衡，MePdR濃度達(dá)到23.75g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到95％。
四.MePdR的分離純化。
反應(yīng)混合液離心得上清，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至1/10體積，使用硅膠柱層析分離MePdR。
柱層析方法如下硅膠GF254干法填柱，邊填柱邊敲管壁以保證硅膠填充緊密。硅膠填充至有效柱長度25cm(直徑2.5cm)為止。將1ml濃縮后的樣品與約0.5g的硅膠混勻，電吹風(fēng)吹干，得到固體狀物質(zhì)，小心研細(xì)后填加到柱頂部，壓緊，在其上小心放置一個濾紙片，以氯仿/乙酸乙酯/異丙醇/氨水混合溶劑洗脫，收集含有MePdR的流出液后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮結(jié)晶，重結(jié)晶純化。
結(jié)晶后的產(chǎn)品以HPLC鑒定其純度，達(dá)到99.3％。核磁共振(共振頻率500MHz，溶劑為氘代甲醇)確定所得產(chǎn)物即為MePdR，結(jié)果示于圖2中1H NMR(500MHz，CD3OD)δ＝2.486(ddd，J＝3.36，6.21，13.52Hz，1H，H-2′/2″)；2.814(s，3H，CH3)；2.856(m，1H，H-2′/2″)；3.765(ABX，J＝3.88，12.12Hz，1H，H-5′/5″)；3.831(ABX，J＝3.40，12.13Hz，1H，H-5′/5″)；4.063(dd，J＝3.42，6.74Hz，1H，H-4′)；4.611(td，J＝3.19，6.15Hz，1H，H-3′)；6.556(t，J＝6.78Hz，1H，H-1′)；8.705(s，1H，H-2)；8.772(s，1H，H-8)。δ＝3.310和δ＝4.871分別是溶劑和水的峰。
權(quán)利要求
1.一種用基因工程菌合成6-甲基嘌呤2′-脫氧核苷的方法，其特征在于包括如下步驟(A)利用重組DNA技術(shù)，構(gòu)建嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到高效表達(dá)嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的基因工程菌；(B)以嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶催化嘧啶脫氧核苷和6-甲基嘌呤合成6-甲基嘌呤2′-脫氧核苷；(C)6-甲基嘌呤2′-脫氧核苷的分離與純化。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的嘧啶核苷磷酸化酶為尿嘧啶核苷磷酸化酶或胸腺嘧啶核苷磷酸化酶。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(B)的反應(yīng)溫度為40-70℃，緩沖液為終濃度為10-100mM的磷酸鹽溶液，其溶液配制的pH值為6.0-8.0，反應(yīng)底物濃度為10-400mM，嘧啶脫氧核苷與6-甲基嘌呤物質(zhì)的量之比為1∶1～3∶1，反應(yīng)時間為1-10小時。
4如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(C)中的分離純化方法為合成樹脂吸附法或沉淀劑沉淀法。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種以DNA重組技術(shù)構(gòu)建基因工程菌，并利用該基因工程菌合成6－甲基嘌呤－2′－脫氧核苷(6－Methylpurine－2′－Deoxyriboside，MePdR)的方法。包括如下步驟(A)利用重組DNA技術(shù)，構(gòu)建嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到高效表達(dá)嘌呤核苷磷酸化酶和胸腺嘧啶核苷磷酸化酶的基因工程菌。(B)以嘧啶核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶催化嘧啶脫氧核苷和6－甲基嘌呤合成6－甲基嘌呤2′－脫氧核苷。(C)6－甲基嘌呤2′－脫氧核苷的分離與純化。利用本發(fā)明的方法催化合成MePdR，具有簡單，高效，周期短，低成本，符合環(huán)保要求等特點(diǎn)，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12N15/31GK101067145SQ20071003863
公開日2007年11月7日 申請日期2007年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月29日
發(fā)明者梁勝華 申請人:復(fù)旦大學(xué)