大腸桿菌2-脫氧-d-核糖-5-磷酸醛縮酶突變體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種大腸桿菌2-脫氧-D-核糖-5-磷 酸醛縮酶突變體及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 大腸桿菌2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶（DERA)，編號(hào)為EC4. 1. 2. 4,能夠催化 5-磷酸-2-脫氧-D-核糖分解成3-磷酸-D-甘油醛和乙醛，并可催化其逆反應(yīng)。
[0003] 易錯(cuò)PCR是指通過(guò)改變PCR反應(yīng)條件來(lái)調(diào)整PCR反應(yīng)中的突變頻率，降低聚合酶 固有的突變序列的傾向性，提高突變譜的多樣性，使得錯(cuò)誤堿基隨機(jī)地以一定的頻率摻入 到擴(kuò)增的基因中，從而得到隨機(jī)突變的DNA群體，最后用合適的載體克隆突變基因。
[0004] 通過(guò)易錯(cuò)PCR法獲得酶活力更高的DERA突變體成為一種改造DERA酶的有效手 段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種大腸桿菌2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶（DERA)突變 體及其制備方法。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的大腸桿菌2-脫氧-D-核糖-5-磷酸醛縮酶突 變體，其為：1)由SEQIDNo. 1所示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白；或2)SEQIDNo. 1所示氨基 酸序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且同等功能的由1)衍生的蛋白。
[0007] 本發(fā)明還提供編碼所述DERA突變體酶的基因，其核苷酸序列如SEQIDNo. 2所 不。
[0008] 本發(fā)明還提供含有編碼所述DERA突變體酶的基因的載體、宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因工 程菌。
[0009] 本發(fā)明還提供含有編碼所述DERA突變體酶的基因的大腸桿菌工程菌。
[0010] 本發(fā)明進(jìn)一步提供所述DERA突變體酶的制備方法，將含有編碼所述DERA突變體 酶的基因的大腸桿菌工程菌接種于LB培養(yǎng)基中，37°C，180rpm培養(yǎng)8-10h，按3%的接種量 接種于盛有3L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐容積為5L，在37 ± 1 °C，300rpm，空氣流量4L/ min的條件下培養(yǎng)8-10h后，添加60%甘油作為補(bǔ)料，當(dāng)0D600達(dá)到30時(shí)，降溫至30°C，添 加0.ImMIPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)10h后，放罐，離心發(fā)酵液，收集菌體，加入3倍體積pH7. 5的 50mM碳酸氫鈉緩沖液，冰水浴超聲破碎，8000rpm離心取上清，即得含有所述DERA突變體的 粗酶液。
[0011] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基為：甘油4g/L，磷酸氫二鉀12. 8g/L，磷酸二氫鉀3g/L，硫酸銨 〇? 5g/L，氯化鈣 0? 0152g/L，氯化鎂 0? 41g/L。
[0012] 經(jīng)酶活力測(cè)定，本發(fā)明提供的大腸桿菌DERA突變體酶較野生型DERA酶活可提高 3. 8個(gè)活力單位。通過(guò)對(duì)含有編碼所述DERA突變體的基因的大腸桿菌工程菌進(jìn)行大規(guī)模發(fā) 酵，可實(shí)現(xiàn)大腸桿菌DERA突變體酶的批量生產(chǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中PCR擴(kuò)增DERA基因的電泳檢測(cè)結(jié)果；其中，M為DNA Marker，1和2為目的DERA基因。
[0014] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中質(zhì)粒pET-DERA的酶切電泳圖；其中，M為DNAMarker，1 為酶切后的pET-DERA。
[0015] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中DERA突變體的SDS-PAGE電泳檢測(cè)圖；其中，M為蛋白 Marker，1為細(xì)菌裂解液。
[0016] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例4中DERA酶活力測(cè)定原理示意圖。
[0017] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例7中DERA突變體酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的GC分析結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:alaboratorymanual, 2001)，或按照制造廠商說(shuō)明書(shū)建議的條件。
[0019] 實(shí)施例1質(zhì)粒pET-DERA的構(gòu)建方法
[0020] 1、PCR擴(kuò)增DERA基因
[0021] 以1yg大腸桿菌基因組DNA為PCR反應(yīng)模板，設(shè)計(jì)引物A1 :5'-AAAAACATATGACT GATCTGAAAGCAAGCA-3'和引物A2 :5' -AAAAACTCGAGTTAGCTGCTGGCGCTCTTAC-3 '，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR反應(yīng)在50y1總體積中進(jìn)行，反應(yīng)條件為：94°C變性5min;94°C變性50s，55°C退 火lmin，72°C延伸2min，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠 電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。
[0022] 2、DERA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0023] 凝膠回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用NdeI和XhoI雙酶切，回收酶切片段，與同樣用NdeI 和XhoI雙酶切的pET_42a載體連接（于16°C連接16h)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞， 挑選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切分析驗(yàn)證，結(jié)果如圖2所示，并進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定，插 入序列正確的質(zhì)粒命名為pET-DERA。
[0024] DERA的氨基酸序列如SEQIDNo. 3所示，核苷酸序列如SEQIDNo. 4所示。
[0025] 實(shí)施例2構(gòu)建DERA突變體酶文庫(kù)
[0026] 使用隨機(jī)誘變?cè)噭┖?，通過(guò)改變MnCl2濃度和dNTPs濃度來(lái)進(jìn)行多個(gè)反應(yīng)，從而將 多個(gè)點(diǎn)突變引入E.coliDERA基因中。
[0027] 易錯(cuò)PCR所用引物為Al:5 ' -AAAAACATATGACTGATCTGAAAGCAAGCA-3 '和A2 : 5 ^ -AAAAACTCGAGTTAGCTGCTGGCGCTCTTAC-3'，易錯(cuò)PCR總體為 50y1，反應(yīng)條件為：94°C變 性4min;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10min。 將易錯(cuò)PCR片段用NdeI和XhoI雙酶切，回收酶切片段，與同樣用NdeI和XhoI雙酶切 的pET-42a載體連接，構(gòu)建成表達(dá)文庫(kù)，選取10個(gè)單克隆。然后將表達(dá)文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，用于表達(dá)突變的DERA基因。
[0028] 實(shí)施例3DERA突變體酶的表達(dá)
[0029] 突變DERA基因的表達(dá)：將實(shí)施例2中獲得的突變菌，挑取單克隆接種至5mlLB培 養(yǎng)基中（含50yg/ml的卡那霉素），37°C，200rpm培養(yǎng)6-8h，0D6QQ= 0. 6-0.8時(shí)，加入終濃 度為0. 5mM的IPTG，30°C誘導(dǎo)表達(dá)10h后冰浴超聲破碎菌體，細(xì)菌裂解液經(jīng)SDS-PAGE電泳 檢測(cè)，結(jié)果如圖