專利名稱：強(qiáng)旱生植物霸王液泡膜氫焦磷酸酶基因和植物表達(dá)載體及其植株遺傳轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及從中亞荒漠特有古老的強(qiáng)旱生植物 霸王(Zygophyllum xanthoxylum)中克隆的液泡膜氫焦磷酸酶基因ZxVPl-1，以及該基因 的植物表達(dá)載體pCAMBIA1302-ZxVPl-l和含有該表達(dá)載體的工程農(nóng)桿菌GV3101及其植株 遺傳轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
干旱和土壤鹽漬化是制約全球農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)的兩個(gè)最主要不利因素。目前，世界上 干旱區(qū)總面積約為61億公頃，約占全球陸地面積的40% (《環(huán)球時(shí)報(bào)》2009)。而且，由于溫 室氣體排放，氣溫升高，水分蒸發(fā)加劇，致使某些半濕潤地區(qū)也變成了干旱地區(qū)。此外，由于 干旱和半干旱地區(qū)的強(qiáng)烈蒸發(fā)，使這些地區(qū)的土壤中富集了大量鹽分而使土壤鹽漬化、荒 漠化。另外，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球還有各種鹽漬土地約9. 5億公頃(Kovda & SzabolcsModellingof Soil Salinization and Alkalization. 1979)；而且，由于耕地的次生鹽漬化，鹽漬土地面 積也在不斷增加。隨著社會(huì)不斷進(jìn)步，人口急速膨脹，世界糧食出現(xiàn)危機(jī)；因此，在耕地資源 愈趨匱乏和全球生態(tài)日益惡化的形勢(shì)下，對(duì)大面積存在的干旱鹽漬土地資源進(jìn)行開發(fā)利用 變得愈加迫切。然而，令人遺憾的是，全球植物物種的99%，尤其是農(nóng)作物對(duì)干旱和鹽漬環(huán)境的耐 受性都不強(qiáng)(Flowers T J and Colmer T D. 2008. New Phytol. 179(4) :945_63 ；Xiong L M and Zhu J K. Salt Tolerance. The ArabidopsisBook. 2002)；因此，提高農(nóng)作物以及其它植 物的耐鹽抗旱性是開發(fā)利用大面積存在的干旱鹽漬土地資源的重要途徑之一，也是解決糧 食危機(jī)和應(yīng)對(duì)全球氣候變暖的重要手段。然而目前作物性狀的改良主要依賴于傳統(tǒng)育種。 由于遺傳物質(zhì)的雜合性和優(yōu)良品種數(shù)以及其有限的抗逆性的限制，傳統(tǒng)育種不但費(fèi)時(shí)長而 且成功幾率小。慶幸的是一方面，植物基因工程可以克服傳統(tǒng)育種的缺陷，突破物種間優(yōu) 良抗逆基因資源轉(zhuǎn)移的障礙，培育出傳統(tǒng)育種方法所不能培育的新品種(系)；另一方面， 干旱鹽漬生境中的植物在漫長的生命史中演化出適應(yīng)不良生境的獨(dú)特機(jī)制，進(jìn)化出大量對(duì) 干旱鹽漬生境具有強(qiáng)抗性的獨(dú)特抗逆基因資源，這為農(nóng)作物抗旱耐鹽性的遺傳改良帶來了 新曙光。為了在干旱鹽漬環(huán)境中生存，植物細(xì)胞必須維持很低的滲透勢(shì)以保證在干旱條 件下根系能從土壤中吸收水分以及減少葉片細(xì)胞的水分散失。盡管植物可以合成大量“兼 性”有機(jī)溶質(zhì)，如糖類(蔗糖)、糖醇類(山梨醇)、氨基酸類(脯氨酸)、甲基化脯氨酸類 化合物(甲基脯氨酸)、甜菜堿類(甘氨酸甜菜堿)和甲基磺酸化合物(β_ 二甲基巰基 丙酸鹽，DMSP) (Gasegawa PM, Bressan R A, Zhu J K, Bohnert H J. 2000. Annual Review of PlantPhysiology and Plant Molecular Biology. 51 463-499 ；Rhodes D, HansonA D. 1993. Annual Review of Plant Phys iology and Plant MolecularBiology 44 357-384)等進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)；但其不僅消耗了大量的C源和N源，而且在合成過程中還需要耗費(fèi)相當(dāng)?shù)哪芰?。因此，合成有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)并不是一種理想的滲透調(diào)節(jié)方式。研究表明，干旱鹽漬生境中的植物可利用大量無機(jī)離子如Na+、K+等進(jìn)行滲透調(diào) 節(jié)，如Wang等發(fā)現(xiàn)霸王可從含鹽量極低的生境中吸收并積累大量的Na+以降低細(xì)胞滲透 勢(shì)來適應(yīng)極端的干旱環(huán)境(Wang S Μ, Wang Y R, ChenH, et al. 2004. J. Arid Environ. 56 525539)。霸王作為一種典型的荒漠多漿旱生植物，廣泛分布于我國西北荒漠(趙一之，朱 宗元.2003.云南植物研究.25(2) 113 121)，在其漫長的生命進(jìn)化史中孕育出大量而獨(dú)特 的抗逆基因資源，對(duì)極端環(huán)境如強(qiáng)光照、極度干旱、強(qiáng)烈溫差和貧瘠的荒漠土壤等具有很強(qiáng) 的適應(yīng)性(周向睿，周志宇，吳彩霞.2006.草業(yè)科學(xué)，23(6) :38-41)。因此，本發(fā)明的動(dòng)因 就是利用現(xiàn)代生物技術(shù)，從具有特殊適應(yīng)機(jī)制的荒漠植物霸王中挖掘其特異的抗逆基因 資源，用于農(nóng)作物和優(yōu)良牧草抗逆性的遺傳改良，使其能夠更有效地利用土壤中的Na+進(jìn)行 滲透調(diào)節(jié)，增強(qiáng)其適應(yīng)干旱鹽漬等不良生境的能力。由于Na+會(huì)危害細(xì)胞質(zhì)內(nèi)各種代謝酶的活性(Blumwald E. 2000. CurrOpin Cell Biol. 12(4) :431-4)，因此，植物細(xì)胞需要將進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的Na+進(jìn)行區(qū)隔以維持正常的生 長代謝活動(dòng)(Frommer W B and Rentsch D. 1999. Science. 285 1222-1223)。由于液泡 占成熟細(xì)胞體積的 80-90% (Schmidt UG, Endler A, Schelbert S, et al. 2007. Plant Physiology. 145 :216_229)，因此液泡是大量有害物質(zhì)如Na+等的理想?yún)^(qū)隔場(chǎng)所。研究表明， 離子區(qū)域化的實(shí)現(xiàn)主要依賴各種離子的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和為離子膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白提供轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力的 質(zhì)子泵。因此，提高膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和膜質(zhì)子泵的活性或增加其表達(dá)量均可使離子轉(zhuǎn)運(yùn)效率提 高。液泡膜質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)無機(jī)焦磷酸酶OT-pyrophosphatase，H+-PPase, EC3. 6. 1. 1)是位于液 泡膜上的一種質(zhì)子泵，它可水解由ATPase酶代謝產(chǎn)生的含有一個(gè)高能磷酸鍵的次級(jí)代謝 物焦磷酸，同時(shí)將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的H+轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡內(nèi)形成跨液泡膜的質(zhì)子梯度，為各種溶質(zhì)(如 陽離子、陰離子、氨基酸和糖類等)分子跨液泡膜的次級(jí)主動(dòng)運(yùn)輸提供驅(qū)動(dòng)力(Blumwald Ε.1987.Physiologia Plantarum. 69 :731_734)。高等植物的第一個(gè)液泡膜H+-PPase基因AVPl (M81892)首先從擬南芥中克隆得到 (Sarafian V,Kim Y,Poole R J，et al. 1992. Natl. Acad. Sci. USA. 89 1775 1779)。Gaxiola 等(Gaxiola R A, Li J, Undurraga S, et al. 2001. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 11444 11449)首次將帶有35S啟動(dòng)子的AVPl基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，與野生型相比，發(fā)現(xiàn)AVPl蛋白 含量顯著增加的轉(zhuǎn)基因植株幼苗在250mM NaCl中處理10天仍能正常生長發(fā)育，而野生植 株型則出現(xiàn)黃化枯萎。Guo 等(Guo S L, Yin H L，Zhang X，et al. 2006. Plant Molecular Biology. 60 41-50)將鹽地堿蓬SsVP轉(zhuǎn)入擬南芥，也發(fā)現(xiàn)超表達(dá)SsVP的轉(zhuǎn)基因擬南芥細(xì) 胞中積累包括Na+在內(nèi)的更多陽離子，其抗旱性和耐鹽性顯著提高。Bao等(Bao A K,Wang S M,ffu G Q，et al. 2009. Plant Science. 176 232240)將擬南芥 AVPl 轉(zhuǎn)入紫花苜蓿，與野 生型相比，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的葉和根中積累了更多的Na+、K+和Ca2+，葉片具有更低的 滲透勢(shì)，其耐鹽性和抗旱性也顯著增強(qiáng)。這些研究結(jié)果表明超表達(dá)液泡膜H+-PPase基因， 的確可以促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株吸收大量的無機(jī)離子，尤其是把在細(xì)胞質(zhì)中具有毒害效應(yīng)的Na+ 區(qū)域化到液泡中作為有益的滲透調(diào)節(jié)劑，從而使植物在水分虧缺或鹽分脅迫下表現(xiàn)出更強(qiáng) 的抗旱性和耐鹽性。此外，Li等(Li J,Yang H,Peer W A, et al. 2005. Science. 310 121125)發(fā)現(xiàn)，液 泡膜H+-PPase還可控制生長素的運(yùn)輸、進(jìn)而影響植物的生長發(fā)育，如超表達(dá)AVPl可提高生
4長素的運(yùn)輸效率，進(jìn)而加快細(xì)胞的分裂和植物器官的形成及增生，從而提高生物量；相反， avpl-Ι缺失突變體由于生長素運(yùn)輸效率的降低，導(dǎo)致根和地上部發(fā)育受到嚴(yán)重抑制，從而 大大減少了生物量。因此，轉(zhuǎn)基因植株和野生型相比，具有更多的葉片和更發(fā)達(dá)的根系。發(fā) 達(dá)的植物根系具有重要的生物學(xué)意義，可以從土壤中吸收更多的營養(yǎng)物質(zhì)，因此具有發(fā)達(dá) 根系的轉(zhuǎn)基因植株具有顯著增強(qiáng)的耐貧瘠能力。然而令人遺憾的是，目前已克隆的液泡膜H+-PPase基因多來自抗逆能力弱的模式 植物或農(nóng)作物，如擬南芥、小麥、水稻和煙草等(包愛科，張金林，郭正剛，等.2006.植物生 理學(xué)通訊.42 (4) 777-783)；而H+-PPase在荒漠旱生植物中尚未見報(bào)道。因此，更進(jìn)一步 地說，本發(fā)明動(dòng)因就是從一種荒漠旱生植物一霸王中優(yōu)選了其泡膜H+-PPase基因并提供 了它生產(chǎn)方法和用途。本發(fā)明提供了所選基因在獲得抗旱耐鹽轉(zhuǎn)基因植物方面的應(yīng)用，其 為本發(fā)明的優(yōu)選應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種強(qiáng)旱生植物霸王(Zygophyllum xanthoxylum)液泡膜 氫焦磷酸酶基因和植物表達(dá)載體及其植株遺傳轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明以霸王為材料，首次克隆 出第一個(gè)荒漠旱生植物的液泡膜H+-PPase基因，并構(gòu)建其植物表達(dá)載體以及含有該載體的 工程農(nóng)桿菌，可用于培育耐鹽抗旱的農(nóng)作物和優(yōu)良牧草新品種(系)。本發(fā)明采取的技術(shù)方案為一種強(qiáng)旱生植物霸王的液泡膜氫焦磷酸酶基因ZxVP 核酸分子，包含下屬核酸分子(a).核酸編碼鏈 SEQ ID NO =USEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO 3 以及其互補(bǔ)鏈；(b).編碼如(a)核酸分子所編碼氨基酸的核酸分子以及其互補(bǔ)鏈；(c). (a)和(b)所述核酸分子的一部分。上述核酸分子序列可以是DNA、cDNA或RNA，且本領(lǐng)域的技術(shù)人員在知道SEQ ID NO =USEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3后，可以通過多種途徑獲得，如通過本發(fā)明所述的cDNA 克隆、基因組重組、DNA合成、PCR技術(shù)或這些技術(shù)的組合。本發(fā)明的核酸分子并不受限于 任何特殊途徑的獲得方式。更進(jìn)一步地說，本發(fā)明提供的霸王的液泡膜H+-PPase基因ZxVP 核酸分子還包括在嚴(yán)格條件下，可以與核酸分子核酸編碼鏈SEQ ID NO =USEQ ID NO :2和 SEQ ID NO :3以及其互補(bǔ)鏈雜交的核酸分子及其互補(bǔ)序列，其中這些核酸分子編碼具有液 泡膜H+-PPase活性的蛋白。所述嚴(yán)格條件為在0. IXSSPE(或0. IXSSC)、0. 1% SDS的溶 液中，65°C條件下雜交并洗膜。本發(fā)明核酸分子編碼的多肽蛋白，其包括序列表SEQ ID N0:4、SEQ IDNO :5和SEQ I D NO :6中所示全部或部分氨基酸序列。本發(fā)明蛋白或蛋白片段可以很容易通過本領(lǐng)域 技術(shù)人員所熟知的方法制備重組蛋白或天然蛋白。由所述的強(qiáng)旱生植物霸王的液泡膜氫焦磷酸酶基因ZxVP核酸分子的編碼蛋白所 獲得的單克隆抗體和多克隆抗體。本發(fā)明還涉及霸王的液泡膜氫焦磷酸酶基因ZxVP核酸分子的生產(chǎn)和使用，尤其 是利用該基因植物表達(dá)載體如pCAMBIA1302-ZxVPl-l產(chǎn)生耐鹽抗旱高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因植物的 方法。含有所述核酸分子的載體，所述核酸分子包括(a).核酸編碼鏈SEQ IDN0:USEQID NO 2和SEQ ID NO 3以及其互補(bǔ)鏈；(b).編碼如(a)核酸分子所編碼氨基酸的核酸分 子以及其互補(bǔ)鏈；(c). (a)和(b)所述核酸分子的一部分。含有所述核酸分子的宿主菌，所述核酸分子包括(a).核酸編碼鏈SEQID NO=U SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3以及其互補(bǔ)鏈；(b).編碼如(a)核酸分子所編碼氨基酸的核 酸分子以及其互補(bǔ)鏈；(c). (a)和(b)所述核酸分子的一部分。含有所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因植物及其后代，所述核酸分子包括 (a).核酸編碼鏈SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3以及其互補(bǔ)鏈；(b).編碼如 (a)核酸分子所編碼氨基酸的核酸分子以及其互補(bǔ)鏈；(c). (a)和(b)所述核酸分子的一部 分。得到所述核酸分子在植物中超表達(dá)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其包括有(a)克隆或合成權(quán)利要求1中的核酸分子；(b)將(a)步驟的核酸分子插入到可使其在轉(zhuǎn)基因植物中超表達(dá)的載體中并將獲 得的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌，以獲得轉(zhuǎn)基因用工程農(nóng)桿菌(c)通過(b)步驟的工程農(nóng)桿菌將將本發(fā)明所述基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞或組織或種 子；(d)將(C)步驟植物細(xì)胞或組織或者種子進(jìn)行植株再生，其中轉(zhuǎn)基因植株與野生 型植株相比耐鹽抗旱性提高或其它性狀發(fā)生改良。


圖1 霸王H+-Ppase基因ZxVPl-I的核酸序列及其預(yù)測(cè)的氨基酸序列。圖左側(cè)和 右側(cè)的數(shù)字分別代表核苷酸和氨基酸的位點(diǎn)，陰影部分ATG和TGA分別表示起始密碼子和 終止密碼子，其它的陰影部分為H+-PPase的PPi結(jié)合位點(diǎn)。圖2 霸王H+-PPase ZxVPl-I氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)示意圖。N和C分別代表 霸王H+-PPase ZxVPl-I的氮末端和碳末端；圓柱上的編號(hào)代表跨膜區(qū)的個(gè)數(shù)，其中灰色 圓柱代表確定的跨膜區(qū)，白色代表可能的跨膜區(qū)；Ll (Loop length)代表連接兩個(gè)跨膜區(qū) 的多肽鏈上的氨基酸殘基數(shù)目，KR代表該段肽鏈上所含有的精氨酸和賴氨酸殘基的數(shù)目； CYTOPLASM代表細(xì)胞質(zhì)一側(cè)，EXTRACELLULAR代表細(xì)胞外或液泡內(nèi)的一側(cè)。圖3 霸王H+-PPase ZxVPl-I與其它植物液泡膜H+-PPase氨基酸序列的多重比 較。液泡膜H+-PPase的來源和基因庫登錄號(hào)分別為擬南芥(Arabidopsis thaliana) AVPl NM_101437 ；霸王(Zygophyllumxanthoxylum) ZxVPl-I :EU103624 ； /K 稻(Oryza sativa) OsVP :D45383 ；玉米(Zea mays)ZmVP :AJ715528 ；小鹽芥(Thellungiella salsuginea) TsVP :AY436553 ；萄葡(Vitis vinifera)VvVP :AF257777。不同顏色背景分別表示氨基酸的 不同保守性，其中黑色表示100%保守，灰色和白色分別表示>50%和不足50%的同源性。圖4 霸王H+-PPase酶ZxVPl-I與其它植物液泡膜H+-PPase酶氨基酸序列的系統(tǒng) 進(jìn)化樹。液泡膜H+-PPase酶的來源和基因庫登錄號(hào)分別為紅葉藜(Chenopodium rubrum) CrVPl :AF533337 ；桃樹(Prunus persica) PpVP :AF367447 ；鹽穗木(Halostachys caspica) HcVP :EF471358 ；鹽爪爪(Kalidiumfoliatum)KfVP :EF114315 ；番茄(Lycopersicon esculentum) LeVP :BT014617 ；煙草(Nicotiana rustica)NrVP :DQ630713 ；巴西橡膠樹 (Heveabrasiliensis)HbVP :AY514019，其它的參考圖 3 的圖注。圖 5 霸王 H+-PPase 基因 ZxVPl-Ι —價(jià)表達(dá)載體 pCAMBIA1302_ZxVPl_l 的構(gòu)建流
6程。圖6 表達(dá)載體構(gòu)建過程的電泳檢測(cè)。其中M =DNA Marker III ；1 以霸王cDNA 為模板的PCR擴(kuò)增ZxVPl-I基因ORF框；2 =PCR檢測(cè)pMD19-T_ZxVPl_l載體；3 =PCR檢測(cè) pCAMBIA1302-ZxVPl-lo
具體實(shí)施例方式以下對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限 定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 霸王H+-PPase基因的克隆方法根據(jù)其它植物H+-PPase基因的保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)簡并性引物，以霸王葉片總RNA 為模板，采用RT-PCR的方法擴(kuò)增出H+-PPase基因片段并克隆到pUCm-T載體。陽性克隆經(jīng) PCR鑒定后進(jìn)行測(cè)序，序列分析結(jié)果表明克隆到3個(gè)同源的序列片段(898bp)，編碼299 個(gè)氨基酸；所得序列與GenBank中注冊(cè)的高等植物H+-PPase基因核苷酸序列的同源性均在 69%以上、氨基酸序列的同源性達(dá)78%以上。此外，三個(gè)片段都含有液泡膜H+-PPase所特 有的PPi的結(jié)合位點(diǎn)和活性部位序列。高等植物中存在兩種類型的H+-PPase 1型依賴K+ 激活而適度被Ca2+激活，主要分布在液泡膜上，II型對(duì)K+不敏感而對(duì)Ca2+極其敏感，主要 分布在高爾基體和溶酶體上。這兩種類型的H+-PPase酶親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，它們間的同源性僅 有37-39%。本發(fā)明克隆到的三個(gè)片段與模式植物擬南芥I型H+-PPase AVPl的同源性分 別為 83. 9%、94· 6%禾口 94. 0%，而與 II 型 H+-PPase AVP2 的同源性僅為 38. 8%,39. 禾口 39. 8%，由此表明，霸王的三個(gè)H+-PPase同源序列片段均屬于I型。這些結(jié)果表明克隆到 的三個(gè)片段均為H+-PPase基因片段。在此基礎(chǔ)上，選擇其中的一個(gè)片段作為模板，設(shè)計(jì)末端快速擴(kuò)增(RACE)引物，獲 得該片段的3’端和5’端的序列。將克隆到的霸王液泡膜H+-PPase基因的核心片段、3’端和 5，端的序列進(jìn)行拼接，得到一個(gè)全長2695bp霸王液泡H+-PPase酶基因的cDNA(圖1)。該 eDNA包含一個(gè)2262bp開放閱讀框(ORF)，編碼753個(gè)氨基酸。起始密碼子ATG前面有206bp 長的5’非翻譯區(qū)(5’ -UTR)，終止密碼子TGA后面有224bp包含poly (A)尾巴的3’非翻譯 區(qū)(3，-UTR)。本發(fā)明將該基因命名為ZxVPl-I (SEQ ID NO 1)，并在GenBank注冊(cè)，登錄號(hào) 為EU103625;其編碼的蛋白質(zhì)命名為ZxVPl-l(SEQ IDNO :4)，注冊(cè)號(hào)為ABU92563。此外，將 另兩個(gè)核心片分別命名 ZxVPl-2(SEQI D NO 2)和 ZxVPl_3(SEQ ID NO :3)，在 GenBank 中 的登錄號(hào)分別為EU103626和EU103627 ；其編碼的蛋白質(zhì)分別命名為ZxVPl_2(SEQ ID NO 5)和 ZxVPl-3(SEQ ID NO :6)，注冊(cè)號(hào)分別為 ABU92564 和 ABU92565。霸王ZxVPl-I的cDNA編碼一個(gè)由753個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的多肽蛋白，其分 子量約為80KDa，等電點(diǎn)為6.27。疏水性分析表明，ZxVPl-I蛋白含有15個(gè)跨膜區(qū) (TM-transmebane)(圖2)，其中在細(xì)胞質(zhì)中的連接跨膜區(qū)TM5和TM6的環(huán)上含有液泡膜 H+-PPase 的 PPi 結(jié)合位點(diǎn)，序列為 2。3GGG2。5、212DVGADLVGK220 和 238KAADVGADLVGKVE25。(圖 1)。 這些序列基元(sequence motif)不但是H+-PPase實(shí)現(xiàn)質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)功能所必需的(Hedlund J， Cantoni R，Baltscheffsky M，et al. 2006. FEBS J. 273 :5183_5193)，而且還是高度保守的， 與 AVPl (NM_101437)、水稻 OsVP (D45383)、小鹽芥 TsVP(AY436553)、葡萄 VvVP (AF257777)和 玉米ZmVP (AJ715528)的完全一致(圖3)。將推測(cè)的ZxVPl-I與其他植物液泡膜H+-PPase的氨基酸序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)它與葡萄VvVP的同源性最高(85. 5% )；其次是擬南芥AVP1， 同源性為80. 5%,接下來依次是TsVP (79. 8% ), OsVP (79. 7%), ZmVP (78. 7%)。在進(jìn)化關(guān) 系上，ZxVPl-I與木本植物葡萄VvVP關(guān)系較近，而與單子葉植物玉米ZmVP的關(guān)系較遠(yuǎn)(圖 4)。由此表明，本發(fā)明中的霸王H+-PPase ZxVPl-I基因應(yīng)在液泡膜上表達(dá)，并且具有其它 植物液泡膜H+-PPase如擬南芥AVPl相同的功能。其具體的克隆方法如下(1)總RNA的提取采用《一種改進(jìn)的多漿旱生植物霸王葉和根總RNA提取方法》 (伍國強(qiáng)，席杰軍，周向睿等.2008.分子植物育種.6(1) 1-4) 一文所述方法提取總RNA。(2) cDNA第一條鏈的合成①于冰上將7 μ 1 總重 RNA, 1 μ 1 Oligo (dT) 18 (0. 5 μ g/ μ 1)禾口 4 μ 1 ddH20 按總體 積12 μ 1輕輕混勻，瞬時(shí)離心液體。②反應(yīng)混合物在70°C水浴5分鐘后，冰浴30秒，然后瞬時(shí)離心。③在冰上按順序加入下列組分5XReaction Buffer4μ 1RNase Inhibitor(20U/μ 1)1 μ 1dNTP Mix(IOmmo 1/L)2μ 1④輕輕混勻后瞬時(shí)離心，37°C水浴5分鐘，加入1 μ IM-MuLV RT (20U/ μ 1)，終體積 為 20 μ 1。⑤反應(yīng)混合物37°C水浴60分鐘(如果采用隨機(jī)六合引物則預(yù)先在25V溫育10 分鐘，然后37°C水浴60分鐘)。⑥在70°C加熱10分鐘結(jié)束反應(yīng)，置冰上進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或_4°C冷凍保存。(3) PCR 擴(kuò)增①在50 μ 1 PCR管中混合如下組分Taq DNA Polymerase (5U/μ 1)0. 5 μ 110XPCR Buffer5μ 12mmol/L dNTP5μ 125mmol/L MgCl22. 5 μ 1Primer VPF(IOyM)1 μ 1Primer VPR(IOyM)1 μ 1cDNA4 μ 1SterilizedddH2O31 μ 1Total Volume50 μ 1VPF 5，-TACTATGGTGATGA(T/C)TGGGAAGG-3，VPR 5，-CAGCAAT (A/G)CC(Α/Τ)CCAGCATT(A/G)TCAC—3，②輕輕混勻并短暫離心將管壁上的液體收到管底，然后按下列條件進(jìn)行反應(yīng)
894 °C 2min 94°C 30s
56°C 45s 1 30Cycles 72 °C 2min [ 72°C IOmin J 4 "C oc(4)基因克隆取6 μ 1 PCR純化產(chǎn)物與pUCm-T vector載體連接，操作步驟按上海 生工“T-裁體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒”說明書進(jìn)行。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，在表面涂 有 40 μ 1 x-gal (20mg/ml)、4 μ 1 IPTG (200mg/ml)的含有 Amp (50 μ g/ml)的 LB 平板上 37°C 使之過夜培養(yǎng)。用牙簽從轉(zhuǎn)化平板上隨機(jī)挑取白斑單菌落，在裝有Iml LB+Amp(50yg/ml) 的1. 5ml離心管中37°C培養(yǎng)8-10小時(shí)。(5)質(zhì)粒DNA的提取堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，條件如 3所述。(6)序列測(cè)序?qū)㈥栃钥寺【晁蜕虾Ｉy(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，獲得三個(gè)同源核 心片段。(7) 3’和5’序列的分離按Invitrogen公司的TOPO TA Cloning 說明書操作。(8)將獲得的霸王H+-PPase基因全長cDNA命名為ZxVPl-I，其余兩個(gè)同源核心片 段分別命名為ZxVPl-2和ZxVPl-3。實(shí)施例2 =ZxVP的重組核酸分子載體根據(jù)不同的生產(chǎn)或?qū)嶒?yàn)?zāi)康?，如獲得重組蛋白或獲得轉(zhuǎn)基因植物，可以選擇不同 的載體和相應(yīng)的宿主細(xì)胞以及相應(yīng)的轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行不同的實(shí)際應(yīng)用。需要指出的是，本發(fā) 明所述核酸分子并不限于某一個(gè)具體的表達(dá)載體，更不限于特定的轉(zhuǎn)化宿主，同樣也不限 于特定的轉(zhuǎn)化方法。含有本發(fā)明所述ZxVP任何核酸分子的全長或部分序列的任何重組核酸分子，該 重組核酸分子可以在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或加強(qiáng)表達(dá)上述核酸分子所編碼的多肽或多肽的一 部分。所述重組核酸分子包括各種類型的載體如質(zhì)粒、科斯質(zhì)粒、噬菌體、桿狀病毒、 其它病毒等；適合在各種宿主細(xì)胞或生物體中表達(dá)的載體，這些細(xì)胞包括細(xì)菌、酵母、真 菌、原蟲、藻類、苔蘚、裸子植物、種子植物、各種卵、各種動(dòng)物等；適于植物細(xì)胞表達(dá)的載 體，尤其指含有能加強(qiáng)所述核酸分子在宿主細(xì)胞內(nèi)加強(qiáng)表達(dá)的誘導(dǎo)型或組成型啟動(dòng)子的 載體，如本發(fā)明中實(shí)施例1中所述的克隆載體pUCm-T、實(shí)施例3中所述的雞腺病毒表達(dá) 載體AdCEV、實(shí)施例5中所述的大腸桿菌表達(dá)載體PGEX-2TK、實(shí)施例6中所述的克隆載體 pMD19-T-ZxVPl-l、植物表達(dá)載體 pCAMBIA1302-ZxVPl-l。實(shí)施例3 霸王H+-PPase重組蛋白的獲得獲得霸王H+-PPase蛋白或該蛋白的一部分片段，可以采用“重組卵以及基于鳥類 腺病毒的基因克隆和表達(dá)載體”(中國專利號(hào)=00815895. 9)中所述的方法，將本發(fā)明所述 核酸分子或核酸分子片段重組到一種雞腺病毒表達(dá)載體AdCEV中，然后將這種重組核酸分 子通過顯微注射的方法轉(zhuǎn)染至雞卵中，再將這種轉(zhuǎn)染的雞卵在加濕培養(yǎng)箱中37°C下培養(yǎng) 72小時(shí)后收集尿囊液并進(jìn)行對(duì)重組H+-PPase蛋白或該蛋白的一部分進(jìn)行分離純化。純化方 法可以采用通常的純化方法，如離子交換、親和層析、免疫共沉淀等或這些方法的組合。當(dāng)
9然，也可以采用適于在大腸桿菌或酵母中表達(dá)的載體來生產(chǎn)H+-PPase蛋白或該蛋白的一 部分片段。實(shí)施例4 霸王H+-PPase天然蛋白的獲得天然蛋白的制備可以將本發(fā)明的載體pCAMBIA1302-ZxVPl-l轉(zhuǎn)化到霸王細(xì)胞(參 考實(shí)施例7)，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞大量表達(dá)H+-PPase蛋白；然后用含有實(shí)施例5所述的單克隆或多 克隆抗體的親和層析柱從該細(xì)胞液泡膜微囊體的提取物中提取分離純化天然的H+-PPase 蛋白。液泡膜微囊體及其膜蛋白的提取方法參考Schumaker和Sze的方法(Schumaker， K. S.，and Sze, H. (1985). Plant Physiol 79，II I 1—1117)。實(shí)施例5 霸王H+-PPase酶的單克隆抗體和多克隆抗體的制備將本發(fā)明的核酸分子DNA插入適合于特定宿主的載體中，通過已知的基因轉(zhuǎn)移方 法如磷酸鈣、電穿孔、氯化鈣法等方法將上述載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞，如大腸桿菌、枯草桿菌、酵母細(xì) 胞、爪蟾卵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞等等，然后在適宜的培養(yǎng)條件下讓轉(zhuǎn)化細(xì)胞表 達(dá)該重組蛋白。在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組蛋白可以用本技術(shù)領(lǐng)域人員熟知的方法進(jìn)行純 化，如離子交換、親和層析、液相色譜、二維凝膠電泳等方法。例如，把本發(fā)明的核酸分子或 核酸分子片段亞克隆到載體PGEX-2TK(Pharmacia)使其在大腸桿菌(E. coli.)中超表達(dá)本 發(fā)明多肽或多肽片段的GST融合蛋白。該融合蛋白可以用谷胱甘肽親和層析方法純化(分 子克隆實(shí)驗(yàn)指南.第三版，科學(xué)出版社.1245-1248)。然后用作抗原在兔子體內(nèi)制備多克隆 抗體(精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南.第四版，科學(xué)出版社.492-496)。單克隆抗體可用上述純 化蛋白在鼠雜合細(xì)胞中制備(精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南.第四版，科學(xué)出版社.485-492)。實(shí)施例6 霸王H+-PPase基因表達(dá)載體的構(gòu)建(圖5)由于本發(fā)明核酸分子所編碼產(chǎn)物在植物細(xì)胞代謝中具有重要的功能，如調(diào)節(jié)胞質(zhì) 和液泡的PH、清除各種代謝途徑的副產(chǎn)物PPi、參與Na+、K+等溶質(zhì)向液泡內(nèi)運(yùn)輸，降低細(xì) 胞的滲透勢(shì)，進(jìn)而提高細(xì)胞的耐鹽抗旱性；此外，植物細(xì)胞中超表達(dá)該核酸分子還可促進(jìn)生 長素的運(yùn)輸效率，導(dǎo)致細(xì)胞加快分裂和增生，使植物根系更加茁壯和葉片更加繁茂，因而使 植株可以耐貧瘠的土壤和增加生物量。所以，該核酸分子的一個(gè)重要實(shí)際應(yīng)用就是用含有 該核酸分子的植物表達(dá)載體改良當(dāng)前具有重要意義的各種農(nóng)作物或花草樹木，使其相對(duì)非 轉(zhuǎn)基因植株來說具有更強(qiáng)的耐鹽抗旱性或更高的產(chǎn)量。因此，本發(fā)明人根據(jù)已獲得的霸王 H+-PPase基因ZxVPl-I的序列設(shè)計(jì)了含酶切位點(diǎn)的引物，以霸王葉的總RNA為模板，采用 RT-PCR方法，擴(kuò)增出ZxVPl-I基因的ORF框，膠回收后連接到pMD19-TSimple Vector載體。 測(cè)序確認(rèn)正確后，將含有ZxVPl-I基因的ORF框的pMD19-T-ZxVPl-l載體酶切回收，并將 回收到的產(chǎn)物正確無誤地插入二元載體PCAMBIA1302以獲得一價(jià)表達(dá)載體，并將其命名為 pCAMBIA1302-ZxVPl-l。然后通過電擊法獲得了含有一價(jià)表達(dá)載體pCAMBIA1302_ZxVPl_l 的可用于對(duì)牧草或農(nóng)作物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的工程根癌農(nóng)桿菌GV3101。通過本工程農(nóng)桿菌，可 以獲得耐鹽抗旱高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因植物。其具體的構(gòu)建方法如下(1)根據(jù)分離得到的霸王H+-PPase基因ZxVPl-I核苷酸序列設(shè)計(jì)引物上游引 物5’ -CCATGGTTGTGAAGATGGGTCAGGTGAAAGATAGCC-3，下游引物
5’ -GGTTACCGTGTATGTGTAGACTGTAGAGCAATGGC-3，。以葉的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增該基因完整的開放閱讀 框框(ORF)。(2)取5 μ 1 PCR純化產(chǎn)物與pMD19_T Simple Vector載體連接，操作步驟按大連 寶生物公司“PMD19-T Simple Vector”說明書進(jìn)行。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，在表面 涂有 40 μ 1 X-gal(20mg/ml)、4y 1 IPTG (200mg/ml)的含有 Amp (50 μ g/ml)的 LB 平板上 37°C使之過夜培養(yǎng)。用牙簽從轉(zhuǎn)化平板上隨機(jī)挑取白斑單菌落，在裝有Iml LB+Amp(50yg/ ml)的1. 5ml離心管中37°C培養(yǎng)8_10小時(shí)。堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行序列測(cè)定。(3)用限制性內(nèi)切酶NcoI和PspEI將霸王H+-PPa se基因ZxVPl-lORF框從 pMD19-T-ZxVPl-l載體上切下，與相同酶切的pCAMBIA1302 二元表達(dá)載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn) 化大腸桿菌DH5a，然后在卡那霉素的LB培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)，并對(duì)菌株進(jìn)行PCR鑒定，然后送 上海生工測(cè)序以確保連接正確。(4)將構(gòu)建好的載體命名為pCAMBIA1302-ZxVPl-l，電轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101。 電轉(zhuǎn)化條件為:C = 25 μ F ；PC = 200ohm ；V = 2. 4kV。在本實(shí)施例中，植物表達(dá)載體中與本發(fā)明所述核酸分子可操作連接的啟動(dòng)子是 35SCaMV啟動(dòng)子。需要指出的是，本發(fā)明所述核酸分子可操作連接的啟動(dòng)子還可選自干旱誘 導(dǎo)啟動(dòng)子、ABA誘導(dǎo)啟動(dòng)子、熱激誘導(dǎo)啟動(dòng)子、鹽誘導(dǎo)啟動(dòng)子、銅誘導(dǎo)啟動(dòng)子、類固醇誘導(dǎo)啟 動(dòng)子和組織特異啟動(dòng)子等。實(shí)施例7 耐鹽抗旱增產(chǎn)轉(zhuǎn)基因作物的獲得的方法以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的途徑獲得本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因百脈根(1)無菌苗的獲得將籽粒飽滿的百脈根種子洗凈后用70%乙醇振蕩消毒3-5分 鐘，0. 升汞振蕩滅菌l-2min，無菌水沖洗3_5次；在含無菌水的三角瓶中24°C黑暗吸脹 過夜，之后接種于鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中24°C暗培養(yǎng)1天，然后再接種至MS培養(yǎng)基上培 養(yǎng)5-7天(光周期為16時(shí)/天，光照強(qiáng)度為200 μ mol/m2 *s，溫度為24°C )，即可獲得無菌
田ο(2)侵染菌液的制備挑取鑒定好的根癌農(nóng)桿菌GV3101加入含有50mg/LKan的 YM液體培養(yǎng)基中，置28°C恒溫?fù)u床中，ISOrpm暗培養(yǎng)36小時(shí)至對(duì)數(shù)生長期(0D_值為 0. 6-0. 8) ；4000rpm離心5分鐘收集菌體，然后再加入適量的無菌B5液體培養(yǎng)基重懸浮工 程菌，使達(dá)到最佳侵染濃度(0D_ = 0. 5)。(3)浸染外植體的獲得將萌發(fā)5-7天的百脈根無菌苗的子葉(帶葉柄)切成小 塊并接到分化培養(yǎng)基上(B5+0. 5mg/L 6-BA)，黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)3_4天。(4)侵染將預(yù)培養(yǎng)的外植體放入制備好侵染菌液中，輕輕搖動(dòng)，使外植體與農(nóng) 桿菌充分接觸20分鐘。(5)共培養(yǎng)將上述侵染過的外植體放在滅菌濾紙上吸干多余的菌液之后，接到 分化培養(yǎng)基上(B5+0. 5mg/L 6-BA)，在黑暗條件下共培養(yǎng)3天。(6)脫菌將共培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)移至含300mg/L Carb的分化培養(yǎng)基(B5+0. 5mg/ L 6-BA)上，24°C光照培養(yǎng)20天，中間繼代一次。(7)抗性胚選擇將上述脫菌分化的外植體轉(zhuǎn)移至含有10mg/L潮霉素(Hyp)的分 化培養(yǎng)基中篩選2-3周，獲得抗性芽點(diǎn)。
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(8)將抗性芽點(diǎn)移至生根培養(yǎng)基中使其生根，獲得抗性轉(zhuǎn)化植株。(9)對(duì)抗性植株進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，確保獲得轉(zhuǎn)基因苗。(10)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行生理生化分析，確保優(yōu)良性狀后，進(jìn)行大田試驗(yàn)和新品種培育。由于MS培養(yǎng)基、YM液體培養(yǎng)基、B5液體培養(yǎng)基和B5固體培養(yǎng)基的配方為本領(lǐng)域 的技術(shù)人員所熟知，因此不再贅述。至于分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，其分別是0. 5mg/L 6-BA 的B5固體培養(yǎng)基和0. 05mg/L NAA的1/2MS固體培養(yǎng)基。本發(fā)明所述植物表達(dá)載體載體pCAMBIA1302-ZxVPl-l適合在所有植物細(xì)胞中表 達(dá)。因此，本發(fā)明的基因并不限制植物的類型，它們可以是單子葉植物、雙子葉植物；可以是 種子植物、裸子植物；也可以是苔蘚類、蕨類、藻類和高等植物；也可以是經(jīng)濟(jì)作物、糧食作 物、牧草、花草樹木等。本發(fā)明優(yōu)選比較重要的植物有馬鈴薯、番茄、蕓薹、棉花、向日葵、草 莓、菠菜、萵苣、水稻、大豆、水稻、棉花、玉米、小麥、黑麥草、大麥、濱藜、堿篷、燕麥、大麥、啤 酒花、甘蔗、苜蓿、百脈根、羊茅、高羊茅、早熟禾、三葉草、箭舌豌豆、向日葵、甜菜、胡椒、煙 草、西瓜、西葫蘆、豌豆、可可、大麻、咖啡、葡萄、漆樹、樺樹、松樹、橡樹、楊樹、康乃馨、玫瑰、 花生、油菜、甜菜、柳枝稷、木薯和藻類等。此外，可以根據(jù)不同的植物和相應(yīng)的載體類型使 用不同的轉(zhuǎn)化方法，如農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍、顯微注射、電穿孔、聚乙二醇、磷酸鈣共沉淀等 方法獲得本發(fā)明基因的轉(zhuǎn)基因植株。實(shí)施例8 得到所述的核酸分子在植物中超表達(dá)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，步驟包括(1)克隆或合成本發(fā)明所述的核酸分子，按實(shí)施例1的步驟；(2)將(1)步驟的核酸分子插入到可使其在轉(zhuǎn)基因植物中超表達(dá)的載體中然后將 表達(dá)載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌，以獲得轉(zhuǎn)基因用工程農(nóng)桿菌，按實(shí)施例6的步驟；(3)通過(2)步驟的工程農(nóng)桿菌將本發(fā)明所述的核酸分子轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞或組織或 種子，按實(shí)施例7的步驟；(4)將(3)步驟植物細(xì)胞或組織或者種子進(jìn)行植株再生，其中轉(zhuǎn)基因植株與野生 型植株相比耐鹽抗旱性提高或其它性狀發(fā)生改良。實(shí)施例9 霸王H+-PPase突變體研究工具根據(jù)霸王H+-PPase ZxVPl-I和其它物種H+-PPase的氨基酸序列的同源比對(duì)找 出保守氨基酸殘基，然后參考ZxVPl-I的跨膜預(yù)測(cè)模型，找出一些重要區(qū)段中的靠近或在 α -螺旋跨膜內(nèi)部的特異氨基酸殘基，利用定點(diǎn)突變技術(shù)將ZxVPl-lcDNA中相應(yīng)密碼子突 變并將其構(gòu)建到含有酵母啟動(dòng)子GALl的pYES2載體中(Invitrogen)。將這些載體分別轉(zhuǎn) 化到酵母中進(jìn)行異源表達(dá)分析。分離酵母微囊體并對(duì)微囊體上的霸王H+-PPase突變體利用 上述抗體進(jìn)行酶聯(lián)免疫定量，然后通過測(cè)定該微囊體焦磷酸依賴的質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)活性來確定霸 王H+-PPase突變體的活性。研究人員也可以根據(jù)專業(yè)背景在ZxVPl-lcDNA中插入特定的 密碼子后分析其翻譯產(chǎn)物的活性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將具有活性提高的H+-PPase酶 突變體的DNA構(gòu)建成植物表達(dá)載體。實(shí)施例10 從其它多漿旱生植物中鑒定同源核酸分子可根據(jù)本發(fā)明所公布的核酸序列和其他植物H+-PPase基因的核苷酸序列進(jìn)行 同源性的比較，找出高度保守的區(qū)段；再根據(jù)同源性高和簡并性低的原則，利用DNAMAN和 Primer 5. 0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)上下游簡并性引物；提取目標(biāo)植物的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為PCR模板以擴(kuò)增目標(biāo)植物的H+-PPase基因的片段。然后再根據(jù)所得基因片段為根據(jù)， 設(shè)計(jì)3’ RACE和5’ RACE引物，分離3’和5’序列的序列。然后進(jìn)行3’序列、5’序列和核心 序列的拼接即可得到全長cDNA (參考實(shí)施例1)。此外，熟知本領(lǐng)域的技術(shù)人員也可以用霸王H+-PPase基因全長cDNA作為探針從 目標(biāo)植物的cDNA文庫或基因組文庫中以較低的嚴(yán)謹(jǐn)度篩選出目標(biāo)植物的H+-PPase基因。實(shí)施例11 霸王H+-PPase基因作為RNA干擾的設(shè)計(jì)工具每種生物在漫長的進(jìn)化過程中都形成了對(duì)環(huán)境的獨(dú)特適應(yīng)機(jī)制。這種獨(dú)特適應(yīng)機(jī) 制的實(shí)現(xiàn)得益于其獨(dú)特遺傳物質(zhì)在時(shí)空上能夠精準(zhǔn)有序地轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯產(chǎn)物定位。本 發(fā)明獲得的霸王H+-PPase基因三個(gè)同源核心片段說明霸王至少具有三個(gè)不同的液泡膜氫 焦磷酸酶。然而，每種氫焦磷酸酶在霸王細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞器上的精細(xì)定位以及各自對(duì)霸王 的獨(dú)特適應(yīng)機(jī)制的貢獻(xiàn)究竟如何，目前尚不清楚。因此，研究人員可以根據(jù)本發(fā)明的核酸序 列設(shè)計(jì)RNA干擾序列，對(duì)霸王的不同氫焦磷酸酶基因進(jìn)行干擾，然后測(cè)定各種干擾后的霸 王生理生化指標(biāo)的變化，以確定各種氫焦磷酸酶在霸王抗性的具體作用。實(shí)施例12 生態(tài)恢復(fù)與環(huán)境保護(hù)目前全球有大面積植物難以生長的地區(qū)。這些地區(qū)生態(tài)環(huán)境惡劣，氣候干旱、土壤 貧瘠，或伴有不同程度的鹽漬化?；诖?，可以將本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)化到適宜的地方植物中， 然后將耐鹽抗旱耐貧瘠的轉(zhuǎn)基因植物在這些地區(qū)種植，一方面可以在一定程度上恢復(fù)當(dāng)?shù)?的植被蓋度，防止荒漠化繼續(xù)擴(kuò)大；另一方面可以改良土壤，如增加土壤有機(jī)質(zhì)，疏松土壤 結(jié)構(gòu)，增加土壤微生物活性和多樣性等。由于溫室氣體引起的全球氣候變化給人類的發(fā)展帶來了很多不確定的因素，如海 平面的大幅上升，氣候的變遷、極端氣候的頻發(fā)等，因此CO2的減排問題成為各國政府、科學(xué) 界和民眾的關(guān)注焦點(diǎn)。在這一背景下，碳稅產(chǎn)業(yè)也迅猛發(fā)展。因此，有些高排放量的企業(yè) 可在干旱、鹽漬、貧瘠的土地上大量種植具有本發(fā)明的耐受性的轉(zhuǎn)基因植物，以固定空氣中 的CO2，將在防止全球氣候變暖方面具有積極重要的意義。上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原 則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
1權(quán)利要求
一種強(qiáng)旱生植物霸王的液泡膜氫焦磷酸酶基因ZxVP核酸分子，包含下屬核酸分子(a).核酸編碼鏈SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3以及其互補(bǔ)鏈；(b).編碼如(a)核酸分子所編碼氨基酸的核酸分子以及其互補(bǔ)鏈；(c).(a)和(b)所述核酸分子的一部分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的強(qiáng)旱生植物霸王液泡膜氫焦磷酸酶基因ZxVP核酸分子的編 碼蛋白，其包括SEQ ID NO :4，SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6中全部或部分氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的強(qiáng)旱生植物霸王液泡膜氫焦磷酸酶基因ZxVP核酸分子的編 碼蛋白所獲得的單克隆抗體和多克隆抗體。
4.含有權(quán)利要求1中所述核酸分子的載體。
5.含有權(quán)利要求1中所述核酸分子的宿主菌。
6.含有權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因植物及其后代。
7.得到權(quán)利要求1所述的核酸分子在植物中超表達(dá)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其步驟包括(a).克隆或合成權(quán)利要求1中的核酸分子；(b).將(a)步驟的核酸分子插入到可使其在轉(zhuǎn)基因植物中超表達(dá)的載體中并將獲得 的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌，以獲得轉(zhuǎn)基因用工程農(nóng)桿菌；(c).通過(b)步驟的工程農(nóng)桿菌將權(quán)利要求1中基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞或組織或種子；(d).將(c)步驟植物細(xì)胞或組織或者種子進(jìn)行植株再生，其中轉(zhuǎn)基因植株與野生型植 株相比耐鹽抗旱性提高或其它性狀發(fā)生改良。
全文摘要
本發(fā)明涉及從中亞荒漠特有的多漿旱生植物霸王(Zygophyllumxanthoxylum)中克隆的液泡膜氫焦磷酸酶基因ZxVP1-1和兩個(gè)核心片段ZxVP1-2、ZxVP1-3，以及該基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1302-ZxVP1-1和含有該表達(dá)載體的工程農(nóng)桿菌GV3101。本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，主要用于農(nóng)作物的遺傳改良，可以提高農(nóng)作物的耐鹽、抗旱、抗寒、耐貧瘠和生物量等性狀，具有重要的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效益。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101899456SQ201010120239
公開日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2010年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月5日
發(fā)明者伍國強(qiáng), 席杰軍, 王燕雯, 王鎖民 申請(qǐng)人:蘭州大學(xué)