專(zhuān)利名稱(chēng)：沙冬青的焦磷酸酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種液泡膜焦磷酸酶及其編碼基 因與應(yīng)用，特別是涉及沙冬青的焦磷酸酶及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鹽害和干旱是限制農(nóng)作物生長(zhǎng)的兩大限制因子。中國(guó)的干旱區(qū)面積占全國(guó)總面 積的1/3，鹽堿土廣泛分布于其中，干旱與鹽漬并存嚴(yán)重限制了我國(guó)農(nóng)作物產(chǎn)量的提高和 農(nóng)業(yè)發(fā)展。因此，了解和研究植物耐鹽堿抗干旱脅迫的機(jī)制；從我國(guó)特有的資源生物中 克隆抗鹽耐干旱基因，獲得寶貴的基因資源；培育耐干旱耐鹽堿農(nóng)作物具有重要的現(xiàn)實(shí) 和戰(zhàn)略意義。植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，形成了一系列抵抗干旱和鹽漬脅迫的適應(yīng)機(jī)制。如在 細(xì)胞中積累無(wú)害的可溶性小分子物質(zhì)；通過(guò)Na+外排途徑將Na+排出細(xì)胞以及提高下游抵 抗氧化傷害的抗氧化酶的活性等等。其中通過(guò)Na7H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在液泡中積累Na+— 方面可以降低Na+在細(xì)胞質(zhì)的含量，降低Na+的毒害性；另一方面還可以降低細(xì)胞水勢(shì)， 能夠讓植物在高鹽溶液中獲得和保持更多的水分[Cixin He等(2005)，Plant Cell Physiol. 46(11):1848—1854]。NHX基因家族是植物中Na+區(qū)隔化至液泡的關(guān)鍵基因，而液泡膜焦磷酸酶 則為Na+區(qū)隔化過(guò)程提供質(zhì)子電化向?qū)W梯度[Gao F等，Cloning of an H+-PPase gene from Thellungiella halophila and its heterologous expression to improve tobacco salt tolerance. Journal of Experimental Botany 57:3259-3270 (2006)]。迄今為止，人們已經(jīng)從擬南芥、小 麥、鹽芥等植物中分離得到了液泡膜焦磷酸酶基因[GaxiolaRA等(2001) Drought- and salt-tolerant plants result from overexpression of the AVPl H+-pump. P Natl Acad Sci USA 98:11444-11449; Brini F 等(2007) Overexpression of wheat Na+/H+ antiporter TNHXl and H+-pyrophosphatase TVPl improve salt- and drought-stress tolerance in Arabidopsis thaliana plants. Journal of Experimental Botany 58:301-308 ； Gao F 等(2006), Cloning of an H+-PPase gene from Thellungiella halophila and its heterologous expression to improve tobacco salt tolerance. Journal of Experimental Botany 57:3259-3270]。人們已經(jīng)對(duì)焦磷酸酶基因的結(jié) 構(gòu)功能已研究得較為詳細(xì)。目前，研究人員已經(jīng)對(duì)焦磷酸酶基因進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)、分子 結(jié)構(gòu)、表達(dá)調(diào)控、酵母突變體的功能互補(bǔ)以及過(guò)量表達(dá)等多方面的研究。焦磷酸酶基因 對(duì)于植物的耐鹽性、體內(nèi)離子動(dòng)態(tài)平衡以及整個(gè)的植物發(fā)育過(guò)程，都起到非常重要的作 用。焦磷酸酶基因是迄今為之，單個(gè)基因改良植物耐鹽抗旱性狀最有效的基因之 一。在擬南芥，番茄，苜蓿，剪股穎，棉花等植物中過(guò)量表達(dá)焦磷酸酶基因均能夠有 效提高植物耐鹽性甚至抗旱性(Gaxiola RA 等(2001) Drought- and salt-tolerant plants result from overexpression of the AVPl H+-pump. P Natl Acad Sci USA 98:11444-11449; Park S 等(2005) Up-regulation of a H+-pyrophosphatase (H+-PPase) as a strategy toengineer drought-resistant crop plants. P Natl Acad Sci USA 102:18830-18835 ； Bao AK 等 (2009) Overexpression of the Arabidopsis H+-PPase enhanced resistance to salt and drought stress in transgenic alfalfa (Medicago sativa L.). Plant Sci 176:232-240 ； Li ZG 等(2010) Heterologous expression of Arabidopsis H plus -pyrophosphatase enhances salt tolerance in transgenic creeping bentgrass (Agrostis stolonifera L.). Plant Cell Environ 33:272-289 ； Lv S 等(2008) Overexpression of an H+-PPase gene from Thellungiella halophila in cotton enhances salt tolerance and improves growth and photosynthetic performance. Plant Cell Physiol 49:1150-1164 ； Lv SL 等(2009) Overexpression of Thellungiella halophila H+-PPase (TsVP) in cotton enhances drought stress resistance of plants. Planta 229:899-910)。沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus (Maximl)Cheng Fl)又名蒙古沙冬青、蒙 古黃花木，是古老的第三紀(jì)殘遺種，也是迄今為止我國(guó)溫帶荒漠的惟一珍貴常綠灌木，是 阿拉善荒漠區(qū)所特有的建群植物(郭生祥，甘肅林業(yè)科技，第30卷第4期，2005年12 月)。沙冬青不僅具有極強(qiáng)的抗干旱性，抗高溫，耐低溫以及抗風(fēng)蝕沙埋還具有很強(qiáng)的 抗鹽性，種子能夠在含有200mm NaCl的MS培養(yǎng)平板上正常生長(zhǎng)。目前對(duì)沙冬青的耐 逆性研究?jī)H停留在生理生化階段，從遺傳上闡述沙冬青的抗逆性機(jī)制是一片空白。因此 借助擬南芥模式生物，挖掘沙冬青重要的抗逆性基因資源，并應(yīng)用到農(nóng)作物抗逆性狀改 良上具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種沙冬青焦磷酸酶及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的沙冬青焦磷酸酶，是具有SEQ ID N0.2氨基酸殘基序列的蛋白 質(zhì)或者是將序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加具 有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。沙冬青焦磷酸酶的編碼基因，是下列核苷酸之一 1) SEQ ID NO. 1所示的DNA序列。2)編碼SEQ ID N0.2所示氨基酸序列的多核苷酸。SEQ ID NO. 1由2875個(gè)堿基組成，該基因的讀碼框?yàn)樽?，端第353位至第2668 位堿基；SEQ IDN0.2由771個(gè)氨基酸殘基組成。含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體和細(xì)胞系均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的基因 將在沙冬青耐鹽耐旱分子機(jī)制研究，植物耐鹽耐旱性狀改良中發(fā)揮重要作用。


圖1為RACE-PCR電泳圖譜。圖2為AmVPl同幾種重要物種焦磷酸酶的多重序列比對(duì)。圖3為RT-PCR鑒定轉(zhuǎn)基因植株XmWV表達(dá)水平電泳圖。圖4為轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性。圖5為轉(zhuǎn)基因植株的抗鹽性。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、沙冬青焦磷酸酶基因的獲得。1.1沙冬青鹽脅迫處理
沙冬青種子用0.01% HgCl2表面滅菌15 min,無(wú)菌水沖洗5次,37°C無(wú)菌水浸泡過(guò)夜 后移至1/2 MS + 1.5%蔗糖+ 1.0%瓊脂+200mmNaCl鹽脅迫培養(yǎng)基上。在16h L/8h D 光照，24°C條件下培養(yǎng)一周。1.2 RNA 提取
取經(jīng)過(guò)鹽脅迫處理的沙冬青幼根材料約O.lg。液氮充分研磨后，轉(zhuǎn)移到1.5ml離心 管，加ImlTRΙζοΙΦ (invitrogen公司)，混勻后，室溫放置
15 min,加0.2ml氯仿異戊醇(24:1)，劇烈搖動(dòng)15 s后室溫放置5 min，13000rpm, 4°C 離心15 min。取上清液并加入等體積異丙醇，小心混勻，室溫放置15min，13000rpm, 41離心151^11。70%乙醇洗滌沉淀，室溫干燥15 min。溶解于適量的經(jīng)0.1% DEPC處 理過(guò)的ddH20水中，貯存于-80°C備用。1.3 cDNA第一鏈合成和反轉(zhuǎn)錄PCR
采用上海申能博彩生物技術(shù)公司(SHBC)的cDNA第一鏈合成試劑盒，按照操作 指南將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件分別為2 μ g制備的總RNA， 0.5 μ 1 Rnase inhibitor,力口 DEPC 處理過(guò)的去離子水至 8.5 μ 1, 2 μ 1 的 Oligo (dT) 18 primer. 65°C ,5min,室溫放置 lOmin，13000rpm 簡(jiǎn)短離心 5s。再依次加入 4 μ 1 5 XFirst-Strand buffer, 0.5 μ 1 RNase Inhibitor, 2 μ 1 IOOmM DTT, 2 μ 1 dNTP, 1 μ 1 MMLV Reverse Transcriptase。小心混勻；37°C反轉(zhuǎn)錄1小時(shí)，90°C 5分鐘；冰上冷卻；13000rpm短暫 離心5秒鐘，存放于-20°C待用。1.4 RT-PCR擴(kuò)增AmVP 1基因中間片斷
根據(jù)以往在其他植物中克隆到的Na7H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的保守序列，設(shè)計(jì)了兩條同源 兼并弓丨物 AmNHXlCF (5'GCCTATAATATTCAATGCAGGGTTTCA 3’)禾口 AmNHXlCR (5'GTCCAGGGCATCCATACCAACATA 3’) (SEQ ID N0.3)作為 PCR 反應(yīng)的引物。 PCR反應(yīng)體系為50 μ 1，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性40s，55°C復(fù)性40s， 72°C延伸60s，循環(huán)35次。72°C充分延伸lOmin。將所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠 電泳分離獲得一段約900bp的片斷?；厥詹⑶彝ㄟ^(guò)TA克隆至TAKARA pMD_19_T載體 后，由上海英駿公司測(cè)序，獲得乂m^V的中間序列。1.5 RACE法擴(kuò)增Am KW基因的3 ’末端序列
AmVP 1基因的3 ’末端序列擴(kuò)增使用Clontech公司的BD-SMARTTMRACE試劑盒。 根據(jù)已經(jīng)獲得的保守序列設(shè)計(jì)了兩個(gè)特異性引物進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)。AmVPlV RACEF 5' CTGGGCTGGACTTATTATTGGGTTTGTG 3' AmVPlV RACENF 5’ GATGTTGCTGATTCCTGCCG 3’
(SEQ ID N0.4) 反應(yīng)條件分別為
第一輪PCR反應(yīng)94°C預(yù)變性5min，94°C變性40s，53°C復(fù)性40s，72°C延伸90s， 循環(huán)35次。72°C充分延伸lOmin。第二輪PCR 反應(yīng)94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 40s，56°C 復(fù)性 40s，72°C延伸90s，循環(huán)35次。72°C充分延伸lOmin。第二輪PCR反應(yīng)結(jié)束后，電泳檢測(cè)，獲得約1200bp的片段，割膠回收并克 隆至克隆載體進(jìn)行測(cè)序，獲得3’末端序列。1.65，RACE法擴(kuò)增Am VPl基因的末端序列
按照Takara5’ FULL-RACE (Code D6122)方法，依次經(jīng)過(guò)cDNA第一鏈的合 成，Hybrid RNA的分解，連接反應(yīng)(單鏈cDNA環(huán)化或形成首尾連接物)，以及兩輪 PCR反應(yīng)，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離獲得約600bp的PCR片斷。最后經(jīng)割膠回收，克隆 至克隆載體，測(cè)序，最終獲得AmVPl基因的5’末端序列。Am VPl5，末端 P 標(biāo)記反轉(zhuǎn)錄弓丨物5’ ACAGACAAGAATGCC 3’ (SEQ ID N0.5) 1st PCR Al: 5’ TGGGGTCTGATCTTTTTGGT 3’
1st PCR Si: 5’ CAGATCAGCACCGACATCAG 3’ (SEQ ID N0.6)
2nd PCR A2: 5’ TCAACCATGATTTCACTGCC 3’
2nd PCR S2: 5’ GATACCACCACCGACTCTCC 3’ (SEQ ID N0.7)。第一輪PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性40s，60°C復(fù)性40s，72°C延 伸60s，循環(huán)35次。72°C充分延伸lOmin。第二輪PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性40s，57°C復(fù)性40s，72°C延 伸60s，循環(huán)35次。72°C充分延伸lOmin。全長(zhǎng)基因的克隆
根據(jù)已經(jīng)獲得的乂末端序列和5’末端序列以及中間序列拼接獲得了 AmVPl的全長(zhǎng)序列，并設(shè)計(jì)了如下一對(duì)引物擴(kuò)增XfflW^編碼區(qū)。AmVPlELF 5’ TTTTTTTCTGGCGAGGATGG 3’ AmVPlELR 5’ CAGATCAGCACCGACATCAG 3’ (SEQ ID N0.8)
PCR反應(yīng)條件如下94°C預(yù)變性5min，94 °C變性40s，52 °C復(fù)性40s，72°C延伸 150s，循環(huán)35次。72°C充分延伸lOmin。1%瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定，獲得了約2.2kb的片段，并克隆測(cè)序。實(shí)施例2 沙冬青焦磷酸酶基因功能分析。2.1序列比較分析
多序列比對(duì)使用Genedoc軟件，ORF (Opening Reading Frame )查找使用分子分 析軟件Lasergene6.0進(jìn)行。ORF翻譯使用Primer5軟件。多重序列比對(duì)表明，AmVPl 與擬南芥，煙草，水稻，玉米，大麥，高粱等不同植物來(lái)源的焦磷酸酶蛋白序列具有很 高的同源性，如附圖2所示。各蛋白基因登錄號(hào)如下AtVPl,擬南芥液泡膜焦磷酸酶 (NP_173021) ； NtVPl，煙草液泡膜焦磷酸酶(CAA58701) ； OsVPl，水稻液泡膜焦磷 酸酶(BAA31523) ； ZmVPl,玉米液泡膜焦磷酸酶(CAG29370 ) ； HvVPl,大麥液泡膜 焦磷酸酶(Q06572 ) ； TaVPl,高粱液泡膜焦磷酸酶(ABX10014)。2.2擬南芥轉(zhuǎn)基因分析。2.2.1植物表達(dá)載體構(gòu)建
利用引物 AmVPlP (￡mri5nTTnTOGGOGAGGATGG3,ie^gGAGArCAGCAOOGACmAG3) (SBQIDM).9)擴(kuò)增出如奶^^馬區(qū)，并克隆至pMDlFTM (Bkaa)，測(cè)序后。分別M BamBJl, Sail鵬切，回僻屯化目的片斷，并餓到紐同樣兩^SW切，純化的pRZPY122載體上。
2.2.2農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。2.2.2.1 LBA4404農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備
1)在含利福霉素40μ g/ml,鏈霉素100 μ g/ml的YEB固體培養(yǎng)基上劃線(xiàn)，28°C培養(yǎng) 48h-72h ；
2)挑單菌落到含利福霉素40μ g/ml,鏈霉素100 μ g/ml的YEB液體培養(yǎng)基中28°C培 養(yǎng)至 OD600 0.5 ；
3)冰上冷卻菌液，5000rpm,4 °C 10分鐘收集菌體；
4)ImM Hepes pH 7.0洗滌3次，再用10%甘油洗滌一次；
5)懸浮菌體于3ml10%甘油中，分裝到1.5ml離心管中，每管40ul。2.2.2農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
1)200ng質(zhì)粒DNA，加40ul農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞混勻后按以下條件進(jìn)行電轉(zhuǎn)化 U 1.8 KV
R 200 W C 25 UF ；
2)電擊后添加800μ 1 SOC液體培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)Ih ；
3)4000rpm, 10分鐘收集菌體，懸浮于200 μ 1 SOC中，涂在含12 μ g/ml氯霉素， 利福平40 μ g/ml,鏈霉素100 μ g/ml YEB固體培養(yǎng)基上，28°C倒置培養(yǎng)48h_72h。2.2.3農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥轉(zhuǎn)化。2.2.3.1擬南芥基質(zhì)培養(yǎng)
基質(zhì)組分蛭石黑土 珍珠巖9 3 0.5 營(yíng)養(yǎng)液組分
權(quán)利要求
1.一種沙冬青焦磷酸酶，其特征在于為具有SEQ ID N0.2所示氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
2.沙冬青焦磷酸酶編碼基因，其特征在于DNA序列為SEQID N0.1所示序列，或?yàn)?編碼SEQ ID N0.2所示氨基酸序列的多核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的沙冬青焦磷酸酶編碼基因，其特征在于該基因的編碼框 為自5，端第353位到第2668位堿基的DNA序列。
4.含有權(quán)利要求2或3所述沙冬青焦磷酸酶的編碼基因的表達(dá)載體。
5.含有權(quán)利要求2或3所述沙冬青焦磷酸酶的編碼基因的細(xì)胞系。
6.如權(quán)利要求2或3所述沙冬青焦磷酸酶的編碼基因在植物耐鹽耐旱性狀改良中的應(yīng)
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種沙冬青的焦磷酸酶及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的焦磷酸酶基因，來(lái)源于沙冬青，名稱(chēng)為AmVP1,其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。沙冬青焦磷酸酶的編碼基因，是下列核苷酸序列之一SEQIDNO.1；SEQIDNO.2氨基酸序列的多核苷酸。本發(fā)明的基因可用于沙冬青抗鹽耐旱分子機(jī)制研究，用于改良植物抗鹽耐旱性狀。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102002485SQ201010519920
公開(kāi)日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2010年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月26日
發(fā)明者梁寧菁, 蒯本科, 郭玉娟, 魏強(qiáng) 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)