一種環(huán)境來(lái)源外切幾丁質(zhì)酶及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種環(huán)境來(lái)源外切幾丁質(zhì)酶及其編碼基因與 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 幾丁質(zhì)是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖以0 -1，4-糖苷鍵連接而成的高分子聚合物， 廣泛存在于自然界，是僅次于纖維素的第二大可再生資源。幾丁質(zhì)的降解產(chǎn)物幾丁寡糖和 N-乙酰氨基葡萄糖具有抗菌、抗腫瘤等活性，在食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、環(huán)保、生物工程等領(lǐng)域具 有廣泛的應(yīng)用前景（SynowieckiJ,Al-KhateebNA.Production,properties,andsomenew applicationsofchitinanditsderivatives.CritRevFoodSci2010;43:145-71)。 幾丁質(zhì)酶廣泛分布于自然界中，幾乎從微生物到高等動(dòng)植物所有的生物類(lèi)群中都有分布。 國(guó)內(nèi)外對(duì)于幾丁質(zhì)酶的篩選大多采用單菌落純培養(yǎng)的方式從自然界中篩選產(chǎn)酶活性較高 的微生物菌株。然而，土壤中不可培養(yǎng)的微生物占據(jù)微生物總數(shù)的99%以上，傳統(tǒng)的分離培 養(yǎng)單菌落只能分離土壤里不到1 %的微生物，這己成為微生物資源開(kāi)發(fā)利用的一個(gè)限制性 因素。宏基因組學(xué)是以某一特定環(huán)境中的所有微生物基因組DNA為基礎(chǔ)，應(yīng)用分子生物學(xué) 技術(shù)尋找和發(fā)現(xiàn)新的功能基因及活性代謝產(chǎn)物的一種方法。它避開(kāi)了微生物分離培養(yǎng)的過(guò) 程，極大地?cái)U(kuò)展了微生物資源的利用空間。
[0003] 近幾年來(lái)，海產(chǎn)品養(yǎng)殖加工業(yè)尤其是貝類(lèi)養(yǎng)殖加工業(yè)迅猛發(fā)展，而幾丁質(zhì)是水產(chǎn) 品加工中產(chǎn)生的大量蝦、蟹殼等廢棄物主要成分之一，因此新型幾丁質(zhì)酶對(duì)于開(kāi)發(fā)利用這 一類(lèi)資源具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種蛋白質(zhì)。
[0005] 本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)是如下a)或b)或c)的蛋白質(zhì)：
[0006]a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；
[0007]b)在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的N端和/或C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白 質(zhì)；
[0008]c)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。
[0009] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供與上述蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料。
[0010] 本發(fā)明提供的與上述蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料為下述B1)_B4)中的任一種：
[0011] B1)編碼上述蛋白質(zhì)的核酸分子；
[0012] B2)含有B1)所述核酸分子的表達(dá)盒；
[0013]B3)含有B1)所述核酸分子的重組載體或含有B2)所述表達(dá)盒的重組載體；
[0014]B4)含有B1)所述核酸分子的重組菌或含有B2)所述表達(dá)盒的重組菌或含有B3) 所述重組載體的重組菌。
[0015] 上述相關(guān)生物材料中，B1)所述核酸分子為如下1)或2)或3)的DNA分子：
[0016] 1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
[0017] 2)與1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85 %、至少具有90 %、至少具有95 %、至少具有96 %、至少具有97 %、至少具有98 %或至少 具有99 %同源性且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0018] 3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0019] 上述蛋白質(zhì)在作為幾丁質(zhì)酶中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的一個(gè)目的。
[0020] 上述相關(guān)生物材料在制備幾丁質(zhì)酶中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的一個(gè)目的。
[0021] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供上述蛋白質(zhì)或上述相關(guān)生物材料的新用途。
[0022] 本發(fā)明提供了上述蛋白質(zhì)或上述相關(guān)生物材料在水解膠體幾丁質(zhì)和/或幾丁三 糖和/或幾丁四糖中的應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明還提供了上述蛋白質(zhì)或上述相關(guān)生物材料在制備水解膠體幾丁質(zhì)和/或 幾丁三糖和/或幾丁四糖的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0024] 本發(fā)明還提供了上述蛋白質(zhì)或上述相關(guān)生物材料在制備幾丁二糖中的應(yīng)用。
[0025] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種重組菌。
[0026] 本發(fā)明提供的重組菌是將幾丁質(zhì)酶的編碼基因?qū)胨拗骶械玫降?；所述幾丁質(zhì) 酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
[0027] 上述重組菌中，所述幾丁質(zhì)酶的編碼基因是通過(guò)重組載體導(dǎo)入宿主菌的；
[0028] 所述重組載體是將編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的核酸分子插入表達(dá)載體，得到表 達(dá)權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的載體；
[0029] 所述幾丁質(zhì)酶的編碼基因的序列如序列表中序列1所示。
[0030] 上述重組菌中，所述宿主菌為巴斯德畢赤酵母GS115。
[0031] 本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種制備幾丁質(zhì)酶方法。
[0032] 本發(fā)明提供的制備幾丁質(zhì)酶方法包括如下步驟：發(fā)酵培養(yǎng)上述重組菌，得到幾丁 質(zhì)酶。
[0033] 本發(fā)明應(yīng)用基因組步移技術(shù)從豬糞便宏基因組中克隆了一種新型外切幾丁質(zhì)酶 基因并進(jìn)行了異源表達(dá)、重組酶純化及其性質(zhì)研究。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明：該幾丁質(zhì)酶在模擬胃腸 道環(huán)境中保持很高的穩(wěn)定性和酶活力。
【附圖說(shuō)明】
[0034] 圖1為幾丁質(zhì)酶基因Echi47的電泳圖。
[0035] 圖2為幾丁質(zhì)酶Echi47的純化電泳圖。
[0036] 圖3為幾丁質(zhì)酶Echi47的最適pH及pH穩(wěn)定性。圖3A為幾丁質(zhì)酶Echi47的最 適pH;圖3B為幾丁質(zhì)酶Echi47的pH穩(wěn)定性。
[0037] 圖4為幾丁質(zhì)酶Echi47的最適溫度及溫度穩(wěn)定性。圖4A為幾丁質(zhì)酶Echi47的 最適溫度；圖4B為幾丁質(zhì)酶Echi47的溫度穩(wěn)定性。
[0038] 圖5為幾丁質(zhì)酶Echi47水解膠體幾丁質(zhì)產(chǎn)物的薄層層析分析結(jié)果、HPLC分析結(jié) 果以及幾丁寡糖水解薄層層析分析結(jié)果。圖5A為幾丁質(zhì)酶Echi47水解膠體幾丁質(zhì)產(chǎn)物薄 層層析分析結(jié)果；圖5B為幾丁質(zhì)酶Echi47水解膠體幾丁質(zhì)產(chǎn)物的HPLC分析結(jié)果；圖5C為 幾丁質(zhì)酶Echi47水解膠體幾丁質(zhì)產(chǎn)物中的幾丁寡糖水解薄層層析分析結(jié)果。
[0039] 圖6為人工模擬胃腸液對(duì)幾丁質(zhì)酶Echi47穩(wěn)定性及活性影響。
[0040] 圖7為Echi47在胃腸道環(huán)境下的相對(duì)酶活性及其對(duì)膠體幾丁質(zhì)降解的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 圖7A為Echi47在胃腸道環(huán)境下的相對(duì)酶活性；圖7B為Echi47在胃腸道環(huán)境下對(duì)膠體幾 丁質(zhì)降解的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0042] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0043] 實(shí)施例1、幾丁質(zhì)酶基因Echi47的獲得
[0044] 一、幾丁質(zhì)酶基因組保守區(qū)片斷的PCR擴(kuò)增
[0045] 1、引物的設(shè)計(jì)
[0046] 利用在線(xiàn)引物設(shè)計(jì)軟件C0DEH0P (http://blocks, fhcrc. org/codehop. html)設(shè) 計(jì)簡(jiǎn)并引物CHIF(正向引物）：5'-GGNRTNGAYHTNGAYTGGGARTAYCC-3' ；CHIR(反向引物）： 5'-CCAATGNCCRTTDATRTCRTA-3'。
[0047] 2、PCR擴(kuò)增
[0048] 以豬糞便微生物的基因組DNA為模板，采用步驟1設(shè)計(jì)的CHIF和CHIR為引物進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0049]PCR反應(yīng)條件：94°C5min;94°C30s，48°C_52°C(每個(gè)循環(huán)降低 0? 5°C)30s，72°C 30s，共 8 個(gè)循環(huán)；94°C30s，56°C30s，72°C30s，共 25 個(gè)循環(huán)；72°C，5min。
[0050] 3、電泳
[0051]PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示在280bp附近有特異條帶， 將該條帶回收，并連接PMD18-T載體，得到重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)化E. coli DH5 a， 經(jīng)菌落PCR鑒定重組子后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI BLAST搜索比對(duì)，表明PCR擴(kuò)增得到 的目的基因片段與其它微生物來(lái)源的幾丁質(zhì)酶基因有較高同源性。
[0052] 二、幾丁質(zhì)酶基因Echi47的獲得
[0053] 1、引物的設(shè)計(jì)
[0054] 根據(jù)克隆得到的DNA片段的序列分析結(jié)果，分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增上游序列的引物rspl、 18口2、^口3和下游序列的引物€8口1、€8口2、€8口3。引物序列如下：
[0055] rspl:5,-GCAAACTCGGAAACATCCTTCA-3'；
[0056] rsp2 :5'-GCTCCTTCTTGCCACCTTTCT-3' ；
[0057] rsp3 :5'-GCTTGTTGCTCGGGACTGG-3'；
[0058] fspl :5'-TATCCTGCCAGTCCCGAGCAA-3' ；
[0059] fsp2 :5'-TCAATGAAGCCGAGGATACCA-3' ；
[0060] fsp3 :5'-ATGAAGGATGTTTCCGAGTTTGC-3' 。
[0061] 2、TAIL_PCR
[0062] TAIL-PCR參照文獻(xiàn)"Liu YG, Chen Y. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences. Biotechniques 2007, 43:649-650"中的方法。第一輪的模板為豬糞便基因組DNA ;第二輪和第三輪的模板 分別為第一輪和第二輪PCR產(chǎn)物（稀釋50倍）。TAIL-PCR擴(kuò)增得到TAIL-PCR產(chǎn)物。
[0063] 第一輪PCR擴(kuò)增條件為：94°C預(yù)變性5min，5個(gè)循環(huán)（94°C30s，60°C30s，72°C 31^11)，15個(gè)循環(huán)（941€308,601€308,72 1€3111111，941€308,601€208,721€3111111，94 1€ 30s，44°C30s，72°C3min)，延伸72°ClOmin。
[0064] 第二輪和第三