專利名稱：一種環(huán)亞胺水解酶基因及其表達蛋白的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體屬于來源于假單胞桿菌的一種環(huán)亞胺水解酶的編碼基因，以及重組酶的表達和應用。
背景技術：
環(huán)亞胺水解酶(cyclic imide hydrolase，EC.3.5.2.16)是環(huán)酰胺酶類(EC.3.5.2)(包括海因酶、二氫嘧啶酶，二氫乳清酸酶、尿囊素酶等)中的一種，由于其在生物體內(nèi)的代謝功能不明確，研究較少，但廣泛存在各類生物體。過去一般將環(huán)亞胺水解酶和海因酶，二氫脲嘧啶酶混為一談。隨著研究的深入，現(xiàn)在已經(jīng)明確環(huán)亞胺水解酶和上述酶有著較明顯的不同(1)作用底物不同海因酶等作用底物為海因等環(huán)酰胺類，少量的海因酶也可作用于復雜的環(huán)亞胺，而環(huán)亞胺水解酶盡管也可以海因和二氫尿嘧啶作為底物，但它水解簡單的環(huán)亞胺底物諸如琥珀酰亞胺、馬來酰亞胺以及含巰基的環(huán)亞胺，卻是前者不具有的(見附圖1)。(2)分子量不同環(huán)亞胺水解酶和海因酶等環(huán)酰胺酶均屬金屬依賴性酶，但環(huán)亞胺水解酶分子量在30kD左右，天然蛋白為三聚體，而后者分子量均在50kD～60kD，一般為二聚體或四聚體。(3)保守活性位點不同海因酶一級結構序列同源性比較，酶活性的保守殘基均是和金屬結合的四個組氨酸，一個天冬氨酸；但環(huán)亞胺水解酶在一級結構序列和上述任一類環(huán)酰胺水解酶無任何同源性。(4)保守結構域不同海因酶等在保守結構域均屬酰胺酶(Amidase)，但已知蛋白質(zhì)序列的環(huán)亞胺水解酶保守結構域卻不屬該結構域。(5)空間結構不同海因酶等的空間結構類似Triosephosphate isomerase的TIM桶，而后者預測空間結構在數(shù)據(jù)庫比對未發(fā)現(xiàn)類似結構。
Ogawa J等在1997年研究Blasterbacter sp.A17-4中首先發(fā)現(xiàn)和分離純化了環(huán)亞胺水解酶并對該酶的理化性質(zhì)進行了研究。Soong等對232種細菌，250種酵母和118種霉菌的調(diào)查揭示在細菌中水解環(huán)酰胺和水解環(huán)亞胺的兩種活性不一定在同一個菌體存在；在細菌中假單胞桿菌對水解環(huán)亞胺和環(huán)酰脲均有較高活性，但在節(jié)桿菌屬、農(nóng)桿菌屬、短桿菌屬有較高的水解環(huán)亞胺活性，而環(huán)酰脲的活性很低；酵母和霉菌中環(huán)亞胺水解酶的活性都很低。在微生物中，環(huán)亞胺水解酶和半酰胺酶(half-amidase)共同參與簡單環(huán)亞胺的代謝，其中環(huán)亞胺水解酶為第一個催化環(huán)亞胺水解形成半酰胺，后者再在半酰胺酶的作用下形成二羧酸，參與類似TCA的循環(huán)反應。由于大多的農(nóng)藥和藥物中間體均是亞胺類化合物，環(huán)亞胺水解酶可能在藥物中間體的制備，異生物質(zhì)的體內(nèi)降解中發(fā)揮作用。
國內(nèi)外有關海因酶的研究報道較多，但環(huán)亞胺水解酶研究很少，除Ogawa J等報道外，第二例來自王宇等2002年從真氧產(chǎn)堿桿菌112R4中克隆到一種環(huán)亞胺水解酶基因(王宇等，微生物學報，2002，42.153～162)。但該酶在氨基酸序列同源性，作用底物范圍，催化效率上均與本發(fā)明的環(huán)亞胺水解酶有明顯差異，后續(xù)重組酶的研究未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種環(huán)亞胺水解酶及其編碼基因，獲得作用底物廣泛、活力較高的重組酶，并且這種重組環(huán)亞胺水解酶可在制備單一構型N-氨甲酰-氨基酸或酰胺酸中應用。
本發(fā)明提供的環(huán)亞胺水解酶，來源于假單胞桿菌，是序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID NO1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的替代或添加且具有與SEQ ID NO1相同活性的由SEQ ID NO1衍生的蛋白質(zhì)。
序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列是由293個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明所提供的環(huán)亞胺水解酶的編碼基因，是下列核苷酸序列之一(1)序列表中SEQ ID NO2的DNA序列，由879個堿基組成；(2)編碼序列表中SEQ ID NO1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸序列。
含本發(fā)明基因的表達載體及細胞體系均屬于本發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明重組環(huán)亞胺水解酶蛋白可以通過以下方法獲得培養(yǎng)含有環(huán)亞胺水解酶表達載體的宿主菌pEI/E.coli BL21，在所規(guī)定的蛋白質(zhì)表達條件下，獲得表達產(chǎn)物環(huán)亞胺水解酶，然后從宿主細胞中提取并純化該酶。
本發(fā)明的環(huán)亞胺水解酶及其編碼基因可在制備單一構型N-氨甲酰-氨基酸以及制備酰胺酸中應用。
所述的單一構型N-氨甲酰-氨基酸，可以是海因酸；所述的酰胺酸可以是琥珀酰胺酸或馬來酰胺酸。
本發(fā)明從一株假單胞桿菌中成功地克隆到一新的環(huán)亞胺水解酶基因并進行了表達，重組酶的制備和底物轉化等研究，本發(fā)明涉及的環(huán)亞胺水解酶氨基酸序列和海因酶等環(huán)酰胺酶的同源性低于10％。從文獻報道和網(wǎng)上資源搜索，環(huán)亞胺水解酶的蛋白和基因研究共報道2例，完整序列只有來自真氧產(chǎn)堿桿菌一例，本發(fā)明的酰亞胺水解酶和真氧產(chǎn)堿桿菌112R4來源的序列比對同源性為78％(見附圖2)，作用底物較前者更廣泛，而且活力較高。


圖1二氫嘧啶(A)、海因類化合物(B)和環(huán)亞胺(C)三類底物的酶法水解反應。其中1.二氫脲嘧啶酶；2.β-脲基丙酸酶；3.海因酶；4.N-氨甲酰氨基酸水解酶；5.環(huán)亞胺酶；6.半酰胺酶。
圖2環(huán)亞胺水解酶與數(shù)據(jù)庫中已知序列環(huán)亞胺水解酶(AF373287)的比對。
圖3環(huán)亞胺水解酶純化結果圖。其中泳道1為含空質(zhì)粒的E.coliBL21全菌體蛋白；泳道2為含重組子pEI/E.coliBL21全菌體蛋白；泳道3超聲后的上清；泳道4經(jīng)鎳親和柱洗脫的目的蛋白；泳道5經(jīng)Sephacryl S-200柱洗脫的目的蛋白。
圖4所得產(chǎn)物在不同反應條件下HPLC分析。反應條件12μg酶，底物琥珀酰亞胺濃度為20mmol/L，反應體系為200uL，37℃反應。
具體實施例方式
實施例1環(huán)亞胺水解酶的克隆及一級結構特征本發(fā)明人從假單胞桿菌YZ-26(石亞偉等，Chemical Research of Chinese University，2005)中用CTAB法提取基因組DNA，然后用EcoRI酶切基因組DNA，用膠回收試劑盒從0.8％的agarose膠上分部回收2-9kb的EcoRI酶切片段，將回收的酶切片段連接在經(jīng)相同酶切處理的pUC18載體上(大連寶生物公司)，轉入E.coilJM109中，在涂有X-gal和IPTG的平板上進行藍白初篩。
將含有插入片段的重組白色單菌落，分別挑入每孔含50μl YCG培養(yǎng)基(0.5％酵母粉，0.5％蛋白胨，0.5％甘油，0.2％磷酸氫二鉀和0.1％海因pH7.0)，37℃過夜培養(yǎng)后，加入50μl的50mmol/L二氫脲嘧啶作為底物，37℃振蕩30min，分別加入50μl 5％的對二甲氨基苯甲醛，進行顯色反應。
通過微孔板復篩較高活性的重組子，并抽提質(zhì)粒，然后進行DNA序列測定，結果顯示陽性重組子pUS804中含有插入片段為2787bp，在其中只有位于1301～2118bp間有一個完整的讀框，為879bp(SEQ ID NO2).G+C含量為60.66％，編碼293aa，其計算分子量為33.711kD.將該DNA序列在BlastX程序進行對比和保守結構域搜索，和已知水解海因的酶諸如海因酶，尿囊素酶，二氫嘧啶酶等(含有環(huán)酰胺酶結構域)是完全不同的，目前只和真氧產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes eutrophus 112R4)酰亞氨酶有78％的同源性(王宇等，微生物學報，2002，42.153～162)，與芽生桿菌(Blastobacter sp.)A17-P-4酰亞氨酶(只報道N末端的20氨基酸)氨基端20個氨基酸有80％的同源性(Ogawa J et al Eur JBiochem 1997，243(1-2)322～327)，因此，本發(fā)明的環(huán)亞胺水解酶基因序列不同于現(xiàn)有文獻報道的類似酶的序列，它是一個新基因。
實施2.環(huán)亞胺水解酶基因重組子構建根據(jù)測序結果，按該蛋白質(zhì)編碼基因的兩末端序列設計正向引物，CGGAA TTCATGGCCAAGGAAATC和反向引物CCG AAG CCT TCA CTT CTT GCG CGG，以pUS804重組子為DNA模板，按如下PCR程序進行擴增.94℃變性1min，50℃復性1min，72℃延伸1min，擴增反應進行25個循環(huán)。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)EcoRI/HindIII雙酶切連接到經(jīng)相同酶切后的載體pET32a(Novagen公司)構建含硫氧還蛋白表達載體pETI。然后利用載體上的硫氧還蛋白編碼區(qū)兩側的NdeI酶的位點，將硫氧還蛋白讀框從融合蛋白中切除，構建成pEI重組子。每一步獲得的重組子經(jīng)PCR檢測，質(zhì)粒抽提和酶切分析，最終再經(jīng)DNA序列分析確定。
實施例3重組環(huán)亞胺水解酶的表達與制備將實施例2中獲得重組子pEI(環(huán)亞胺水解酶的基因的N末端融合了一段六個組氨酸的親合臂利于蛋白質(zhì)的純化)，轉化經(jīng)Cacl2法致敏的Ecoli.BL21(DE3)的感受態(tài)細胞獲得pEI/Ecoli.BL21(DE3)工程菌。
從LB平板上挑取單菌落接于5ml(含100μg/ml Amp)液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10～12hr，取上述預培養(yǎng)菌以1％接種量轉接于新鮮的Amp(100μg/ml)的LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD達到0.600左右，加終濃度0.3mmol/L IPTG，37℃再誘導培養(yǎng)4hr后，4℃，5000rpm離心，收集菌體。菌體用50mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，pH8.0緩沖液懸浮，在冰浴中用超聲波破碎細胞，然后15000rpm，4℃離心30min去除細胞碎片等不溶物質(zhì)。將離心上清上樣于Ni2+-NTA親和柱，經(jīng)含50mmol/L咪唑的相同緩沖液洗去大部分雜蛋白，最后用20ml含100mmol/L EDTA洗脫目的蛋白。將洗脫的目的蛋白用Amico超濾器PM30膜濃縮至5ml。上樣于Sephacryl S-200凝膠層析柱(LKB層析系統(tǒng))。經(jīng)洗脫的活性峰合并，獲得SDS-PAGE電泳純的環(huán)亞胺水解酶(見附圖3)，比活力為35.8U/mg(海因作底物)。
實施例4重組環(huán)亞胺水解酶的應用1.N-氨甲酰氨基酸的制備N-氨甲酰氨基酸是單一構型氨基酸，特別在D-型或L型氨基酸生產(chǎn)中的關鍵中間產(chǎn)物，它的生產(chǎn)一般通過化學法或酶法，目前多采用酶法生產(chǎn)，常用的酶主要是海因酶，本發(fā)明提到的環(huán)亞胺酶也可水解海因等底物，活力可達35.8U/mg(海因作底物)。整個反應通過水解海因等底物的酰胺鍵，開環(huán)生成N-氨甲酰氨基酸。
酶反應體系組成底物2％海因或二氫尿嘧啶反應溫度37℃緩沖液50mmol/L Tris.HCl pH8.0緩沖液酶液或菌體適量反應液總體積為1.5ml，經(jīng)30min保溫后，加入0.25ml的三氯乙酸終止反應，0.25ml，10％對二甲氨基苯甲醛(DMBA)溶液顯色，然后加入1.0ml H2O補足3.0ml體積，在430nm下進行比色。用已知濃度的N-氨甲酰丙氨酸為標準產(chǎn)物，在相同體系情況下，繪制標準曲線，求出K值，根據(jù)公式，計算酶活性。
酶的轉化率1％海因(20μmole)，酶量為300ug，37℃反應1hr，在上述條件下，底物轉化率約85％。
2.酰胺酸的制備酰亞胺是生物體代謝中重要的中間物，特別是嘧啶類的代謝，環(huán)亞胺水解酶可以催化水解環(huán)亞胺生成酰胺酸(單亞胺二羧酸)，在有機酸和藥物中間體的生產(chǎn)中有很好的前景。
酶反應體系組成底物20mmol/L琥珀酰亞胺或馬來酰亞胺反應溫度37℃緩沖液50mmol/L Tris.HCl pH8.0緩沖液酶液適量將反應混合液在沸水中加熱5min，13000rpm離心5min后，上清液進行HPLC測定，層析柱SymmetryC18(4.6mm×150mm，5μm)；流動相為磷酸緩沖液(20mmol/L pH6.5)甲醇(95∶5)，馬來酰胺酸在255nm下檢測；琥珀酰胺酸在210nm下檢測。
酶的轉化率在上述酶反應的條件下，酶量為12μg(5U/mg)，底物琥珀酰亞胺濃度為20mmol/L，反應體系為200uL，37℃反應30min后，轉化率98％(見附圖4)。底物為馬來酰亞胺時，在上述條件下，轉化率95％。
序列表<110>山西大學<120>一種環(huán)亞胺水解酶基因及其表達蛋白的應用<140>申請?zhí)枮?amp;lt;141>2005-4-18<160>2<210>1<211>293<212>PRT<213>惡臭假單胞桿菌YZ-26(Pseudomonas putida YZ-26)<220>
<222>(1)..(293)<400>1Met Ala Lys Glu Ile Leu Cys Ser Phe Gly Ile Asp Val Asp Ala1 5 10 15Val Ala Gly Trp Leu Gly Ser Tyr Gly Gly Glu Asp Ser Pro Asp20 25 30Asp Ile Ser Arg Gly Leu Phe Ala Gly Glu Val Gly Ser Pro Arg35 40 45Leu Leu Lys Leu Phe Glu Arg Phe Gly Ile Lys Thr Thr Trp Phe50 55 60Ile Pro Gly His Ser Ile Glu Thr Phe Pro Glu Gln Met Gln Ala65 70 75Val Ala Asp Ala Gly His Glu Ile Gly Ile His Gly Tyr Thr His80 85 90Glu Asn Pro Ile Ala Met Thr Arg Glu Gln Glu Thr Ala Val Leu95 100 105Asp Lys Cys Ile Asp Leu Val Thr Lys Leu Ser Gly Lys Arg Pro110 115 120Thr Gly Tyr Val Ala Pro Trp Trp Glu Phe Ser Asn Val Thr Asn125 130 135Glu Leu Leu Leu Glu Arg Gly Ile Lys Tyr Asp His Ser Leu Met140 145 150His Asn Asp Phe Thr Pro Tyr Tyr Val Arg Val Gly Asp Lys Trp155 160 165
Thr Lys Ile Asp Tyr Ser Lys Lys Pro Ser Asp Trp Met Val Pro170 175 180Leu Thr Arg Gly Lys Glu Thr Asp Leu Ile Glu Ile Pro Ala Ser185 190 195Trp Tyr Leu Asp Asp Leu Pro Pro Met Met phe Ile Lys Lys Ser200 205 210Pro Asn Ser His Gly Phe Val Asn Pro His Asp Ile Glu Gln Ile215 220 225Trp Arg Asp Gln Phe Asp Trp Val Tyr Arg Glu Met Asp Tyr Ala230 235 240Val Phe Pro Ile Thr Ile His Pro Asp Val Ala Gly Arg Pro Gln245 250 255Val Leu Met Met Leu Glu Arg Leu Tyr Ala His Met Ile Lys His260 265 270Pro Gly Val Lys Phe Val Thr Met Asn Glu Ile Ala Asp Asp Phe275 280 285Ala Lys Arg Phe Pro Arg Lys Lys290<210>2<211>882<212>DNA<213>惡臭假單胞桿菌YZ-26(Pseudomonas putida YZ-26)<220>
<222>(1)..(882)<400>2atggccaagg aaatcctctg cagcttcggc atcgacgtcg atgcggtcgc cggctggctc 60ggatcctatg ggggcgagga ttcgcctgac gatatctcgc gcggcctttt cgccggcgag 120gtcggcagcc cgcgcctcct gaagctgttc gaacgcttcg gaatcaagac cacctggttc 180attcccggcc actcgatcga gaccttcccg gaacagatgc aggcggttgc cgatgccggc 240cacgagatcg gcattcacgg ctacacccat gaaaacccga tcgccatgac gcgcgagcag 300gagaccgcgg tcctcgacaa gtgcatcgac ctcgtcacca agctctcggg caagcgcccg 360accggctatg tcgcgccgtg gtgggagttt tccaacgtca ccaacgagct gctgctggaa 420cgcggcatca agtacgacca ctccctgatg cacaacgact tcacgcccta ttatgtgcgc 480gtcggcgaca agtggaccaa gatcgactac tccaagaagc cgtccgactg gatggtgccg 540ctcacgcgcg gcaaggaaac cgatctcatc gaaatcccgg cctcctggta cctcgacgac 600ctgccgccga tgatgttcat caagaagtcg ccaaacagcc acggcttcgt caatccgcat 660gacatcgagc agatctggcg cgaccagttc gattgggtct accgcgagat ggactatgcg 720gtgtttccga ttaccatcca tcccgatgtt gccgggcgcc cgcaggtgct gatgatgctg 780gagcggctct atgcccacat gatcaagcat cccggcgtga agttcgtgac gatgaacgag 840atcgccgacg actttgccaa gcgcttcccg cgcaagaagt ga
權利要求
1.一種環(huán)亞胺水解酶，特征在于，它具有序列表中SEQ ID NO 1氨基酸殘基序列。
2.一種環(huán)亞胺水解酶的編碼基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID NO 2；2)編碼序列表中的SEQ ID NO 1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸序列。
3.據(jù)權利要求2所述基因，其特征在于，所述環(huán)亞胺水解酶的編碼基因是序列表的SEQID NO 2。
4.含有權利要求3所述基因的表達載體。
5.含有權利要求3所述基因的細胞體系。
6.權利要求5所述的細胞體系為原核細胞系統(tǒng)。
7.權利要求1所述的重組環(huán)亞胺水解酶在制備單一構型N-氨甲酰-氨基酸或酰胺酸中的應用。
8.權利要求7所述的單一構型N-氨甲酰-氨基酸是海因酸。
9.權利要求7所述的酰胺酸是馬來酰胺酸或琥珀酰胺酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種環(huán)亞胺水解酶基因序列及其表達蛋白的制備與應用。本發(fā)明所提供的來源于假單胞桿菌的環(huán)亞胺水解酶是序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列或?qū)EQ ID NO1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的替代，缺失或添加具有與SEQ ID NO1相同活性的由SEQ ID NO1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明將來源于假單胞桿菌環(huán)亞胺水解酶基因克隆并表達制備重組酶，可用于生物法生產(chǎn)N－氨甲酰－氨基酸以及酰胺酸等。
文檔編號C12P13/00GK1715404SQ20051001255
公開日2006年1月4日 申請日期2005年5月25日 優(yōu)先權日2005年5月25日
發(fā)明者石亞偉, 袁靜明, 崔麗芳, 鈕利喜 申請人:山西大學