專利名稱：：植物葉片各級脈和分蘗基部特異表達啟動子及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程和植物學(xué)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一類組織特異表達啟動子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：作為單子葉植物研究的模式植物，水稻是一種重要的經(jīng)濟作物，其提供了世界上、特別是亞太地區(qū)大部分人口的食品和營養(yǎng)來源。在中國，水稻種植面積約占全國糧食作物面積的30%，產(chǎn)量接近糧食總產(chǎn)量的一半。同時，水稻具有生長周期較短，轉(zhuǎn)化體系成熟，占地面積小等優(yōu)勢。認(rèn)識水稻生長發(fā)育的分子基礎(chǔ)，研究水稻基因的表達調(diào)控機制以提高水稻單產(chǎn)，改良其種植結(jié)構(gòu)，是科學(xué)工作者長期以來研究的目標(biāo)。水稻生長過程中有著單子葉植物特有的組織器官發(fā)育過程例如平行葉脈的發(fā)育過程，分蘗過程以及不定根的發(fā)生等等。通過對這些生長過程的研究，以及相關(guān)聯(lián)的科學(xué)問題，既可以了解單子葉植物特有的生長過程，又可直接應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。對基因在植物中表達模式的研究是探究基因功能的重要內(nèi)容和提示。通過特定基因的啟動子區(qū)與報告基因的融合，可以追蹤到基因在植物體內(nèi)的時間和空間的表達模式?；虻谋磉_模式往往暗示所具有的生理功能，是基因研究的重要組成部分。例如，Oshoxl是水稻中一個Horaebox家族的轉(zhuǎn)錄因子，它在葉原形成層中表達，調(diào)控原形成層的命運，而通過增加生長素的運輸特性可以促進原形成層細胞分化的命運(ScarpellaE.等，Development2002，127:3655-3669)。在船Z^基因在花中的特異表達等在揭示基因本身的功能的同時也能作為標(biāo)記性指示對特異組織生長發(fā)育做深入界定和分析(ParenicovaL.等，PlantCell.2003，15:1538-1551)。在種子發(fā)育過程中胚和胚乳特異啟動子，也往往參與了種子發(fā)育過程。從應(yīng)用角度而言，一些特異性基因可作為標(biāo)記基因，應(yīng)用于特定生長過程的研究和特定組織或細胞類型的改造。在水稻中，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了若干的標(biāo)記基因，例如OsMZP在葉原基的特異性表達，可以用來標(biāo)記前特化中的形成層細胞(ScarpellaE.等，Development2002，127:3655-3669)。基因可標(biāo)記胚乳的盾片外層。水稻中的&5r/7基因，可標(biāo)記根部的第二皮層細胞。利用/0C7用于標(biāo)記胚表皮層(Ll)，6s/W^4示記胚發(fā)育的維管層(L3)。植物基因工程研究中需要使外源目的基因能在特定的組織中高效表達，分離植物中一些具有組織專一性、不同表達水平的啟動子和有關(guān)的調(diào)控元件在基因工程研究中有廣泛的用途。葉脈和分蘗部作為植物重要組成部分，在植物生長、發(fā)育或營養(yǎng)吸收等過程中起著無可替代的作用，因此分離植物葉脈和分蘗部特異表達的啟動子對植物品質(zhì)的改良有著重要的作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一類植物葉脈(葉不同級脈)或分蘗基部特異表達啟動子。本發(fā)明的另一目的在于提供所述啟動子的應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供一種在植物葉脈或分蘗基部特異表達的啟動子，所述的啟動子選自下組(1)具有SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、或SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的啟動子；(2)核苷酸序列在嚴(yán)格條件下能夠與(1)限定的多核苷酸序列雜交且具有指導(dǎo)目的基因在植物葉脈或分蘗基部特異表達功能的啟動子；(3)核苷酸序列與SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、或SEQIDNO:3有95%以上同源性且具有指導(dǎo)目的基因在植物葉脈或分蘗基部特異表達功能的啟動子；或(4)核苷酸序列與SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、或SEQIDNO:3所示的核苷酸序列完全互補的啟動子。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的目的基因是結(jié)構(gòu)基因。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的目的基因可編碼具有特定功能的蛋白。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的目的基因是外源基因。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的目的基因包括(但不限于)生長素合成和降解相關(guān)基因，生長素轉(zhuǎn)運基因，細胞分裂分化相關(guān)基因，營養(yǎng)運輸相關(guān)基因等。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的目的基因位于所述植物葉脈(不同級葉脈)或分蘗基部特異表達啟動子的下游，且與所述啟動子區(qū)直接鄰近的編碼基因的序列。通常，所述啟動子與目的基因的間隔小于1000bp(優(yōu)選的，小于500bp;更優(yōu)選的，小于100bp;最優(yōu)選的，小于50bp)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的植物是單子葉植物。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的植物包括(但不限于)禾本科植物、石蒜科植物、百合科植物、鳶尾科植物、或薯蕷科植物等。更優(yōu)選的，所述的植物是禾本科植物。例如所述植物包括但不限于水稻、小麥、大麥、玉米、高粱等。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的多核苷酸(或其具有相同功能的變異體)能夠指導(dǎo)目的基因在植物分蘗基部特異表達;或具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的多核苷酸(或其具有相同功能的變異體)能夠指導(dǎo)目的基因在植物葉脈特異表達。更優(yōu)選的，具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列的多核苷酸(或其具有相同功能的變異體)能夠指導(dǎo)目的基因在植物葉脈的二級脈中表達；或具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的多核苷酸(或其具有相同功能的變異體)能夠指導(dǎo)目的基因在植物葉脈的中脈和一級脈中表達。在本發(fā)明的第二方面，提供一種載體，所述的載體含有所述的植物葉脈(葉不同級脈)或分蘗基部特異表達啟動子，作為啟動子元件。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的載體還含有與所述的植物葉脈或分蘗基部特異表達啟動子可操作地連接的目的基因。在本發(fā)明的第三方面，提供一種遺傳工程化的宿主細胞，所述的細胞含有所述的載體；或其基因組中整合有外源的所述的植物葉脈或分蘗基部特異表達啟動子。在本發(fā)明的第四方面，提供一種使目的基因在植物葉脈或分蘗基部特異表達的方法，所述的方法包括將構(gòu)建物轉(zhuǎn)化植物細胞，所述的構(gòu)建物含有所述的植物葉脈或分蘗基部特異表達啟動子以及與所述的啟動子可操作地連接的目的基因；篩選出轉(zhuǎn)入了所述構(gòu)建物或染色體中整合有所述構(gòu)建物的植物細胞；和將所述植物細胞再生成植株。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的方法包括(a)提供攜帶表達載體的農(nóng)桿菌，所述表達載體中含有構(gòu)建物，所述的構(gòu)建物含有所述的植物葉脈或分蘗基部特異表達啟動子以及與所述的啟動子可操作地連接的目的基因；(b)將植物細胞、組織或器官與步驟(a)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使所述的構(gòu)建物轉(zhuǎn)入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；(c)選擇出轉(zhuǎn)入了所述構(gòu)建物的植物細胞、組織或器官；以及(d)將步驟(c)中的植物細胞、組織或器官再生成植物。在本發(fā)明的第五方面，提供所述的啟動子的用途，用于指導(dǎo)目的基因在植物的葉脈或分蘗基部特異表達。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。圖1顯示了攜帶C^尸/W2-GUS融合基因的轉(zhuǎn)基因植物的分蘗組織，可見特異表達的啟動子GUS染色(藍色)，圖中以箭頭表示發(fā)生染色的部分區(qū)域。圖2顯示了攜帶0^>/7V4-GUS融合基因的轉(zhuǎn)基因植物的中脈和一級脈組織，可見特異表達的啟動子GUS染色(藍色)，圖中以箭頭表示發(fā)生染色的部分區(qū)域。圖3A顯示了攜帶Os尸/iV3-GUS融合基因的轉(zhuǎn)基因植物的二級脈組織，可見特異表達的啟動子GUS染色(藍色)，圖中以箭頭表示發(fā)生染色的部分區(qū)域。圖3B顯示了攜帶OsP/iV3-GUS融合基因的轉(zhuǎn)基因植物染色后的切片觀察。圖中以箭頭表示染色的二級脈維管組織。圖4顯示了&尸/#啟動子表達載體的構(gòu)建方法，通過將pBI101上的多克隆位點以及GUS基因用EcoRI和HindIII酶切引入pCAMBIA1300中構(gòu)建而成。具體實施方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次發(fā)現(xiàn)一類能夠指導(dǎo)目的基因在植物的葉不同級脈或分蘗基部特異性表達的啟動子。更特別的，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，OsPIN2啟動子能夠指導(dǎo)目的基因在植物分蘗基部表達；OsPIN3啟動子或OsPIN4啟動子能夠指導(dǎo)目的基因在植物葉脈中表達(更優(yōu)選的，OsPIN3啟動子能夠指導(dǎo)目的基因在植物的二級脈中表達；OsPIN4啟動子能夠指導(dǎo)目的基因在植物的中脈和一級脈中表達)。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。如本文所用，所述的"植物"主要是指單子葉植物，包括(但不限于)禾本科植物、石蒜科植物、百合科植物、鳶尾科植物、或薯蕷科植物等。更優(yōu)選的，所述的植物是禾本科植物，包括但不限于水稻、小麥、大麥、玉米、高粱等。如本文所用，所述的"可操作地連接"是指兩個或多個核酸區(qū)域或核酸序列的功能性的空間排列。例如啟動子區(qū)被置于相對于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動子區(qū)域的引導(dǎo)，從而，啟動子區(qū)域被"可操作地連接"到該核酸序列上。如本文所用，所述的"啟動子"或"啟動子區(qū)(域)"是指一種核酸序列，其通常存在于目的基因編碼序列的上游(5'端)，能夠引導(dǎo)核酸序列轉(zhuǎn)錄為mRNA。一般地，啟動子或啟動子區(qū)提供RNA聚合酶和正確起始轉(zhuǎn)錄所必需的其它因子的識別位點。在本文中，所述的啟動子或啟動子區(qū)包括啟動子的變體，其通過插入或刪除調(diào)控區(qū)域，進行隨機或定點突變啟動子等來獲得。如本文所用，"組織特異性啟動子"又稱"器官特異性啟動子"，在這類啟動子調(diào)控下，基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達，并表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。本發(fā)明中，所述的"組織特異性啟動子"是植物葉脈(葉不同級脈)或分蘗基部特異表達啟動子。通常，如果在某組織或器官中mRNA以比在其它組織或器官中高至少10倍，優(yōu)選至少高100倍，更優(yōu)選至少高1000倍水平被表達，則該啟動子被認(rèn)為是組織或器官特異性的。植物特異性啟動子及其指導(dǎo)的基因表達本發(fā)明提供一種植物葉脈(葉不同級脈)或分蘗基部特異表達啟動子，所述的啟動子具有SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、或SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的多核苷酸，各啟動子的命名和來源如下具有SEQIDNO:1所示核苷酸序列的啟動子0sPIN2啟動子，來自于。s尸/T^基因(LOC一Os01g45550)的ATG上游；具有SEQIDNO:2所示核苷酸序列的啟動子OsPIN3啟動子，來自于6^P/A^基因(LOCJ)s01g51780)的ATG上游;具有SEQIDNO:3所示核苷酸序列的啟動子OsPIN4啟動子，來自于^尸/tW基因(LOC—Os01g69070)的ATG上游。此外，本發(fā)明還包括上述啟動子的一些具有相同功能的變異體。包括核苷酸序列在嚴(yán)格條件下能夠與SEQIDNO:1、SEQIDN0:2、或SEQIDN0:3所示的多核苷酸序列雜交且具有指導(dǎo)目的基因在植物葉不同級脈或分蘗基部特異表達功能的啟動子；或核苷酸序列與SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、或SEQIDNO:3有95%以上同源性且具有指導(dǎo)目的基因在植物葉不同級脈或分蘗基部特異表達功能的啟動子；或核苷酸序列與SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、或SEQIDNO:3所示的核苷酸序列完全互補的啟動子。多核苷酸的雜交是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，特定的一對核酸的雜交特性指示它們的相似性或同一性。因此，本發(fā)明還涉及與SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、或SEQIDNO:3所示的核苷酸序列雜交且兩個序列之間具有至少50%，較佳地至少70%，更佳地至少80%(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%)相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，"嚴(yán)格條件"是指(l)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2XSSC，0.1%SDS，60°C;或(2)雜交時加有變性劑，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.l%Ficoll,42。C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90%以上，更好是95%以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸也具有指導(dǎo)目的基因在植物葉不同級脈或分蘗基部特異表達的功能。在本發(fā)明的實例中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在所述的啟動子的指導(dǎo)下，可以使P-葡萄糖苷酶(GUS)基因特異地在水稻的分蘗基部或葉脈中表達。因此可見，本發(fā)明的啟動子是一種組織或器官特異性的啟動子。所述的啟動子對于定點地改良植物的品質(zhì)是特別有用的。(3-葡萄糖苷酶(GUS)能催化裂解一系列的/3-葡萄糖苷，產(chǎn)生具有發(fā)色團或熒光的物質(zhì)，可用分光光度計、熒光計或組織化學(xué)等方法對GUS活性進行定量和空間定位分析。在本
技術(shù)領(lǐng)域：
中，GUS基因已被廣泛地用作轉(zhuǎn)基因植物、細菌和真菌的報告基因，特別是其可被用于研究外源基因表達的具體細胞和組織部位。本發(fā)明的啟動子是組織或器官特異性的，更特別的，對于Os尸/V2啟動子而言，其是植物分蘗基部特異性的，其可指導(dǎo)目的基因在植物分蘗基部特異性表達；對于Os尸/A^啟動子或C^尸/W啟動子而言，其是植物葉脈特異性的，能夠指導(dǎo)目的基因在植物葉脈中特異性表達。更優(yōu)選的，C^Pi7V3啟動子能夠指導(dǎo)目的基因在植物的二級脈中表達；(^P/W啟動子能夠指導(dǎo)目的基因在植物的中脈和一級脈中表達。作為一種實施方式，所述的啟動子在植物特定的組織中表達相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因。本發(fā)明的啟動子可以被可操作地連接到目的基因上，該目的基因相對于啟動子而言可以是外源(異源)的。所述的目的基因通常可以是任何核酸序列(如一種結(jié)構(gòu)性核酸序列)，所述的目的基因優(yōu)選編碼具有特定功能的蛋白，例如某些在農(nóng)業(yè)或植物改良上具有重要特性或功能的蛋白。合適的目的基因包括但不限于生長素合成和降解相關(guān)基因，生長素轉(zhuǎn)運基因，細胞分裂分化相關(guān)基因，營養(yǎng)運輸相關(guān)基因等。本發(fā)明的啟動子還可以被可操作地連接到被改進的目的基因序列上，該目的基因相對于啟動子是外源(異源)的。所述的目的基因可以被改進來產(chǎn)生各種期望的特性。例如，目的基因可以被改進來增加必需氨基酸的含量，提高氨基酸序列的翻譯，改變翻譯后的修飾(如磷酸化位點)，將翻譯產(chǎn)物轉(zhuǎn)運到細胞外，改善蛋白的穩(wěn)定性，插入或刪除細胞信號等。此外，啟動子和目的基因可以設(shè)計成下調(diào)特定基因。這一般是通過將啟動子連接到目的基因序列上來實現(xiàn)，該序列以反義反向被引導(dǎo)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟悉這種反義技術(shù)。任何核酸序列可以以這種方式被調(diào)節(jié)。任何一種前述的啟動子和目的基因序列可被包含在重組載體中。所述的重組載體一般包括(從5'到3'方向)引導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)錄的啟動子，和目的基因。如果需要，所述的重組載體還可以包括3'轉(zhuǎn)錄終止子，3'多聚核苷酸化信號，其它非翻譯核酸序列，轉(zhuǎn)運和靶向核酸序列、抗性選擇標(biāo)記、增強子或操作子。用于制備重組載體的方法是本領(lǐng)域熟知的。術(shù)語"重組表達載體"指本領(lǐng)域熟知的細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他載體?？傊?，只要其能夠在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都是可以被采用的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含有本發(fā)明所述的啟動子和/或目的基因序列的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型性狀，如二氫葉酸還原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)等。重組載體中除了含有本發(fā)明的啟動子，還可含有一種或多種其它啟動子。所述的其它啟動子例如是組織特異性的、組成型的或誘導(dǎo)型的。例如甘露氨酸合成酶的花椰菜花葉病毒19S和35S(CaMV19SCaMV35S)、增強的CaMV、煙草RB7等。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的重組載體是pCAMBIA1300。pCAMBIA1300是CAMBIA公司開發(fā)的可以同時用于大腸桿菌、農(nóng)桿菌和植物轉(zhuǎn)化的穿梭質(zhì)粒載體，是一種可應(yīng)用于植物活體轉(zhuǎn)化的雙元載體。通過改造，即利用pCAMBIA1300上的多克隆位點，將編碼W^基因的序列連接入載體，再將目標(biāo)基因的啟動子區(qū)域構(gòu)建到^/6"基因的前面，轉(zhuǎn)化植株，啟動子將激活GUS基因的表達，所述啟動受到啟動子區(qū)各順式作用元件的調(diào)控，模擬了基因在體內(nèi)被激活轉(zhuǎn)錄的狀況。包含上述適當(dāng)?shù)膯幼雍湍康幕虻妮d體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷毎允蛊淠軌虮磉_蛋白質(zhì)。宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如植物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬、農(nóng)桿菌；真菌細胞如酵母；植物細胞等。本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉(zhuǎn)錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動子、增強子和宿主細胞。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。轉(zhuǎn)化植物也可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如葉盤法、水稻幼胚轉(zhuǎn)化法等。對于轉(zhuǎn)化的植物細胞、組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得轉(zhuǎn)基因的植物。本發(fā)明的組織特異性啟動子在理論研究和農(nóng)藝改良中具有重要的應(yīng)用價值。這些啟動子可以被應(yīng)用于標(biāo)記特定組織，引導(dǎo)特定的功能基因在特定的組織中表達，以及應(yīng)用于特有組織的生長發(fā)育研究和針對性改良。由0sPIN2啟動子、0sPIN3啟動子、0sPIN4啟動子分別引導(dǎo)GUS基因在不同的植物組織中表達可知，在植物中，0sPIN2(L0C—0s01g45550)、0sPIN3(L0C—0s01g51780)、0sPIN4(L0C—0s01g69070)這三個基因分別在蘗分生的基部、平行脈的中脈和一級脈、以及二級脈中特異的表達。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于揭示一類可指導(dǎo)目的基因在植物的葉不同級脈或分蘗基部特異表達啟動子，所述的啟動子對于定點地改良植物品質(zhì)是特別有用的。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1tts尸/W啟動子區(qū)域的PCR擴增利用NCBI中的Os尸Z/V2、Os尸/tV3、Os尸iT^4的cDNA序歹ij(GenBank登錄號分別是AK063976、AP003288,AK066552),在水稻基因組數(shù)據(jù)庫(TIGR)中通過BLAST(ProgramBLASTN)檢索其所對應(yīng)的基因組DNA序列(在水稻基因組數(shù)據(jù)庫中^尸/vV2、fe尸/W3、Os尸77V4對應(yīng)的TIGR網(wǎng)站的登錄號分別是L0C—0s01g45550，L0C—0s01g51780，L0C—0s01g69070)。在Os尸7^2、&尸/yV3、fc尸H4基因組序列中ATG上游分別取1698bp，1657bp，1920bp包含啟動子區(qū)的序列，設(shè)計引物(見表1)，通過ExTaqDNA聚合酶擴增出PCR產(chǎn)物，獲得0sPIN2、0sPIN3、0sPIN4啟動子片段。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>將前述PCR獲得的各啟動子片段克隆入TA載體(TAKARA)中，測序驗證序列正確。實施例2Os尸i^啟動子表達載體的構(gòu)建分別利用引物自帶的限制性內(nèi)切酶位點HindlII/BamHI,SalI/BamHI，Pstl/Xba11，酶切前述制備的含有OsPIN2、OsPIN3、OsPIN4啟動子片段的TA載體，回收DNA片段，將之克隆入經(jīng)同樣酶切的自身攜帶GUS基因的pCAMBIA1300+pBI101中，形成攜帶啟動子和GUS融合序列的重組載體。其中，pCAMBIA1300+pBI101是將pBI101(購自CLONTECH)上的多克隆位點以及GUS基因用EcoRI和HindIII酶切引入pCAMBIA1300(購自pCAMBIA公司)構(gòu)建而成，構(gòu)建方法如圖4所示。工作原理是利用插入的啟動子去啟動GUS在組織中的表達來反映該啟動子對應(yīng)基因的表達情況。實施例3水稻轉(zhuǎn)基因株系的建立將實施例2構(gòu)建的3個啟動子表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法感染水稻的幼胚，構(gòu)建出轉(zhuǎn)基因株系。具體實驗方法及步驟如下1.菌種構(gòu)建以常規(guī)的CaCl2處理法(參見《分子生物學(xué)實驗技術(shù)》，郝福英等編著，北京大學(xué)出版社，北京，1998)制備根癌農(nóng)桿菌EHA105(購自CAMBIA公司)感受態(tài)，通過電擊轉(zhuǎn)化法將前述構(gòu)建的Os尸77V啟動子表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，在含卡那霉素(Km)的LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，瓊脂15g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)上，在28t:下培養(yǎng)2天。挑取單菌落，在含卡那霉素的YEP酵母培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵母浸膏10g/L，NaCl5g/L，卡那霉素50rag/L，pH7.0)中28。C培養(yǎng)約24小時至對數(shù)期。按線的量接種到相同的培養(yǎng)基中，28'C下培養(yǎng)24小時。將培養(yǎng)液于4。C、3000rpm下離心10min，取沉淀(菌體)，用等體積AAM-As培養(yǎng)基(AA培養(yǎng)基無機鹽和氨基酸MS維他命，干酪素500mg/L，蔗糖68.5g/L，葡萄糖36g/L，乙酰丁香酮，pH5.2)懸浮，靜置2小時。2.共培養(yǎng)外植體(幼胚)的準(zhǔn)備取粳稻(中花ll)未成熟種子，經(jīng)75%的乙醇漂洗lmin后用無菌水漂洗3遍，之后用0.1%升汞浸泡15min，再用無菌水漂洗3遍；然后取幼胚接種于ND2培養(yǎng)基(N6大量元素，N6微量元素和N6維他命，脯氨酸500rag/L，干酪素300mg/L，蔗糖30g/L，2,4-D2rag/L，瓊脂8g/L，pH5.8)上，在25。C、黑暗條件下培養(yǎng)3天。3.轉(zhuǎn)化外植體將經(jīng)培養(yǎng)后的外植體浸入上述3.l所得菌體懸液，靜置20min，用無菌濾紙吸干后轉(zhuǎn)移到ND2-As培養(yǎng)基(ND2培養(yǎng)基加入乙酰丁香酮(30umol/L))上，25°C、黑暗條件下共培養(yǎng)3天。用無菌水將培養(yǎng)后的外植體洗滌5次以除去表面吸附的農(nóng)桿菌，然后用含羧芐青霉素250rag/L和頭孢霉素100mg/L的無菌水浸泡2小時。用無菌濾紙吸干后轉(zhuǎn)移至ND2CH(ND2培養(yǎng)基加入水解酪蛋白500mg/L，2,4-二氯苯氧乙酸2rag/L)培養(yǎng)基，25。C下培養(yǎng)，篩選抗性愈傷，每2周繼代一次。3.再生篩選得到的抗性愈傷轉(zhuǎn)移到NN1B2H分化培養(yǎng)基(N6大量元素、N6微量元素、N6維他命，干酪素300rag/L，蔗糖30g/L、6-芐基腺嘌呤2rag/L，潮霉素50mg/L，瓊脂10g/L，pH5.8)上，25。C下培養(yǎng)分化。分化出來的小苗轉(zhuǎn)移到含50mg/L潮霉素的MS分化培養(yǎng)基(DUCHEFABIOCHEMIE公司)上，25。C下培養(yǎng)至約IOcm高，移至人工氣候室培養(yǎng)至成熟。水稻在人工氣候室中，每天于26'C下培養(yǎng)12小時；再于18"C下培養(yǎng)12小時。實施例4GUS活性的檢測GUS緩沖液的配方如下:(pH7.0)lOOmM磷酸緩沖液，0.5mMK3[Fe(CN)6]，0.5mMK4[Fe(CN)6],100mMEDTA，1mM5-溴-4-氯-3-B引哚-b-D-葡糖苷酸。GUS活性檢測取花序浸入GUS(lmg/ml)緩沖液中，抽真空半小時后在37"C過夜，室溫酒精脫色。切片取染色脫色的葉片固定于FAA溶液(配方90ml70%乙醇，5ml甲醛，5ml醋酸)中，包埋入環(huán)氧樹脂812中，6(TC聚合后切片厚度為3陶并觀察。結(jié)果見圖1-3。其中，圖1顯示了攜帶C^/W2-GUS融合基因的轉(zhuǎn)基因植物的分蘗組織，可見特異表達的啟動子GUS染色(藍色)。圖2顯示了攜帶Os尸/iV4-GUS融合基因的轉(zhuǎn)基因植物的中脈和一級脈組織，可見特異表達的啟動子GUS染色(藍色)。圖3A顯示了攜帶CWV7V3-GUS融合基因的轉(zhuǎn)基因植物的二級脈組織，可見特異表達的啟動子GUS染色(藍色)。圖3B顯示了攜帶O^P/TV3-GUS融合基因的轉(zhuǎn)基因植物染色后的切片觀察。圖中以箭頭表示GUS染色的二級脈組織。實施例5應(yīng)用實例利用所述的組織特異表達啟動子，本發(fā)明人可以進行作物改良和一系列生物學(xué)問題的研究。為了更好地研究生長素對水稻葉脈發(fā)育的影響，本發(fā)明人利用所述的在葉脈中特異表達的啟動子，在葉脈一級脈(0sPIN4啟動子)和二級脈(0sPIN3啟動子)部位特異表達生長素合成相關(guān)基因吲哚乙酸-賴氨酸合成酶基因(iaaL)或吲哚乙酰胺水解酶基因(iaaH)，來改變特異部位的生長素(IAA)活性，從而改變水稻組織的生長和發(fā)育。對于改良作物，利用所述的在分蘗基部特異表達的啟動子(0sPIN2啟動子)，在分蘗基部引導(dǎo)細胞分裂伸長相關(guān)基因的特異表達，可以改良作物的分蘗性狀。所述的0sPIN2、0sPIN3、0sPIN4啟動子在水稻以外的單子葉植物中也具有指導(dǎo)目的基因組織特異性表達的功能。此外，本發(fā)明人還分別采用Os尸i^2、6^尸/yV3、Os尸i^4基因組序列中ATG上游1705bp、1654bp和1923bp，同前述實施例1-4的方法將這些基因片段與GUS相融合，插入到表達載體中，轉(zhuǎn)化入宿主細胞，通過農(nóng)桿菌法制備轉(zhuǎn)基因水稻。GUS活性檢測的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Os尸/yV2、Os尸/;V3、fc/YiV4基因組序列中ATG上游1701bp、1661bp和1923bp的多核苷酸也具有指導(dǎo)GUS基因在分蘗組織、二級脈、中脈和一級脈中表達的功能。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。序列表<110>中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120〉植物葉片各級脈和分蘗基部特異表達啟動子及應(yīng)用<130〉068090<160〉9<170>Patentlnversion3.3<210〉1<211>1844<212>DNA<213〉稻屬(0ryzasativaL.)<220〉<221>啟動子(Promoter)<222〉(144)..(1841)<400〉1aactatatcaatgtgaaaatatatttcatgacaattctattgatattttttaatat肌犯60agttttgtatattaatgaattattaagattttaaaattttgtcccacgaaaacggagata120agtacatcttagcatatgatt肌gcaatcatcactagccaagcgcaatcttttgcaatac180agttcttcccc肪gtca^tcggccacattctctttcatgcasgctagcaa240ccagcctgccttgttatttttttaaggaatagaatgaggg3tggatgtccacactccacg300cttctcgatcatgctcttaaacsttacaatttttgtaaaacatatatttc360ataaaaaaagttttaaatccagtatgcagctttatgataccatttgtgcc420ctaaagtaattcgca犯tcattcagctatttaaccgttcagccattcaac480gtacctcgttggccctctcaccatagacaaacctctgtaatcttgcggga540gactattttgatgcctcaagaggatattgccttgttcgtttaattaaaaaCC3tCC3肌C600ggttatgaatttctttttaaa幼犯tatgat^C3CtC3tacetacatatctatacaeictc660tttatctaaactcaactcacacatcgagatat犯aa卿ggagacaaatc720c犯catatgaatagtagcataMataatgttcatatatgaatttgtcactttttttctca780atgtgtaagtcttgtttttttttggactgatatactttat840attgtcaatttctttcataactatttatatcgaaattg肌agaaaaattt900atatgagggaacatcccctcgatcttgcacgagtttaccattcgccattcggttgtatag960cacttgttcatgtata肌cctaeLetatgcgc犯tttc犯tagtttaactaa1020tccaatctttgttgatttgttgctatagtacttcaacaataccgagctactgttatttgc1080atattggaacactagtctttcacacgtattgttgtactacatccgtccca1M0cggagggagtagctgctagctggagUgctagtgttctcgttcatggacg1200gtcggggcaccgtgageigccggataagtgcagacagtggtcagtacaact1260tctgcagtatcccgtacgcgcgctcgatcatcagcttgcatagtcacgga犯犯gCCC3C1320cacgtacataaccgataagatcaatcgatcggtttcacggagcaatgcaaatctatcttc1380agagcagc犯tgcctctatgactctattcgcatccagtgatgca犯tccatcgccaagat1440gcaatctatatacccccggtacccattgcattgtgtatcacaacgctagcttgtacatgt1500gcgcgcatgaactacgggctt犯tttgCELCctccgagcgaaacattgatcgtttcttatg1560幼gcacacgcccactggtgggtcagtcacgatcgcgcattcaa犯tctctcatgttttta1620cagtaaaatccaccctggagcctggatgacggg卿atgtagaccgctcctcaactctgt1680gctcgttggacttggacgcagcctataagtggctgaccccgagttctccgagttagcaag1740aagccactccactcggccgctcctgcatgtataactagctagttctagctcgctcaggca1800ctcgatccaccgccgggcgcgttggattgagataggctgaggag1844<210〉2<211〉2033<212〉DNA<213〉稻屬(0ryzasativaL.)<220><221><222〉啟動子(Promotor)(4)..(2033)<400>2ccttctgaagagacccccttttacaagcatcttggcctaggtgataggttttacaagcatcttagctgcaggatagagtttaggatgggcggtggtaaagttaaaaagatgcaaaactgggattgacggccacaaattcttcagag咖agctgatgaagatgcaaaccctgagcaaagatgatgcaatgttgctatttatttcaccgaagcactcattccagtcttttgccatatttgggaactgtaaatgtacatctcttcgttgcttgattgcttcctcttgccttcgacctatcagctttgtaggactggtacatttttttttttcccgagaaaatgacagcaaacctgaaaggactttgaacagcatactttcaaaggaatgagcccgtcactgccaatttacgaggatgtgaaaacaattgatatattcatacatattgtagtcgaaatatcagaattttttaacagcatgtaatacggtctagaaaccaatgcacaacaactcaaatat肌acagtgagtgctgttcacggtcaagtgagaccgtgaggaccaaacgctgatgatcagtgaaacaccaaaccgacaagctatggctggaattgtcacccaatttctttttctcaagtcttgttgaa幼ag犯aaaga組gctattctgactttaaactgttgctactgcttagcatgctgcataatgtttccctactgataactgcagaatgtagaagagacatagtccattaaacacggccacatctttgccgtgatacgtcagtccagacaggc組gcacacgaaaacagtttctttgccctaaaaaaatcttaaagagttttatgcaagctctacctgaaggccactacaaagattgacagattttctctgttatggcattaatgttaataaatatagtc犯caacataaagagaagaatatca犯acttcacacsctattattctgaactgggtttcactgttattatgtctaataactttttgcagattgaaaacaatgaatcaggatttagtccagaattccacataaatatggtcaaatcattatcattattcagcacacataggaacgataacggaactggcatttatccagcttccaaagactctgctaatgctaaaacctgcatggaaaagtgtctgtggtctatataagacagctacagtatgcccaaaacaggagagttggagtgttcttcaggttcatccattatggttcgttcttgaagcgacagttccactatatgtagctatgat犯tggtggaagctgttcaccccagagcagtgctctgggattttctattcctctgctctcttttcaggtcatttccacaacagtttgatccatgcaaagaa60tgatccatgcaaagaagtga120ggaacctgctagcttgcaag180agcataaagagaagtcgtaa240tgggga犯acgc犯agcaag300agaaacatggaaaatctggt360tccacaattaacttctttat420gcaggaacctggagcaaagt480aataaacagcacaattatct540actccaaatggcaatttgat600taggatcagtacaagtaagg660acagagaggtgaggccgcca720Ugtgtaaaagtacaaatca780caatgccactactaaaattt840cca犯gcttctgtgttattt900ctgctgactagaaacaaaaa960gagcacatgctttggtcatt1020atcatggggaaacaaactgg1080tgatttcgcacatcatcaag1140acatgtaactctgtcaaagt1200tataaaacatcgagagtctc1260aaggttcataaaaaatacat1320aggtctaaaggcccactgag1380ttttgcactgggttttcacc1440cataagaaaacaccaggaga1500agcagtgttttacttcttta1560ctcaaiacagatgtccttact1620atgggcaatttggacaattt1680tttgcacaaaacctggcttc1740ctttctacatcccagttgggi800gtcctgg犯ggacatctacc1860actggcctacctatccataa1920caacaagtttgtggcgaagt1980cgatccttatgac2033<210〉3<211〉1811<212〉DNA<213〉稻屬(0ryzasativaL.)<220〉<221〉啟動子(Promotor)<222〉(121)..(1777)<400>3aggttaatccaggagatgctagtcgacctagctagctagctagctagagcacctttgcagG0caatactgacctgaccggccacctgatgttgaaactagcataagcatacagtactatagc120attgtgctagcatttccttcaaaatatcattaactgttcctttatttgcgttaagtaatt訓(xùn)attaccaccgttattccaaaatataagggattaatttaactatgaatttgtattgct肌a240atttcttatatctcgagacggagatagtatctaagctagttttUatcgggacggctaag300gaggcggccgaccaaattttattaagaaagaaagatgttacaactttaacaatatcgaca360ttaaactgtcgagggsgagaacgtgggagaacagag鄧犯gagaac肌aagicaaaaaeica420cacaggaccgctttatagcggggttcttagccaacttatctaaaaataacggcctccctc480tacaccaggatctcatctctaatatcattgtatatccctaacactgagcactctaaaaat540accagcctccctccacaccatgatctcatctctaatatcattgtatatccctaacaccaa600gcataacctttgctcaaagatcctggcgttcctctctttccgcataaaccaacaaaccat660catacaatgaagtacggtggtgtttgaatcttctgaagatgaagatgaagataaagatta720agtgtttcacgtaaaacaagatggtaataacgtgtgattaattgagttttaattattaca了80aMttgaaaaattgattaatctgatattttagagcaacttttatatagaaagttttcaaa840aaaaaaccgcaccgtttagcagtttgaaaaacatgctacgagtatccaaaatttcatcca900attcttatcggagaaacgaatgcagccagttgcatgcgctaggtggagctaagtttgatg960aaactgaagagatgttgataatcaaaacgagtacgtcctttcagcagagatgattgtctg1020aaatcaaaatattttagacgacgacgttggttcagagattcaattcatagacatatatac1080tagtaaggtaaactatagattcacgtataatatacatgaacaccctgaaactgaaaccga1140aagctagctagtgatcagaccacacagatgatcactacttgcctttcggcaacggtagtc1200acacacacctcaagaacacatgc.ttgcttgcatatagcattgccagtttgccactaattg1260catgcagtctccatcatcgaagc肌agcaaagaaaaacscacacatgtacacacacacac1320tctctctctctctctctctctctctctctctctctctctctgcacgcgcgcgtgcatgca1380tgcaaagatttcaaataatcccaagcgcgcgagagcgagaaagcaaaaaagcgcgcgaac1440aagatcccgttaacctaaccggccgtcgcgtcaacttccaaccccccactaacactcaca1500ctcgcactcaccaccatgcagcaatgtcatccgaatcaaaattaccaagctagctaatcc1560accaatcctccccagccgttcgttcggatcgatccgacggccaccatcccactctgatcg1620atccatgcatatattcctccccagtgactagctcgcccccgctataaagcccagctcaca1680ctacacccactcatccacagcgatcaaccgcattacacttggttaattaattaattctcc1740attagcagctagctagggttctagggttaatttagttgatcagttcgccggaaccggaga1800agaagagigaag1811<210>4<211〉28<212〉DNA〈213>人丁序列<220><221〉misc_feature<223>引物<400〉4cccaagcttgcaatcatcactagccaag28<210><211><212〉<213〉<220〉<221><223>526DNA人工序列misc—feature引物<400〉5cgggatccagcctatctcaatccaac26<210〉<211〉<212><213><220><221〉<223〉627DNA人工序列misc一feature引物<400>6gcgtcgacagtgataggatgggcggtg27<210><211><212〉<213〉<220><221〉<223〉28醒人工序列raise—feature引物<400>7cgggatccgtcataaggatcggttgtgg28<210〉8<211〉28<212〉腿<213>人工序列<220〉<221>misc—feature<223>引物<400>8aactgcagattgtgctagcatttccttc28<210>9<211〉28<212>DNA<213>人T.序列<220><221〉misc—feature<223〉引物<400>9gctctagaactaaattaaccctagaacc28權(quán)利要求1.一種在植物葉脈或分蘗基部特異表達的啟動子，其特征在于，所述的啟動子選自下組(1)具有SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3所示的核苷酸序列的啟動子；(2)核苷酸序列在嚴(yán)格條件下能夠與(1)限定的多核苷酸序列雜交且具有指導(dǎo)目的基因在植物葉脈或分蘗基部特異表達功能的啟動子；(3)核苷酸序列與SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3有95％以上同源性且具有指導(dǎo)目的基因在植物葉脈或分蘗基部特異表達功能的啟動子；或(4)核苷酸序列與SEQIDNO1、SEQIDNO2、或SEQIDNO3所示的核苷酸序列完全互補的啟動子。2.如權(quán)利要求l所述的啟動子，其特征在于，所述的植物是單子葉植物。3.如權(quán)利要求l所述的啟動子，其特征在于，具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的多核苷酸能夠指導(dǎo)目的基因在植物分蘗基部特異表達；或具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的多核苷酸能夠指導(dǎo)目的基因在植物葉脈特異表達。4.如權(quán)利要求3所述的啟動子，其特征在于，具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列的多核苷酸能夠指導(dǎo)目的基因在植物葉脈的二級脈中表達；或具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列的多核苷酸能夠指導(dǎo)目的基因在植物葉脈的中脈和一級脈中表達。5.—種載體，其特征在于，所述的載體含有權(quán)利要求1所述的植物葉脈或分蘗基部特異表達啟動子，作為啟動子元件。6.如權(quán)利要求5所述的載體，其特征在于，所述的載體還含有與所述的植物葉脈或分蘗基部特異表達啟動子可操作地連接的目的基因。7.—種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，所述的細胞含有權(quán)利要求6所述的載體；或其基因組中整合有外源的權(quán)利要求1所述的植物葉脈或分蘗基部特異表達啟動子。8.—種使目的基因在植物葉脈或分蘗基部特異表達的方法，其特征在于，所述的方法包括將構(gòu)建物轉(zhuǎn)化植物細胞，所述的構(gòu)建物含有權(quán)利要求l所述的植物葉脈或分蘗基部特異表達啟動子以及與所述的啟動子可操作地連接的目的基因；篩選出轉(zhuǎn)入了所述構(gòu)建物或染色體中整合有所述構(gòu)建物的植物細胞；和將所述植物細胞再生成植株。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的方法包括(a)提供攜帶表達載體的農(nóng)桿菌，所述表達載體中含有構(gòu)建物，所述的構(gòu)建物含有權(quán)利要求1所述的植物葉脈或分蘗基部特異表達啟動子以及與所述的啟動子可操作地連接的目的基因；(b)將植物細胞、組織或器官與步驟(a)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使所述的構(gòu)建物轉(zhuǎn)入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；(C)選擇出轉(zhuǎn)入了所述構(gòu)建物的植物細胞、組織或器官；以及(d)將步驟(C)中的植物細胞、組織或器官再生成植物。10.權(quán)利要求l所述的啟動子的用途，其特征在于，所述的啟動子用于指導(dǎo)目的基因在植物的葉脈或分蘗基部特異表達。全文摘要本發(fā)明公開了一類植物葉片各級脈和分蘗基部特異表達啟動子，所述的啟動子能夠指導(dǎo)目的基因在植物葉片各級脈或分蘗基部特異性表達。本發(fā)明還公開了所述啟動子的應(yīng)用，可用于標(biāo)記特定組織，引導(dǎo)特定的功能基因在特定的組織中表達，以及應(yīng)用于特有組織的生長發(fā)育研究和針對性改良。因此本發(fā)明的組織特異性啟動子在理論研究和農(nóng)藝改良中具有重要的應(yīng)用價值。文檔編號C12N15/87GK101245349SQ20071003764公開日2008年8月20日申請日期2007年2月16日優(yōu)先權(quán)日2007年2月16日發(fā)明者倩胥,薛紅衛(wèi)申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院