一種生物素標記無機焦磷酸酶的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種生物素標記無機焦磷酸酶的制備方法。
【背景技術】
[0002]生物素化(b1tinylat1n)是指將生物素共價連接到蛋白質、核酸或其它分子上的過程。由于生物素的分子量不大(分子量為244.31)，生物素化反應快速、高效且不易被干擾。生物素化的分子能通過生物素與鏈霉親和素、親和素互作，且不受高熱、PH、蛋白酶解的影響。生物素與鏈霉親和素、親和素的結合特異且高效，因此這一互作在生物技術的許多領域有著廣泛的應用。另外，多個生物素化分子可以發(fā)生交聯(lián)來形成個科研人員感興趣的蛋白，同時允許和多個鏈霉親和素、親和素、中性親和素蛋白結合，增加了對此蛋白的檢測靈敏度。此外還有大量的生物素化分子的應用有待開發(fā)。
[0003]無機焦磷酸酶是以焦磷酸為底物的水解酶，該酶廣泛存在于自然界，參與合成糖類、核酸和蛋白質等多種代謝途徑中所形成的焦磷酸的水解。許多利用ATP的代謝活動會產生焦磷酸，無機焦磷酸酶能將生物體代謝活動中產生的焦磷酸降解掉，防止其過度積累。IPPA不僅在生物體內發(fā)揮作用，防止無機焦磷酸影響生物體的正常代謝，近年來隨著生物催化劑的興起，其體外功能也逐漸顯現(xiàn)出來。
[0004]無機焦磷酸酶是催化焦磷酸水解為正磷酸的一類酶。焦磷酸是某些代謝過程如DNA和RNA聚合、氨基酸活化氨酰tRNA合成、脂肪酸的β -氧化脂酰輔酶A的合成、纖維素合成UDP-葡萄糖的合成和淀粉合成ADP-葡萄糖的合成過程的副產物。無機焦磷酸酶通過分解焦磷酸可使上述反應向合成方向進行并能為許多生物合成反應提供能量，因而無機焦磷酸酶是生命所必需的。
[0005]無機焦磷酸酶被生物素修飾之后就可以同親和素進行固相親和作用。生物素與親和素是一對特異性相當高的親和配體，并且具有解離速率慢、不易受干擾等特點。目前，生物素化的手段有化學修飾和生物修飾，但修飾后的生物素化蛋白活性普遍不高。生物素化的無機焦磷酸酶可應用于焦磷酸測序反應中，酶活會直接關系到測序反應的準確度，所以急需找到一種可操作性強，產物活性高的制備方法。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的一個目的是一種生物素標記無機焦磷酸酶的制備方法，包括以下步驟:
(1)使用Tris-HCl緩沖液溶解無機焦磷酸酶；
(2)活化生物素；
(3)平衡生物素至10°C以下；
(4)將活化的生物素溶于二甲基甲酰胺和四氫呋喃混合溶劑中，加入無機焦磷酸酶，按照生物素與無機焦磷酸酶摩爾比(22-25):1的比例混合，攪拌，得到混合溶液；
(5)使用Tris-HCl緩沖液對混合溶液進行透析，溫度為4°C，去除雜質和游離生物素；
(6)使用280nm的吸光度測定蛋白含量； (7)加入保護劑，冷藏保存至-80°C — -16°C。
[0007]所述步驟(I)-步驟(5 )中，Tris-HCl緩沖液pH值為8.5。
[0008]所述溶解無機焦磷酸酶，使無機焦磷酸酶濃度為1.5-2mg/ml。
[0009]所述活化生物素使用EDC/NHS和有機溶劑，生物素、EDC和NHS的摩爾比為4:5: 4，有機溶劑為二甲基甲酰胺，純度為分析純以上。
[0010]所述攪拌溫度為4°C，持續(xù)5小時以上，優(yōu)選為8小時。
[0011]所述透析過程持續(xù)12小時以上，優(yōu)選為18小時。
[0012]所述透析過程，Tris-HCl緩沖液體積為混合溶液的10倍以上，Tris-HCl緩沖液更換一次以上。
[0013]所述保護劑含有Tris-HCl緩沖液；還含有甘氨酸、組氨酸、甘露醇、DTT、EDTA、疊氮鈉和聚乙二醇中的一種或幾種。
[0014]所述保護劑優(yōu)選含有Tris-HCl緩沖液、甘氨酸、組氨酸、DTT、EDTA和疊氮鈉。
[0015]加入保護劑后，將保護劑與酶的混合液調節(jié)至pH 8.0。
[0016]本發(fā)明中二甲基甲酰胺和四氫呋喃混合溶劑能夠使生物素和無機焦磷酸酶溶解于其中，在其中高效、充分的結合。制備得到的生物素化無機焦磷酸酶，非常適合應用于焦磷酸測序反應中，無機焦磷酸酶的高活性可確保測序反應的準確度。在測序反應中，可與焦磷酸酶和ATP硫化酶協(xié)同作用，進行通量高、讀長大的測序反應。
【具體實施方式】
[0017]實施例1
Cl)使用PH8.5的Tris-HCl緩沖液溶解無機焦磷酸酶，無機焦磷酸酶濃度為1.8mg/
ml ；
(2)活化生物素:將Imol生物素，1.25molEDC，Imol NHS加入IL分析純的二甲基甲酰胺中，進行生物素的活化；
(3)平衡生物素至10°C;
(4)將活化的生物素0.24mol溶于由90ml 二甲基甲酰胺和10ml四氫呋喃混合得到的混合溶劑中，加入無機焦磷酸酶0.0lmol，混合，攪拌8小時，溫度為4°C，得到混合溶液；
(5)使用ILTris-HCl緩沖液對10ml混合溶液進行透析，持續(xù)18小時，溫度為4°C，去除雜質和游離生物素，Tris-HCl緩沖液在6小時更換一次；
(6)使用280nm的吸光度測定蛋白含量；
(7)加入酶體積2倍的保護劑，保護劑含有1mMTris-HCl緩沖液、20%甘氨酸、30%組氨酸、0.15mM DTT、0.08mM EDTA 和 0.06mM 疊氮鈉，調節(jié) pH 至 8.0，保存至-16°C。
[0018]實施例2
Cl)使用PH8.5的Tris-HCl緩沖液溶解無機焦磷酸酶，無機焦磷酸酶濃度為1.5mg/
ml ；
(2)活化生物素:將Imol生物素，1.25molEDC，Imol NHS加入IL分析純的二甲基甲酰胺中，進行生物素的活化；
(3)平衡生物素至4°C;
(4)將活化的生物素0.22mol溶于由90ml 二甲基甲酰胺和10ml四氫呋喃混合得到的混合溶劑中，加入無機焦磷酸酶0.0lmol，混合，攪拌5小時，溫度為4°C，得到混合溶液；
(5)使用ILTris-HCl緩沖液對80ml混合溶液進行透析，持續(xù)12小時，溫度為4°C，去除雜質和游離生物素，Tris-HCl緩沖液在4小時更換一次；
(6)使用280nm的吸光度測定蛋白含量；
(7)加入酶體積1.5倍的保護劑，保護劑含有1mM Tris-HCl緩沖液和0.1mM DTT，調節(jié)pH至8.0，保存至-20 0C ο
[0019]實施例3
Cl)使用PH8.5的Tris-HCl緩沖液溶解無機焦磷酸酶，無機焦磷酸酶濃度為1.6mg/
ml ；
(2)活化生物素:將Imol生物素，1.25mol EDC, Imol NHS加入分析純的二甲基甲酰胺中，進行生物素的活化；
(3)平衡生物素至4°C;
(4)將活化的生物素0.25mol溶于二甲基甲酰胺和四氫呋喃混合溶劑中，加入無機焦磷酸酶0.0lmol，混合，攪拌6小時，溫度為4°C，得到混合溶液；
(5)使用ILTris-HCl緩沖液對90ml混合溶液進行透析，持續(xù)15小時，溫度為4°C，去除雜質和游離生物素，Tris-HCl緩沖液在4小時和8小時更換；
(6)使用280nm的吸光度測定蛋白含量；
(7)加入酶體積2倍的保護劑，保護劑含有1mMTris-HCl緩沖液、20%甘氨酸、0.2mM甘露醇、0.15mM DTT 和 0.08mM EDTA，調節(jié) pH 至 8.0，保存至 _70°C。
[0020]實施例4
Cl)使用pH8.5的Tris-HCl緩沖液溶解無機焦磷酸酶，無機焦磷酸酶濃度為2mg/ml ；
(2)活化生物素:將Imol生物素，1.25mol EDC, Imol NHS加入分析純的二甲基甲酰胺中，進行生物素的活化；
(3)平衡生物素至O°C;
(4)將活化的生物素0.23mol溶于二甲基甲酰胺和四氫呋喃混合溶劑中，加入無機焦磷酸酶0.0lmol，混合，攪拌7小時，溫度為4°C，得到混合溶液；
(5)使用ILTris-HCl緩沖液對85ml混合溶液進行透析，持續(xù)13小時，溫度為4°C，去除雜質和游離生物素，Tris-HCl緩沖液在2小時和9小時更換；
(6)使用280nm的吸光度測定蛋白含量；
(7)加入與酶等體積的保護劑，保護劑含有1mMTris-HCl緩沖液、25%甘氨酸、0.15mMDTT和0.2mM聚乙二醇，調節(jié)pH至8.0，保存至-80 °C。
【主權項】
1.一種生物素標記無機焦磷酸酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)使用TriS-HCl緩沖液溶解無機焦磷酸酶； (2)活化生物素； (3)平衡生物素至10°C以下； (4)將活化的生物素溶于二甲基甲酰胺和四氫呋喃混合溶劑中，加入無機焦磷酸酶，按照生物素與無機焦磷酸酶摩爾比(22-25):1的比例混合，攪拌，得到混合溶液； (5)使用Tris-HCl緩沖液對混合溶液進行透析，溫度為4°C，去除雜質和游離生物素； (6)使用280nm的吸光度測定蛋白含量； (7)加入保護劑，冷藏保存至-80°C— -16°C。2.如權利要求1所述的生物素標記無機焦磷酸酶的制備方法，其特征在于，所述步驟(O-步驟(5 )中，Tris-HCl緩沖液pH值為8.5。3.如權利要求1所述的生物素標記無機焦磷酸酶的制備方法，其特征在于，所述溶解無機焦磷酸酶，使無機焦磷酸酶濃度為1.5-2mg/ml04.如權利要求1所述的生物素標記無機焦磷酸酶的制備方法，其特征在于，所述活化生物素使用H)C/NHS和有機溶劑，生物素、EDC和NHS的摩爾比為4:5: 4，有機溶劑為二甲基甲酰胺，純度為分析純以上。5.如權利要求1所述的生物素標記無機焦磷酸酶的制備方法，其特征在于，所述攪拌溫度為4°C，持續(xù)5小時以上，優(yōu)選為8小時。6.如權利要求1所述的生物素標記無機焦磷酸酶的制備方法，其特征在于，所述透析過程持續(xù)12小時以上，優(yōu)選為18小時。7.如權利要求1所述的生物素標記無機焦磷酸酶的制備方法，其特征在于，所述透析過程，Tris-HCl緩沖液體積為混合溶液的10倍以上，Tris-HCl緩沖液更換一次以上。8.如權利要求1所述的生物素標記無機焦磷酸酶的制備方法，其特征在于，所述保護劑含有Tris-HCl緩沖液；還含有甘氨酸、組氨酸、甘露醇、DTT、EDTA、疊氮鈉和聚乙二醇中的一種或幾種。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種生物素標記無機焦磷酸酶的制備方法。步驟如下：溶解無機焦磷酸酶，活化生物素，結合無機焦磷酸酶，透析，測定蛋白含量，保存。本發(fā)明制備得到的無機焦磷酸酶，非常適合應用于焦磷酸測序反應中，無機焦磷酸酶的高活性可確保測序反應的準確度。
【IPC分類】C12N9/14
【公開號】CN105062988
【申請?zhí)枴緾N201510416726
【發(fā)明人】高靜, 蔡亦梅, 徐瀟, 吳超, 張睿, 王者馥, 王緒敏, 殷金龍, 任魯風
【申請人】北京中科紫鑫科技有限責任公司
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年7月16日