專利名稱：用于進(jìn)行涉及核酸分子的直接酶反應(yīng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種直接使用生物樣品進(jìn)行涉及核酸分子的直接酶反 應(yīng)的方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
自從Watson和Crick闡明DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)以來(lái)，核酸分子已變 成分子生物學(xué)中最重要的對(duì)象和目標(biāo)。另外，已廣泛開發(fā)和研究了使 用核酸分子作為底物或模板的酶，且已經(jīng)提出了包括克隆和誘變的多 種操作核酸分子的技術(shù)。Mullis等人(1 3)已在二十世紀(jì)八十年代末開發(fā)了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR),其在分子生物學(xué)中邁出了巨大一步。此外，已報(bào)道了如連接酶 鏈反應(yīng)(LCR)、分枝DNA技術(shù)(bDNA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)、雜交 保護(hù)分析(HPA)、雜交捕獲系統(tǒng)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、環(huán)狀探針技術(shù) (CPT)、實(shí)時(shí)PCR、侵染才企測(cè)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)的多種核酸操 作技術(shù)，以滿足如基因工程、蛋白質(zhì)工程、診斷學(xué)和治療學(xué)的研究和 工業(yè)領(lǐng)域中的多種需要。同樣地，核酸分子被廣泛地應(yīng)用到多種領(lǐng)域中，它們的應(yīng)用不可 缺少地伴隨有預(yù)純化(分離)方法。換句話說(shuō)，因?yàn)楹泻怂岱肿拥纳?樣品很可能含有酶反應(yīng)特別是酶的抑制劑，所以在應(yīng)用之前需要將核 酸分子與抑制劑分離。例如，因?yàn)樯飿悠分写嬖诘母鞣N物質(zhì)抑制PCR 過(guò)程，從而不能得到所需結(jié)果，所以PCR方法通常使用從生物樣品中 純化的核酸分子作為模板。為了從生物樣品中分離或純化核酸分子，通常采用酚-氯仿抽提、 離子交換層析或使用玻璃珠的方法。然而，這些被認(rèn)為煩瑣的方法是 耗時(shí)和耗成本的方法。此外，眾所周知酚對(duì)人類和環(huán)境是十分有毒的。 因此，如果可以將生物樣品直接進(jìn)行涉及核酸的酶反應(yīng)，那么可以具 有多種優(yōu)點(diǎn)。將血液樣品用擴(kuò)增發(fā)應(yīng)，尤其是PCR進(jìn)行分析。然而，因?yàn)樵谘?液樣品中存在多種聚合酶的酶抑制劑，所以血液樣品在直接進(jìn)行擴(kuò)增 反應(yīng)中具有固有局限性。其固有的抑制劑包括血紅蛋白(4)、免疫球蛋 白G(IgG)(5)、鹽(例如，K+和Na+)、膽鹽以及血細(xì)胞中的脫氧核糖核 酸酶和蛋白酶。另外，如EDTA、肝素和檸檬酸鈉的抗凝劑對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)， 特別是PCR呈現(xiàn)出強(qiáng)的抑制活性。不經(jīng)過(guò)核酸純化的直接擴(kuò)增反應(yīng)是可行的，可以克服與核酸純化 相關(guān)的許多缺點(diǎn)，其包括(i)傳染研究者；(ii)核酸樣品間的交叉污染； (iii)核酸損失，尤其是在存在痕量樣品時(shí)；(iv)損摔毛時(shí)間和成本；以及(v) 難以自動(dòng)操作。與此相關(guān)，已進(jìn)行許多研究以提出用于進(jìn)行直接酶反 應(yīng)的方法。例如，Mercier等人(6), Panaccio等人(7)和McCusker等人(8)已 報(bào)道了直接使用血液樣品的PCR法。另外，Panaccio等人(9)已經(jīng)提出 了使用血液樣品的直接PCR法。然而，所述方法的缺點(diǎn)在于血液樣品 與甲酰胺混合并使混合物進(jìn)行預(yù)反應(yīng)(9,10)。 Burckhardt公開了改變 PCR反應(yīng)中的陽(yáng)離子濃度以使用高達(dá)80 % (v/v)的血液樣品進(jìn)行直接 PCR(ll)。根據(jù)Burckhardt的方法，PCR反應(yīng)的配方和組成根據(jù)血液樣 品的量而改變，且在擴(kuò)增反應(yīng)之前將血液樣品預(yù)熱。雖然前述報(bào)道描述了使用血液樣品進(jìn)行直接PCR的可能性，但是 需要解決如需要單鏈DNA結(jié)合蛋白(T4基因32蛋白(gp32) ) (12)或特 殊的預(yù)處理的不方便性(8,13)。最近，包括Makowski等人(14)、 Kreader(12)和Satoh等人(15)的一 些研究者也已報(bào)道了直接PCR反應(yīng)。Al-Soud等人已研究將從細(xì)菌中分離的DNA樣品與不同量的如血 液、糞便以及干酪和肉的懸浮液的生物樣品混合，然后使用各種熱穩(wěn) 定的DNA聚合酶和PCR促進(jìn)劑進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)牛血 清白蛋白(BSA)、甜菜堿和gp32可以防止血液樣品抑制PCR反應(yīng)。然 而，他們的試驗(yàn)使用與如血液的生物樣品人工混合的DNA樣品而不是 生物樣品本身，其不能反映直接擴(kuò)增反應(yīng)的真實(shí)條件。而且，他們使 用相對(duì)高含量的DNA樣品(l ng/25 pl反應(yīng)物)，從而他們不能評(píng)價(jià)是否 能使用這種PCR促進(jìn)劑進(jìn)行痕量DNA樣品擴(kuò)增。Nishimura等人已提出在高于8.9的pH范圍內(nèi)進(jìn)行PCR可以有效 地克服血液對(duì)PCR的抑制作用(美國(guó)專利號(hào)5,935,825)。另外，他們已 提出了高水平的多胺使用糞便的直接PCR反應(yīng)成為可能(美國(guó)專利號(hào) 6,413,747)。然而，因?yàn)檫@些方法采用較高的pH,所以，如AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems^^司)、FastStart Taq DNA聚合酶(Roche Applied Science7>司)和HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen^^司)的化學(xué)修 飾DNA聚合酶熱啟動(dòng)PCR在這些條件下不能進(jìn)行，且多種DNA聚合 酶不能用于這些PCR反應(yīng)中。
另外，Kato等人已提出了使用多胺進(jìn)行低拷貝DNA分子直接擴(kuò)增 反應(yīng)(美國(guó)專利號(hào)6，413，747)。然而，他們沒有直4妄-使用血液樣品。他 們而是使用間接收集的添加有人免疫缺陷病毒型1型(HIV-1) DNA分 子的白細(xì)胞，其不含如血紅蛋白的PCR抑制劑。因此，他們給出的防 止血液樣品抑制PCR活性的結(jié)果是不合理的。因此，現(xiàn)有技術(shù)中迫切需要開發(fā)一種新的不經(jīng)過(guò)核酸純化的直接 酶反應(yīng)(尤其是擴(kuò)增反應(yīng))。整個(gè)申請(qǐng)中參考多個(gè)專利和出版物，且引文列于括號(hào)中。為了更 充分地描述本發(fā)明和本發(fā)明所述技術(shù)領(lǐng)域的情況，在此將這些專利和 出版物的內(nèi)容全部引入本申請(qǐng)中作為參考。發(fā)明內(nèi)容在這種背景下，本發(fā)明人已進(jìn)行深入研究，以開發(fā)用于直接使用 生物樣品進(jìn)行涉及核酸分子的直接酶反應(yīng)的新方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，包含 在反應(yīng)混合物中的兩性離子緩沖液和/或非還原性碳水化合物使生物樣 品中含有的核酸分子不經(jīng)過(guò)預(yù)純化而直接酶反應(yīng)是可行的。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于進(jìn)行涉及核酸分子和直 接使用生物樣品的的直接酶反應(yīng)的方法。本發(fā)明的另 一個(gè)目的是提供一種用于進(jìn)行涉及核酸分子和直接使 用生物樣品的直接酶反應(yīng)的試劑盒。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種防止生物樣品抑制涉及核酸分子 的酶反應(yīng)的方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供兩性離子緩沖液和/或非還原性碳水化 合物用于制備用于涉及核酸分子的直接酶反應(yīng)的反應(yīng)混合物的用途。結(jié)合附屬權(quán)利要求和附圖，通過(guò)下面的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它 目的和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見。


圖1示出使用引物對(duì)GH20/GH21的(3-珠蛋白基因(408 bp)的直接 PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))結(jié)果。泳道1-9對(duì)應(yīng)于Tris緩沖液(pH分別為8.3 、 8.4、 8.5、 8.6、 8.7、 8.8、 8.9、 9.0和9.2),泳道10-20對(duì)應(yīng)于Tricine 緩沖液(pH分別為8.0、 8.1、 8.2、 8.3、 8.4、 8.5、 8.6、 8.7、 8.8、 8.9 和9.0)，泳道21-29對(duì)應(yīng)于Bicine緩沖液(pH分別為8.0、 8.1、 8.2、 8.3、8.4、 8.5、 8.6、 8.7和8.8),且泳道30-40對(duì)應(yīng)于HEPES緩沖液(pH分 別為8.0、 8丄8.2、 8.3、 8.4、 8.5、 8.6、 8.7、 8.8、 8.9和9.0)。 L表示 范圍為100 1500bp的100bp梯度。圖2示出使用引物對(duì)GH20/KM38的(3-珠蛋白基因(325bp)的直接 PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))結(jié)果。泳道1-9對(duì)應(yīng)于Tricine緩沖液(pH分別為 8.0、 8.3、 8.4、 8.5、 8.6、 8.7、 8.8、 8.9和9.0),且泳道10-19對(duì)應(yīng)于 Tris緩沖液(pH分別為8.3、 8.4、 8.5、 8.6、 8.7、 8.8、 8.9、 9.0、 9.2和 9.5)。 L表示范圍為100 1500bp的100bp梯度。圖3示出p53基因的直接PCR結(jié)果。泳道1-9表示使用Tris緩沖 液(pH分別為8.3、 8.4、 8.5、 8.6、 8.7、 8.8、 8.9、 9.0和9.2)的結(jié)果， 泳道10-20表示使用Tricine緩沖液(pH分別為8.0、 8.1、 8.2、 8.3、 8,4、8.5、 8.6、 8.7、 8.8、 8.9和9.0)的結(jié)果，泳道21-29表示使用Bicine緩
沖液(pH分別為8.0、 8.1、 8.2、 8.3、 8.4、 8.5、 8.6、 8.7和8.8)的結(jié)果， 且泳道30-40表示使用HEPES緩沖液(pH分別為8.0、 8.1、 8.2、 8.3、 8.4、 8.5、 8.6、 8.7、 8.8、 8.9和9.0)的結(jié)果。L表示范圍為100 1500bp 的100bp梯度。圖4表示多種非還原性碳水化合物防止血液樣品抑制擴(kuò)增反應(yīng)的 可能性的分析結(jié)果葡萄糖(板A，泳道3-6)，蔗糖(板A，泳道7-10)， 乳糖(板A,泳道11-14),松三糖(板A，泳道15-18)，水蘇糖(板A,泳 道19-22),海藻糖(板B,泳道3-6),蜜三糖(板B,泳道7-10)，山梨糖 醇(板B,泳道11-14),甘露醇(板B,泳道15-18),聚乙烯吡咯烷酮(板 B,泳道19-22)。在板A和B中，泳道1對(duì)應(yīng)于不添加非還原性碳水 化合物，且泳道2對(duì)應(yīng)于使用2 ng人基因組DNA代替血液的結(jié)果。圖5示出使用蜜三糖或海藻糖作為用于防止血液抑制擴(kuò)增反應(yīng)的 試劑的直接PCR結(jié)果。使用Tris緩沖液(pH 8.3)(泳道l-12)或Tricine 緩沖液(pH8.3)(泳道13_24)。蜜三糖最終濃度(。/。(w/v))為0 (泳道1和 13)、 1.4 (泳道2和14)、 2.8 (泳道3和15)、 4.2 (泳道4和16)、 5.6 (泳 道5和17)和7.0 (泳道6和18)。使用的海藻糖的最終濃度(。/。(w/v))為 1.5 (泳道8和20)、 3.0 (泳道9和21)、 4.5 (泳道10和22)、 6.0 (泳道11 和23)和7.5 (泳道12和24)。圖6示出使用海藻糖作為阻止血液對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的抑制作用的試劑 的直接PCR結(jié)果。使用Tricine緩沖液(pH8.3)和2.0單位AmpliTaq DNA 聚合酶。在泳道1-8中使用的海藻糖的最終濃度分別為0、 2.4、 4.8、 6、 12、 18、 24和30。/。(w/v)。
圖7表示海藻糖根據(jù)pH對(duì)直接擴(kuò)增反應(yīng)的影響的分析結(jié)果。泳道l-9對(duì)應(yīng)于Tris緩沖液(pH分別為8.3、 8.4、 8.5、 8.6、 8.7、 8.8、 8.9、 9.0和9.2)，且泳道10-20對(duì)應(yīng)于Tricine緩沖液(pH分別為8.0、 8.1、 8.2、 8.3、 8.4、 8.5、 8.6、 8.7、 8.8、 8.9禾口 9.0)。 <吏用1單4立AmpliTaq DNA聚合酶。板A表示0。/。海藻糖，且板B表示3。/。(W/V)海藻糖。圖8示出使用CHAPS擴(kuò)增p53基因的直接PCR結(jié)果。使用Tricine 緩沖液(pH 8.3)(泳道l-9)或Tricine緩沖液(pH 8.7)(泳道10-15)。使用 包含0.4mM三亞乙基四胺(泳道2)或2.4。/。海藻糖(泳道3-15)的共50jil 的PCR反應(yīng)物。CHAPS的濃度為0 mM (泳道1 、 2和3)、 0.3 mM (泳 道4和10)、 0.6 mM (泳道5和11)、 1.25 mM (泳道6和12)、 2.5 mM (泳 道7和13)、 5 mM (泳道8和14)以及10 mM (泳道9和15)。圖9示出使用多胺、亞精胺(板A)和三亞乙基四胺(板B)擴(kuò)增p53 基因的直接PCR結(jié)果。直接使用l)il肝素處理的血液。泳道l-6對(duì)應(yīng) 于Tris緩沖液(pH 8.3),泳道7-12對(duì)應(yīng)于Tricine緩沖液(pH 8.3),泳道 13-18對(duì)應(yīng)于Tris緩沖液(pH 8.7)，且泳道19-24對(duì)應(yīng)于Tricine緩沖液 (pH 8.7)。亞精胺或三亞乙基四胺最終濃度為0 mM (泳道1、 7、 13和 19)、 0.25mM(泳道2、 8、 14和20)、 0,5mM(泳道3、 9、 15和21)、 1.0mM(泳道4、 10、 16和22)、 2.0mM(泳道5、 11、 17和23)、 4 mM (泳道6、 12、 18和24)。圖10示出使用包含不同濃度的亞精胺(泳道1-6和13-18)或三亞乙 基四胺(泳道7-12和19-24)的Tricine緩沖液(泳道1-12 pH 8.3，泳道 13-24 pH8.7)的直接PCR結(jié)果。直接使用2|_11肝素處理的血液。亞精胺 或三亞乙基四胺最終濃度為0 mM (泳道1 、 7、 13和19)、 0.25 mM (泳 道2、 8、 14和20)、 0.5mM()氷道3、 9、 15和21)、 1.0mM(泳道4、
10、 16和22)、 2.0mM(泳道5、 11、 17和23)、 4mM(泳道6、 12、 18和24)。圖11示出使用不同濃度的BSA(牛血清白蛋白)擴(kuò)增p53基因的直 接PCR結(jié)果。泳道1-6對(duì)應(yīng)于Tris緩沖液(pH 8.3)、泳道7-12對(duì)應(yīng)于 Tricine緩沖液(pH 8.3),泳道13-18對(duì)應(yīng)于Tris緩沖液(pH 8.7)、且泳道 19-24對(duì)應(yīng)于Tricine緩沖液(pH 8.7)。 BSA的最終濃度為0 mg/ml (泳道 1、 7、 13和19)、 0.62 mg/ml (泳道2、 8、 14和20)、 1.25 mg/ml (泳道 3、 9、 15和21)、 2.5mg/ml(泳道4、 10、 16和22)、 5mg/ml(泳道5、11、 17和23)、 10mg/ml(泳道6、 12、 18和24)。圖12表示使用不同的模板擴(kuò)增p53基因的PCR結(jié)果。泳道1-6對(duì) 應(yīng)于人基因組DNA(分別為0.3、 0.6、 1.25、 2.5、 5和10ng)，泳道7-12 對(duì)應(yīng)于肝素處理的血液(分別為0.6、 1.25、 2.5、 5、 10和20 jil)，泳道 13-18對(duì)應(yīng)于EDTA處理的血液(分別為0.6、 1.25、 2.5、 5、 10和20)dl)， 且泳道19-24對(duì)應(yīng)于檸檬酸鈉處理的血液(分別為0.6、 1.25、 2.5、 5、 10和20 nl)。使用Tricine緩沖液(pH 8.7)。圖13表示使用不同的模板擴(kuò)增p53基因的PCR結(jié)果。泳道l-6對(duì) 應(yīng)于人基因組DNA(分別為0.3、 0.6、 1.25、 2.5、 5和10ng),泳道7-12 對(duì)應(yīng)于肝素處理的血液(分別為0.3、 0.6、 1.25、 2.5、 5和lOpl),泳道 13-18對(duì)應(yīng)于EDTA處理的血液(分別為0.3、 0.6、 1.25、 2.5、 5和10 (il)， 且泳道19-24對(duì)應(yīng)于檸檬酸鈉處理的血液(分別為0.3、 0.6、 1.25、 2.5、 5和10^1)。 PCR反應(yīng)物包含Tricine緩沖液(pH 8.7)、 2.4 % (w/v)海藻 糖和4 mg/ml BSA。
圖14示出使用甜菜堿在本發(fā)明所提供的條件下擴(kuò)增人成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因(板A和B， 180bp)或載脂蛋白E基因(板C和D, 268bp)的直 接PCR結(jié)果。使用20ng人基因組DNA(板A和C)或l^d肝素處理的 血液(板B和D)作為模板。泳道1-5中的甜菜堿的最終濃度分別為0、 0.5、 1.0、 1.5、 2.0禾口2.5M。圖15示出以不同拷貝數(shù)和不同血液樣品的量來(lái)擴(kuò)增HIV-1(人免疫 缺陷病毒-1)的核苷酸序列的直接PCR結(jié)果。PCR反應(yīng)物包含Tricine 緩沖液(pH8.3)、 2.8 % (w/v)海藻糖和4 mg/ml BSA。泳道1-6對(duì)應(yīng)于 分別包含0、 10、 20、 30、 40和50拷貝HIV-1質(zhì)粒的1 pl肝素處理 的血液，且泳道7-13對(duì)應(yīng)于分別包含在0、 1、 2、 3、 4、 5和6 |il肝 素處理的血液樣品中的20拷貝HIV-1質(zhì)粒。4吏用引物對(duì)SK145和 SK431以產(chǎn)生142 bp的擴(kuò)增子。圖16示出以不同拷貝數(shù)和不同血液樣品的量來(lái)擴(kuò)增HIV-l(人免疫 缺陷病毒-l)的核苷酸序列的直接PCR結(jié)果。PCR反應(yīng)物包含Tricine 緩沖液(pH8.3)、 2.8 % (w/v)海藻糖和4 mg/ml BSA。泳道l-6對(duì)應(yīng)于 分別包含0、 10、 20、 30、 40和50拷貝HIV-1質(zhì)粒的1 pl肝素處理 的血液，且泳道7-13對(duì)應(yīng)于分別包含在0、 1、 2、 3、 4、 5和6 (il肝 素處理的血液樣品中的20拷貝HIV-1質(zhì)粒J吏用引物對(duì)SK38和SK39 以產(chǎn)生115 bp的擴(kuò)增子。圖17示出使用多種熱穩(wěn)定的DNA聚合酶的p53基因的擴(kuò)增結(jié)果。 泳道1-5對(duì)應(yīng)于PfU DNA聚合酶，泳道6-10對(duì)應(yīng)于Pwo DNA聚合酶， 且泳道11-15對(duì)應(yīng)于Tth DNA聚合酶。泳道1、 6和11對(duì)應(yīng)于Tris 緩沖液(pH 8.3)，泳道2、 7和12對(duì)應(yīng)于Tris緩沖液(pH 8.7)， 泳道3、 8和13對(duì)應(yīng)于Tricine緩沖液(pH8.3),且泳道4、9和14對(duì)應(yīng)于Tricine
緩沖液(pH 8.7),其全部包含2.4。/。的海藻糖。泳道5、 10和15各自4吏 用商業(yè)制造商提供的反應(yīng)混合物。圖18示出擴(kuò)增在細(xì)胞培養(yǎng)基中的p53基因的PCR結(jié)果。使用包 含2.4%的海藻糖的Tricine緩沖液(pH 8.7)。使用10 ng人基因組DNA 作為模板。泳道l-6分別表示2、 5、 10、 15和20 (il的細(xì)胞培養(yǎng)基(包 含10%FBS的DMEM)。圖19示出使用唾液(板A)或血液(板B)通過(guò)AmpFLSTR Identifier 試劑盒(Applied Biosystems公司)獲得的分析結(jié)果中的藍(lán)染 結(jié)果。使用的反應(yīng)混合物包含海藻糖作為用于防止生物樣品抑制擴(kuò)增 反應(yīng)的試劑。圖20示出直接使用hepG2-SK細(xì)胞擴(kuò)增(3-肌動(dòng)蛋白基因(264 bp) 的RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))結(jié)果。泳道1和2分別表示人基因 組DNA和總cDNA的RT-PCR結(jié)果。泳道3-4對(duì)應(yīng)于直4妻<吏用1 x 103 個(gè)細(xì)胞的RT-PCR結(jié)果，且泳道5-6對(duì)應(yīng)于直接使用1 x 104個(gè)細(xì)胞的 結(jié)果。泳道3和5為不使用逆轉(zhuǎn)錄酶的結(jié)果(RT-陰性)；泳道4和6為 使用逆轉(zhuǎn)錄酶的結(jié)果(RT-陽(yáng)性)。圖21表示使用從牛肉組織得到的溶解產(chǎn)物樣品的直接PCR & RFLP(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)分析的結(jié)果。泳道1-2對(duì)應(yīng)于分離的 DNA,泳道3-4對(duì)應(yīng)于1 mg肉溶解產(chǎn)物，且泳道5-6對(duì)應(yīng)于10 mg肉 溶解產(chǎn)物沖莫板。泳道2、 4和6表示對(duì)擴(kuò)增子的MspAlI處理的結(jié)果。圖22A示出直接使用含有弗氏志賀菌(幼&e他i7e;me/7)的糞便樣品 擴(kuò)增virA基因的直接PCR結(jié)果。泳道1-8表示Tris緩沖液(pH 8.3),
且泳道9_16表示含有2.4 % (w/v)海藻糖的Tricine緩沖液(pH 8J)。弗 氏志賀菌的滴度調(diào)整到128,000 CFU (泳道1和9)、 6,400 CFU (泳道2 和10)、 320 CFU (泳道3和11)、 16 CFU (泳道4和12)、 8 CFU (泳道5 和13)、 4CFU (泳道6和14)、 2 CFU (泳道7和15)以及1 CFU (泳道8 和16)。
圖22B表示實(shí)時(shí)PCR的結(jié)果。上面的小圖表示標(biāo)準(zhǔn)曲線，且下面 的小圖表示來(lái)自SYBR Green I試驗(yàn)的熔解曲線分析，其表示刺入糞便 中的弗氏志賀菌的virA基因檢測(cè)。
圖23示出使用包括20 ng分離的DNA(泳道1)、 0.4 mg(泳道2)和 0.1 mg(泳道3)凍干粉末、各1 (id來(lái)自水稻葉的0.04 mg/)al的葉懸浮液(泳 道4)和0.1 mg/pl的葉懸浮液(泳道5)的多種植物樣品來(lái)擴(kuò)增水稻(3-肌 動(dòng)蛋白基因的直接PCR結(jié)果。板A表示含2.4%海藻糖的Tricine緩沖 液(pH 8.3)，且板B表示Tris緩沖液(pH 8.3)。
圖24示出直接使用從組織微陣列(ISU Abxis公司)中提取的組織點(diǎn) 來(lái)擴(kuò)增表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因的直接PCR結(jié)果。泳道1-4分別 對(duì)應(yīng)于EGFR基因的外顯子18、 19、 20和21。使用包含2.4%海藻糖 的Tricine緩沖液(pH 8.3)。
圖25表示在ABI 3100基因分析儀上分析的SNaPshot ddNTP引物 延伸(Primer-Extension)試驗(yàn)的電泳圖，其用于SNP(單核苷酸多態(tài)性)基 因分型，以檢測(cè)EGFR基因的啟動(dòng)子區(qū)域的多態(tài)性(上面的圖，TT純合 子；中部的圖GT雜合子；以及底部的圖，GG純合子)。 圖26A和26B表示由熒光染料終止循環(huán)測(cè)序法得到的測(cè)序數(shù)據(jù)。 在循環(huán)測(cè)序之前，用NucleoSpin Extract II將直接PCR產(chǎn)物進(jìn)行PCR 產(chǎn)物純化(圖26A)或不經(jīng)過(guò)純化(圖26B)。
具體實(shí)施方式
在本發(fā)明的 一 個(gè)技術(shù)方案中，提供一種用于進(jìn)行涉及核酸分子的 直接酶反應(yīng)的方法，其包括如下步驟(a)直接使用生物樣品在包含兩 性離子緩沖液和/或非還原性碳水化合物的反應(yīng)混合物中進(jìn)行酶反應(yīng)， 該兩性離子緩沖液和/或非還原性碳水化合物用于防止生物樣品抑制酶 反應(yīng)，其中在酶反應(yīng)之前不純化生物樣品中存在的核酸分子；以及(b) 從酶反應(yīng)中得到產(chǎn)物。在本發(fā)明的另 一個(gè)技術(shù)方案中，提供一種用于進(jìn)行涉及核酸分子 的直接酶反應(yīng)并直接使用生物樣品的試劑盒，其包括用于酶反應(yīng)的反 應(yīng)混合物，該反應(yīng)混合物包含用以防止生物樣品抑制酶反應(yīng)的兩性離 子緩沖液和/或非還原性碳水化合物，而存在于生物樣品中的核酸分子 在酶反應(yīng)之前不需要純化。本發(fā)明人已進(jìn)行深入研究，以開發(fā)用于直接使用生物樣品進(jìn)行涉 及核酸分子的直接酶反應(yīng)的新方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，包含在反應(yīng)混合物中 的兩性離子緩沖液和/或非還原性碳水化合物使生物樣品中含有的核酸 分子不經(jīng)過(guò)預(yù)純化而直接酶反應(yīng)是可行的。使用生物樣品的直接酶反應(yīng)的成功取決于如何防止生物樣品抑制 酶反應(yīng)。本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)"直接酶反應(yīng)"指直接使用生物樣品而 不需要用于分離或純化生物樣品中包含的特定生物物質(zhì)的預(yù)處理的由 酶催化的反應(yīng)。
如體液(例如，血液、唾液和淋巴液)的生物樣品和細(xì)胞培養(yǎng)物通常 含有酶反應(yīng)特別是本身是酶的固有抑制劑。本發(fā)明完全保證克服與存 在于生物樣品中的酶抑制劑有關(guān)的缺陷，從而可以使用生物樣品以較 高的效率和適用性成功地進(jìn)行直接酶反應(yīng)。本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)"涉及核酸分子的酶反應(yīng)"指使用核酸分子作為 底物、模板或引物的由酶催化的反應(yīng)。涉及核酸分子的酶反應(yīng)引起核 酸分子的改變。本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)"核酸"指單鏈或雙鏈形式的脫氧核 糖核酸或核糖核酸聚合物。本發(fā)明可以以較高的效率和適用性使用生物樣品來(lái)進(jìn)行直接酶反 應(yīng)，其不需要任何預(yù)處理以分離或純化生物樣品中存在的核酸分子。本發(fā)明可以應(yīng)用到多種涉及核酸(NA)的酶反應(yīng)。優(yōu)選將本發(fā)明應(yīng) 用到擴(kuò)增反應(yīng)、逆轉(zhuǎn)錄、DNA連接、核酸酶介導(dǎo)的反應(yīng)、DNA曱基化、 拓樸異構(gòu)酶介導(dǎo)的反應(yīng)或端粒酶介導(dǎo)的反應(yīng)。使用的術(shù)語(yǔ)"擴(kuò)增反應(yīng)"指用于擴(kuò)增核酸分子的反應(yīng)。本領(lǐng)域中已 提出了多種擴(kuò)增反應(yīng)，其包括但不限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(下文稱為 PCR)(美國(guó)專利號(hào)4,683,195、 4,683,202和4,800,159)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈 式反應(yīng)(下文稱為RT-PCR) (Sambrook， J.等人，Molecular Cloning. A Laboratory Manual,第 3 Zf反.Cold Spring Harbor Press (2001)), the methods of Miller, H. I. (WO 89/06700)以及Davey, C.等人(EP 329,822)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)(17, 18)、缺口-LCR (WO 90/01069)、修 復(fù)鏈反應(yīng)(EP 439,182)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA) (19) (WO 88/10315)、 自主序列復(fù)制(20) (WO 90/06"5)、目標(biāo)多核苷酸序列的選擇性擴(kuò)增(美 國(guó)專利號(hào)6,410,276)、共有序列引物聚合酶鏈反應(yīng)(CP-PCR)(美國(guó)專利
號(hào)4,437,975)、隨機(jī)引物聚合酶鏈反應(yīng)(AP-PCR)(美國(guó)專利號(hào)5,413，卯9 和5,861,245)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)(美國(guó)專利號(hào)5,130,238、 5,409,818、 5,554,517和6,063,603)、鏈置換擴(kuò)增(21, 22)和環(huán)介導(dǎo)等溫 擴(kuò)增(LAMP)(23)。可以1"吏用美國(guó)專利號(hào)5,242,794、 5,494,810、 4,988,617 以及美國(guó)序列號(hào)09/854,317中所描述的其它擴(kuò)增方法。本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)"逆轉(zhuǎn)錄"指以RNA為模板合成DNA的反 應(yīng)。例如，RT-PCR涉及逆轉(zhuǎn)錄。術(shù)語(yǔ)"DNA連接"意指在兩個(gè)DNA 分子之間形成共價(jià)連接的反應(yīng)。例如，LCR中涉及DNA連接。本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)"核酸酶介導(dǎo)的反應(yīng)"指由核酸酶催化的切 斷核酸分子間的磷酸二酯鍵的反應(yīng)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知多種核酸 酶。例如，核酸酶包括但不限于內(nèi)切核酸酶(例如，F(xiàn)EN-1內(nèi)切核酸酶、 限制性內(nèi)切酶、DNase I、 DNase II和RNase I)和外切核酸酶(蛇毒磷酸 二酯酶和脾磷酸二酯酶)。例如，F(xiàn)EN-I內(nèi)切核酸酶在侵染檢測(cè)中起關(guān) 鍵作用。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)"DNA曱基化"指在DNA堿基的特定位置引 起曱基化的反應(yīng)。本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)"拓樸異構(gòu)酶介導(dǎo)的反應(yīng)"指 由拓樸異構(gòu)酶(例如，I或II型拓樸異構(gòu)酶)催化的將共價(jià)閉合環(huán)狀DNA 的一種拓樸異構(gòu)體轉(zhuǎn)變成另一種的反應(yīng)。術(shù)語(yǔ)"端粒酶介導(dǎo)的反應(yīng)" 指由端粒酶催化的在端粒產(chǎn)生一條鏈的重復(fù)單元的反應(yīng)。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述酶反應(yīng)為擴(kuò)增反應(yīng)。完成本方法以擴(kuò)兩性離子緩沖液和/或非還原性碳水化合物的反應(yīng)混合物來(lái)進(jìn)行。本發(fā) 明的直接擴(kuò)增優(yōu)選包括如下步驟(i)獲得包括目標(biāo)核酸分子的生物樣 品；(ii)將上述生物樣品接觸用于擴(kuò)增反應(yīng)的包含酶以及用以防止生物樣品抑制擴(kuò)增反應(yīng)的兩性離子緩沖液和/或非還原性碳水化合物的反應(yīng)混合物中；以及(iii)擴(kuò)增目標(biāo)核酸分子。本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)"直接擴(kuò)增"指直接使用生物樣品而不需要 用于分離或純化生物樣品中包含的核酸分子的預(yù)處理的擴(kuò)增反應(yīng)。包含于反應(yīng)混合物中的酶包括但不限于用于基于PCR擴(kuò)增的熱穩(wěn) 定的DNA聚合酶、用于LCR的熱穩(wěn)定的連接酶以及用于NASBA和 TMA的逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase H和RNA聚合酶。根據(jù)本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方式，所述酶反應(yīng)為基于PCR的擴(kuò)增。PCR是用于核酸擴(kuò)增的最重要的方法之一，已經(jīng)開發(fā)其多種變形 和應(yīng)用。例如，為了提高PCR的特異性或靈敏度，通過(guò)修改傳統(tǒng)PCR 方法已開發(fā)了遞減PCR(24)、熱啟動(dòng)PCR(25，26)、巢式PCR(2)和加強(qiáng) PCR(27)。另外，為了特定應(yīng)用已經(jīng)提出了實(shí)時(shí)PCR、差異顯示PCR (DD-PCR)、 cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)、多重PCR、反向聚合酶鏈反 應(yīng)(IPCR)、載體PCR(Vectorette PCR)、熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR (TAIL-PCR) 和多重PCR。 PCR的具體內(nèi)容可以參考McPherson， M.丄，和Moller, S. G PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N. Y. (2000),其全部?jī)?nèi)容引入此處作為參考。雖然已經(jīng)報(bào)道了多種基于PCR的擴(kuò)增方法，但是其遵循共同的步 驟如熱循環(huán)并使用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶。根據(jù)基于PCR的擴(kuò)增完成本發(fā)明，其可以包括如下步驟(i)獲得 包括目標(biāo)核酸分子的生物樣品；(ii)將上述生物樣品接觸用于PCR的包 含熱穩(wěn)定的DNA聚合酶以及用以防止生物樣品抑制擴(kuò)增反應(yīng)的兩性
離子緩沖液和/或非還原性碳水化合物的反應(yīng)混合物中；以及(iii)擴(kuò)增目 標(biāo)核酸分子。包含在PCR反應(yīng)物中的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶可以是從嗜熱性真 細(xì)菌或古細(xì)菌，例如水生嗜熱菌(r力e/7770s a 朋f/'c"^、 r tf e/777opA 7/cs、77 e/mo/ /^S77 a ac/Jo/ 力/Aw和5W^ /o&" s/ ec中分離的 一種。所述熱穩(wěn) 定的DNA聚合酶優(yōu)選為Tag DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Pfo DNA 聚合酶、PwoDNA聚合酶以及在室溫下無(wú)活性的修飾的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶。在室溫下無(wú)活性的修飾的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶包括化學(xué)修飾的 熱穩(wěn)定的DNA聚合酶和抗體結(jié)合的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶。本發(fā)明中 使用的術(shù)語(yǔ)"化學(xué)地修飾(或化學(xué)修飾)的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，，指經(jīng) 過(guò)化學(xué)修飾以在室溫下無(wú)活性的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，其已開發(fā)用于 熱啟動(dòng)PCR。化學(xué)修飾的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶在起始再生(regeneration) 步驟(例如，在95。C下加熱10分鐘)中再生然后進(jìn)行PCR。市售的化學(xué) 修飾的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶的非限制性例子包括AmpliTaq Gold DNA 聚合酶(Applied Biosystem公司)、FastStart Taq DNA聚合酶(Roche Applied Science公司)和HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen公司)?？贵w結(jié) 合的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶由于結(jié)合的抗體而在室溫下無(wú)活性，而在高 溫下抗體變性時(shí)變得有活性。
在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，優(yōu)選在反應(yīng)容器中提供過(guò)量的用于這種反應(yīng) 的成分。所指的擴(kuò)增反應(yīng)的成分的過(guò)量是指各成分的量使得完成所述 擴(kuò)增的能力基本不受所述成分的濃度的限制。需要向反應(yīng)混合物中提供充足量的如Mg2+的輔因子以及dATP、 dCTP、 dGTP和dTTP,以達(dá)到所需的擴(kuò)增程度。種出版物中，如Joseph Sambrook等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)以及McPherson， M丄，和Moller, S. G. PCR, BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N. Y. (2000),在此包含其全部技術(shù)內(nèi)容作為參考。除了直接使用生物樣品代替分離的 核酸模板，并在反應(yīng)混合物中使用兩性離子緩沖液和/或非還原性碳水 化合物之外，可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一般用于PCR的方法和 條件進(jìn)行本發(fā)明的直接PCR。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，根據(jù)RT-PCR進(jìn)行本發(fā)明。令人驚訝地， 本發(fā)明使得無(wú)需RNA分離的直接RT-PCR是可行的。本發(fā)明的直接 RT-PCR在擴(kuò)增步驟之前包括用于從mRNA制備cDNA的反轉(zhuǎn)錄步驟， 其詳纟田內(nèi)容參考Joseph Sambroo—k等人,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001);以及Noonan，K.F等人(28)。為進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用可與mRNA 的poly A尾巴雜交的寡核苷酸dT引物?？梢杂媚孓D(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄， 例如，來(lái)自MMLV(莫洛尼鼠類白血病毒)、AMV(禽類成髓胞瘤病 毒)或HIV (人免疫缺陷病毒)。 根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，將本發(fā)明應(yīng)用于熱啟動(dòng)PCR。已開發(fā)熱啟動(dòng)PCR以提高PCR的靈敏度和特異性(25)。用于傳染病或法醫(yī)學(xué)的擴(kuò) 增反應(yīng)通常使用低拷貝數(shù)的核酸樣品。尤其是，為診斷如與HIV和HBV 相關(guān)的疾病的傳染病，病毒感染的早期檢測(cè)很重要。換句話說(shuō)，為得 到準(zhǔn)確可靠的診斷結(jié)果，必須擴(kuò)增以低拷貝數(shù)存在的病毒的核酸分子。 根據(jù)本發(fā)明，可以直接使用生物樣品通過(guò)熱啟動(dòng)PCR來(lái)擴(kuò)增低拷貝數(shù) 的核酸分子。本發(fā)明中的這種成果歸因于使用用以防止生物樣品抑制 酶反應(yīng)的兩性離子緩沖液和/或非還原性碳水化合物。所述兩性離子緩 沖液和/或非還原性碳水化合物可以在比前面報(bào)道的pH (例如，pH 9.0) 相對(duì)低的pH(例如，pH 8.3)下發(fā)揮這種作用，/人而可以-使用生物樣品在 本發(fā)明提供的條件下通過(guò)化學(xué)修飾的聚合酶來(lái)成功地完成熱啟動(dòng) PCR。另外，本發(fā)明可以應(yīng)用到在室溫下使用如葡聚糖硫酸酯(美國(guó)專利 號(hào)6，667,165)或適體(29，30)的聚合酶抑制劑的其它熱啟動(dòng)PCR變形中。在此處包含其內(nèi)容作為參考D'Aquila, R. T.等人(25、 26、 31、 32) 中描述了用于熱啟動(dòng)PCR的一般方法和條件。除了直接使用生物樣品 代替分離的核酸，并在反應(yīng)混合物中使用兩性離子緩沖液和/或非還原 性碳水化合物之外，可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一^殳用于熱啟動(dòng) PCR的方法和條件進(jìn)行本發(fā)明的直接熱啟動(dòng)PCR。本發(fā)明中使用的生物樣品不限于但優(yōu)選包括病毒、細(xì)菌、組織、 纟田月包、血液、'淋巴液、骨髓液、唾液、奶、尿、糞i"更、目艮內(nèi)液、精液、 腦提取物、脊髓液、關(guān)節(jié)液、胸液(thymic fluid)、腹水、羊水和細(xì)胞組 織液，更優(yōu)選為病毒、纟田菌、組織、細(xì)胞、血液、唾液、奶、尿和糞
便，仍更優(yōu)選為病毒、細(xì)菌、組織、細(xì)胞和血液，且最優(yōu)選為血液。 作為生物樣品，血液可以是全血、血漿或血清，優(yōu)選為全血樣品。優(yōu)選的是，在加入混合物之前，用如肝素、EDTA(乙二胺四乙酸)和檸檬酸鈉的抗凝劑預(yù)處理全血。然而，抗凝劑很可能抑制酶反應(yīng)，尤其是PCR活性，從而它們?cè)诖_定向PCR反應(yīng)物中加入血液的量中變 成限制性因素。本發(fā)明使用兩性離子緩沖液和/或非還原性碳水化合物 可以克服來(lái)自抗凝劑的這種缺點(diǎn)，從而可以在直接擴(kuò)增中使用較大量 的血液，例如，如實(shí)施例in所示，相對(duì)于反應(yīng)混合物總體積高達(dá)10%(v/v)。本發(fā)明最主要的特征在于使用作為用于防止生物樣品抑制酶反應(yīng) 的試劑的兩性離子緩沖液和/或非還原性碳水化合物。生物樣品中存在的多種物質(zhì)(例如，血紅蛋白、免疫球蛋白G、無(wú)機(jī)鹽、膽鹽、脫氧核 糖核酸酶和蛋白酶)抑制反應(yīng)涉及的酶的活性。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，兩性離抑制反應(yīng)中的酶的物質(zhì)的障礙。本發(fā)明的這種巨大的效果可以在兩性 離子緩沖液或非還原性碳水化合物的單獨(dú)幫助下實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選地，本發(fā) 明使用兩性離子緩沖液和非還原性碳水化合物。本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)"兩性離子緩沖液"指包含在同一分子中具 有酸性和堿性基團(tuán)的化合物的緩沖液。在中性pH下，多數(shù)兩性離子緩 沖液同時(shí)具有負(fù)電荷的陰離子和正電荷的陽(yáng)離子。兩性離子緩沖液有 時(shí)被稱為"Good"緩沖液(33)。在本發(fā)明中可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員 已知的任何兩性離子緩沖液，其優(yōu)選包括HEPES (4-(2-羥乙基)-l-哌。秦 乙烷磺酸)、Tricine (N-三(羥曱基)曱基甘氨酸)、Bicine (N,N-雙(2-羥乙
基)甘氨酸)、Taps (N-三(羥曱基)曱基J-氨基丙烷磺酸)、ACE(N-O乙 酰胺)-2-氨基乙烷-磺酸)、ADA (N-(2-乙酰胺)-亞氨基二乙酸)、MES (2-(N-嗎啉代)-乙烷磺酸)、MOPS (3-(N-嗎啉代)丙烷磺酸)和MOPSO (3-N-嗎啉代)-2-羥基丙烷磺酸)、MOPSO(3-N-嗎啉代)-2-羥基丙烷磺 酸)、PIPES 4-雙(2-乙烷磺酸))和CAPS (N-環(huán)己基-3_氨基丙烷磺酸)，更優(yōu)選HEPES、 Tricine和Bicine，且最優(yōu)選Tricine。本發(fā)明中使用的兩性離子緩沖液的濃度沒有特別限制，優(yōu)選為 5 60mM，更優(yōu)選為10 60mM,且最優(yōu)選為10 50 mM。才艮據(jù)如使用 的酶的類型的多個(gè)反應(yīng)條件的改變通過(guò)兩性離子緩沖液調(diào)整的反應(yīng)混 合物的pH,優(yōu)選在6.8 9.5、更優(yōu)選在7.5 9.0、且最優(yōu)選在8.0~8.7的范圍內(nèi)。直接酶反應(yīng)。本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)"非還原性碳水化合物"指具有不少于兩個(gè) 羥基且不具有還原能力的碳水化合物。非還原性碳水化合物包括多元 醇(多羥基化合物)及其衍生物。多元醇的代表性例子包括乙二醇、聚乙 二醇(例如，聚乙二醇)和聚甘油。另外，非還原性碳水化合物的代表性 例子包括碳的非還原性水合物，所謂的非還原性糖或糖類，及其衍生 物。非還原性糖的例子包括但不限于如蔗糖、海藻糖和異麥芽酮糖醇的二糖；如蜜三糖和松三糖的三糖；如水蘇糖的四糖。非還原性糖衍生物包括但不限于糖醇(醛糖或酮糖的氬化形式)，如山梨糖醇、甘露醇、赤蘚糖醇和木糖醇(衍生自單糖)、乳糖醇和麥芽糖醇(衍生自二糖)；如 葡萄糖酸、葡萄糖酸y-內(nèi)酯的醛糖酸及其內(nèi)酯；如瑞巴瑞克酸(ribaraic
acid)、阿拉伯酸(arabinaricacid)和半乳糖二酸的糖二酸及其內(nèi)酉旨；如葡 萄糖醛酸、半乳糖醛酸(galaccuronicacid)和甘露糖醛酸的糖醛酸；如海 藻糖八乙酸酯、蔗糖八乙酸酯和纖維二糖八乙酸酯的酯衍生物(優(yōu)選 C廣C4脂肪酸酯衍生物)；其中羥基轉(zhuǎn)變成醚的醚衍生物(優(yōu)選C廣C4烷基 醚衍生物)?？梢証吏用非還原性;友水化合物的D和L形式。
三糖、四糖和衍生自單糖的糖醇，更優(yōu)選非還原性二糖和衍生自單糖 的糖醇，且最優(yōu)選山梨糖醇、甘露醇、海藻糖、蜜三糖和蔗糖。
本發(fā)明中使用的非還原性碳水化合物的量沒有特別限制，基于反 應(yīng)混合物的總重，優(yōu)選為至少1.5 % (w/v)，更優(yōu)選為至少2 % (w/v)， 且最優(yōu)選為2-30 % (w/v)。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明應(yīng)用到核酸酶介導(dǎo)的反應(yīng)。更優(yōu)選 地，本發(fā)明按照侵染檢測(cè)(34-36)(美國(guó)專利號(hào)5,846,717, 6,090，543， 6,001,567， 5,985,557和5，994，069)進(jìn)行。在直接使用生物樣品的直接侵 染檢測(cè)中，兩性離子緩沖液和/或非還原性碳水化合物防止生物樣品抑 制酶反應(yīng)，如FEN-1內(nèi)切核酸酶介導(dǎo)的反應(yīng)。4曼染一企測(cè)通過(guò){吏用用于 切斷由重疊寡核苷酸探針雜交形成的復(fù)合體的如FEN-1內(nèi)切核酸酶的 結(jié)構(gòu)特異性酶而一企測(cè)特定DNA和RNA序列。不經(jīng)過(guò)溫度循環(huán)，升高 的溫度和其中一種探針過(guò)量使多數(shù)探針被切斷用于存在的各自的目標(biāo) 序列。這些切斷的探針然后促進(jìn)次級(jí)標(biāo)記探針的切斷。次級(jí)探針寡核 苷酸可以用通過(guò)第二染料或其它半淬滅劑淬滅的熒光染料進(jìn)行5'-端標(biāo) 記。切斷時(shí)，在反應(yīng)過(guò)程中可以使用標(biāo)準(zhǔn)熒光板分析儀或收集熒光數(shù) 據(jù)的裝置檢測(cè)去淬滅的染料標(biāo)記的產(chǎn)物。侵染檢測(cè)在未擴(kuò)增的基因組
DNA中4企測(cè)特定突變和SNP(單核苷酸多態(tài)性)。侵染4企測(cè)可以結(jié)合多 重PCR以廣泛地進(jìn)行基因組相關(guān)的研究。本發(fā)明中使用的反應(yīng)混合物可以進(jìn)一步包含兩性離子表面活性 劑、牛血清白蛋白、多胺或其組合。這些添加劑同樣能夠防止生物樣 品抑制酶反應(yīng)。然而，為進(jìn)行直接酶反應(yīng)，在本發(fā)明中不是必須使用 這些添加劑。本發(fā)明中使用的兩性離子表面活性劑的例子包括但不限 于正辛基-N,N-二曱基-3-銨-l-丙磺酸鹽、正癸基-N,N-二甲基-3-氨基溶 -1-丙磺酸鹽、正十二烷基-N, N-二曱基-3-銨-l-丙磺酸鹽、正十四烷基-N, N-二曱基-3-銨-l-丙磺酸鹽、正十六烷基-N，N-二曱基-3-銨-l-丙磺酸鹽、 CHAPS (3-[(3-膽酰胺丙基)二曱基氨基]-l-丙磺酸鹽)和zwittergent (N-烷基-N,N-二曱基-3-氨基-l-丙碌酸鹽)，優(yōu)選CHAPS和zwittergent,更 優(yōu)選CHAPS。本發(fā)明中使用的多胺優(yōu)選包括但不限于精胺、腐胺、亞 精胺和三亞乙基四胺，更優(yōu)選亞精胺和三亞乙基四胺，且最優(yōu)選三亞 乙基四胺。當(dāng)將本發(fā)明應(yīng)用到直接擴(kuò)增生物樣品、尤其是血液中的低拷貝數(shù) 的核酸分子時(shí)，其優(yōu)點(diǎn)變得最突出。所指的作為模板的核酸分子的術(shù) 語(yǔ)"低拷貝數(shù)"指1 1000拷貝的目標(biāo)核酸分子。以前沒有報(bào)道過(guò)使用具 有低拷貝數(shù)的核酸分子的生物樣品的直接擴(kuò)增。令人吃驚地，如實(shí)施 例V中所示，本發(fā)明可以使用血液樣品直接擴(kuò)增低拷貝數(shù)(例如，50(il 總反應(yīng)物中10拷貝HIV-1核酸)的HIV-1核酸分子。本發(fā)明的目的在于一種通過(guò)克服來(lái)自生物樣品中存在的酶抑制劑 的障礙而可以實(shí)現(xiàn)直接酶反應(yīng)(優(yōu)選擴(kuò)增，更優(yōu)選基于PCR的擴(kuò)增)的 新方法。據(jù)我所知，與如Nishimura等人(美國(guó)專利號(hào)5,935,825和
6,413,747)和Al-Soud等人(16, 37)的方法的目前已報(bào)道的其它直接擴(kuò)增 方法相比，本發(fā)明的效果最好。更具體而言，Nishimura等人的方法存在嚴(yán)重的問(wèn)題用于熱啟動(dòng) PCR的化學(xué)修飾的聚合酶，如AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems 7>司)、FastStart Taq DNA聚合酶(Roche Applied Science 司)和HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen公司)在Nishimura等人提供的條 件下不起作用。另外，Al-Soud等人的嘗試對(duì)于低拷貝數(shù)的DNA模板 不能獲得擴(kuò)增結(jié)果。與這些常規(guī)的技術(shù)相比，本發(fā)明在幾乎全部擴(kuò)增 反應(yīng)中呈現(xiàn)出改進(jìn)的性能。Nishimura等人的方法使用三(羥氨基)曱烷(Tris)反應(yīng)緩沖液(IO mMTris-HCl，在25°C下高于pH 8.9, 50 mM KC1),其提供了一種通過(guò) 將pH調(diào)整到高于通常PCR反應(yīng)緩沖液的pH以抵抗PCR抑制的策略。 與此相反，本發(fā)明通過(guò)使用兩性離子緩沖液(或Good緩沖液，25。C下PCR抑制。如下文實(shí)施例中所述，本發(fā)明用于擴(kuò)增血液中的目標(biāo)核酸 分子的PCR反應(yīng)對(duì)PCR抑制呈現(xiàn)出十分優(yōu)異的防止作用，即使在比使 用Tris緩沖液的方法的pH更低的pH下。此外，Nishimura等人已經(jīng)報(bào)道了通過(guò)僅使用Taq DNA聚合酶而 獲得的結(jié)果。關(guān)于Shimadzu公司的AmpdirectTM的報(bào)道提出在使用血 液的直接擴(kuò)增中通過(guò)使用PfUDNA聚合酶沒有成功。相反，本發(fā)明的 直接擴(kuò)增能夠使用包括Tth DNA聚合酶、PfU DNA聚合酶和Pwo DNA 聚合酶以及TaqDNA聚合酶的多種熱穩(wěn)定的聚合酶進(jìn)行。
最廣泛使用AmpFLSTR Identifiler⑧試劑盒(Applied Biosystems公司)用于基因4全測(cè)或鑒定。當(dāng)將血液樣品直^t妄應(yīng)用到該試劑盒時(shí)，不 產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。然而，如實(shí)施例IX中所示，當(dāng)將兩性離子緩沖液和/ 或非還原性碳水化合物加入到反應(yīng)混合物中時(shí)，該試劑盒產(chǎn)生所需的 分析結(jié)果。另外，才艮據(jù)本發(fā)明，在Guthrie卡片、FTA卡片或?yàn)V紙上的 血跡可以直接用作用于直接基因檢測(cè)模板。本發(fā)明的目的還在于用于進(jìn)行直接酶反應(yīng)的試劑盒。用于進(jìn)行直 接酶反應(yīng)的本試劑盒可以選擇性地用于進(jìn)行酶反應(yīng)所需的包括如酶、 底物和輔因子的其它成分。其中，制成本發(fā)明的試劑盒以用于擴(kuò)增DNA 分子，其可以選擇性地包括進(jìn)行PCR所需的試劑，如DNA聚合酶、 輔因子和脫氧核糖核酸-5-三磷酸酯。本試劑盒還可選擇性地包括多核 苦酸分子、逆轉(zhuǎn)錄酶、各種緩沖液和試劑以及抑制DNA聚合酶活性的 抗體。本試劑盒還可以包括用于進(jìn)行陽(yáng)性或陰性對(duì)照反應(yīng)所需的試劑。 在特定反應(yīng)中使用的試劑的最佳量已通過(guò)受益于本公開內(nèi)容的技術(shù)人 員測(cè)定。本試劑盒一般適于被包括在單獨(dú)的包裝中或上述組成的分裝 部分中。在本發(fā)明的另 一個(gè)技術(shù)方案中，提供一種用于防止生物樣品抑制 涉及核酸分子的酶反應(yīng)的方法，其包括將生物樣品接觸包含兩性離子 緩沖液和/或非還原性石友水化合物的用于酶反應(yīng)的反應(yīng)混合物中，其中 存在于生物樣品中的核酸分子在酶反應(yīng)之前不經(jīng)過(guò)純化。在本發(fā)明的又一個(gè)技術(shù)方案中，提供兩性離子緩沖液和/或非還原 性碳水化合物用于制造用于涉及核酸分子的直接酶反應(yīng)的反應(yīng)混合物 的用途。
既然本發(fā)明的這些技術(shù)方案遵循上述本發(fā)明的方法的原理，那么 省略它們間的共同說(shuō)明，以避免過(guò)分冗成而導(dǎo)致本說(shuō)明復(fù)雜。被認(rèn)為煩瑣的核酸純化(分離)是耗時(shí)和耗成分的方法，其通常使用如酚的有毒材料。所述方法會(huì)引起一些問(wèn)題(i)傳染研究者；(ii)核酸 樣品間的交叉污染；(iii)核酸損失，尤其是在存在痕量樣品時(shí)。因此， 急需開發(fā)不經(jīng)過(guò)核酸純化的直接酶反應(yīng)(尤其是，擴(kuò)增反應(yīng))。另外，在 使用許多樣品的對(duì)比試驗(yàn)中，由于純化效率的不同而使得核酸純化很 可能產(chǎn)生人為誤差。因此可以理解，使用生物樣品而不經(jīng)過(guò)核酸純化 可以消除這種人為誤差。根據(jù)本發(fā)明，由于樣品制備簡(jiǎn)單，已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)酶反應(yīng)，尤其是 擴(kuò)增反應(yīng)的自動(dòng)操作。且可以對(duì)痕量的樣品進(jìn)行酶操作。除此之外， 由于其時(shí)效本發(fā)明可以處理緊急的情況，快速產(chǎn)生擴(kuò)增結(jié)果，且由于 其不需要用于核酸純化的設(shè)備和試劑而可以以簡(jiǎn)單的方式進(jìn)行戶外分析。下面具體的實(shí)施例意在說(shuō)明本發(fā)明，且其不解釋為限制如附屬權(quán) 利要求所限定的本發(fā)明的范圍。實(shí)施例除非另外特別指出，下文給出了的固體混合物中的固體、液體中 的液體以及液體中的固體的百分比分別為w/w、 v/v和w/v。實(shí)施例I:使用血液樣品的核酸擴(kuò)增(使用多種類型的緩沖液)
使用Taq DNA聚合酶的PCR反應(yīng)通常使用10x濃縮的PCR緩沖 液(包含100 mM Tris-HCl、 500 mM KC1和15 mM MgCl2)，其通過(guò)Tris 的緩沖力調(diào)節(jié)的pH主要為8.3,且可以升高到9.0。為了證明Good緩沖液有助于防止血液樣品抑制PCR活性，制備 包含100 mM IC沖液(Tris或如Tricine、 HEPES和Bicine的Good)、 500 mM KC1和15 mM MgCl2的10x濃縮的PCR緩沖液，直接使用血液樣 品進(jìn)行PCR反應(yīng)。調(diào)節(jié)Tris緩沖液的pH從8.3~9.0(增加0.1), Tricine 緩沖液和HEPES緩沖液的pH從8.0 9.0(增加0.1)，且Bicine緩沖液的 pH從8.0 8.8(增加0.1)。所述緩沖液的pH在25。C下測(cè)定。使用總體積為50^1的PCR反應(yīng)混合物進(jìn)行PCR反應(yīng)，該P(yáng)CR反 應(yīng)混合物包含5 |il的10x濃縮的PCR緩沖液、0.2 mM dNTPs混合物 以及0.4 [iM的人卩-珠蛋白(3)的引物GH20 (正義引物 5'-CAACTTCATCCACGTTCACC-S') 和 GH21( 反義引物 5'-GGAAAATAGACCAATAGGCAG-S')。 AmpliTaq DNA聚合酶(5單 位/|11, Applied Biosystems公司)和1 jil肝素預(yù)處理的血液樣品用于直 接PCR。 PCR反應(yīng)在如下溫度條件下進(jìn)行94。C下10分鐘，接著40 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94。C下30秒、55。C下30秒、72。C下1分鐘；然 后在72。C下最后延伸7分鐘。在94。C下進(jìn)行10分鐘起始變性步驟， 以破碎細(xì)胞并使血液樣品中存在的如蛋白酶和脫氧核糖核酸酶的PCR 抑制劑變性。通過(guò)包含0.5嗎/ml的溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳， 接著UV照射來(lái)分析擴(kuò)增的產(chǎn)物。圖1示出使用引物對(duì)GH20/GH21的408 bp的f3-珠蛋白基因的擴(kuò) 增結(jié)果。雖然只有在Tris緩沖液的pH變得不低于8.5(泳道3-9)時(shí)其才 產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，而Good緩沖液甚至在更低的pH下，即，Tricine緩 沖液為pH8.3(泳道12), Bicine緩沖液為pH8.1(泳道22)，且HEPES 11 沖液為pH8.0(泳道30)產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。因此，可以看出Good緩沖液成功地防止血液才羊品承卩制PCR活性。圖 2表示 <吏用引物對(duì)GH20/KM38 (KM38 引物，5'-TGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG-3')的325bp的(3-J朱蛋白基因的擴(kuò)增 結(jié)果。PCR條件與用于引物對(duì)GH20/GH21的條件相同。與圖1的結(jié)果 相似，顯示使用pH低于8.5的Tris緩沖液的擴(kuò)增反應(yīng)受血液樣品抑制； 然而，Good緩沖液，pH8.3的Tricine緩沖液可以使用血液樣品進(jìn)行直 接PCR擴(kuò)增。使用正義引物(E6f, 5'- TGTTCACTTGTGCCCTGACT-3')和反義引 物(E6r， 5'- GGAGGGCCACTGACAACCA-3')擴(kuò)增p53基因以得到 489bp的產(chǎn)物。50 (nl PCR混合物包含0.2 mM dNTPs混合物、0.4 引 物、0.4 |il AmpliTaqDNA聚合酶和1 (il肝素預(yù)處理的血液樣品。PCR 反應(yīng)在如下溫度條件下進(jìn)行94。C下10分鐘，接著40個(gè)循環(huán)，每個(gè) 循環(huán)為94。C下30秒、56。C下30秒、72。C下l分鐘；然后在72。C下最 后延伸7分鐘。擴(kuò)增的產(chǎn)物通過(guò)2%的瓊脂糖凝膠電泳分辨。如圖3所 示，使用Tris緩沖液的擴(kuò)增從pH8.8開始產(chǎn)生微弱的條帶，而在pH9.0 和9.2產(chǎn)生強(qiáng)的條帶。而Tricine、 Bicine和HEPES緩沖液在更低的pH 下產(chǎn)生PCR擴(kuò)增條帶。如圖1和3中所示，HEPES緩沖液在寬的pH范圍內(nèi)產(chǎn)生更好的 結(jié)果。其原因在于，由于HEPES的緩沖區(qū)域(pH6.8-8.2),所以如dNTPs 和引物的PCR反應(yīng)物加入pH高于8.3的HEPES緩沖液中引起PCR反 應(yīng)混合物中pH迅速降至8.3左右，其有助于在不同的pH下得到相似 的PCR結(jié)果。
為成功地進(jìn)行直接擴(kuò)增需阻斷血液中存在的PCR抑制劑的活性。 本發(fā)明人認(rèn)為血液中代表性的抑制劑，血紅蛋白的活性可以通過(guò)在？ 1起變性的pH和溫度條件下血紅蛋白的分子間結(jié)合而被阻斷。我們采納了這種理由以選取用于進(jìn)行有前途的直接擴(kuò)增的 一類合適的緩沖液。Nishimura等人已經(jīng)報(bào)道較高的pH有助于使用血液樣品進(jìn)行直接 PCR擴(kuò)增。然而，盡管由于與其它Good緩沖液相比Tricine緩沖液隨 溫度而呈現(xiàn)出較大的pH變化(根據(jù)默克索引，Tricine: ApKa廠C-0.021, Bicine: ApKa廠C-0.018, HEPES: ApKaTC-0.014)的事實(shí)，但是由于Tricine 緩沖液在較低pH下由血液樣品產(chǎn)生擴(kuò)增子，所以應(yīng)該理解，使用Good 緩沖液的優(yōu)異的結(jié)果并不是由于PCR混合物較高的pH值。已知Tris 緩沖液的pH在5 25。C降低0.03,在25 37。C降低0.025 (根據(jù)Sigma 公司的出版物)。我們利用包括兩性緩沖液、無(wú)反應(yīng)性和低離子強(qiáng)度的Good緩沖液 的一些性質(zhì)而不是其pH范圍。與Tris緩沖液不同，Good緩沖液具有 正電荷和負(fù)電荷，從而其能夠與具有正電荷或負(fù)電荷的生物分子結(jié)合。 另外，我們認(rèn)為由于其低離子強(qiáng)度，所以Good緩沖液可以提高蛋白質(zhì) 的熱變性。pl左右的pH引起蛋白質(zhì)沉淀，且在低離子強(qiáng)度下促進(jìn)沉淀。 這些事實(shí)使我們認(rèn)為包含Good緩沖液的PCR反應(yīng)變得具有低離子強(qiáng) 度，且在溫度升高時(shí)其pH變得在PCR抑制蛋白的pl左右，從而引起 血液樣品中的蛋白質(zhì)的凝集，以阻斷PCR抑制劑的活性。實(shí)施例II:使用血液樣品的核酸擴(kuò)增(使用多種類型的添加劑)
為測(cè)定添加劑對(duì)使用血液樣品的直接擴(kuò)增的影響，使用非還原性 碳水化合物、表面活性劑或用于通常PCR方法的其它已知常規(guī)添加劑(例如，多胺、BSA和甜菜堿)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 實(shí)施例II-1: 一一還原性碳水化合物的影響為了說(shuō)明非還原性碳水化合物及其衍生物對(duì)直接擴(kuò)增的積極影 響，進(jìn)行使用包含在血液樣品中的未分離的DNA作為模板的PCR來(lái) 擴(kuò)增p53。除了使用Tricine緩沖液(pH8.3)之外，使用的引物和條件與 實(shí)施例I中的相同。如圖4中所示，使用葡萄糖(板A，泳道3-6分別為0.18、 0.38、 0.75和.5 % (w/v))的PCR擴(kuò)增不產(chǎn)生擴(kuò)增子。與此相似，乳糖(板A,泳 道11-14分別為0.18、 0.38、 0.75和1,5 % (w/v))在較高濃度下同樣不 能擴(kuò)增p53，而其較低濃度時(shí)呈現(xiàn)出微弱的產(chǎn)物條帶。與對(duì)照條帶相比 (板A和B,泳道l),應(yīng)該理解，低濃度的乳糖對(duì)使用血液的直接擴(kuò)增 的成功沒有幫助，其甚至在較高濃度時(shí)抑制PCR活性。這些結(jié)果使我 們推出還原性碳水化合物不能使使用包含擴(kuò)增抑制劑的生物樣品直接 擴(kuò)增。作為非還原性糖的例子，測(cè)試蔗糖(圖4,板A,泳道7-10分別為 1.25、 2.5、 5和10%(w/v))、海藻糖(圖4,板B，泳道3-6分別為0.94、 1.8、 3,8和7.5 % (w/v))和蜜三糖(圖4，板B,泳道7-10分別為0.87、 1.8、 3.5和7 % (w/v)),以證明其防止血液樣品抑制擴(kuò)增反應(yīng)的能力。 所述還原性糖在其濃度提高時(shí)呈現(xiàn)出增強(qiáng)的防止能力。另外，發(fā)現(xiàn)其 它非還原性糖，如松三糖(圖4,板A，泳道15-18分別為0.6、 1.25、2.5和5% (w/v))和水蘇糖(圖4,板A，泳道19-22分別為0.6、 1.25、2.5和5% (w/v》同樣防止血液樣品抑制擴(kuò)增反應(yīng)。在不具有還原本領(lǐng)的糖醇(糖醇)，包括山梨糖醇(圖4，板B,泳道 11-14分別為1.25、 2.5、 5和10% (w/v))和甘露醇(圖4,板B,泳道15-18 分別為0.6、 1.25、 2.5和5% (w/v))中同樣觀察到使用血液樣品的直接擴(kuò)增的完成。同時(shí)，不在本發(fā)明中描述的非還原性碳水化合物的范圍內(nèi)的聚乙 烯吡咯烷酮(圖4，板B,泳道19-22分別為0.25、 0.5、 1和2 % (w/v)) 不能使用血液樣品進(jìn)行直接擴(kuò)增。因此，這些結(jié)果證明，所述非還原性碳水化合物用作進(jìn)行使用包 含抑制擴(kuò)增的抑制劑的生物樣品的直接擴(kuò)增的優(yōu)異試劑。實(shí)施例II-2:海藻糖和蜜三糖的影響的詳細(xì)評(píng)《介為了更詳細(xì)地測(cè)定海藻糖(作為二糖的代表性例子)和蜜三糖(作為 三糖的代表性例子)對(duì)直接擴(kuò)增的影響，進(jìn)行使用包含在血液樣品中的 未分離的DNA作為模板的PCR來(lái)擴(kuò)增p53。除了使用Tris緩沖液(pH 8.3)或Tricine緩沖液(pH 8.3)，以及2.5 pl的肝素預(yù)處理的血液樣品使 用相對(duì)于PCR反應(yīng)物總體積的(5 % (v/v)之外，使用的引物和條件與實(shí) 施例I中的相同。如圖5中所示，使用5%血液樣品和2.0單位TaqDNA聚合酶且不 使用非還原性碳水化合物的常規(guī)PCR反應(yīng)受血液樣品抑制。而使用Tris 緩沖液，7%的蜜三糖呈現(xiàn)十分微弱的條帶(泳道6)，且在其濃度提高時(shí) 海藻糖呈現(xiàn)更明顯的條帶(泳道8-12)。與此不同，Tricine緩沖液中的蜜
三糖和海藻糖在其相對(duì)高的濃度呈現(xiàn)明顯的擴(kuò)增條帶(泳道6-18和22-24)。此外，如圖6中所示，通過(guò)使用其提高的濃度(0-30。/。(w/v))證明 海藻糖的作用。通過(guò)增加其濃度，發(fā)現(xiàn)海藻糖的這種作用更加清楚地呈現(xiàn)。因此，可以證明非還原性石友水化合物可以完全避免血液樣品中包 含的抑制劑的作用，從而實(shí)現(xiàn)使用生物樣品的直接擴(kuò)增。為了測(cè)定緩沖液(pH和類型)與非還原性碳水化合物的組合效果， 使用存在或缺失海藻糖的Tris緩沖液(pH 8.3-9.0和9.2)或Tricine緩沖 液(pH 8.0-9.0)直接擴(kuò)增p53。車輛使用1.0單位Taq DNA聚合酶之夕卜， 使用的引物和條件與上述的相同。不使用添加劑的情況下，對(duì)于Tris 緩沖液只有在十分高的pH(例如，高于pH9.0)下觀察到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物， 而對(duì)于Tricine緩沖液(圖8，板A)在相對(duì)較低的pH(例如，高于8.6)觀 察到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。在向PCR反應(yīng)物中加入3 % (w/v)海藻糖的情況 下，產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物的pH變得更低對(duì)于Tris緩沖液約pH8.5，而對(duì)于 Tricine緩沖液約pH 8.2(圖8，板B)。因此，可以理解，非還原性碳水化合物結(jié)合合適的緩沖液類型和 pH可以具有更大的防止生物樣品抑制擴(kuò)增反應(yīng)的能力。實(shí)施例II-3:表面活性劑的作用我們觀'j試如CHAPS (3-[(3-膽酰胺丙基)二甲基氨基]-l-丙磺酸鹽) 的兩性離子表面活性劑是否可以改進(jìn)使用血液樣品的直接擴(kuò)增。以與 實(shí)施例I中所述的相同方法進(jìn)行PCR反應(yīng)以擴(kuò)增p53。如圖8中所示，Tricine緩沖液(pH 8.3或8.7)中的CHAPS以濃度依賴的方式促進(jìn)使用 生物樣品的直接擴(kuò)增。實(shí)施例II-4:多胺的作用已報(bào)道作為多胺的代表性例子的亞精胺可以提高PCR擴(kuò)增的效 率。Kato等人提出高濃度的多胺可以避免包含在血液、尿和糞便中的 PCR抑制劑的作用(美國(guó)專利號(hào)6,413,747)。進(jìn)行擴(kuò)增p53的PCR反應(yīng)以比較多胺在Tris緩沖液和Good緩沖 液中的作用。使用濃度變化的亞精胺或三亞乙基四胺和2% (v/v)的肝素 處理的血液。用于PCR反應(yīng)的引物和條件與實(shí)施例I中所述的相同。如圖9中所示，全部濃度(甚至4 mM)的亞姊青胺和三亞乙基四胺在 pH 8.3的Tris緩沖液中不產(chǎn)生擴(kuò)增子(泳道1-6),亞^青胺和三亞乙基四 胺在pH 8.7的Tris緩沖液中分別對(duì)應(yīng)于其0.5 mM和1 mM的濃度呈 現(xiàn)增加的PCR產(chǎn)物(泳道13-18)。同時(shí)，難以評(píng)^介多胺在^f吏用pH 8.3 或pH 8.7的Tricine緩沖液的PCR中的作用。Tris緩沖液和Tricine緩 沖液中的更高濃度的多胺甚至抑制PCR活性。在使用4 % (v/v)的肝 素處理的血液的試驗(yàn)中，如圖10中所示，在Tricine緩沖液中觀察到 多胺對(duì)使用血液樣品的PCR的正面作用。實(shí)施例II-5: BSA的作用Kreader(12)和Al-Soud等人(16， 37)提出高濃度的BSA可以防止 血液樣品抑制PCR。進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增p53以檢測(cè)BSA在Tris緩沖 液和Good緩沖液中的這種作用，且使用2 % (v/v)的肝素處理的血液。 用于PCR反應(yīng)的引物和條件與實(shí)施例I中所述的相同。
如圖11中所示，在pH 8.3或pH 8.7的Tris緩沖液中包含BSA 的PCR反應(yīng)產(chǎn)生p53擴(kuò)增子；在不使用BSA的情況下，沒有p53擴(kuò)增 子(泳道1和13)。與此相反，在pH 8.3或pH 8.7的Tricine緩沖液中不 含或者含有BSA的擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生p53擴(kuò)增子。尤其清楚地觀察到隨其 在pH8.3的Tricine緩沖液中的濃度提高BSA的作用變得更明顯。因此，應(yīng)該認(rèn)為，在將BSA進(jìn)一步加入擴(kuò)增反應(yīng)物中時(shí)，使用 含有兩性離子緩沖液的本發(fā)明的緩沖系統(tǒng)的直接擴(kuò)增可以更高效的進(jìn)行。Al-Soud等人描述BSA的作用歸因于其保護(hù)DNA酶免受蛋白酶 的作用且防止血紅素基結(jié)合到Taq聚合酶上。然而，考慮到較高pH的 Tris緩沖液和pH 8.3的Tricine緩沖液可以使用血液樣品進(jìn)行直接PCR， 所以BSA的作用應(yīng)該是由于其阻止血紅素基的能力，而不是其保護(hù)免 受蛋白酶的能力。另外，可以認(rèn)為在高溫度下的BSA的變性形式會(huì)容 易引起對(duì)PCR活性具有抑制作用的蛋白的凝集，從而降低了所述蛋白 質(zhì)的抑制作用。實(shí)施例m:抗凝劑的作用的分析用于擴(kuò)增的血液樣品通常通過(guò)用包括肝素、EDTA和檸檬酸鈉的 抗凝劑預(yù)處理而制備。然而，這些抗凝劑很可能抑制PCR活性，從而 它們?cè)诖_定向PCR反應(yīng)物中加入血液的量中變成限制性因素。進(jìn)行4吏用Good緩沖液的PCR反應(yīng)來(lái)擴(kuò)增p53 ，以確定在我們的 直接擴(kuò)增反應(yīng)體系中的合適的血液量。用于PCR反應(yīng)的引物和條件與 實(shí)施例I中描述的相同。
如圖12中所示，使用pH 8.7的Tricine緩沖液的直接PCR反應(yīng) 適宜使用2.5 % (v/v)的肝素處理的血液和5 % (v/v) EDTA或4寧檬酸鈉 處理的血液。使用分離的人DNA (Promega公司)作為模板的PCR反應(yīng) 而呈現(xiàn)出低特異性的結(jié)果，其中觀察到除了 p53條帶的其它幾條帶。 使用血液樣品本身作為模板可以使PCR反應(yīng)在熱啟動(dòng)PCR的條件下進(jìn) 行，其中因?yàn)檠褐械募?xì)胞在更高的溫度下破碎，所以目標(biāo)DNA在第 一循環(huán)退火步驟開始與引物作用。在Tricine緩沖液(pH 8.7)中使用2.4%海藻糖和4 mg/ml BSA時(shí)，直接擴(kuò)增反應(yīng)對(duì)于高達(dá)5 % (v/v)的肝素或檸檬酸鈉處理的血液和10 % (v/v)的EDTA處理的血液產(chǎn)生擴(kuò)增子。實(shí)施例IV:具有高GC含量的模板DNA的直接PCR已報(bào)道可以使用甜菜堿,、氯化四曱基銨(TMAC)或二曱基亞砜 (DMSO) PCR擴(kuò)增具有高GC含量的模板。為評(píng)價(jià)使用這種添加劑時(shí)用于具有高GC含量的模板或引物的直 接PCR是否成功，進(jìn)行使用Tricine緩沖液(pH 8.7)和甜菜堿的直接 PCR。用于成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤(RB)基因的擴(kuò)增反應(yīng)使用正義引物(E1 SD, 5'-CAGGACAGCGGCCCGGAG-B') 和反義 引 物 (I1SD, 5'-CTGCAGACGCTCCGCCGT-S')以獲得180 bp的擴(kuò)增子，對(duì)于載脂 蛋白 E(apoE)基因，使用正義引物(apoE-f , 5'-GGCACGGCTGTCCAAGGA-3') 和反義引物(apoE-r , 5'-CTCGCGGATGGCGCTGAG-3')以獲得268bp的擴(kuò)增子。由于兩個(gè) 引物對(duì)具有高的GC含量，所以在普通PCR反應(yīng)中它們不產(chǎn)生所需的 擴(kuò)增子。使用總體積50 pl的反應(yīng)混合物進(jìn)行直接PCR反應(yīng)，該反應(yīng)混合物包含5 (il的10 x濃縮的PCR緩沖液、0.2 mM dNTPs混合物、0.4 |iiM 引物、2.0單位AmpliTaq DNA聚合酶(Applied Biosysterns 7>司)和1 pi 肝素處理的血液樣品。PCR反應(yīng)在如下溫度條件下進(jìn)行94。C下10分 鐘，接著40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94。C下30秒、6CTC下30秒、72。C下 1分鐘；然后在72。C下最后延伸7分鐘。將Tris緩沖液(pH 8.3)用于 人基因組DNA模板(Promega公司)和包含海藻糖的Tricine緩沖液(pH 8.7)用于肝素處理的血液模板。使用的甜菜堿的濃度調(diào)節(jié)到0、 0.5、 1.0、 1.5、 2.0和2.5 M。如圖14中所示，使用Good緩沖液和高于l.OM的甜菜堿的直接 PCR產(chǎn)生所需擴(kuò)增子。因此，應(yīng)該理解，在使用Good緩沖液和/或非 還原性碳水化合物時(shí)，用于擴(kuò)增具有高GC含量的才莫板的直接擴(kuò)增可 以在用于克服來(lái)自具有高GC含量的模板的問(wèn)題的添加劑(例如，甜菜 堿、TMAC和DMSO)的存在下成功地進(jìn)行。實(shí)施例V:使用化學(xué)修飾的Taq聚合酶擴(kuò)增低拷貝模板Nishimum等人已提出使用高于pH 9.0的Tris、 CHES或CAPSO 可以完成血液樣品的直接PCR。然而，如果PCR反應(yīng)混合物的pH較 高，如AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems 乂>司)、FastStart Taq DNA聚合酶(Roche Applied Science公司)和HotStarTaq DNA聚合 酶(Qiagen公司)的用于熱啟動(dòng)PCR的化學(xué)修飾的聚合酶不呈現(xiàn)或具有 較低的再生作用。
如上所述，因?yàn)镚ood緩沖液和/或非還原性碳水化合物即使在較 低pH下也可以阻斷生物樣品中存在的抑制劑的作用，所以使用這種化 學(xué)修飾的聚合酶的熱啟動(dòng)PCR可以在本發(fā)明的條件下成功進(jìn)行。
用于傳染病或法醫(yī)學(xué)的擴(kuò)增反應(yīng)通常使用低拷貝數(shù)的核酸樣品。 尤其是，對(duì)于傳染病如HIV和HBV相關(guān)疾病的i貪斷和病毒性感染的 早期檢測(cè)很重要。換句話說(shuō)，必須擴(kuò)增以低拷貝數(shù)存在的病毒核酸分 子，以得到準(zhǔn)確可靠的診斷結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明，可以使用化學(xué)修飾的 Taq聚合酶在采用Good緩沖液和非還原性碳水化合物的條件下擴(kuò)增低 拷貝凄t的HIV-1。
Al-Soud等人(37)已使用AmpliTaq Gold DNA聚合酶和高濃度的 BSA由血樣樣品中的產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌(Listria monocytogenes)擴(kuò)增 DNA分子。然而，他們沒有提供低拷貝DNA分子的擴(kuò)增結(jié)果。雖然 Kato等人(美國(guó)專利號(hào)6,413,747)已提供了使用多胺的低拷貝DNA分子 的擴(kuò)增結(jié)果，但是他們沒有直接使用血液樣品。他們而是間接地使用 添加有HIVDNA分子的白細(xì)胞樣品，其不含有包括血紅蛋白和免疫球 蛋白G的PCR抑制劑。
使用總體積50 (il的反應(yīng)混合物進(jìn)行低拷貝數(shù)的HIV-1的PCR反 應(yīng)(26、 31、 38),該反應(yīng)混合物包含Tricine緩沖液(pH 8.3)、 0.2 mM dNTPs混合物、0.5pM引物、2.5mMMgCl2、 2.5單位AmpliTaq Gold DNA聚合酶或HotStarTaq DNA聚合酶和1 肝素處理的血液樣品。 使用2.4%的海藻糖和4 mg/ml的BSA作為添加劑。J吏用的引物對(duì)的 核苷酸序列為 SK145(5'-AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT國(guó)3')和 SK431(5'-TGCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTCT畫3'); 或者 SK38 (5'畫 ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT-3') 和 SK39 (5'-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC-3')。HIV-1DNA(HIV-1陽(yáng)性對(duì)照DNA, Applied Biosystems公司)的拷貝數(shù)從0至50依次增加10。為了通過(guò)變化的血液量來(lái)檢測(cè)低拷貝DNA 的擴(kuò)增，分別向0、 1、 2、 3、 4、 5和6 的肝素處理的血液中加入20 拷貝的HIV-1。使用引物對(duì)SK145和SK431的PCR反應(yīng)在如下溫度條件下進(jìn)行 95°。下15分鐘，接著45個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94"C下30秒、6(TC下1 分鐘；然后在6(TC下最后延伸IO分鐘。擴(kuò)增子的大小為142 bp。對(duì)于 引物對(duì)SK38的SK39，擴(kuò)增在如下溫度條件下進(jìn)行以產(chǎn)生115bp的擴(kuò) 增子95。C下15分鐘，接著45個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94。C下30秒、55°C 下1分鐘、72。C下1分鐘；然后在72。C下最后延伸7分鐘。如圖15中所示，使用AmpliTaqGoldDNA聚合酶，通過(guò)根據(jù)本發(fā) 明的PCR可以明顯地檢測(cè)到存在于6 pl地肝素處理的血液中的10拷 貝和存在于高達(dá)6 % (v/v)的血液中的20拷貝。存在于高達(dá)8 12 % (v/v) 的血液中的20拷貝同樣產(chǎn)生擴(kuò)增子。如圖16所示，使用HotStarTaq DNA聚合酶擴(kuò)增呈現(xiàn)出與AmpliTaq Gold DNA聚合酶擴(kuò)增相似的結(jié) 果。因此，可以認(rèn)為，使用Good緩沖液和/或非還原性碳水化合物的 本發(fā)明能夠使用于熱啟動(dòng)PCR的化學(xué)修飾的DNA聚合酶通過(guò)再生而 起作用，從而可以直接檢測(cè)存在于如血液的生物樣品中的低拷貝核酸分子。
實(shí)施例VI:對(duì)其它熱穩(wěn)定的DNA聚合酶的試驗(yàn)?zāi)壳伴_發(fā)的熱穩(wěn)定DNA聚合酶包括Pfu DNA聚合酶(Stratagene 公司)、具有高保真性的Pwo DNA聚合酶(Roche Applied Science公司) 和具有高反轉(zhuǎn)錄活性的Tth DNA聚合酶(Roche Applied Science公司) 以及Taq DNA聚合酶。我們測(cè)試使用多種熱穩(wěn)定的DNA聚合酶的直 接擴(kuò)增在本發(fā)明提供的條件下是否可以進(jìn)行。為了對(duì)比，我們還使用 市售的反應(yīng)混合物[用于Pfu DNA聚合酶的20 mM Tris (pH 8.8)、 10 mMKCl、 10mM(NH4)2SO4、 0.1% Triton X-100、 100昭/mlBSA和2 mM MgS04;用于Pwo DNA聚合酶的10 mM Tris (pH 8.85)、 25 mM KCl、 5 mM (NH4) 2S04和2 mM MgS04;以及用于Tth DNA聚合酶的 10mMTris(pH 8.9)、 100mMKCl、 50嗎/mlBSA、 0.05 % (w/v) Tween 20和1.5 mM MgCl2]。使用2.0單位的各自的聚合酶進(jìn)行直接PCR以 擴(kuò)增 p53 基因。使用的引物為正向引物，E8f (5'-GACAAGGGTGGTTGGGAGTAGATG-3')和反向引物E-R2 (5'-CACAAACACGCACCTCAAAG-3')。產(chǎn)生的擴(kuò)增子的大小為357 bp 。 PCR熱循環(huán)的條件與實(shí)施例I中的相同。如圖17所示，常失見反應(yīng)混合物不產(chǎn)生擴(kuò)增子(泳道5、 10和15), 而本發(fā)明的混合物(pH 8.3和8.7)產(chǎn)生可在瓊脂糖凝膠上檢測(cè)的擴(kuò)增子。實(shí)施例VII:來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)物的擴(kuò)增抑制動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是分子生物學(xué)中經(jīng)常進(jìn)行的普通方法。細(xì)胞培養(yǎng)基 中存在的PCR抑制劑是使用培養(yǎng)細(xì)胞的直接擴(kuò)增的巨大障礙。根據(jù)目
前開發(fā)的擴(kuò)增，通過(guò)離心收集培養(yǎng)的細(xì)胞，然后進(jìn)行DNA純化，接著進(jìn)行PCR過(guò)程。為了驗(yàn)證本擴(kuò)增體系是否可以克服與細(xì)胞培養(yǎng)物相關(guān)的障礙，使用包含Tricine緩沖液(pH8.7)、 2.4%海藻糖、細(xì)胞培養(yǎng)基和10 ng作為 模板的人基因組DNA (Promega公司)的反應(yīng)混合物進(jìn)行直接PCR以擴(kuò) 增p53基因。使用的細(xì)胞培養(yǎng)基為添加有10。/。的胎牛血清(FBS)、 100 嗎/ml青霉素和100嗎/ml鏈霉素的DMEM (Dulbecco's modified Eagle's 培養(yǎng)基)。用于PCR反應(yīng)的引物和條件與實(shí)施例I中所述的相同。實(shí)施例vm: ^使用口腔上皮細(xì)胞的擴(kuò)增使用細(xì)胞刷收集口腔上皮細(xì)胞、千燥并懸于500 pl TE(IO mM Tris 和O.lmM EDTA, pH 8.0)中。才艮據(jù)操作說(shuō)明通過(guò)AmpFLSTR 1dentifiler⑧試劑盒(Applied Biosystems公司)使用2.5 (il細(xì)胞懸浮液進(jìn)行 擴(kuò)增。新鮮制備反應(yīng)混合物(25 W)，使其包含含有2.4%的海藻糖和4 mg/ml BSA的Tricine緩沖液(pH 8.3)、 0.2 mM dNTP、2.5單位AmpliT叫 Gold DNA聚合酶和AmpFLSTR Identifiler引物對(duì)。使用ABI Prism基 因分析儀3.7 (Applied Biosystems公司)分析通過(guò)AmpFLSTR IdentifUer⑧試劑盒擴(kuò)增的產(chǎn)物。圖19的板A表示由ABI Prism基因分析儀3.7獲得的通過(guò) AmpFLSTR Identifiler⑧試劑盒擴(kuò)增的口腔上皮細(xì)月包中的DNA分子的 分析結(jié)果中的藍(lán)染結(jié)果，其顯示本發(fā)明使用Good和/和非還原性碳水 化合物可以阻斷細(xì)胞懸浮液中包含的PCR抑制劑的作用，乂人而可以使 用細(xì)胞而不是純化的DNA樣品來(lái)進(jìn)行成功的DNA指紋分析。另外， 顯著的是，根據(jù)本發(fā)明制備的反應(yīng)混合物能夠使AmpliTaq Gold DNA 聚合酶在使用細(xì)胞懸浮液的擴(kuò)增反應(yīng)中具有活性。實(shí)施例IX:法醫(yī)學(xué)中的基因檢測(cè)在法醫(yī)學(xué)中，基因檢測(cè)變得突出且其相關(guān)技術(shù)發(fā)展迅速。然而， 法醫(yī)學(xué)中的基因;f企測(cè)通常會(huì)遇到如待分析樣品的各種類型和狀態(tài)的與 樣品相關(guān)的問(wèn)題。換句話說(shuō)，會(huì)使用如純凈的、分解的和污染的樣品 或痕量的樣品的多種樣品進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)。除此之外，法醫(yī)學(xué)中的 基因檢測(cè)通常需要快速的結(jié)果。我們測(cè)試本發(fā)明是否可以滿足法醫(yī)學(xué)中的基因檢測(cè)的要求。使用 2.5 pl用TE緩沖液稀釋40 50倍的血液作為模板，且使用AmpFLSTR Identifiler⑧試劑盒(Applied Biosystems公司)進(jìn)4亍DNA指紋分析。 照實(shí)施例VIII中所述進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)和分析。如圖19的板B所示，本發(fā)明使用Good緩沖液和/或非還原性碳水液而不是純化的DNA樣品成功地進(jìn)行DNA指紋分析。另外，顯著的 是，根據(jù)本發(fā)明制備的反應(yīng)混合物能夠使AmpliTaq Gold DNA聚合酶 在使用血液樣品的擴(kuò)增反應(yīng)中具有活性。實(shí)施例X:由培養(yǎng)細(xì)胞合成cDNA用磷酸緩沖鹽水(PBS)將培養(yǎng)細(xì)胞(hepG2-SK, 5 x 106個(gè)細(xì)胞)稀采 至l x 103—4個(gè)細(xì)胞/^1。將1^1稀釋后的細(xì)胞直接加入50^1的反應(yīng)溶液 中使用對(duì)人(3-肌動(dòng)蛋白mRNA特異性的引物進(jìn)行RT-PCR。或者，為 使用分離的RNA進(jìn)行常規(guī)RT-PCR，通過(guò)RNeasy Mini試劑盒(Qiagen
公司)從hepG2-SK細(xì)胞中純化總RNA，然后通過(guò)具有oligo(dT)18的 cDNA合成試劑盒由l昭純化的RNA合成cDNA 。為在RT-PCR中區(qū)分RNA來(lái)源的產(chǎn)物與DNA來(lái)源的產(chǎn)物，設(shè)計(jì) 引物使DNA來(lái)源的產(chǎn)物(370 bp)由于跨內(nèi)含子而比RNA來(lái)源的產(chǎn)物 (264 bp)長(zhǎng)107 bp。使用的引物序列為b-肌動(dòng)蛋白-f (5'-CAA GAG ATG GCC ACG GCT GCT-3')和b-肌動(dòng)蛋白-r (5'- TCC TTC TGC ATC CTG TCG GCA-3')。通過(guò)向RT反應(yīng)產(chǎn)物中加入PCR反應(yīng)試劑來(lái)進(jìn)行 RT-PCR。使用包含50 mM Tricine (pH 8.7)、 80 mM KC1、 2.5 mM MgCl2、 250 jiM dNTPs混合物、5 mM DTT、 0.4 jiM b-肌動(dòng)蛋白-r引物、20單位 RNase抑制劑(Promega公司)和4.5單位AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Roche Applied Science公司)的總體積25(il的RT反應(yīng)混合物進(jìn)行RT反應(yīng)。向反應(yīng)中 加入無(wú)RNase的水作為RT陰性對(duì)照。RT反應(yīng)在60。C進(jìn)行60分鐘， 接著95。C下IO分鐘以使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。RT后，加入10 pmol的b-肌動(dòng)蛋白-f引物和2單位的Taq DNA 聚合酶以進(jìn)行后續(xù)PCR反應(yīng)。在PCR反應(yīng)中，使用10 ng人基因組 DNA(Promega公司)和由hepG2-SK合成的cDNA作為PCR對(duì)照。反 應(yīng)在如下溫度條件下進(jìn)行94。C下2分鐘，接著45個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán) 為94。C下30秒、65'C下30秒、72。C下30秒；然后在72。C下最后延 伸5分鐘。通過(guò)包含0.5 jag/ml的溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳，接 著UV照射來(lái)分析擴(kuò)增的產(chǎn)物。
如圖20中所示，通過(guò)直接將培養(yǎng)細(xì)胞加入反應(yīng)溶液中，在逆轉(zhuǎn)錄酶的存在下進(jìn)行的RT-PCR中獲得對(duì)人(3-肌動(dòng)蛋白mRNA特異的擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)施例VI:肉的RFLP分析將1 mg或10 mg牛肉樣品于56。C下在包含0.2 mg蛋白酶K (Sigma-Aldrich公司)、0.3 % SDS、 0.6 % Tween 20、 5 mM EDTA和400 mM NaCl的20 mM Tricine緩沖液(pH 8.0)中溫育2小時(shí)，接著在85。C 下溫育45分鐘，以獲得牛組織的溶解產(chǎn)物。將溶解產(chǎn)物直接進(jìn)行PCR 以擴(kuò)增牛MC1-R基因，并通過(guò)lU的MspAlI在37。C下消化45分鐘， 以分析RFLP(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)。使用包含200 |iM dNTPs混合 物、0.2 jliM引物和1.25單位的AmpliTaq DNA聚合酶以及10 mM Tricine (pH 8.3)、 50 mM KC1、 2.5 mM MgCl2和2.4 % (w/v)海藻糖的總 體積25 (il總體積的PCR反應(yīng)混合物進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用的引物的序 列為MClR-f(5'畫CAAGAACCGCAACCTGCACT-3')和 MClR-r(5'-TGATGAAGAGCAGGCTGGTG- 3' )。 PCR反應(yīng)在如下溫度 條件下進(jìn)行94。C下5分鐘，接著40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94"C下30 秒、62。C下30秒、72。C下l分鐘；然后在72。C下最后延伸10分鐘。如圖21中所示，在本發(fā)明提供的條件下直接使用牛組織溶解產(chǎn)物 的直接擴(kuò)增明顯產(chǎn)生擴(kuò)增子，且還獲得RFLP分析結(jié)果。實(shí)施例XII:糞便中引起食物中毒的微生物的檢測(cè)我們測(cè)定本發(fā)明是否可以克服糞便樣品對(duì)PCR的抑制。將作為引 起食物中毒的微生物的代表性例子弗氏志賀菌于37。C下在血液瓊脂平
板上溫育24小時(shí)。將產(chǎn)生的一個(gè)集落懸浮于0.2 ml的PBS中，然后鑒 定其集落形成單位(CFU)。用PBS將健康成人的糞便樣品稀釋10倍 (v/w)、渦旋并在4。C放置過(guò)夜以獲得上清夜。將1 jil的該上清液和7 pi 的包含具有確定的CFU的弗氏志賀菌的懸浮液混合以提供用于PCR 擴(kuò)增的模板。使用包含200 dNTPs混合物、引物vir-f (正義引物，5'-CTGCATTCTGGCAATCTCTTCACATC-3 ')和vir-r (反以引物，5'-TGATGAGCTAACTTCGTAAGCCCTCC-3')各0.2 、 1單位的 AmpliTaq DNA聚合酶和含有2.4%海藻糖的Tricine緩沖液(pH 8.3)的 總體積20 (al的PCR反應(yīng)混合物進(jìn)行PCR反應(yīng)，以擴(kuò)增弟/^4 的 vir A基因。使用8 |il總計(jì)相當(dāng)于總反應(yīng)體積的5%的分別包含128,000 CFU、 6,400 CFU、 320 CFU、 16 CFU、 8 CFU、 4 CFU、 2 CFU和1 CFU 的糞便懸浮液。PCR反應(yīng)在如下溫度條件下進(jìn)行95。C下5分鐘，接 著40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為95。C下40秒、55。C下40秒、72。C下40秒； 然后在72。C下最后延伸10分鐘。我們還評(píng)價(jià)本發(fā)明是否可以用于精確實(shí)時(shí)PCR(qPCR)試驗(yàn)，以檢 測(cè)并量化人糞便樣品中相關(guān)的病原體并。用PBS將健康成人的糞便樣 品稀釋10倍(v/w)、渦旋并在4。C放置過(guò)夜以獲得上清液。將liil的該 上清液和7 的包含具有已知拷貝的弗氏志賀菌的懸浮液混合以提供 用于產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線的沖莫板。換句話說(shuō)，使用8 (il總計(jì)相當(dāng)于總反應(yīng)體 積的5%的分別包含128,000 CFU、 6,400 CFU、320 CFU、 16 CFU、4 CFU 和2CFU的糞便懸浮液。在Mx3000P QPCR系統(tǒng)(Stratagene公司)上通過(guò)以下反應(yīng)混合物 進(jìn)行實(shí)時(shí)熱啟動(dòng)PCR: 20 pl的反應(yīng)混合物包含200 |aM dNTPs混合物、 引物vir-f和vir-r各0.2 pM、 1單位的HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen
公司)、包含2.4%的海藻糖的Tricine緩沖液(pH8.3) 、 lxSYBR Green95。C下15分鐘，4妄著50個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94X:下30秒、60。C下 30秒、72。C下30秒(數(shù)據(jù)采集)。如圖22A中所示，在本發(fā)明提供的條件下直接PCR由甚至含有8 CFU病原體的糞便樣品產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，而Tris緩沖液由含有128,000 CFU病原體的糞便樣品不產(chǎn)生擴(kuò)增子。這些結(jié)果使我們推出Good緩 沖液和/或非還原性碳水化合物確保能克服來(lái)自糞便樣品的PCR抑制。糞便樣品直接獲得PCR產(chǎn)物，并根據(jù)實(shí)時(shí)SYBR GREEN定量PCR方法不需要對(duì)制造商提供的技術(shù)手冊(cè)進(jìn)行下游修改而以迅速的方式進(jìn)行分析。實(shí)施例XIII:使用植物組織的基因擴(kuò)增將凍干的水稻(Qo/za幼f/'ra)葉子制成粉末樣品。將4~10 mg粉末樣 品懸浮于100 (^l的懸浮緩沖液(20 mM Tricine緩沖液，pH 8.0,包含 0.3% SDS 、 0.6% Tween 20、 5 mM EDTA和400 mM NaCl)中以得到水 稻葉子的懸浮液。將0.04 lmg的粉末或1 (il的樣品懸浮液直接進(jìn)行 PCR以擴(kuò)增(3-肌動(dòng)蛋白基因。使用包含200 pM dNTPs混合物、0.2 (iM 引物和1.25單位ArapliTaq DNA聚合酶的總體積為25 的PCR反應(yīng) 混合物進(jìn)行PCR反應(yīng)。緩沖體系為包含2.4 % (w/v)的海藻糖的Tricine 緩沖液(pH8.3)(圖23,板A)。為了對(duì)比，還使用Tris緩沖液(pH8.3)(圖 23,板B)。 使用的引物的核苷酸序列為正義引物 5'-TCCATCTTGGCATCTCTCAG-S' 和 反 義 引 物5'-GTACCCGCATCAGGCATCTG-3'。 PCR反應(yīng)在如下溫度條件下進(jìn) 行94。C下5分鐘，接著40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94。C下30秒、62。C 下30秒、72。C下1分鐘；然后在72。C下最后延伸10分鐘。在使用包含2.4 % (w/v)的海藻糖的Tricine緩沖液(pH 8.3)的情況 下，使用任何^t板(純化的DNA、葉子粉末和葉子懸浮液)的全部反應(yīng) 產(chǎn)生擴(kuò)增子(圖23,板A)。與此相反，只有在使用純化的DNA作為模 板時(shí)Tris緩沖液才產(chǎn)生擴(kuò)增子(圖23，板B)。因此，可以認(rèn)為兩性離子緩沖液和/或非還原性石友水化合物同樣可 以使用植物組織進(jìn)行直接擴(kuò)增。實(shí)施例XIV:組織切片中的基因擴(kuò)增在肺組織，特別是肺癌組織中，已對(duì)如gefitinib (Iressa)和elrotilib (tarceva) (39)的肺癌藥物的敏感性進(jìn)行了深入研究，其注意力集中于表 皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因外顯子18、 19、 20和21的突變。為了驗(yàn) 證使用組織切片的直接PCR的可能性，從組織微陣列(ISU Abxis公司) 上提取一點(diǎn)并直接進(jìn)行PCR。使用的四對(duì)引物為用于擴(kuò)增外顯子18 以 獲 得 425 bp 的 擴(kuò) 增 子 的 E18F1， 5'-AATGAGCTGGCAAGTGCCGTGTCCTG隱S' 和 E18R1, 5'-CCTCTCAATAACTTGGGAAAAACACTG-3';用于擴(kuò)增外顯子19以 獲 得 446bp 的 擴(kuò) 增 子 的 E19F1， 5'-AGCCCCCAGCAATATCAGCCTTAGGTG-S' 和 E19R1， 5'-ATGGGAGAGGCCAGTGCTGTCTCTAAG-S';用于擴(kuò)增外顯子20 以獲得 385 bp 的擴(kuò)增子的 E20F1, 5'-GCATTCATGCGTCTTCACCTGGAAGG-3' 和 E20R1, 5'-GCACACACATATCCCCATGGCAAACTC-3';以及用于擴(kuò)增外顯子 21 以 獲得 386 bp 的 擴(kuò) 增 子 的 E21F1, 5'-CGCCAGCCATAAGTCCTCGACGTGGAG-S' 和 E21R1, 5'-TCTGGAGAGCATCCTCCCCTGCATGTG-S'。將10 pi 30%的甘油滴加到組織微陣列的組織點(diǎn)中，1~2分鐘后， 通過(guò)連續(xù)吹打?qū)⒔M織點(diǎn)裂解。將裂解的組織點(diǎn)直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 使用包含200 (iM dNTPs混合物、0.3 引物和1.25單位的AmpliTaq DNA聚合酶的總體積25 pl的PCR反應(yīng)混合物進(jìn)行PCR反應(yīng)。緩沖體 系為包含2.4 % (w/v)的海藻糖的Tridne緩沖液(pH 8.3)。 PCR反應(yīng)在 如下溫度條件下進(jìn)行94。C下5分鐘，接著40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94 。C下30秒、62。C下30秒、72。C下1分鐘；然后在72。C下最后延伸10 分鐘。如圖24中所示，根據(jù)本發(fā)明組織切片可以不經(jīng)過(guò)DNA純化而直接擴(kuò)增。實(shí)施例XV: SNP基因分型SNP表示"單核苷酸多態(tài)性"。SNP為最常見的遺傳性變異，其 每100~300個(gè)堿基發(fā)生一次。在過(guò)去幾年中已經(jīng)開發(fā)了多種SNP基因 分型技術(shù)。然而，現(xiàn)有技術(shù)中需要快速、可靠和廉價(jià)的SNP基因分型方法。我們?cè)囼?yàn)本發(fā)明是否可以應(yīng)用于SNP基因分型。為了 SNP基因分 型，設(shè)計(jì)引物以使擴(kuò)增子(525 bp)在EGFR基因的啟動(dòng)子區(qū)域包含 -216G/T多態(tài)性。使用的引物的序列為egfr-f
(5'隱GGCCCGCGCGAGCTAGACGT畫3') 和 egfr-r(5'匿CAGGTGGCCTGTCGTCCGGTCT-3')。將0.5 pl血液直接加入包含200 ^MdNTPs混合物、0.3 引物 和1.25單位的AmpliTaq DNA聚合酶的總體為25|il的PCR反應(yīng)混合 物中。緩沖體系為包含2.4 % (w/v)的海藻糖的Tricine緩沖液(pH 8.3)。 PCR反應(yīng)在如下溫度條件下進(jìn)行94。C下5分鐘，接著40個(gè)循環(huán)，每 個(gè)循環(huán)為94。C下30秒、6(TC下30秒、72。C下30秒；然后在72。C下 最后延伸10分鐘。然后通過(guò)用ExoSAP-IT (USB公司)或QIAquick PCR 純化試劑盒(Qiagen公司)的處理來(lái)純化PCR產(chǎn)物。然后使用純化的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行單堿基延伸， 以用引物 egfr-sbe (5'-GCGCGGCCGCAGCAGCCTCC- 3')和SNaPshot試劑盒(Applied Biosystems公司)按照制造商的說(shuō)明來(lái)基因分型-216G/T多態(tài)性，并對(duì) 基因分型評(píng)分。如圖25中所示，在本發(fā)明提供的條件下直接從血液得到PCR產(chǎn) 物，且其不需要對(duì)制造商提供的技術(shù)手冊(cè)進(jìn)行下游修改而用作的ABI PRISM SNaPshot ddNTP引物延伸試驗(yàn)的模板，從而獲得精確的 SNP基因分型結(jié)果。實(shí)施例XVI:焚光染料鏈終止循環(huán)測(cè)序法DNA測(cè)序?yàn)闇y(cè)定DNA樣品中精確的核苷酸序列。用于測(cè)序的最 主要的方法為所謂的熒光雙脫氧法。我們?cè)囼?yàn)本發(fā)明是否可以應(yīng)用到 自動(dòng)熒光染料鏈終止循環(huán)測(cè)序法。為了自動(dòng)循環(huán)測(cè)序，設(shè)計(jì)引物，使 擴(kuò)增子(406 bp)包含人線粒體DNA中D-環(huán)區(qū)的HVI片段。使用的引物 的序列為L(zhǎng)15996 (5'-CTCCACCATTAGCACCCAAAG-S')和H16401 (5'-TGATTTCACGGAGGATGGTG-3')。將的血液直接加入包含200 |iM dNTPs混合物、0.2 (iM引物和1.25單位的AmpliTaq DNA聚合酶 (Applied Biosystems7^司)的總體為25jal的PCR反應(yīng)混合物中。緩沖體 系為包含2.4 % (w/v)的海藻糖的Tricine緩沖液(pH 8,3)。 PCR反應(yīng)在 如下溫度條件下進(jìn)行94。C下5分鐘，接著35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94 t下45秒、58。C下45秒、72。C下45秒；然后在72。C下最后延伸5分 鐘。然后將一半的PCR產(chǎn)物用NucleoSpin Extract II (Macherey-Nagel 公司)純化或通過(guò)用ExoSAP- IT (USB公司)處理，而剩余的不純化。 然后按照制造商的說(shuō)明，使用BigDye terminator v3.1循環(huán)測(cè)序反應(yīng) (Applied Biosystems公司)和用于延伸正向/反向鏈的L15996/H406引物 對(duì)純化或未純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。如圖26A-26B中所示，在通過(guò)本發(fā)明提供的條件下從血液中直接 得到PCR產(chǎn)物，且其不需要對(duì)制造商提供的技術(shù)手冊(cè)進(jìn)行下游修改而 用作BigDye terminator v3.1循環(huán)測(cè)序反應(yīng)的沖莫^反，最終;彈到DNA測(cè)序 結(jié)果。雖然已經(jīng)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)該理解，在本發(fā)明的 實(shí)質(zhì)內(nèi)的變化和修改對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員變得顯而易見，本發(fā)明的 范圍通過(guò)附屬權(quán)利要求和其等效物確定。參考文獻(xiàn)1. Saiki, R. K., Scharf， S., Faloona， F.， Mullis， K. B., Horn, G. T.， Erlich, H. A. & Arnheim, N. (1985) Science 230, 1350-1354, 2. Mullis, K. B. & Faloona, F. A. (1987) Methods Enzymol. 155， 335-350.3.3. Saiki, R. K" Gelfand, D. H.， Stoffel, S., Scharf, S. J., Higuchi, R.， Horn G. T., Mullis， K. B. & Erlich, H. A. (1988) Science 239, 487-491.4. Akane, A.， Matsubara, K., Nakamura, H., Takahashi, S. & Kimura， K. (1994) J. Forensic Sci. 39， 362-372.5. Al Soud, W. A.， Jo腦on, L.丄& Radstrom, P. (2000) J. Clin. Microbiol. 38， 345-350.6. Mercier, B., Gaucher, C, Feugeas， O. & Mazurier， C (1990) Nucleic Acids Res. 18, 5908.7. Panaccio, M. & Lew, A. (1991) Nucleic Acids Res. 19， 1151.8. McCusker, J., Dawson, M. T., Noone， D.， Gannon, F. & Smith, T. (1992) Nucleic Acids Res. 20， 6747.9. Panaccio, M., Georgesz, M. & Lew, A. M. (1993) Biotechniques 14, 238-243.10. Sarkar, G., Kapelner, S. & Sommer， S. S. (1990) Nucleic Acids Res . 18 , 7465.11. Burckhardt， J. (1994) PCR Methods Appl. 3, 239-243.12. Kreader, C. A. (1996) Appl. Environ. Microbiol, 62, 1102- 1106.13. Cheyrou, A" Guyomarc'h, C， Jasserand, P. & Blouin, P.(1991) Nucleic Acids Res. 19， 4006.14. Makowski, G. S., Davis, E. L.， Aslanzadeh, J. & Hopfer, S.M. (1995) Nucleic Acids Res. 23, 3788-3789.
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權(quán)利要求
1、一種用于進(jìn)行涉及核酸分子的直接酶反應(yīng)的方法，其包括如下步驟(a)直接使用生物樣品在包含兩性離子緩沖液和/或非還原性碳水化合物的反應(yīng)混合物中進(jìn)行酶反應(yīng)，該兩性離子緩沖液和/或非還原性碳水化合物用于防止生物樣品抑制酶反應(yīng)，其中在酶反應(yīng)之前不純化生物樣品中存在的核酸分子；以及(b)從酶反應(yīng)中得到產(chǎn)物。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述涉及核酸分子的酶反 應(yīng)為擴(kuò)增反應(yīng)、逆轉(zhuǎn)錄、DNA連接、核酸酶介導(dǎo)的反應(yīng)或DNA曱基化。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述生物樣品為病毒、細(xì) 菌、組織、纟田胞、血液、淋巴液、骨髓液、唾液、奶、尿、糞便、目艮 內(nèi)液、精液、腦提取物、脊髓液、關(guān)節(jié)液、胸液、腹水、羊水或細(xì)胞組織液。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述兩性離子緩沖液選自 包括HEPES (4-(2-羥乙基)-l-哌溱乙烷磺酸)、Tricine (N-三(鞋甲基)曱 基甘氨酸)、Bicine(N,N-雙(2-羥乙基)甘氨酸)、Taps (N-三(羥曱基)曱基 -3-氨基丙烷磺酸)、ACE(N-(2-(乙酰胺)-2-氨基乙烷-磺酸)、ADA(N-(2-乙酰胺)-亞氨基二乙酸)、MES(2-(N-嗎啉代)-乙烷磺酸)、MOPS(3-(N-嗎啉代)丙烷磺酸)和MOPSO (3-N-嗎啉代)-2-羥基丙烷磺酸)的組。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述兩性離子緩沖液為 HEPES、 Tricine或Bicine。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述兩性離子緩沖液為Tricine。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述非還原性碳水化合物 為乙二醇、聚乙二醇、聚甘油、非還原性二糖、三糖、四糖、糖醇、 醛糖酸或其內(nèi)酯、糖二酸或其內(nèi)酯或者糖醛酸。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述非還原性碳水化合物 為非還原性二糖、三糖、四糖或衍生自單糖的糖醇。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述非還原性碳水化合物 為山梨糖醇、甘露醇、海藻糖、蜜三糖或蔗糖。
10、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述酶反應(yīng)為擴(kuò)增反應(yīng)。
11、 根據(jù)權(quán)利要求IO所述的方法，其中，所述擴(kuò)增反應(yīng)為熱啟動(dòng) PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))。
12、 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述擴(kuò)增反應(yīng)為 RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶4連式反應(yīng))。
13、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述酶反應(yīng)為核酸酶介 導(dǎo)的反應(yīng)。
14、 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述核酸酶介導(dǎo)的反應(yīng)為侵染檢測(cè)。
15、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述反應(yīng)混合物進(jìn)一步 包含兩性離子表面活性劑、牛血清白蛋白、多胺或其組合。
16、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述生物樣品為血液。
17、 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，所述生物樣品為血液， 且存在于血液中的核酸分子具有低拷貝數(shù)。
18、 一種用于進(jìn)行涉及核酸分子的直接酶反應(yīng)并直4妄^使用生物樣 品的試劑盒，其包括用于酶反應(yīng)的反應(yīng)混合物，該反應(yīng)混合物包含用 以防止生物樣品抑制酶反應(yīng)的兩性離子緩沖液和/或非還原性碳水化合 物，而存在于生物樣品中的核酸分子在酶反應(yīng)之前不需要純化。
19、 根據(jù)權(quán)利要求18所述的試劑盒，其中，所述涉及核酸分子的 酶反應(yīng)為擴(kuò)增反應(yīng)、逆轉(zhuǎn)錄、DNA連接、核酸酶介導(dǎo)的反應(yīng)或DNA曱基化。
20、 根據(jù)權(quán)利要求18所述的試劑盒，其中，所述生物樣品為病毒、 細(xì)菌、組織、細(xì)月包、血液、淋巴液、骨髓液、唾液、奶、尿、糞便、 眼內(nèi)液、精液、腦提取物、脊髓液、關(guān)節(jié)液、胸液、腹水、羊水或細(xì)月包組織液。
21、 根據(jù)權(quán)利要求18所述的試劑盒，其中，所述兩性離子緩沖液 選自包括HEPES (4-(2-羥乙基)-l-哌。秦乙烷磺酸)、Tricine (N-三(羥曱基) 甲基甘氨酸)、Bicine (N,N-雙O羥乙基)甘氨酸)、Taps (N-三(羥曱基) 曱基-3-氨基丙烷磺酸)、ACE (N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙烷-磺酸)、ADA (N-O乙酰胺)-亞氨基二乙酸)、MES (2-(N-嗎啉代)-乙烷磺酸)、MOPS O(N-嗎啉代)丙烷磺酸)和MOPSO (3-N-嗎啉代)J-羥基丙烷磺酸)的 組。
22、 根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，其中，所述兩性離子緩沖液 為HEPES、 Tricine或Bicine。
23、 根據(jù)權(quán)利要求22所述的試劑盒，其中，所述兩性離子緩沖液 為Tricine。
24、 根據(jù)權(quán)利要求18所述的試劑盒，其中，非還原性碳水化合物 為乙二醇、聚乙二醇、聚甘油、非還原性二糖、三糖、四糖、糖醇、 醛糖酸或其內(nèi)酯、糖二酸或其內(nèi)酯或者糖醛酸。
25、 根據(jù)權(quán)利要求24所述的試劑盒，其中，所述非還原性碳水化 合物為非還原性二糖、三糖、四糖或衍生自單糖的糖醇。
26、 根據(jù)權(quán)利要求25所述的試劑盒，其中，所述非還原性碳水化 合物為山梨糖醇、甘露醇、海藻糖、蜜三糖或蔗糖。
27、 根據(jù)權(quán)利要求19所述的試劑盒，其中，所述酶反應(yīng)為擴(kuò)增反應(yīng)。
28、 根據(jù)權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中，所述擴(kuò)增反應(yīng)為熱啟 動(dòng)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))。
29、 根據(jù)權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中，所述擴(kuò)增反應(yīng)為 RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))。
30、 根據(jù)權(quán)利要求19所述的試劑盒，其中，所述酶反應(yīng)為核酸酶 介導(dǎo)的反應(yīng)。
31、 根據(jù)權(quán)利要求30所述的試劑盒，其中，所述核酸酶介導(dǎo)的反 應(yīng)為侵染4企測(cè)。
32、 根據(jù)權(quán)利要求18所述的試劑盒，其中，所述酶反應(yīng)混合物進(jìn) 一步包含兩性離子表面活性劑、牛血清白蛋白、多胺或其組合。
33、 根據(jù)權(quán)利要求20所述的試劑盒，其中，所述生物樣品為血液。
34、 根據(jù)權(quán)利要求33所述的試劑盒，其中，所述生物樣品為血液， 且存在于血液中的核酸分子具有低拷貝數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于進(jìn)行涉及核酸分子的直接酶反應(yīng)的方法，其包括如下步驟(a)直接使用生物樣品在包含兩性離子緩沖液和/或非還原性碳水化合物的反應(yīng)混合物中進(jìn)行酶反應(yīng)，該兩性離子緩沖液和/或非還原性碳水化合物用于防止生物樣品抑制酶反應(yīng)，其中在酶反應(yīng)之前不純化生物樣品中存在的核酸分子；以及(b)從酶反應(yīng)中得到產(chǎn)物。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101128604SQ200680006345
公開日2008年2月20日 申請(qǐng)日期2006年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月28日
發(fā)明者李承寬, 梁寧根, 金圣旭, 金鐘烈 申請(qǐng)人:生物探索公司