專利名稱：生產(chǎn)1，6－二磷酸果糖的方法
發(fā)明的所屬領(lǐng)域本發(fā)明涉及生產(chǎn)1，6-二磷酸果糖的方法，特別涉及使用傳代馴化并處理的巴斯德畢赤酵母作為生產(chǎn)菌株，經(jīng)高密度發(fā)酵生產(chǎn)1，6-二磷酸果糖的方法。
發(fā)明的背景糖酵解是細(xì)胞產(chǎn)生和利用能量的最基本的生物學(xué)過程。在這個過程中，葡萄糖分子被分解成兩分子丙酮酸，并且由不同的酶控制其中所包括的一系列反應(yīng)。在繼后的反應(yīng)中，如果細(xì)胞內(nèi)存在足夠的氧，丙酮酸將通過不同的途徑被轉(zhuǎn)化成二氧化碳和水。
1，6-二磷酸果糖(FDP)是一種天然存在的糖-磷酸分子，在糖酵解的一系列反應(yīng)中，所產(chǎn)生的FDP很快作為中間產(chǎn)物被消耗掉。因此，正常情況下，F(xiàn)DP只以相對低的濃度存在于細(xì)胞內(nèi)。
二磷酸果糖的1，6-異構(gòu)體含有連接到果糖的第1和6位碳原子上的磷酸基團(tuán)。本發(fā)明所稱的FDP即是這種1，6-異構(gòu)體。
由于FDP在許多代謝過程中所起的重要作用，所以其在醫(yī)藥領(lǐng)域中的價值越來越受到人們的重視。然而，F(xiàn)DP的生產(chǎn)卻一直不能適應(yīng)這種不斷增長的客觀需求。
目前，商品FDP仍然是使用酵母介導(dǎo)的磷酸化過程生產(chǎn)的，即利用酵母的磷酸化能力，用酵母發(fā)酵葡萄糖(右旋糖)使之磷酸化而產(chǎn)生FDP。為了利于產(chǎn)物FDP從胞漿內(nèi)排出，曾借助胞壁溶解劑如甲苯或去污劑三硝基甲苯(TRITON)處理細(xì)胞，或者通過改變溫度或造成滲透休克來提高酵母細(xì)胞壁的通透性。然而，這些方法也同時帶來了細(xì)胞壁保留胞漿內(nèi)容物的能力降低的問題，結(jié)果導(dǎo)致許多酵解酶隨FD一起通過細(xì)胞壁漏出并分散于過濾或離心的含F(xiàn)DP溶液中。
為了解決上述問題，意大利專利19865A/86號描述了使用戊二醛對酵母的糖酵解酶進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)固定，以保留酵母細(xì)胞的磷酸化能力的方法。這種方法允許人為地“調(diào)整”細(xì)胞通透性，從而既可使FDP從細(xì)胞內(nèi)流出，同時又可有效地防止代謝酶的漏出，從而保證FDP生產(chǎn)的連續(xù)進(jìn)行。
另一方面，在磷酸化過程中，由于不斷有新生成的FDP透過細(xì)胞膜被輸出，也致使酵母細(xì)胞的酶系統(tǒng)逐漸被耗盡。為了維持FDP的連續(xù)產(chǎn)生，有時必須在完成一個磷酸化過程后定時地更換酵母菌。
然而，在許多情況下，由于啤酒酵母的固有特性(細(xì)胞壁通透性、細(xì)胞酶含量及糖酵解能力等)所決定的，包括上述方法在內(nèi)的許多方法仍難以克服其作為FDP生產(chǎn)菌的種種缺陷。
發(fā)明的目的本發(fā)明的一個目的是一種使用酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)1，6-二磷酸果糖的方法，特征在于所說的酵母菌是經(jīng)過傳代馴化并進(jìn)行了處理的巴斯德畢赤酵母。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的巴斯德畢赤酵母是野生型巴斯德畢赤酵母NRRL Y-11430-SC5菌株。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的傳代是在以葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)15-20代。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的傳代過程優(yōu)化了所說的巴斯德畢赤酵母細(xì)胞的糖酵解和ATP生成能力。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的處理包括在加入葡萄糖和磷酸之前，于緩慢攪拌下向50％巴斯德畢赤酵母的水懸浮液中加入0.5體積含1.5M葡萄糖和0.8M磷酸鈉的高滲溶液，以增加酵母細(xì)胞的通透性并允許所產(chǎn)生的1，6-二磷酸果糖從胞漿流出細(xì)胞外，然后向增加了通透性的酵母細(xì)胞的懸液內(nèi)加入酵解酶保護(hù)劑。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的酵解酶保護(hù)劑是50％(V/V)酵母提取物和50％(V/V)由牛血清白蛋白(5-10g/L)，明膠(5-10g/L)，海藻糖(30-50g/L)，谷氨酸鈉(5-10g/L)，尿素(5-15g/L)和山梨醇(2-5g/L)組成的溶液。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的適于用作酵解酶保護(hù)劑成分的酵母提取物是在含有由1.5M葡萄糖和0.6M磷酸鈉組成之溶液的玻璃勻漿中經(jīng)破碎巴斯德畢赤酵母細(xì)胞而制成的。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中加入到增加了通透性的巴斯德畢赤酵母細(xì)胞的懸液內(nèi)的酵解酶保護(hù)劑的量為磷酸化混合物體積的15-20％。
發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)1，6-二磷酸果糖的方法，特別提供了使用經(jīng)過傳代馴化和體外處理的巴斯德畢赤酵母作為生產(chǎn)菌株，以高密度發(fā)酵生產(chǎn)1，6-二磷酸果糖的方法。
畢赤酵母，特別是巴斯德畢赤酵母一種可利用甲醇作為唯一碳源的甲基營養(yǎng)酵母。巴斯德畢赤酵母可以在液體或固體培養(yǎng)基上，利用葡萄糖、甘油、果糖等多種簡單碳源良好地生長。在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上，其倍增時間約為90分鐘，而在甲醇基質(zhì)上的細(xì)胞倍增時間約為6小時。在震蕩培養(yǎng)條件下，細(xì)胞的生長溫度為30℃。巴斯德畢赤酵母特別適于高密度和超高密度發(fā)酵。
與其他酵母菌相比，畢赤酵母特別是巴斯德畢赤酵母具有更加旺盛的活力(生長與代謝能力)，因此推測巴斯德畢赤酵母細(xì)胞內(nèi)可能存在有更為豐富的酶體系和磷酸化能力，從而可能更適合以葡萄糖為原料發(fā)酵生產(chǎn)1，6-二磷酸果糖。
本發(fā)明方法中所使用的優(yōu)選酵母菌株是巴斯德畢赤酵母菌株NRRLY-11430-SC5。作為野生型巴斯德畢赤酵母，NRRL Y-11430-SC5菌株具有完善和高活力的葡萄糖酵解酶體系，并因而具有很強的能量供應(yīng)分子三磷酸腺苷(ATP)的生成和輸出能力。因此，在發(fā)酵生產(chǎn)1，6-二磷酸果糖的實踐中，該菌株比常規(guī)使用的啤酒酵母具有更大的優(yōu)越性。經(jīng)過在葡萄糖培養(yǎng)基中的傳代馴化后，本發(fā)明所使用的菌株進(jìn)一步改善了其糖酵解和ATP生成能力。特別是該菌株在經(jīng)過適當(dāng)?shù)捏w外處理后，基本上可以實現(xiàn)FDP生產(chǎn)的連續(xù)進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明的方法，首先提供了用于發(fā)酵生產(chǎn)1，6-二磷酸果糖的、在含高濃度葡萄糖的培養(yǎng)基中進(jìn)一步傳代馴化的野生型巴斯德畢赤酵母菌株NRRLY-11430-SC5。其中用于傳代培養(yǎng)NRRL Y-11430-SC5酵母菌株細(xì)胞的培養(yǎng)基是添加了20g/L葡萄糖的BSM培養(yǎng)基(每升含有85％磷酸26ml，硫酸鈣0.9g，硫酸鉀18g，硫酸鎂09g，氫氧鉀4g)。細(xì)胞培養(yǎng)溫度為28-32℃。在此細(xì)胞馴化過程中，至少在如上所述的培養(yǎng)基中完成15-20代的細(xì)胞傳代培養(yǎng)。
根據(jù)本發(fā)明的方法，為了有利于酵母菌在葡萄糖酵解過程中的磷酸化循環(huán)，并使葡萄糖酵解產(chǎn)物1，6-二磷酸果糖順利地從細(xì)胞內(nèi)流出，我們首先借助改變溫度和滲透休克方法處理細(xì)胞，以提高酵母細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性。所說的方法包括離心酵母培養(yǎng)物(至少3天)并將細(xì)胞重新懸浮在無菌水中以制備酵母細(xì)胞的懸浮液。然后，向此細(xì)胞懸浮液中加入0.5體積含1.0M葡萄糖和0.5M磷酸鈉的高滲溶液并在持續(xù)攪拌下將懸液加熱到32℃。30分鐘后，以甲烯蘭染色法檢測細(xì)胞的通透性。該方法是使用同體積含001％甲烯蘭和2％乙酸鈉的溶液處理1％酵母細(xì)胞懸液，然后在顯微鏡下檢查細(xì)胞，細(xì)胞出現(xiàn)蘭色即證明已增加了通透性。或者，在細(xì)胞比較脆弱的情況下，也可以使用Triton X-100或甲苯作為細(xì)胞膜通透劑使用。
為了防止在增加了細(xì)胞通透性的情況下酵母細(xì)胞內(nèi)糖酵解酶的漏出，并保證磷酸化循環(huán)的持續(xù)進(jìn)行，有必要進(jìn)一步在細(xì)胞培養(yǎng)物中加入足夠量果糖和磷酸的濃縮溶液和酵解酶保護(hù)劑，以在細(xì)胞外造成一個反滲透條件并盡可能地防止酶降解。根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所說的酵解酶保護(hù)劑包括50％(V/V)酵母提取物和50％(V/V)由牛血清白蛋白(5-10g/L)，明膠(5-10g/L)，海藻糖(30-50g/L)，谷氨酸鈉(5-10g/L)，尿素(5-15g/L)和山梨醇(2-5g/L)組成的溶液。
根據(jù)本發(fā)明的方法，其中所說的適于用作酵解酶保護(hù)劑成分的酵母提取物是在含有1.5M葡萄糖和0.6M磷酸鈉的溶液中，于4℃下使用玻璃勻漿器破碎巴斯德畢赤酵母細(xì)胞而制成的。在這些條件下經(jīng)三次勻漿后，大約有90％的酵母細(xì)胞被破碎。
必要時，也可向細(xì)胞懸液中加入二巰基乙醇(約1-2mM)以防止酵解酶分子中的巰基被氧化。
上述處理的全部過程均在30℃和持續(xù)攪拌下進(jìn)行。
實施例實施例1
將50g離心得到的、在含高濃度葡萄糖的BSM培養(yǎng)基中傳代(共16代)培養(yǎng)的巴斯德畢赤酵母NRRL Y-11430-SC5菌株的細(xì)胞重新懸浮在40ml無菌水中，并向所得到的懸液中加入20ml由1.0M葡萄糖和0.5M磷酸鈉組成的營養(yǎng)混合物。然后將此懸液加熱到32℃。在緩慢攪拌下，在玻璃勻漿器中(4℃)制備細(xì)胞勻漿。然后向所得到的約50ml細(xì)胞勻漿中加入25mg二巰基乙醇和20ml上述酵解酶保護(hù)劑。放置30分鐘后將這些經(jīng)處理的酵母細(xì)胞用于連續(xù)的磷酸化循環(huán)。
實施例2用實施例1所述的方法處理80g離心得到的新鮮巴斯德畢赤酵母NRRLY-11430-SC5細(xì)胞，處理后按下述方法將所得到的細(xì)胞懸液用于連續(xù)的磷酸化循環(huán)。
向如上處理的高密度細(xì)胞懸液中再次加入30ml上述營養(yǎng)混合物和20ml上述酵解酶保護(hù)劑并于28℃保溫8小時。保溫后，離心收集含有1，6-二磷酸果糖的上清液并將分離出酵母細(xì)胞重新懸浮在無菌水中(總體積約100ml)。向其中假如少量15％氯化鎂溶液(2ml)和50ml上述營養(yǎng)混合物，并再次于28℃保溫8小時10小時。然后，再次分離上清、收集并重新懸浮細(xì)胞，以進(jìn)行下一輪的磷酸化循環(huán)。在完成整個10次循環(huán)后系統(tǒng)中仍有二氧化碳產(chǎn)生，表明此時細(xì)胞仍然是活的。
權(quán)利要求
1，使用酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)1，6-二磷酸果糖的方法，特征在于所說的酵母菌是傳代馴化并經(jīng)過處理的巴斯德畢赤酵母。
2，根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的巴斯德畢赤酵母是野生型巴斯德畢赤酵母NRRL Y-11430-SC5菌株。
3，根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的傳代是在以葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)15-20代。
4，根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的傳代過程優(yōu)化了所說的巴斯德畢赤酵母細(xì)胞的糖酵解和ATP生成能力。
5，根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的修飾包括在加入葡萄糖和磷酸之前，于緩慢攪拌下向巴斯德畢赤酵母細(xì)胞的50％水懸浮液中加入0.5體積含1.5M葡萄糖和0.8M磷酸鈉的高滲溶液，以增加酵母細(xì)胞的通透性并允許所產(chǎn)生的1，6-二磷酸果糖從胞漿流出細(xì)胞外，然后向增加了通透性的酵母細(xì)胞的懸液內(nèi)加入酵解酶保護(hù)劑。
6，根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的酵解酶保護(hù)劑是50％(V/V)酵母提取物和50％(V/V)由牛血清白蛋白(5-10g/L)，明膠(5-10g/L)，海藻糖(30-50g/L)，谷氨酸鈉(5-10g/L)，尿素(5-15g/L)和山梨醇(2-5g/L)組成的溶液的混合液。
7，根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的適于用作酵解酶保護(hù)劑成分的酵母提取物是在由1.5M葡萄糖和0.6M磷酸鈉組成的溶液中，使用玻璃勻漿器破碎巴斯德畢赤酵母細(xì)胞而制成的。
8，根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中加入到增加了通透性的巴斯德畢赤酵母細(xì)胞的懸液內(nèi)的酵解酶保護(hù)劑的量為磷酸化混合物體積的15-20％。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)1，6－二磷酸果糖的方法，特別涉及使用傳代馴化并處理的巴斯德畢赤酵母作為生產(chǎn)菌株，經(jīng)高密度發(fā)酵生產(chǎn)1，6－二磷酸果糖的方法。
文檔編號C12P19/02GK1603419SQ03135998
公開日2005年4月6日 申請日期2003年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月29日
發(fā)明者顏煒群 申請人:吉林圣元科技有限責(zé)任公司