專利名稱：通過過表達(dá)液泡膜焦磷酸酶來增強(qiáng)分生活力和感受態(tài)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因改造的植物，相對于環(huán)境應(yīng)激這些植物較強(qiáng)壯，如干旱和/或凍害；相對于營養(yǎng)器官和/或生殖器官的結(jié)構(gòu)這些植物過大(與它們正常表型的對應(yīng)物相比)；并且這些植物可以在高鹽環(huán)境中生長。這類植物還表現(xiàn)出較高的分生活性和增加的細(xì)胞分裂活性。
2.與本發(fā)明相關(guān)的背景技術(shù)當(dāng)我們進(jìn)入新千年的時候，人類獲取食物的前景非常嚴(yán)峻。由于世界人口的日益增長，增加農(nóng)作物產(chǎn)量依然是農(nóng)業(yè)研究的一個主要目標(biāo)。園藝學(xué)研究的一個主要目標(biāo)也是培育更加健壯的非農(nóng)作物植物，如觀賞植物、花草、灌木、以及其它對人類有用或使人愉悅的植物。
迄今為止，農(nóng)作物和園藝植物的改良依賴于選擇性育種具有所希望性狀的植物。然而這些選擇性育種技術(shù)往往不盡如人意，因為許多植物攜帶雜合性遺傳物質(zhì)，不能完全具有同它們的親代相同的令人滿意的性狀。
分子生物學(xué)的進(jìn)展使得人類能夠?qū)印⒅参锏纳迟|(zhì)進(jìn)行操作。植物基因工程需要分離和處理遺傳物質(zhì)(一般是以DNA或RNA的形式)，繼而將該遺傳物質(zhì)導(dǎo)入植物。運用這類技術(shù)已經(jīng)致使多種優(yōu)良性狀植物的產(chǎn)生，如耐害蟲力增強(qiáng)的植物、可以表達(dá)藥物性或其它化學(xué)成分的植物、以及其它表達(dá)有益品質(zhì)的植物。這類植物的優(yōu)點是不僅含有目的基因，而且是可育的。
近期培育具有高抗逆性的植物是植物科學(xué)的一個令人感興趣的領(lǐng)域?？偟膩碚f，植物具有并保持適應(yīng)機(jī)制，從而保證它們在不利的環(huán)境條件中生存。凍害和干旱是植物常常遇到的兩類應(yīng)激，這兩種情況都與細(xì)胞脫水相關(guān)。已知某些植物具有某些基因，這些基因在處于寒冷或長時間的缺水情況下開啟，其編碼產(chǎn)物直接或間接相應(yīng)用來提供與這類植物較其數(shù)目眾多的同類更強(qiáng)的對干旱和/或寒冷的耐受性。很多與高溫和水應(yīng)激相關(guān)的基因已經(jīng)被確定(參見，如美國專利第5,837,545、5,071,962、4,707,359號)。很多人相信這些基因產(chǎn)生某些蛋白，例如“水應(yīng)激蛋白”，這些蛋白被認(rèn)為有助于植物生存。例如某些曝露于應(yīng)激條件的植物產(chǎn)生一種稱為脫落酸(ABA)的激素，它幫助植物關(guān)閉其子座，從而減輕應(yīng)激的嚴(yán)酷性。然而不幸的是，已知脫落酸可以抑制新葉的生成，導(dǎo)致花和果實的脫落，因而導(dǎo)致減產(chǎn)。
據(jù)認(rèn)為大多數(shù)熱帶植物沒有進(jìn)化出耐受長期干旱和/或寒冷的能力；相反，已知很多溫帶植物已至少進(jìn)化出了耐受這類情況的某些能力。在干燥條件下和在凍害后，植物變體的產(chǎn)量會有很大的差異。例如煙草(Nicotiana spp.)產(chǎn)生的嫩葉對干旱非常敏感，并且不能在供水不足而且蒸發(fā)率高的地區(qū)進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)。與水應(yīng)激相反，人們對參與凍害耐受的基因和蛋白知之甚少。然而，有理論假設(shè)凍害耐受的主要成分可能涉及對脫水的耐受性(參見，如G.C.Yelenosky，L.Guy(1989)植物生理學(xué)(PlantPhysiol.)89444-451)。
培育在鹽堿化土壤中具有改善的生長能力的植物是近期的另一個使人感興趣的領(lǐng)域。當(dāng)澆灌的水含有可溶性鹽時，則會發(fā)生土壤的鹽堿化。在水蒸發(fā)后，鹽會逐漸在土壤中積累。灌溉土地的逐漸鹽堿化使我們這個星球上的很多耕地的農(nóng)業(yè)前景黯淡(R.Serrano等，植物科學(xué)評論(Crit.Rev.Plant Sci.)，13121-138(1994))。例如，干旱地區(qū)能對大多數(shù)作物的生長提供理想的光照時間和溫度條件，但降雨量不夠理想。人工灌溉僅可在短期解決這個問題，因為已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這類環(huán)境中的土壤經(jīng)常會迅速鹽堿化。為在鹽堿化的環(huán)境中生長，植物必需保持在其細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的鈉/鉀離子比例比土壤中的鈉/鉀離子比例低得多，這阻止很多植物的生長，包括食用作物。
生理學(xué)研究提示根中鹽的排除，和/或葉細(xì)胞將鹽隔絕于液泡，是決定鹽耐受性的關(guān)鍵因素(M.Kirsch等，植物分子生物學(xué)(Plant Mol.Biol.)，32543-547(1996))。氯化鈉的毒性濃度首先在完全展開的葉中達(dá)到，其中氯化鈉分隔于液泡中。只有當(dāng)超過液泡的承載能力時，才會使得細(xì)胞溶質(zhì)和非原生質(zhì)(apoplasmic)中的濃度達(dá)到有毒的水平，最終導(dǎo)致膨壓的喪失，因此植物死亡。已有人提議，液泡腔內(nèi)的過度酸化(通過V-ATP酶)，可以提供鈉/氫離子交換活性所需要的額外的質(zhì)子，該交換活性使細(xì)胞溶質(zhì)解毒(M.S.Tsiantis，等，植物雜志(Plant J.)，9729-736(1996))。已知鹽應(yīng)激可增加ATP依賴的和焦磷酸(PPi)依賴的在例如向日葵幼苗根中的液泡膜小泡中的氫離子轉(zhuǎn)運。鹽處理還誘發(fā)氨氯吡嗪脒(amiloride)敏感的鈉氫離子交換活性(E.Ballesteros等，植物生理學(xué)(Physiologia Plantarum)，99328-334(1997))。在鹽生植物松葉菊(Mesembryanthemum crystallinum)中，高氯化鈉可以刺激葉細(xì)胞中液泡H+-ATP酶(V-ATP酶)和液泡鈉/氫離子反向轉(zhuǎn)運載體的活性。
而提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和增加某些觀賞植物的美觀性是農(nóng)學(xué)研究中的另一個興趣點。通過種植比野生型植物具有更大的營養(yǎng)性和/或生殖性結(jié)構(gòu)的植物以及通過增加植物的生長速度，可以提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和增強(qiáng)某些觀賞植物的觀賞性。
在現(xiàn)有技術(shù)中，許多化合物被過分夸獎為可以提高植物生長的速度和提高植物有用成分中的生物量的產(chǎn)量。例如，宣稱應(yīng)用于組織培養(yǎng)基中的環(huán)糊精，通過包括增加的細(xì)胞分裂的機(jī)制，能增強(qiáng)細(xì)胞組織培養(yǎng)生長的速度(參見，如美國專利第6,087,176號)。也已知某些植物生長激素，例如植物生長素(除了其許多部位，還促進(jìn)根生長)、細(xì)胞分裂素、赤霉酸(除了其它許多部位之外，還促進(jìn)莖生長)，當(dāng)用于植物組織時會促進(jìn)增加的細(xì)胞分裂。在本技術(shù)領(lǐng)域也已知，某些生長因子可以用來增加植物和/或植物花的尺寸。不幸的是，這些生長激素和因子的分離和應(yīng)用既昂貴又費時。
美國專利第5,859,338號披露了對擬南芥(Arabidopsisthaliana)的CLAVATA1基因的修飾導(dǎo)致根尖分生組織和花分生組織中的細(xì)胞分裂喪失正常的控制。據(jù)說上述任一情況分裂控制的喪失都可導(dǎo)致分生組織的增大。在花中，這種增大據(jù)說會導(dǎo)致花器官數(shù)目的增加，包括心皮(carpel)數(shù)目的增加，其會增加果實的大小和種子的數(shù)目。美國專利第5,859,338號提供了clavatal核酸和蛋白，以及修飾過的clavatal核酸和蛋白，以產(chǎn)生改變的分生組織表型。
美國專利第5,750,862號披露了一種控制植物細(xì)胞生長的方法，該方法包括調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的水平和/或催化活性。尤其是，該專利披露了，通過提高p34cdc2蛋白的水平可以促進(jìn)由單個細(xì)胞或成群細(xì)胞再生為植株。通過調(diào)控間接調(diào)節(jié)p34cdc2蛋白活性的調(diào)節(jié)元件，也可實現(xiàn)對再生的調(diào)控。
因而，我們需要這樣的植物對干旱和/或凍害具有改善的抗應(yīng)激性、具有更大的尺寸特性(相對于野生型對應(yīng)變體)、以及更能耐受它們生長的土壤中的鹽分、并能夠生產(chǎn)更多的有用成分的生物量。
發(fā)明簡述本發(fā)明披露了具有上調(diào)液泡焦磷酸酶表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物。研究發(fā)現(xiàn)，表現(xiàn)出這種上調(diào)活性的植物，通常較其野生型對應(yīng)物更大、表現(xiàn)出更強(qiáng)的抵抗干旱和/或凍害應(yīng)激的能力、對它們生長介質(zhì)中的鹽分更加耐受、以及表現(xiàn)出更強(qiáng)的分生活性(細(xì)胞分裂)，從而導(dǎo)致在某些植物部分的生物量較野生型植物更高。
根據(jù)本發(fā)明，任何可以改變植物中液泡焦磷酸酶表達(dá)的適當(dāng)?shù)耐庠春怂岱肿佣伎梢杂脕磙D(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因植物。該外源核酸可以包括編碼液泡焦磷酸酶蛋白(外源液泡焦磷酸酶)的核酸，如AVP1、其功能部分(肽、多肽)、或其同源物，和/或改變植物(外源核酸導(dǎo)入其中)的內(nèi)源液泡焦磷酸酶表達(dá)的核酸。“外源核酸”指的是來源于外源核酸導(dǎo)入其中的植物細(xì)胞之外的核酸，或者是導(dǎo)入植物或植物的某部分后用以制備轉(zhuǎn)基因植物之外的核酸。用以轉(zhuǎn)化的外源核酸可以是RNA(核糖核酸)或者DNA(脫氧核糖核酸)，(例如cDNA(即互補DNA)、基因組DNA)。此外，外源核酸可以是環(huán)狀或直鏈、雙鏈或單鏈分子。單鏈核酸可以是正義鏈或反義鏈。對液泡焦磷酸酶蛋白進(jìn)行編碼的核酸的“功能部分”指的是對蛋白或多肽(其保留液泡焦磷酸酶蛋白的功能特性)進(jìn)行編碼的部分核酸。在特定具體實施例中，該核酸編碼AVP1，功能部分或其同源物。該AVP1核酸可以從如arabidopsis或任何其它植物、或人工合成而獲得。
改變植物(外源核酸導(dǎo)入其中)內(nèi)源液泡焦磷酸酶表達(dá)的核酸包括在植物中有功能的調(diào)控序列(例如誘導(dǎo)型的、組成型的調(diào)節(jié)序列)和反義核酸。調(diào)控序列的例子包括啟動子、增強(qiáng)子。該核酸還可以包括，例如，聚腺苷酸化位點、報告基因、和/或內(nèi)含子序列等等，這些序列的存在可能并不是該核酸的功能或表達(dá)所必需的，但可通過影響，例如，轉(zhuǎn)錄和/或穩(wěn)定性(例如，mRNA的轉(zhuǎn)錄和/或穩(wěn)定性)而使核酸更好地表達(dá)和/或增強(qiáng)其功能。這類元件可以包括在核酸分子內(nèi)以獲得核酸的最佳效用。
運用已知的方法，本發(fā)明中使用的核酸可以從各種來源獲得。例如本發(fā)明中采用的編碼液泡焦磷酸酶(如AVP1)的核酸可以從自然來源中獲得，如煙草、細(xì)菌、西紅柿、或者玉米。在一個具體實施例中，核酸編碼與轉(zhuǎn)基因植物的野生型相對應(yīng)的液泡焦磷酸酶。在另一個具體實施例中，該核酸編碼與該轉(zhuǎn)基因植物的野生型不相對應(yīng)的液泡焦磷酸酶。改變植物(外源核酸導(dǎo)入其中)的內(nèi)源液泡焦磷酸酶表達(dá)的核酸(如調(diào)控序列)也可以化學(xué)合成、重組生成和/或從商業(yè)來源得到。
把本發(fā)明的核酸導(dǎo)入植物中的各種方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。例如，可采用農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化、粒子轟擊、微粒子轟擊(例如美國專利第4,945,050號；美國專利第5,100,792號)、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、花粉轉(zhuǎn)基因、生殖器官注射、和未成熟胚胎注射。該外源核酸可以被引入到植物的任何合適的細(xì)胞(或多種細(xì)胞(群))中，例如植物的根細(xì)胞(群)、莖細(xì)胞(群)、和/或葉細(xì)胞(群)。
任何合適的植物，包括被子植物、單子葉植物和雙子葉植物、裸子植物、以及藻類都可以用來產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物、組織培養(yǎng)物、或細(xì)胞培養(yǎng)物。例如，西紅柿、玉米、煙草、稻谷、高粱、黃瓜、萵苣、草坪草、觀賞(如更大的花、更大的葉)和豆類植物都可以如本文所述進(jìn)行轉(zhuǎn)化，以產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。此外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以在任何支持植物生長的基質(zhì)中生長，如土壤或水(水生培植)。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物最好耐受土壤中的高鹽濃度。術(shù)語“鹽”包括所有的鹽，即指酸中的氫被金屬或金屬等價物所替代時而生成的化合物，并且包括但不限于包含單價的和二價的有毒陽離子的鹽、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂、氯化鎘、氯化鋅、和硫化鹽。
可通過外源核酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞將鹽耐受性引入本發(fā)明的植物中，該外源核酸可改變植物中液泡焦磷酸酶的表達(dá)，以使其表達(dá)上調(diào)。任何合適的液泡焦磷酸酶，其中有幾種已被克隆，都可用于本發(fā)明的組合物和方法(例如，Z.Sarasian等，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，891775-1779(1992)；Jenslerchl等，分子生物學(xué)(Molec.Biol.)，29833-840(1995)；Y.Kim等，植物生理學(xué)(Plant Physiol.)，106375-382(1994))。在特定的具體實施例中，本發(fā)明涉及耐鹽的轉(zhuǎn)基因植物，包括為過表達(dá)AVP1而設(shè)計的外源核酸組件(construct)(Z.Sarasian等，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，891775-1779(1992))。植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以在整株植物、種子、葉、根、或任何其他植物部分中進(jìn)行。優(yōu)選地，對這些轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行改變，以至于它們可以在抑制相應(yīng)非轉(zhuǎn)基因植物生長的鹽濃度中生長。轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因后代、由轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子、和由轉(zhuǎn)基因種子生成的轉(zhuǎn)基因植物后代(其也是本發(fā)明的主題)，都有利地攜帶這些鹽耐受屬性。植物可以從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，對其可進(jìn)行篩選以獲得一定水平的鹽耐受性。在優(yōu)選具體實施例中，外源核酸編碼AVP1、或其同源物。優(yōu)選地，將植物中的液泡焦磷酸酶的表達(dá)提高到某一程度，從而當(dāng)NaCl濃度是從約0.2M到約0.3M時，轉(zhuǎn)基因植物對氯化鈉(NaCl)具有耐受性?？梢陨L在鹽水中的轉(zhuǎn)基因植物也可以由下面的方法獲得將在植物中上調(diào)表達(dá)液泡焦磷酸酶的核酸導(dǎo)入一個或多個植物細(xì)胞，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞。如本文所使用的，“鹽水”包括以含有鹽為特征的水，并且優(yōu)選地其中鹽在水中的濃度是從約0.2M到約0.4M。在一個具體實施例中，鹽水指海水。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物也可用來產(chǎn)生耐鹽(大約0.2M到約0.4M的鹽濃度)的雙重轉(zhuǎn)基因植物。在一個具體實施例中，本發(fā)明涉及耐鹽的雙重轉(zhuǎn)基因植物，包括一個或多個用外源核酸轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，該外源核酸可以改變植物中液泡焦磷酸酶和Na+/H+反向轉(zhuǎn)運載體的表達(dá)。在一個有利組件中的液泡焦磷酸酶是AVP1、或其同源物，而Na+/H+反向轉(zhuǎn)運載體是AtNHX1、或其同源物。本發(fā)明也包括雙重轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因后代、以及由轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子、和由該種子生成的轉(zhuǎn)基因植物后代。
通過用外源核酸轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞也可將干旱和/或凍害耐受性引入植物，其中外源核酸會改變植物中液泡焦磷酸酶的表達(dá)，從而上調(diào)這種表達(dá)。在優(yōu)選具體實施例中，提供了相當(dāng)程度上耐干旱和/或凍害的轉(zhuǎn)基因植物，其包括基因組，該基因組含有一個或多個外源引入的液泡H+易位性泵基因。特別優(yōu)選的可育轉(zhuǎn)基因植物(誘發(fā)干旱和/或凍害耐受性，以及在鹽漬土中生長的能力)包括分離的外源嵌合DNA組件，該組件編碼液泡H+易位性泵，并最好可操作連接于啟動子，如35-S啟動子或任何其他強(qiáng)啟動子，包括但不限于組織特異性啟動子。該轉(zhuǎn)基因植物可包括多核苷酸序列，而該序列包括可操作連接于啟動子的外源液泡膜焦磷酸氫離子泵基因。在又一個特別優(yōu)選的耐干旱和/或凍害的轉(zhuǎn)基因植物(能在鹽漬土中生長)中，該多核苷酸序列包括可操作連接于35S啟動子的雙串聯(lián)增強(qiáng)子(double tandem enhancer)的外源液泡膜焦磷酸氫離子泵基因。特別優(yōu)選的液泡膜焦磷酸氫離子泵基因是AVP1基因。
用上述方法進(jìn)行的液泡焦磷酸酶上調(diào)表達(dá)也可用來提供較其野生型對應(yīng)植物具有更大的營養(yǎng)和/或生殖性器官的植物。也就是說，本發(fā)明提供增加植物產(chǎn)量的方法，包括將可以改變植物中液泡焦磷酸酶表達(dá)的核酸引入一個或多個植物細(xì)胞，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞，由此增加植物的產(chǎn)量。本方法可進(jìn)一步包括從轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生植株，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株，并選擇比其相應(yīng)野生型植物更大的轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)而產(chǎn)生較其相應(yīng)野生型植物更大的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明還包括獲得比其相應(yīng)野生型植物具有增加的花尺寸的轉(zhuǎn)基因植物(如，觀賞植物)的方法，包括將可以改變植物中液泡焦磷酸酶表達(dá)的核酸引入一個或多個植物細(xì)胞，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
用上述方法進(jìn)行的液泡焦磷酸酶上調(diào)表達(dá)也可用來產(chǎn)生較其野生型對應(yīng)植物具有更強(qiáng)分生活力/細(xì)胞分裂速率的植物。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所明了的，分生組織是高等植物發(fā)育的中心，因為幾乎所有的后胚胎(post-embryonic)器官，包括根、葉、花、腋分生組織、和形成層，都由芽或根分生組織所起動。增加的分生活性在植物結(jié)構(gòu)的一個或多個方面導(dǎo)致更高的生物量，如由植物結(jié)構(gòu)、根結(jié)構(gòu)、以及莖結(jié)構(gòu)的干重所證明的。增加的分生活性被設(shè)想為在根、葉、下胚軸、和子葉外植體中導(dǎo)致再生出芽的速率增加，以及導(dǎo)致整個植株生長速率的增加。
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，焦磷酸驅(qū)動的質(zhì)子(氫離子)泵在液泡中的過表達(dá)導(dǎo)致更大的質(zhì)子泵性能力，而更大的質(zhì)子泵性能力則導(dǎo)致更強(qiáng)將離子攝入液泡的能力，這降低了細(xì)胞的滲透勢；焦磷酸驅(qū)動的質(zhì)子(氫離子)泵在液泡中的過表達(dá)還導(dǎo)致植物細(xì)胞分裂和增殖能力的增加。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所明了的，該發(fā)現(xiàn)可具有巨大的商業(yè)價值，例如，通過對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，以過表達(dá)此類泵，由此減少木材、谷物等的生產(chǎn)時間；增加具有不良或低再生能力植物的芽的再生能力，如木本植物、作物(如玉米)、以及觀賞植物(如蘭花)。導(dǎo)致這類增加的細(xì)胞分裂和增殖的過表達(dá)可用本文所描述的任一組件來實現(xiàn)。雖然許多誘導(dǎo)型啟動子和組織特異性啟動子都可以用來觸發(fā)該基因和/或其同源物的過表達(dá)，但優(yōu)選的組件包括可操作連接于嵌合啟動子(如35S啟動子的雙串聯(lián)增強(qiáng)子)的液泡膜焦磷酸驅(qū)動的氫離子泵基因(AVP-1)，其中嵌合啟動子是設(shè)計用來過表達(dá)AVP-1。
本發(fā)明還披露了新穎的基因盒，包括含有可操作連接于嵌合啟動子的液泡膜焦磷酸驅(qū)動的氫離子泵基因的盒。新穎基因盒包括可操作連接于啟動子的外源液泡膜焦磷酸驅(qū)動的氫離子泵基因，以及新穎的編碼序列包括可操作連接于35S啟動子的雙串聯(lián)增強(qiáng)子的外源液泡膜焦磷酸驅(qū)動的氫離子泵基因。優(yōu)選地，該編碼序列是設(shè)計用來過表達(dá)AVP1。
本發(fā)明還披露了新穎的表達(dá)載體，包括含有多核苷酸序列的表達(dá)載體，其包括可操作連接于35S啟動子的雙串聯(lián)增強(qiáng)子和進(jìn)一步操作連接于多克隆位點的外源液泡膜焦磷酸驅(qū)動的氫離子泵基因；以及含有多核苷酸序列的表達(dá)載體，其包括可操作連接于35S啟動子的雙串聯(lián)增強(qiáng)子和進(jìn)一步操作連接于異源性編碼序列的外源液泡膜焦磷酸驅(qū)動的氫離子泵基因。
本發(fā)明人認(rèn)為，此披露的發(fā)明可應(yīng)用于任何植物，包括但不限于作物性植物、觀賞植物、草、灌木、或任何其他對人類有用或使人愉悅的植物，包括應(yīng)用于單子葉植物、雙子葉植物、被子植物、裸子植物、和藻類。
附圖簡述參照下述發(fā)明詳述和附圖，可更完全地理解以上的描述以及本發(fā)明的進(jìn)一步的目的、特點、和優(yōu)點，其中

圖1A是典型的(每種出自10株植物)野生型(WT)和兩個獨立的轉(zhuǎn)基因系(1’和2’)的俯視圖，它們在10小時的明暗周期中水培生長了7周；
圖1B(1)、圖1B(2)和圖1B(3)是典型的5天苗(old seedling)的根和根毛的顯微鏡照片，這些苗來自圖1A中的典型的野生型、1’和2’，其平行生長于垂直植物營養(yǎng)瓊脂平板的表面；圖1C是從野生型(WT)和兩個獨立的過表達(dá)AVP-1的轉(zhuǎn)基因系(1’和2’)分離出來的膜部分的免疫印跡圖；圖2是暴露于缺水應(yīng)激7天后，典型的野生型(WT)植物對典型的過表達(dá)AVP-1(1’和2’)的轉(zhuǎn)基因植物的俯視圖；圖3是生長在含鹽分高的土壤中的野生型(WT)植物對代表性的過度表達(dá)AVP-1(1’和2’)的轉(zhuǎn)基因植物的透視圖；圖4A是在將鈉隔離于酵母前液泡腔所涉及的轉(zhuǎn)運蛋白的工作模型簡圖；Nhx1(Na+/H+反向轉(zhuǎn)運載體)，Vma1(液泡膜H+-ATP酶)，Gef1(酵母CLC氯離子通道)，Ena1(細(xì)胞膜Na+-ATP酶)；圖4B是示于圖4A中的在將鈉隔離于酵母前液泡腔所涉及的轉(zhuǎn)運蛋白的工作模型簡圖，其還包括Avp1(A.thaliana液泡焦磷酸驅(qū)動的質(zhì)子泵)；圖5A和圖5B是表示野生型酵母系和突變酵母系細(xì)胞內(nèi)Na+和K+含量的柱形圖，其中的突變酵母系攜帶多種影響鈉耐受性的突變，圖中的值是兩次測定數(shù)據(jù)的平均值、而短棒線代表標(biāo)準(zhǔn)差；圖6是來自野生型和AVP-1過表達(dá)(1’和2’)Arabidopsis(擬南芥)植物的根和子葉外植體再生的芽的俯視圖，這些植物培養(yǎng)于圖13的SIM培養(yǎng)基中；
圖7是野生型植物(WT)對典型的過表達(dá)AVP-1的轉(zhuǎn)基因植物(1’和2’)的Na+和K+含量的柱形圖，這些植物種植于含鹽分高的土壤中；圖8是鈣攝入圖3中2’的35SAVP-1轉(zhuǎn)基因液泡膜小泡(方塊)對鈣攝入圖3中野生型(WT)的小泡的曲線圖；圖9A和圖9B圖解說明35SAVP-1假設(shè)機(jī)理，通過質(zhì)子驅(qū)動功能，相對于野生型液泡可使更高的固體積累進(jìn)入液泡；圖10是野生型對比轉(zhuǎn)基因(1’和2’)AVP-1過表達(dá)Arabidopsis(擬南芥)植物的葉子的俯視圖，葉子是按齡期放置；圖11A和11B是以水(蒸餾水)澆灌的野生型和過表達(dá)AVP-1的轉(zhuǎn)基因(1’和2’)Arabidopsis(擬南芥)植物的葉子的俯視圖，說明根結(jié)構(gòu)的生長；圖12是典型的野生型矮牽牛葉插枝(petunia leave cuttings)(WT)對比典型的過表達(dá)AVP-1(35-S AVP-1)的轉(zhuǎn)基因矮牽牛植物葉插枝的芽再生的俯視圖；圖13是從野生型(WT)和AVP-1過表達(dá)(1’和2’)Arabidopsis(擬南芥)植物獲得的并放置在SIM誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的5天齡子葉的芽再生的俯視圖。
圖14是來自野生型和Arabidopsis(擬南芥)植物的兩種AVP-1過表達(dá)系(1’和2’)的充足給水的葉中的滲透勢的柱形圖。
圖15是培養(yǎng)于MS培養(yǎng)基中的矮牽牛外植體的俯視圖，表示在6周的培養(yǎng)后來自該外植體的愈傷組織的誘導(dǎo)。
發(fā)明詳述由于植物液泡占據(jù)成熟植物細(xì)胞胞內(nèi)總體積的40-99％，因而液泡大小的改變對細(xì)胞大小有巨大的影響(R.G.Zhen、E.J.Kim、P.A.Rea，在《植物液泡》(The Plant Vacuole)一書中，(學(xué)術(shù)出版有限公司，1997)，第25卷，298-337頁)。液泡的體積是由離子和水的通量所控制，而后二者由各種泵和轉(zhuǎn)運蛋白所介導(dǎo)。在植物中，觸發(fā)離子、溶質(zhì)、和水跨膜轉(zhuǎn)運的推動力是質(zhì)子梯度。液泡氫離子泵的活性導(dǎo)致腔內(nèi)酸化，并建立跨越該液泡膜的氫離子電化學(xué)電位梯度，該梯度為無機(jī)離子、糖、和有機(jī)酸的次級主動轉(zhuǎn)運蛋白提供能量。這些轉(zhuǎn)運蛋白的活性可以調(diào)節(jié)胞內(nèi)酸堿度和離子體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，并導(dǎo)致產(chǎn)生滲透勢所需的溶質(zhì)的積累，該滲透勢促進(jìn)液泡膨脹(H.Sze、X.Li、M.G.Palmgren，植物細(xì)胞(The Plant Cell)11，677-689(1999))。
有3種不同的可產(chǎn)生質(zhì)子電化學(xué)梯度的泵。一種位于細(xì)胞膜，其將氫離子從細(xì)胞內(nèi)排出(PM H+-ATP酶)，兩種位于液泡膜或其它內(nèi)膜腔，其可以使它們所在的腔內(nèi)酸化(液泡型H+-ATP酶和H+-PP酶)(R.A.Leigh，在L.a.Sanders編輯的《植物液泡》(The Plant Vacuole)一書中，(學(xué)術(shù)出版社，圣地亞哥，加利福尼亞，1997)，第25卷，171-194頁)。
以前的工作表明，利用反義組件降低胡蘿卜液泡H+-ATP酶的A亞基(A subunit)水平會導(dǎo)致植物的伸展降低和葉形態(tài)的改變(J.P.Gogarten等，植物細(xì)胞(The Plant Cell)4，851-864(1992))。本發(fā)明者已假設(shè)，增加供給進(jìn)入液泡中的氫離子可加速細(xì)胞伸展。最近，基于液泡質(zhì)子利于離子積累的相關(guān)理論，同一發(fā)明人假設(shè)液泡中固體物的積累可能有利于保護(hù)植物耐受干旱并提供更耐凍害的植物。
本發(fā)明者認(rèn)識到，植物具有很多液泡氫離子轉(zhuǎn)運泵，通過上調(diào)它們的活性、增加它們的表達(dá)、上調(diào)它們的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯、或增加它們的拷貝數(shù)，則可以增加液泡中固體物的積累，這是由于液泡中可獲得的質(zhì)子增多。本發(fā)明者通過增加液泡氫離子轉(zhuǎn)運泵、無機(jī)焦磷酸酶、或V-PP酶(焦磷酸酶)(其由單多肽組成)的拷貝數(shù)來驗證此假設(shè)(R.G.Zhen、E.J.Kim、P.A.Rea，在《植物液泡》(The Plant Vacuole)一書中，(學(xué)術(shù)出版有限公司，1997)，第25卷，298-337頁)。在擬南芥中，由AVP-1基因編碼的V-PP酶能產(chǎn)生通過液泡膜的氫離子梯度，其與液泡H+-ATP酶產(chǎn)生的氫離子梯度量級相近(similar in magnitude)(V.Sarafian、Y.Kim、R.J.Poole、P.A.Rea，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，89，1775-1779(1992))。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所明了的，在其它植物中的相似基因?qū)⒁灶愃频姆绞狡鹱饔谩?br> 已知在生長的組織中H+-PP酶(氫離子焦磷酸酶)是液泡膜的主要質(zhì)子泵。這可能是由于下述事實生長的組織中，為了構(gòu)建新的細(xì)胞，核酸、DNA、各種RNA、蛋白質(zhì)、以及纖維素等被積極合成，因此，焦磷酸作為這些代謝過程的副產(chǎn)物會大量生成。儲存在焦磷酸分子中的能量可以轉(zhuǎn)化成不同的能源，即跨液泡膜的氫離子梯度。這種氫離子梯度構(gòu)成液泡積聚溶質(zhì)的推動力，從而產(chǎn)生足夠的使植物細(xì)胞開始生長的滲透差。對于已看到的增加的生長效應(yīng)，雖然本發(fā)明并不以任何方式限制于任何特定的假設(shè)，但本發(fā)明者假設(shè)在過表達(dá)AVP-1的轉(zhuǎn)基因植物中，更大數(shù)目的氫離子焦磷酸酶對產(chǎn)生氫離子梯度的速度具有正效應(yīng)，這導(dǎo)致更加活躍的分生活性。
在一個具體實施例中，使用組件來產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物，該組件包括可操作連接于啟動子的液泡焦磷酸酶基因，其中啟動子是設(shè)計用來過表達(dá)液泡焦磷酸酶(例如，表達(dá)盒)。如在本文中所使用的，術(shù)語“過表達(dá)”是指比在無此組件的情況下所發(fā)生的表達(dá)具有更大的表達(dá)/活性。在一個特定的具體實施例中，使用組件來產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物，該組件包括可操作連接于嵌合啟動子的AVP1基因，其中嵌合啟動子是設(shè)計用來過表達(dá)AVP1。更具體地說，本發(fā)明涉及組件，其中AVP1基因是可操作連接于35S啟動子的雙串聯(lián)增強(qiáng)子。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物，除食用價值或觀賞價值、工業(yè)價值(如木材生產(chǎn))之外，可具有其他用途。例如，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以較其野生型對應(yīng)物攝入不同的或更多的離子。如下面所討論的，對突變酵母系(enal)的研究證實在高等生物中液泡中的質(zhì)子轉(zhuǎn)運泵在陽離子解毒作用中起非常重要的作用(在細(xì)胞內(nèi)陽離子解毒系統(tǒng)中涉及的植物成分是通過補充芽殖酵母釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的對鹽敏感的突變體而加以鑒定)。轉(zhuǎn)基因植物和/或其后代可用來生物法恢復(fù)補救土壤和生長培養(yǎng)基，該轉(zhuǎn)基因植物和/或其后代包括外源核酸，而外源核酸(依照此類研究)會改變液泡焦磷酸酶在植物中的表達(dá)。這樣的植物可用來從可支持植物生長的培養(yǎng)介質(zhì)(例如土壤，水)中除去陽離子(如，單價和/或二價陽離子)。例如，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物可以用來從支持植物生長的培養(yǎng)介質(zhì)中除去鈉(Na)、鉛(Pb)、錳(Mn)、和/或鈣(Ca)離子。
為了證明增加液泡中的氫離子供給對植物的干旱和/或凍害耐受性、鹽生長的耐受性、以及植物體積的影響，本發(fā)明人制成了含有額外拷貝的液泡質(zhì)子泵AVP-1的轉(zhuǎn)基因植物。
以含有AVP-1基因的組件轉(zhuǎn)化擬南芥(Arabidopsis thaliana(ecotype columbia))植株。然后分離含有該基因額外拷貝的轉(zhuǎn)基因株系。AVP-1，可譯框架被克隆到經(jīng)修飾的pTR103的Xma1部位[R.Toper、V.Matzeit、B.Gronenbom、J.Shell和H.H.Steinbiss，核酸研究(Nucleic acid Research)，15，5890(1987)]。該載體包括35-S啟動子的串聯(lián)重復(fù)。包括35-S串聯(lián)啟動子、AVP-1可譯框架(ORF)、和聚腺苷酸化信號的Hind III片段被亞克隆到pPZP212載體的Hind III位點(P.Hajdukiewicz、Z.Svab和P.Maliga，植物分子生物學(xué)(Plant Molecular Biology)，25，989-994(1994))。通過正在開花的擬南芥(Arabidopsis thaliana(ecotype columbia))真空滲入進(jìn)行土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。通過把經(jīng)轉(zhuǎn)化的植株的種子種植于植物營養(yǎng)瓊脂板上來篩選轉(zhuǎn)基因植株，其中植物營養(yǎng)瓊脂板補充以25毫克/升的卡那霉素。植物繼續(xù)選擇培養(yǎng)兩代，以鑒定與該基因純合的轉(zhuǎn)基因植物。
圖1A是典型的(每種出自10株植物)野生型(WT)和兩個獨立的轉(zhuǎn)基因系(1’和2’)的俯視圖，它們在10小時的明暗周期中水培生長了7周。如從圖1A中可以看到的，轉(zhuǎn)基因系2’(其在較高的水平表達(dá)AVP-1蛋白)、轉(zhuǎn)基因系1’和野生型(WT)的目視比較說明AVP-1的數(shù)量與植物的大小有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植物的質(zhì)量大于野生型植物的質(zhì)量。轉(zhuǎn)基因系1’和2’的整個轉(zhuǎn)基因植物的干重(樣品數(shù)為4)(在75℃處理24小時后測量)分別比野生型(WT)的干重大1.5和3倍。
圖1B(1)、圖1B(2)和圖1B(3)是典型的5天苗的根和根毛的顯微鏡照片(放大率是40倍，照片上小棒長度是2毫米)，這些苗來自圖1A中的典型的野生型、1’轉(zhuǎn)基因系和2’轉(zhuǎn)基因系，其平行生長于垂直植物營養(yǎng)瓊脂平板的表面。轉(zhuǎn)基因系1’和2’的苗根毛的平均長度較野生型(WT)根毛長40％和70％(圖1B)(沿整個根部測量根毛長度，每組選取5個苗。每株測量平均80個根毛)。根毛的長度與液泡的大小有關(guān)，因此根毛大小的增加可能起因于液泡體積的增加。將這種情況與擬南芥突變體rdh3進(jìn)行比較，據(jù)報道該突變體具有減小的液泡體積，是一種矮小的具有異常短小根毛的植物(M.E.Galway、J.W.J.Heckman、J.W.Schiefelbein，植物(Planta)201，209-218(1997))。已認(rèn)識到增加的根結(jié)構(gòu)對土壤受侵蝕、豆類植物的固氮都有積極的影響，并且有助于植物對水和養(yǎng)分的吸收。
圖1C是從野生型(WT)和兩個獨立的過表達(dá)AVP-1的轉(zhuǎn)基因系(1’和2’)分離出來的膜部分的免疫印跡圖。在水載培養(yǎng)基中生長8周以后，從8周老的野生型(WT)和AVP-1轉(zhuǎn)基因植物(1’和2’)的芽(shoots)分離總的膜部分。植物芽的勻漿分別在8000轉(zhuǎn)/分鐘和100,000轉(zhuǎn)/分鐘條件下順序地離心15和30分鐘。將100毫克的膜沉淀物重懸浮于10mM三羥甲基氨基甲烷(Tris)、pH7.5、150mM NaCl、1mM乙二胺四乙酸(EDTA)、10％甘油，然后1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白(10微克)在10％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)上分離，用抗體進(jìn)行電印跡和免疫染色，所采用的抗體來自(raisedagainst)KLH-共軛(conjugated)的合成肽，該肽對應(yīng)于AVP-1蛋白的推測的第4親水環(huán)(V.Sarafian、Y.Kim、R.J.Poole、P.A.Rea，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89，1778-1779(1992))。焦磷酸酶通過化學(xué)發(fā)光進(jìn)行檢測。圖1C說明轉(zhuǎn)基因系(1’和2’)在比野生型(WT)更高的水平表達(dá)AVP-1蛋白(即，相對于WT，1’增加1.6倍，2’增加2.4倍)。
因為增加細(xì)胞內(nèi)鉀離子濃度(100mM至300mM)，缺水的小麥具有更高的耐旱性(S.Gupta、G.Berkowitz、P.Pier，植物生理學(xué)(Plant Physiol.)89，1358-1365(1989))，因此假設(shè)(但本發(fā)明不限于此理論)AVP-1轉(zhuǎn)基因植物的耐旱性增加可能是其更高的液泡內(nèi)鉀濃度的結(jié)果，而更高的液泡內(nèi)鉀濃度導(dǎo)致水保留能力的增加。實驗室試驗似乎支持此觀點。
圖2是曝露于缺水應(yīng)激7天后，典型的野生型植物(WT)對典型的過表達(dá)AVP-1(1’和2’)的轉(zhuǎn)基因植物的俯視圖。對野生型和過表達(dá)AVP-1的轉(zhuǎn)基因植物(圖3A)進(jìn)行了耐旱測試(24℃)。在7天缺水應(yīng)激后，野生型植物枯萎，而來自35S AVP-1轉(zhuǎn)基因系(1’和2’)的植物則腫脹且活著。此外，當(dāng)把水給予經(jīng)受干旱應(yīng)激的植物時，轉(zhuǎn)基因植物繼續(xù)進(jìn)行正常的生長、抽苔(bolted)并且結(jié)籽，而野生型植物則死亡。野生型和35S AVP-1轉(zhuǎn)基因植物葉子中的相對水含量在缺水應(yīng)激期間的測試表明，轉(zhuǎn)基因系較野生型植物具有更強(qiáng)的保留水分的能力。
圖14是來自野生型和擬南芥植物的兩種AVP-1過表達(dá)系(1’和2’)的充足給水的葉中的滲透勢的柱形圖。在恒定水含量下測得的轉(zhuǎn)基因植物的葉中的降低的滲透勢與AVP-1過表達(dá)導(dǎo)致增加的溶質(zhì)積累的論點相一致，從而增加了保留水的能力。
雖然在附圖中沒有說明，對許多植物種來說，在經(jīng)受24小時或更長時間的凍害壓力(challenge)(＜0℃)后，也得到了相似的結(jié)果。雖然不限制于這樣的假說，但相信過表達(dá)AVP-1(1’和2’)的轉(zhuǎn)基因植物比野生型植物提供更強(qiáng)的防凍害能力，這是由于在液泡中具有更多數(shù)量的陽離子。更多數(shù)量的陽離子可以提供更高的滲透壓，其導(dǎo)致更強(qiáng)的保留水的能力，而更強(qiáng)的保留水的能力不僅賦予植物耐受較低的土壤水勢(Soil water potential)的能力，而且給予植物更強(qiáng)的抵抗凍害的能力，凍害可導(dǎo)致植物嚴(yán)重脫水。
圖3是生長在含鹽分高的土壤中的的野生型植物(WT)對代表性的過表達(dá)AVP-1(1’和2’)的轉(zhuǎn)基因植物的透視圖。五株野生型植物(WT)和五株兩個AVP-1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因系(1’和2’)種植在土壤中，并處于10小時的明暗周期。植物以稀釋的營養(yǎng)液(1/8MS鹽)灌溉6周，然后用補充以NaCl的稀釋的營養(yǎng)液灌溉。起初NaCl的濃度為100mM，然后每4天增加50mM。圖3中的圖示相應(yīng)于在第10天在存在300mM NaCl條件下的典型的植物。圖3說明，兩種AVP-1植物類型(type)(1’和2’)在含鹽分高的土壤中明顯較野生型植物更健壯。下述事實，即過表達(dá)AVP-1(焦磷酸驅(qū)動的液泡膜質(zhì)子泵，本工作)或AtNHX1(鈉離子/質(zhì)子反向轉(zhuǎn)運載體，(M.Apse等，科學(xué)(Science)，2851256-1258(1999))和本工作)的基因工程改造的擬南芥(Arabidopsis thaliana)植物能夠在高濃度NaCl存在下生長，強(qiáng)烈支持本文所闡述的策略。可預(yù)期雙重轉(zhuǎn)基因植物會表現(xiàn)出進(jìn)一步增強(qiáng)的鹽耐受表型。此些擬南芥(Arabidopsis thaliana).轉(zhuǎn)運蛋白或者它們的對應(yīng)物在重要的農(nóng)業(yè)作物中可完成類似的功能。35S AVP-1擬南芥轉(zhuǎn)基因植物的增大的體積也有助于基因工程改造的作物能潛在地增加產(chǎn)量。
植物細(xì)胞器中陽離子體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的工作模型雖然本發(fā)明不局限于任何特定的假說，但本發(fā)明者設(shè)計了在植物細(xì)胞器中陽離子體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的工作模型，其可以解釋本文所披露的轉(zhuǎn)基因植物中所發(fā)現(xiàn)的未曾預(yù)料的結(jié)果。
在植物中，大多數(shù)的轉(zhuǎn)運過程的能量來自于質(zhì)子的初級轉(zhuǎn)運。氫離子轉(zhuǎn)運泵位于細(xì)胞膜和液泡膜，分別將氫離子從細(xì)胞溶質(zhì)轉(zhuǎn)到細(xì)胞外和液泡腔(P.A.Rea等，“液泡膜ATP和焦磷酸酶”(Tonoplast Adenosine Triphosphate and inorganicPyrophosphatase)。在《植物生化方法》(Methods Plant Biochem.)一書中，PP.385-405，學(xué)術(shù)出版有限公司，倫敦(1990))。該植物液泡膜包括兩種氫離子轉(zhuǎn)運泵V-ATP酶和無機(jī)的焦磷酸酶或稱V-PP酶。它們的作用使得腔內(nèi)酸化并建立跨液泡膜的質(zhì)子電化學(xué)電位梯度(J.M.Davies等，“液泡氫離子泵的生物能學(xué)”(The Bioenergetics of Vacular H+Pumps)，在R.A.Leigh、D.Saners所編輯的《植物液泡》(Plant Vacuole)一書中，pp.340-363，學(xué)術(shù)出版社，圣地亞哥(1997))。該液泡膜與很多生理過程相關(guān)，包括細(xì)胞溶質(zhì)的pH靜態(tài)平衡(cytosolic pH stasis)、調(diào)節(jié)性鈣離子分區(qū)、有毒離子如鈉離子的隔離、膨壓調(diào)節(jié)、以及營養(yǎng)的儲存和補償(retrieval)。液泡占據(jù)成熟植物細(xì)胞的總胞內(nèi)體積的40-99％。液泡質(zhì)子泵性焦磷酸酶是植物液泡膜的普遍的并大量存在的成分，它可以產(chǎn)生穩(wěn)態(tài)的跨液泡膜的質(zhì)子電化學(xué)電位，其類似或大于V-ATP酶產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)電位(P.A.Rea等，“液泡膜ATP和焦磷酸酶”(Tonoplast Adenosine Triphosphate andInorganic Pyrophosphatase)。在《植物生化方法》(Methods PlantBiochem.)一書中，pp.385-405，學(xué)術(shù)出版有限公司，倫敦(1990))。在各種生物合成途徑中，焦磷酸(PPi)是活化或多聚化過程中的副產(chǎn)物，它還在植物中作為ATP的替代能量供體通過蔗糖合成酶用于蔗糖轉(zhuǎn)移；通過焦磷酸果糖-6-磷酸磷酸轉(zhuǎn)移酶用于糖酵解；以及通過液泡質(zhì)子泵性焦磷酸酶為液泡膜提供能量(M.Stitt，植物學(xué)報(Bot.Acta)111167-175(1998))。
大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器，包括網(wǎng)格蛋白被膜小泡、內(nèi)體、高爾基體膜、和液泡，都具有酸性的內(nèi)部(X.S.Xie等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，26418870-18873(1989))。這種酸化是由質(zhì)子轉(zhuǎn)運產(chǎn)電ATP酶所介導(dǎo)，而在植物液泡中還通過焦磷酸驅(qū)動的質(zhì)子泵V-PP酶(J.M.Davies等，“液泡氫離子泵的生物能學(xué)”(The Bioenergetics of Vacular H+Pumps)，在R.A.Leigh、D.Saners所編輯的《植物液泡》(Plant Vacuole)一書中，pp.340-363，學(xué)術(shù)出版社，圣地亞哥(1997)；R.G.Zhen等，《在液泡膜焦磷酸驅(qū)動的質(zhì)子轉(zhuǎn)運的分子和生化基礎(chǔ)》(TheMolecular and Biochemical Basis of Pyrophosphate-EnergizedProton Translocation at the Vacuolar Membrane)，學(xué)術(shù)出版有限公司(1997))。需要陰離子轉(zhuǎn)運以維持凈電中性(A.al-Awquti，細(xì)胞生物學(xué)當(dāng)代觀點(Curr.Opin.Cell.Biol.)，7504-508(1995))。
圖4A是在將鈉隔離于酵母前液泡腔所涉及的轉(zhuǎn)運蛋白的工作模型簡圖；Nhx1(Na+/H+反向轉(zhuǎn)運載體)，Vma1(液泡膜H+-ATP酶)，Gef1(酵母CLC氯離子通道)，Ena1(細(xì)胞膜Na+-ATP酶)。GLC電壓門控氯離子通道超家族的酵母成員Gef1，是在酵母中將銅轉(zhuǎn)入晚期高爾基體小泡和陽離子隔離于前液泡腔所必須的。(R.A.Gaxiola等，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)954046-4050(1998)；R.A.Gaxiola等，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，96480-1485(1999)；實施例1)。而且，已經(jīng)表明，gef1突變體的缺陷，可通過下述方法加以抑制導(dǎo)入CLC超家庭的表型成員、Torpedo marmorata CLC-0、或?qū)霐M南芥(Arabidobsis thaliana)CLC-c和CLC-d氯離子通道基因(M.Hechenberger等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，27133662-33638(1996)；R.A.Gaxiola等，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，954046-4050(1998))。圖4B是示于圖4A中的在將鈉隔離于酵母前液泡腔所涉及的轉(zhuǎn)運蛋白的工作模型簡圖，其還包括Avp1(A.thaliana液泡焦磷酸驅(qū)動的質(zhì)子泵)。
雖然不希望被理論所限制，但圖4a和4b展示的兩個觀察結(jié)果導(dǎo)致提出鈉離子隔離于酵母中的模型。首先，gef1突變體對高鹽濃度敏感。其次，鈉離子/質(zhì)子交換體Nhx1是定位于前液泡腔(R.Nass等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，27321054-21060(1998))。在圖4A和4B中提出的模型假定，通過Nhx1的鈉離子隔離依賴于液泡H+-ATP酶和氯離子通道Gef1。Gef1介導(dǎo)的陰離子內(nèi)流允許通過液泡H+-ATP酶建立足夠大小的質(zhì)子梯度，以通過鈉離子/質(zhì)子交換驅(qū)動鈉離子的上向積累(uphillaccumulation)。
基于此模型，假設(shè)增加質(zhì)子內(nèi)流到假定的內(nèi)體腔可以提高通過Nhx1交換體的鈉離子隔離。為了增加氫離子的可獲得性，表達(dá)了A.thaliana的功能獲得型(gain-of-function)突變體基因AVP1-D，該突變體基因為液泡焦磷酸驅(qū)動的質(zhì)子泵編碼(圖3B)(R.G.Zhen等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，27222340-22348(1997))。表達(dá)在酵母中的這種質(zhì)子泵可以恢復(fù)測試株的鈉離子耐受性，但前提是該測試株含有有功能的NHX1和GEF1基因。此外，Gef1p和Nhx1p共定位于同一細(xì)胞器內(nèi)，即前液泡室內(nèi)(R.A.Gaxiola等，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，961480-1485(1999))。這些結(jié)果有力地支持圖4A和4B中的模型，并表明酵母前液泡室可用來鑒定參與細(xì)胞內(nèi)鈉解毒的不確定的植物轉(zhuǎn)運蛋白。
圖4A和4B所示模型與高等植物中液泡在陽離子解毒作用中所起作用的生理數(shù)據(jù)完全一致。酵母和植物細(xì)胞共享從高爾基網(wǎng)向液泡轉(zhuǎn)運小泡的途徑和信號(J.M.Neuhaus等，植物分子生物學(xué)(Plant Mol.Biol.)，38127-144(1998)；(N.Paris等，植物生理學(xué)(Plant Physiol.)，11529-39(1997)；M.H.等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，27224530-24535(1997)；A.V.Vitale等，植物科學(xué)趨勢(Trends Plant Sci.)，4148-154(1999))。因此，在酵母中進(jìn)行研究，以鑒定在高等植物中，液泡在陽離子解毒中的作用。
在酵母中陽離子隔離機(jī)制的研究實施例1在酵母系中AtNhx1和Avp1的功能為了驗證圖4A和4B中提出的分隔模型，構(gòu)建了缺失細(xì)胞膜鈉外流泵的突變酵母系(ena1)，該突變酵母系因而必需依賴于內(nèi)部的解毒系統(tǒng)，以在高鹽環(huán)境中生長。圖4A和4B所示的隔離模型(R.Nass和R.Rao，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，27321054-21060(1998)，以及R.A.Gaxiola等，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，954046-4050(1998))預(yù)計如果在假定的內(nèi)體室可以增強(qiáng)質(zhì)子的可獲得性，那么ena1系可變成耐鹽的，即隨著增加的質(zhì)子內(nèi)流，細(xì)胞質(zhì)鈉離子會通過NHX交換體而被隔離。
酵母液泡ATP酶是多亞基蛋白，因此很難通過過表達(dá)其中的任一亞基來增加其活性。但是(instead)，通過在酵母中表達(dá)A.thaliana AVP1基因來增加質(zhì)子內(nèi)流，從而獲得相同的效果。該基因編碼單鏈多肽，當(dāng)在酵母中表達(dá)時，其能夠?qū)①|(zhì)子泵入液泡的管腔(E.J.Kim等，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，916128-6132(1994))。為確保該質(zhì)子泵的最高活性，表達(dá)了具有增強(qiáng)的氫離子泵性能力的AVP1基因(AVP1-D)的E229D功能獲得突變體(R.G.Zhen等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，27222340-22348(1997))。檢測了生長在含有高濃度NaCl的SD-尿嘧啶(SD-ura)培養(yǎng)基上之后的突變型和野生型細(xì)胞內(nèi)的鈉和鉀含量。材料和方法酵母品系和質(zhì)粒采用了與W303(ura3-1 can1-100 leu2-3，112trp1-1 his3-11，(R.A.Gaxiola等，EMBO雜志(EMBO J.)，113157-3164(1992))等基因的系。為了構(gòu)建GEF1和NHX1基因缺失，采用了質(zhì)粒pRG52(·gef1∷HIS3)(R.A.Gaxiola等，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，954046-4050)(1998)和pRG197(·nhx1∷HIS3)，從而分別制備了RGY85和RGY296系。ena1∷HIS3突變體獲自Fink實驗室收集品(collection)(L5709)。
轉(zhuǎn)化方法通過利用乙酸鋰法進(jìn)行了酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(D.Gietz等，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，201425(1992))。雙突變體RGY324(gef1∷HIS3 ena1∷HIS3)、RGY326(nhx1∷HIS3 ena1∷HIS3)、和RGY343(gef1∷HIS3 nhx1∷HIS3)是經(jīng)單突變系的雜交而獲得。通過對與每個單突變體有關(guān)的表型打分來鑒定分生后代中的雙突變體。出芽(sporulation)、四分體分裂(dissection)、和交配型的打分見下述文獻(xiàn)所述(C.Guthrie和G.R.Fink，《酵母遺傳學(xué)和分子生物學(xué)指南》(Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology)，學(xué)術(shù)出版社，圣地亞哥，(1991))。細(xì)胞在YPD(1％酵母/2％蛋白胨/2％右旋糖，Difco公司)、YPGAL(1％酵母/2％蛋白胨/2％半乳糖，Difco公司)、SD(Difco公司，添加2％右旋糖的合成培養(yǎng)基)、或APG(APG是合成基本培養(yǎng)基，包括10mM精氨酸、8mM磷酸、2％葡萄糖、2mM硫酸鎂、1mM氯化鉀、0.2mM氯化鈣、以及微量礦物質(zhì)和維生素)(A.Rodriguez-NavarroJ.Ramos，《細(xì)菌學(xué)雜志》(J.Bacteriol.)，159940-945(1984))中培養(yǎng)。按說明添加氯化錳(Sigma公司)、氯化四甲基銨(tetramethylammonium chloride)(Sigma公司)、氯化鈉(Sigma公司)、或潮霉素-B(Sigma公司)。
野生型、L5709(ena1.∷HIS3)、RGY324(gef1∷HIS3ena1 ∷ HIS3)、和RGY326(nhx1∷HIS3 ena1∷HIS3)品系用pYES2載體(Invitrogen公司)和質(zhì)粒pYES2-AVP1-E229D進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其描述于R.G.Zhen等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，27222340-22348(1997)。用于組織化學(xué)分析的RGY343(gef1∷HIS3nhx1∷HIS3)品系用pRG151(GEF1-GFP)(R.A.Gaxiola等，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，954046-4050(1998))和用pRIN73[NHX1-(HA)3](R.Nass和R.Rao，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，27321054-21060(1998))進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
野生型和RGY296(nhx1∷HIS3)品系用pAD4載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化(R.Ballester等，細(xì)胞(Cell)，59681-686(1989))。RGY296(nhx1∷HIS3)用pRG308(ADH1∷AtNHX1)進(jìn)行轉(zhuǎn)化(見，《AtNHX1的克隆》)。
細(xì)胞內(nèi)鈉和鉀含量的檢測細(xì)胞過夜培養(yǎng)于SD-ura培養(yǎng)基(Difco公司；合成培養(yǎng)基，含有2％右旋糖，無尿嘧啶)。過夜培養(yǎng)物注入YPGAL(1％酵母抽提物/2％蛋白胨/2％半乳糖；Difco公司)培養(yǎng)基并培養(yǎng)至A600(600納米時的吸光度)為0.6。在該OD(光密度)下，加NaCl至終濃度為0.7M。培養(yǎng)細(xì)胞6小時，離心收集，用1.1M山梨醇和20mM氯化鎂洗滌兩次，然后在95℃下，以水抽提30分鐘。
細(xì)胞內(nèi)鈉離子和鉀離子數(shù)量是在Georgia大學(xué)化學(xué)分析實驗室通過感應(yīng)偶合等離子-質(zhì)譜進(jìn)行檢測(參見網(wǎng)址rserv/uga.edu/rsnew/chemicalanalysis/)。通過利用對生長在1M氯化鈉中細(xì)胞計算的細(xì)胞內(nèi)水值，估計了細(xì)胞內(nèi)陽離子濃度(R.A.Gaxiola等，EMBO雜志(EMBO J.)，113157-3164(1992))。
免疫熒光RGY343(gef1∷HIS3 nhx1∷HIS3)系培養(yǎng)于SD-ura、SD-leu培養(yǎng)基(Difco公司；合成培養(yǎng)基，含有2％右旋糖，無尿嘧啶和亮氨酸)中至對數(shù)生長中期，加入0.1毫克/毫升潮霉素B，然后在30℃培育該培養(yǎng)物一小時。在室溫及不攪拌條件下，用3.7％甲醛(Sigma公司)固定細(xì)胞45分鐘。進(jìn)行了原生質(zhì)球形成(spheroplast formation)、可通透化(permeablization)、洗滌、和抗體培育(J.Pringle等，在C.Guthrie和G.F.Fink編輯的《酵母免疫熒光方法》(Immunofluorescence Methods for Yeast)(學(xué)術(shù)出版社，圣地亞哥)，Vol.194，pp.565-602(1991))。作用第一抗體的MAB HA11是來自Babco公司(Richmond，CA)。Cy3-交聯(lián)的山羊抗小鼠IgG(免疫球蛋白G)是來源于JacksonImmunoresearch公司。把4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-Diamidino-2-phenylindole)(Sigma公司)加入固定培養(yǎng)基以對線粒體和核DNA進(jìn)行染色。
亞細(xì)胞分級分離和Western分析RGY343(gef1∷HIS3 nhx1∷HIS3)系培養(yǎng)于APG培養(yǎng)基(pH7.0)，然后溶胞產(chǎn)物經(jīng)10步蔗糖密度梯度進(jìn)行分級分離(R.Nass和R.Rao，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，27321054-21060(1998))。對各個級分的等分試樣(100微克)進(jìn)行SDS/PAGE(SDS/聚丙烯酰胺凝膠電泳)，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(R.Nass和R.Rao，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，27321054-21060(1998))。用單克隆抗GFP(綠色熒光蛋白)抗體(1∶10,000稀釋，CLONTECH公司)、抗血細(xì)胞凝集素抗體(1∶10,000稀釋，Boehringer Mannheim公司)、和過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠抗體(1∶5000)對蛋白質(zhì)印跡(Werstern blots)進(jìn)行了探針探測，并用電化發(fā)光(ECL)增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(Amersham Pharmacia公司)進(jìn)行顯色。
AtNHX1的克隆AtNHX1是克隆A.thaliana的噬菌體cDNA文庫(J.J.Kieber等，細(xì)胞(Cell)，72427-441(1993))(自擬南芥生物資源中心獲得)，通過用含有部分克隆的表達(dá)的序列標(biāo)記片段(擬南芥生物資源中心，DNA儲存中心)進(jìn)行探針探測。把全長克隆(2.1kB)連接到載體pSK2(Stratagene公司)(在NotI部位)，從而產(chǎn)生質(zhì)粒pRG293。用pRG293(作為模板)和GGCCCGGGATGGATTCTCTAGTGTCGAAACTGCCTTCG(5號序列)(斜體堿基與可譯框架的1-30核苷酸對應(yīng))和T7寡核苷酸，并通過PCR(聚合酶鏈反應(yīng))對AtNHX1可譯框架進(jìn)行擴(kuò)增。然后PCR產(chǎn)物用XbaI和SalI進(jìn)行消化并酶切連接于pAD4載體，得到pRG308質(zhì)粒。測定AtNHX1可譯框架的序列以驗證PCR產(chǎn)物的可靠性。全長序列較擬南芥基因組發(fā)起中心(ATM021B04.4)報道的可譯框架長，并已存放在基因文庫(GenBank)(索取號AF106324)。
AVP1-D的克隆將載體pYES2(Invitrogen公司)導(dǎo)入野生型、ena1、ena1nhx1、和ena1 gef1突變體。將質(zhì)粒pYes2-AVP1-D(R.G.Zhen等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，27222340-22348(1997))導(dǎo)入ena1、ena1 nhx1、和ena1 gef1突變體。每株的5倍連續(xù)稀釋(從105細(xì)胞起)物培養(yǎng)于YPGAL(1％酵母抽提物/2％蛋白胨/2％半乳糖)(含有或不含0.5M氯化鈉)平板，并于30℃培養(yǎng)2天。將指數(shù)生長的細(xì)胞(野生型和以pYES2載體轉(zhuǎn)化的ena1，以及攜帶有pYes2-AVD1-D的ena1、ena1 nhx1、和ena1 gef1突變體)暴露于0.7M氯化鈉6小時。制備了全細(xì)胞抽提物，并測得鈉離子和鉀離子濃度。
結(jié)果上述構(gòu)建的ena1突變體缺少細(xì)胞膜鈉外流泵，因此必需依賴內(nèi)部解毒系統(tǒng)來消除鈉的毒性。ena1株的生長對低鈉濃度敏感(200mM)，此濃度不抑制野生型菌株的生長。過表達(dá)AVP1-D可以恢復(fù)鹽敏感ena1突變體對鹽的耐受性。AVP1-D對ena1株鹽耐受性的恢復(fù)需要有功能的NHX1和GEF1基因ena1 nhx1AVP1-D和ena1 gef1 AVP1-D株是鹽敏感的。
圖5A和圖5B是柱型圖，表示野生型酵母株和攜帶有多種影響鈉耐受性的突變的酵母株的細(xì)胞內(nèi)鈉離子和鉀離子含量，其中數(shù)值是兩次測量的平均值，短棒線表示標(biāo)準(zhǔn)差。在暴露于補充以0.7M氯化鈉的培養(yǎng)基6小時后，檢測了野生型株和攜帶有多種影響鈉耐受性的突變型菌株的細(xì)胞內(nèi)鈉離子和鉀離子含量。可以看到在ena1突變株細(xì)胞內(nèi)的鈉離子含量比野生型株高8倍。可以看到在ena1 AVP1-D株中的總細(xì)胞鈉離子的一致的(consistent)減少，這種減少的原因不明。研究發(fā)現(xiàn)，該ena1AVP1-D株是耐鹽的，雖然其胞內(nèi)鈉離子含量較野生型的胞內(nèi)鈉離子含量高4倍。在缺少gef1或nhx1(即ena1 gef1或ena1 nhx1)的ena1 AVP1-D株中，鈉離子含量沒有降低到在GEF1 NHX1株中鈉離子含量的程度。綜和上面的結(jié)果，遺傳和生理數(shù)據(jù)與Nhx1、Gef1和Avp-1協(xié)同作用以內(nèi)部隔離鈉的模型是一致的。如在圖中可見看到的，擬南芥液泡氫離子-焦磷酸酶(Avp1)明顯為酵母ena1突變株賦予了鹽耐受性。
研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)鉀離子含量與鈉耐受性正相關(guān)，并與菌株的鈉離子含量負(fù)相關(guān)(圖4B)。野生型鉀離子濃度為100mM，但在ena1突變株中則降低到20mm。有趣的是，在過表達(dá)AVP1-D基因的ena1株中，細(xì)胞內(nèi)鉀離子濃度幾乎恢復(fù)到野生型水平(圖4B)。然而，除非NHX1和GEF1都是有功能的，AVP1-D的過表達(dá)則不能恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)鉀離子至野生型水平(見圖4B中雙突變體ena1 nhx1或ena1 gef1)。
如本文所述，酵母細(xì)胞內(nèi)鈉離子的解毒作用需要有功能的鈉離子/氫離子交換體(Nhx1)和氯離子通道(Gef1)，并且它們共同位于前液泡室(R.A.Gaxiola等，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，961480-1485(1999))。當(dāng)酵母NHX1基因(AtNHX1)的擬南芥(Araidopsis thaliana)同源物被克隆時，檢測了其在nhx1酵母突變株中的功能，研究發(fā)現(xiàn)，該AtNHX1基因可以部分抑制nhx1突變株的陽離子敏感表型。圖6是NhX1同源物的推測的氨基酸順序的排列，其中NhX1同源物是來自擬南芥AtNHX1(1號序列)、人類HsNHE-6(2號序列)、和酵母ScNHX1(3號序列)；相同的殘基以黑框表示，短線表示序列中的缺失(gaps)。上面排列的*號表示從人類NHE1(163DVF-FLFLLPPI173)(4號序列)推論出的氨氯咪嗪(amiloride)結(jié)合部位。
實施例2Gef1p Nhx1p在酵母中的功能和共定位NHX1和GEF1基因，其在鈉解毒中有重要作用，同樣也是其它陽離子解毒所需要的。在有毒陽離子存在下，進(jìn)行了含有g(shù)ef1和nhx1(ena1)酵母突變系生存能力的研究，研究是根據(jù)圖4a和4b中提出的模型。
該隔離模型不僅推測在陰離子通道Gef1和鈉交換體Nhx1之間存在功能連接，而且預(yù)測兩種蛋白共同定位于共同的腔室。(校原文中的“these two proteins”不好理解)因為以前的研究表明，Nhx1定位于前液泡室(R.Nass和R.Rao，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，27321054-21060(1998))，所以也進(jìn)行了實驗以確定Gef1和Nhx1蛋白是否共定位于此腔室。
材料和方法用pRG151；GEF1-GFP和pRIN73；NHX1-(HA)3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化RGY419(gef1 nhx1)系。轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)于SD(Difco公司；具有2％右旋糖的合成培養(yǎng)基)。為了檢測這些轉(zhuǎn)化體對毒性陽離子的敏感性，上述系的5倍連續(xù)稀釋(從105細(xì)胞開始)物在30℃培養(yǎng)于YDP(1％酵母抽提物/2％蛋白胨/2％右旋糖)2天，按照指示其中添加3mM氯化錳、0.45M四甲基銨(TMA)，或者添加0.05mg/ml潮霉素B(HYG)。
為證明Gef1p和Nhx1p的共定位，進(jìn)行了兩項研究。
測定了在gef1 nhx1細(xì)胞中亞細(xì)胞級分的熒光分布和免疫探測，其中g(shù)ef1 nhx1細(xì)胞是用下述兩個組件進(jìn)行轉(zhuǎn)化GEF1-GFP融合和NHX1-(HA)3標(biāo)記的融合。當(dāng)細(xì)胞生長至OD600＝0.5時，添加潮霉素B(Sigma公司)至終濃度0.1mg/ml并于30℃培養(yǎng)40分鐘。固定細(xì)胞并以抗HA抗原決定部位和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的抗體染色。以電荷偶聯(lián)的顯微鏡來觀察細(xì)胞并利用去旋算法(deconvolution algorithm)(Scanalytics公司，Billerica，MA)取光學(xué)截面(B.K.Kennedy等，細(xì)胞(Cell)，89381-391(1997))；(短棒＝1m.)。
也測定了Gef1p和Nhx1p在蔗糖梯度中的遷移性能以提供Nhx1(HA)3和GEF1-GFP的共定位證據(jù)。以質(zhì)粒pRG151；GEF1-GFP和pRIN73；NHX1-(HA)3轉(zhuǎn)化RGY419系(gef1 nhx1)并培養(yǎng)于APG培養(yǎng)基(A.Rodriguez-Navarro和P.A.Rea，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，159940-945(1984))。上述(such)被轉(zhuǎn)化為原生質(zhì)球，經(jīng)細(xì)胞溶解(lysed)，然后以10步蔗糖梯度(18-54％)分級分離(A.Sorin等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，2729895-9901(1997)和A.Antebi和G.R.Fink，細(xì)胞分子生物學(xué)(Mol.Biol.Cell)，3633-654(1992))。蛋白質(zhì)印跡顯示了Gef1-GFP和Nhx1-HA的分布。
結(jié)果研究發(fā)現(xiàn)，Gef1突變體對3mM氯化錳、0.45M氯化四甲基銨、和0.05微克/毫升潮霉素B敏感。Nhx1突變體也對氯化四甲基銨和潮霉素敏感。nhx1突變體對潮霉素的極度敏感可為分析nhx1功能提供重要的工具。
研究發(fā)現(xiàn)，血細(xì)胞凝集素(HA)標(biāo)記的Nhx1和Gef1-GFP融合蛋白共定位，如通過外熒光去旋顯微鏡所示。圖象旋轉(zhuǎn)90度后的一致信號進(jìn)一步支持這兩種轉(zhuǎn)運蛋白在這些細(xì)胞中的共定位。Nhx1(HA)3和GEF1-GFP蛋白在膜制劑(membranepreparations)的蔗糖密度梯度中的共遷移也支持兩者共定位，其中膜制劑是獲自表達(dá)標(biāo)記蛋白的細(xì)胞。含有兩種蛋白的膜部分的沉降性能與前液泡室的沉降性能一致(R.Nass和R.Rao，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，27321054-21060(1998))。Gef1-GFP(但不是Nhx1)也存在于高爾基體部分，這與先前的研究相一致(R.A.Gaxiola等，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，954046-4050(1998)，B.Schwappach等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，27315110-15118(1998))。
實施例3NHX1的A.thaliana同系物抑制突變體酵母對潮霉素敏感性的能力本文描述的的酵母系為鑒定在其它生物中介導(dǎo)鹽耐受性的基因提供了重要的手段。為檢驗此系統(tǒng)的實用性，鑒定了來自擬南芥(見材料和方法)的序列(與釀酒酵母NHX1可譯框架具有非常高的同源性)，并使用表達(dá)的序列標(biāo)記片段(見材料和方法)，以獲得該擬南芥基因的全長克隆。擬南芥(AtNhx1)、人類(HsNhe6)、和酵母(ScNhx1)的Nhx1同系物的氨基酸序列的比較(alignment)，揭示了氨基酸相同的片斷以及在預(yù)計的跨膜結(jié)構(gòu)域內(nèi)的相似性(圖6A-C)。然而，需強(qiáng)調(diào)的是，雖然有這些關(guān)系，但AtNhx1和ScNhx1的羧基末端都沒有顯示出高度的同源性(圖6A-C)。
哺乳類鈉離子/氫離子反向轉(zhuǎn)運載體的特征是其可被氨氯吡嗪脒抑制。通過在人類NHE1反向轉(zhuǎn)運基因中的點突變體已確定了推測的氨氯吡嗪脒結(jié)合部位(163天冬-纈-苯丙-苯丙-亮-苯丙-亮-亮-脯-脯-異亮173(163DVFFLFLLPPI173)(4號序列)(L.Counillon等，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，904508-4512(1993))。AtNhx1、HsNhe-6、和ScNhx1具有幾乎相同的序列(圖6)。然而，在酵母培養(yǎng)物中，以氨氯吡嗪脒抑制Nhx1或者AtNhx1的活性的嘗試都不成功。
酵母nhx1突變體對潮霉素的極度敏感性使得可以試驗在酵母中，克隆的擬南芥AtNHX1ORF(可譯框架)是否可以提供鈉離子/氫離子交換功能。將載體pAD4(R.Ballester等，細(xì)胞(Cell)，59681-686(1989))導(dǎo)入野生型和nhx1系。將質(zhì)粒pRG308；ADH；AtNHX1導(dǎo)入nhx1突變體。所述菌株的5倍連續(xù)稀釋物(105細(xì)胞開始)于30℃培養(yǎng)于YPD(-)或補充以0.05mg/ml潮霉素(+)的YPD培養(yǎng)基2天。相同菌系的連續(xù)稀釋物生長于APG培養(yǎng)基(見材料于方法)(-)，或生長于補充以0.4M氯化鈉的APG培養(yǎng)基(A.Rodriguez-Navarro和J.Ramos，細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)，159940-945(1984))該AtNHX1基因能夠抑制nhx1突變體的潮霉素敏感性。該AtNHX1基因也抑制nhx1突變體的氯化鈉敏感性，但前提是鉀離子的可獲得性下降。然而，AtNHX1基因不能挽救過表達(dá)AVP1-D基因的雙突變體ena1 nhx1的Na+-敏感生長表型。
實施例4功能獲得酵母AtNHX突變株的產(chǎn)生材料和方法通過誘變處理克隆的基因來構(gòu)建突變體文庫，則可在ena1酵母中產(chǎn)生增強(qiáng)鹽耐受性的AtNHX的功能獲得突變體。該文庫可用來轉(zhuǎn)化鹽敏感酵母突變體ena1并用增強(qiáng)的耐鹽表型進(jìn)行克隆。
其它顯示出與AtNHX1基因具有相類似的基因，如由擬南芥基因組發(fā)起者(AGI)所報道的基因，也可以在突變酵母中表達(dá)以形成功能獲得突變株。目前認(rèn)為，一些AtNHX1的同源物是細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運蛋白，因此，它們在酵母中的功能常常是pH依賴性的，如欲成功篩選，則需要培養(yǎng)基有精確的組成和pH。細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運蛋白的鑒定有助于設(shè)計具有增強(qiáng)的鹽耐受性的植物(由于減少的鈉攝入)。此外，在酵母中植物cDNA表達(dá)文庫可以用來鑒定其它參與氯化鈉解毒的轉(zhuǎn)運蛋白家族。
為了產(chǎn)生AtNHX的功能獲得突變株，可以采用Stratgene(大腸桿菌(Epicurian Coli)XL1-Red感受態(tài)細(xì)胞，Cat#200129)建立的導(dǎo)入隨機(jī)突變的方法。該方法涉及對克隆到在3種基本DNA修復(fù)途徑上有缺陷的菌株上的基因進(jìn)行擴(kuò)增。在該株中的隨機(jī)突變率大約較野生型高5000倍。突變的AtNHX基因文庫可以轉(zhuǎn)化到ena1酵母突變體中并針對鹽耐受性進(jìn)行篩選。酵母轉(zhuǎn)化采用Schiestl與合作者報道的方法進(jìn)行(D.Gietz等，核酸研究(Nucl.Acid Res.)，201425(1992)，其結(jié)合于此作為參考)。另一替代XL1-Red隨機(jī)誘變策略的方法是Fink與合作者描述的PCR法(H.D.Madhani等，細(xì)胞(Cell)，91673-684(1997))。
為測試AtNHX1同系物，可以采用在R.A.Gaxiola等，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，961480-1485(1999)中描述的相同菌株和條件。然而，也可采用其它方法。當(dāng)涉及到細(xì)胞膜AtNHX1同系物時，測定培養(yǎng)基的pH條件可能非常關(guān)鍵。
結(jié)果A.Thaliana功能獲得突變體基因AVP1-D的過表達(dá)增加了酵母細(xì)胞內(nèi)解毒能力(R.A.Gaxiola等，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，961480-1485(1999))。據(jù)假設(shè)(雖然本發(fā)明者不局限于此假設(shè))后者是由于氫離子增加流入液泡室，從而通過Nhx1交換體改善鈉離子隔離。
從酵母陽離子隔離研究獲得結(jié)論上述酵母研究為前液泡pH值對酵母細(xì)胞內(nèi)鈉離子隔離的重要性提供了證據(jù)。植物H+-焦磷酸酶(Avp1)的過表達(dá)，僅在那些含有有功能的氯離子通道(Gef1)和鈉離子/氫離子交換體(Nhx1)的系中，才賦予酵母鹽耐受性。
這些資料支持Nhx1鈉離子/氫離子交換體與液泡ATP酶和GEF1陰離子通道協(xié)同作用以將陽離子隔離于前液泡室的模型。一些研究提示前液泡室可來源于細(xì)胞膜和晚期高爾基體。這些小泡很可能參與液泡的組裝或者運輸負(fù)荷到細(xì)胞器?？梢院侠眍A(yù)期，這些前液泡小泡通過隔離來對陽離子進(jìn)行解毒，由此降低其在細(xì)胞質(zhì)和其它細(xì)胞器中的濃度。
本文描述的酵母體系允許對不同的異源蛋白的鹽耐受性進(jìn)行功能性評估∷氯離子通道、氫離子泵、鈉離子/氫離子交換體、和其它陽離子/氫離子交換體、或者陽離子/碳酸氫鹽同向轉(zhuǎn)運蛋白(symporters)。該系統(tǒng)既穩(wěn)定又操作靈活。擬南芥氯離子通道(R.A.Gaxiola等，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，954046-4050(1998)；M.Hechenberger等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，27133632-33638(1996))、氫離子泵、和鈉離子/氫離子交換體的功能都可以在相應(yīng)的酵母突變體中進(jìn)行分析。雖然AtNHX1不能抑制所有的酵母nhx1突變體表型，但是它可以抑制某些表型以及與AtNHX1和酵母NHX1之間的DNA同源性偶聯(lián)這一事實，表明此植物基因與酵母同系物具有類似的功能。AtNHX1基因可以抑制nhx1突變體對潮霉素的敏感性但僅提供微弱的鈉離子解毒表型，這可能是該轉(zhuǎn)運蛋白在兩種生物中具有不同的調(diào)控、或者具有不同的陽離子轉(zhuǎn)運選擇性的結(jié)果。
鹽對AtNHX1的調(diào)節(jié)以及植物基因抑制酵母nhx1突變體的能力表明，在酵母和植物中陽離子解毒的機(jī)制可能是類似的。實際上，以前的工作表明，細(xì)胞膜鈉離子/氫離子反向轉(zhuǎn)運載體可介導(dǎo)耐鹽植物中液泡內(nèi)鈉的積累，該反向轉(zhuǎn)運載體利用由液泡H+-ATP酶(V-ATP酶)和/或氫離子轉(zhuǎn)運焦磷酸酶(V-焦磷酸酶；B.J.Barkla等，Symp.Soc.Exp.Biol.，48141-153(1994)；R.G.Zhen等，《焦磷酸能驅(qū)動的在液泡膜的質(zhì)子轉(zhuǎn)運的分子和生化基礎(chǔ)》(The Molecular and Biochemical Basis ofPyrophosphate-Energized Proton Translocation at the VacuolarMembrane)(學(xué)術(shù)出版社，圣地亞哥)；M.Kirsh等，植物分子生物學(xué)(Plant Mol.Biol.)，32543-547(1996))產(chǎn)生的質(zhì)子驅(qū)動力。
本文描述的發(fā)現(xiàn)，即gef1和nhx1突變體都對潮霉素超敏感，表明對潮霉素的抗性程度依賴于液泡和前液泡細(xì)胞器的功能。鉀離子攝入受到損害的酵母突變體(rek1)對潮霉素超敏感(R.Madrid等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，27314838-14844(1998))；降低的鉀離子攝入超極化細(xì)胞膜位并驅(qū)動堿性陽離子如潮霉素的攝入。降低細(xì)胞膜H+-ATP酶(Pmal)的氫離子泵性活性的突變使得細(xì)胞膜電位去極化并賦予對潮霉素的抗性(J.H.McCusker等，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)，74082-4088(1987))。因此，可以預(yù)期影響液泡和前液泡室的pH或膜電位的突變體如gef1或者nhx1會影響潮霉素的區(qū)室化(compartmentation)。
具有上調(diào)液泡氫離子轉(zhuǎn)運泵活性的轉(zhuǎn)基因植物擬南芥AtNHX1基因的表達(dá)在鹽應(yīng)激植物中被誘導(dǎo)這一觀察結(jié)果進(jìn)一步支持?jǐn)M南芥AtNHX1基因在鹽體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中的作用(R.A.Gaxiola等，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，961480-1485(1999))。特別是，擬南芥(Arabidopsisthaliana)已用來作為宿主植物模型以說明這些基因的過表達(dá)導(dǎo)致植物中的鹽耐受性。近期的一項研究報道表明，在轉(zhuǎn)基因擬南芥(Arabidopsis thaliana)植物中AtNHX1基因的過表達(dá)促進(jìn)了該植物在土壤中的持續(xù)生長，該土壤以200mM氯化鈉加上1/8MS鹽灌溉并采用短日照周期條件(M.Apse等，科學(xué)(Science)，2851256-1258(1999))。值得注意的是，每加入1/8MS鹽則提供2.5mM鉀，這降低了氯化鈉應(yīng)激的嚴(yán)厲程度，并且短日照周期降低了氧化性應(yīng)激。
實施例5在鹽應(yīng)激植物中AtNHX1基因的增強(qiáng)的表達(dá)材料和方法在19℃和連續(xù)光照條件下，A.thaliana植物(ecotypeColumbia)無菌培養(yǎng)于無蔗糖的基本(unsupplemented)植物營養(yǎng)瓊脂上(G.W.Haughn和C.Somerville，分子基因遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.)，204430-434(1986))15天。添加氯化鈉或氯化鉀至終濃度250mM，然后培育植物6小時。從經(jīng)鹽處理的和未經(jīng)鹽處理的植物組織中分離總RNA(K.K.Niyogi和G.R.Fink，植物細(xì)胞(Plant Cell)，4721-733(1992))，Hybond-N(Amersham公司)膜以來自質(zhì)粒pRG308的32P標(biāo)記的DNA探針雜交。65℃雜交過夜。在65℃下用0.2％標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸緩沖液(SSC)/0.1％SDS進(jìn)行洗滌(F.Ausebel等，分子生物學(xué)最新方法(Curr.Protocols in Mol.Biol.)(Wiley，紐約)(1988))。以18S探針作為上樣量對照(loading control)(I.Unfried等，核酸研究(NucleicAcids Res.)，177513(1989))。用MACBAS 2.4程序來確定RNA的相對含量。
結(jié)果氯化鈉應(yīng)激增加AtNHX1 mRNA.水平4.2倍，而氯化鉀僅促使增加2.8倍。此種由鈉引起的mRNA水平升高與酵母NHX1基因的情況類似(R.Nass和R.Rao，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，27321054-21060(1998))。RNA組織印跡(tissue blot)以AtNHX1雜交。來自15天齡植物(暴露于250mM氯化鈉或氯化鉀6小時)和未經(jīng)鹽處理的對照植物的10微克總RNA，在變性甲醛凝膠上進(jìn)行電泳。該印跡以AtNHX1 ORF(可譯框架)內(nèi)部探針進(jìn)行雜交。以18S核糖體探針作為上樣量對照。
實施例6過表達(dá)AtNHX1的轉(zhuǎn)基因植物的鹽耐受性過表達(dá)AtNHX1的轉(zhuǎn)基因植物在用200mM氯化鈉灌溉的土壤中表現(xiàn)出持續(xù)生長(M.Apsem等，科學(xué)(Science)，2851256-1258(1999))。
實施例7過表達(dá)35SAVP1的轉(zhuǎn)基因植物的鹽耐受性材料和方法用35S啟動子的雙串聯(lián)增強(qiáng)子來設(shè)計轉(zhuǎn)基因擬南芥(Arabidopsis thaliana)植物，以過表達(dá)AVP1野生型基因(R.Topfer等，核酸研究(Nucl.Acid Res.)，155890(1987))。AVP1編碼來自擬南芥的焦磷酸驅(qū)動的液泡膜質(zhì)子泵(R.G.Zhen等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，27222340-22348(1997))。先前的研究表明，AVP1基因是以單拷貝存在于擬南芥的基因組中(Y.Kim等，植物生理學(xué)(Plant Physiol.)，106375-382(1994))，然而，一個與染色體上AVP1同源但不相同的序列已被擬南芥基因組發(fā)起者(AGI)暫時稱為在BAC F9K20上的可譯框架F9K20.2。
利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了過表達(dá)AVP1的轉(zhuǎn)基因植物。利用CaMV的35S啟動子的雙串聯(lián)增強(qiáng)子來表達(dá)轉(zhuǎn)基因AVP1(R.Topfer等，核酸研究(Nucl.Acid Res.)，155890(1987))。將15株野生型和15株35SAVP1轉(zhuǎn)基因株于24小時周期培養(yǎng)16天。在此期間，植物每4天以稀釋的營養(yǎng)液(1/8M.S.鹽)澆灌一次。在17天時，澆灌液中添加200mM氯化鈉，并且在第27天時以含有250mM氯化鈉的營養(yǎng)液澆灌。在最后的氯化鈉處理10天后，對植物照像。采用實施例6所述的相同的條件和處理。
結(jié)果在T2(第二代)階段，與野生型植株相比較，5個不同系的35SAVP1植株表現(xiàn)出增強(qiáng)的鹽耐受性。然而，最引人注目的表型在純合的T3(第三代)植株中是明顯的。這些轉(zhuǎn)基因植物比野生型植物大。并且，純合的35SAVP1植物，在24小時光照狀態(tài)和存在250mM氯化鈉加上1/8M.S.鹽的條件下，表現(xiàn)出持續(xù)生長。當(dāng)35SAVP1植物在短日周期條件(12小時/天/光照周期)下生長時，可觀察到其在300mM氯化鈉加上1/8M.S.鹽存在下持續(xù)生長。
實施例8野生型植株和35SAVP1轉(zhuǎn)基因植株在水栽培養(yǎng)用溶液中的生長標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)業(yè)用淡水來源的減少可能迫使采用其他的農(nóng)業(yè)技術(shù)。可以設(shè)想，對于耐鹽作物，要用海水水栽將在作物生產(chǎn)上創(chuàng)造新的時代。據(jù)報道，水培增加了植物的生長并提供無應(yīng)激的根和芽材料(D.M.Gibeaut等，植物生理學(xué)(Plant Physiol.)，317-319(1997))。水培的另一個重要優(yōu)點是它使得人們以比在土壤中更精確的方式改變離子成分。這些優(yōu)點對鹽應(yīng)激(salt stress)的生理學(xué)研究可能是重要的。
建立了擬南芥植物的水培條件，并且測試了其在氯化鈉濃度增加的培養(yǎng)基中的性能。
材料和方法在一次試驗中，野生型和35SAVP1轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行水培。野生型和35SAVP1轉(zhuǎn)基因植物生長在溶液培養(yǎng)物中，在12小時光周期下培養(yǎng)65天。
在另一個試驗中，野生型和35SAVP1轉(zhuǎn)基因植物生長在溶液培養(yǎng)物中，在12小時光周期下培養(yǎng)20天。從第21天起，逐漸增加氯化鈉濃度，采用每4天增加50mM的方式。在存在200mM氯化鈉4天后，將植物拍照。
而且又一個水培試驗中，給予(challenge)轉(zhuǎn)基因植物商業(yè)用海水配方，其中包括海水中全部的離子成分。35SAVP1、35SAtNHX1單轉(zhuǎn)基因和雙轉(zhuǎn)基因植物與野生型擬南芥thaliana植物一同在短日照周期和水培條件下生長4周(D.M.Gibeaut等，植物生理學(xué)(Plant Physiol.)，317-319(1997))。然后每4天添加等同于50mM氯化鈉的熱帶海洋海鹽(網(wǎng)址thatpetplace.com)。這種人工海水混合物包括存在于真正海水中的所有其它主要和微量元素。監(jiān)測生長并可監(jiān)測生理參數(shù)，例如，鈉含量和分布。
結(jié)果當(dāng)野生型和35SAVP1轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行水培時，兩者的根、葉、和莖的尺寸存在顯著的差異，其中35SAVP1轉(zhuǎn)基因植物部分要大得多。
當(dāng)逐漸增加氯化鈉濃度、每4天增加50mM時(M.Apse等，科學(xué)(Science)，2851256-1258(1999))，在200mM氯化鈉存在下35SAVP1轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)得很健康，而野生型對照在它們的葉和莖則表現(xiàn)出嚴(yán)重的損害效果。
35SAVP1、35SAtNHX1單轉(zhuǎn)基因和雙轉(zhuǎn)基因植物與野生型擬南芥thaliana植物一同在短日照周期和水培條件下生長4周(D.M.Gibeaut等，植物生理學(xué)(Plant Physiol.)，317-319(1997))，然后每4天添加等同于50mM氯化鈉的熱帶海洋海鹽。研究發(fā)現(xiàn)，35SAVP1、35SAtNHX1單轉(zhuǎn)基因和雙轉(zhuǎn)基因植物在海鹽溶液中的生長狀況好于野生型擬南芥(Arabidopsis thaliana)植物。
實施例9在西紅柿植物中，過表達(dá)擬南芥(Arabidopsisthaliana)質(zhì)子轉(zhuǎn)運蛋白的效果可以檢測過表達(dá)這些擬南芥(Arabidopsis thaliana)質(zhì)子轉(zhuǎn)運蛋白(AVP1和AtNHX1)在農(nóng)業(yè)上更重要的植物—西紅柿植物中的作用。人們相信，增加西紅柿植物的鹽耐受性很可能會具有重要的經(jīng)濟(jì)影響。
可以分離AVP1和AtNHX1的西紅柿同源物，并可以構(gòu)建使它們高表達(dá)的相應(yīng)嵌合體(S.Bidone等，歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)，25320-26(1998)；A.Burbidge等，實驗植物學(xué)雜志(J.Exper.Botany)，482111-21112(1997))。這些基因可以通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)感染導(dǎo)入愈傷組織?？梢赃\用組織培養(yǎng)技術(shù)來再生轉(zhuǎn)化植物?？梢詸z測植物的鹽耐受性以及生理學(xué)參數(shù)，例如鈉含量和分布。
可以用35S AVP1和用35S AtNHX1組件進(jìn)行西紅柿轉(zhuǎn)化(S.McCormick，“用根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化西紅柿”(Transformation oftomato with Agrobacterium tumefaciens)，在K.Lindsey編輯的《植物組織培養(yǎng)手冊》(Plant Tissue Culture Manual)一書中，PP.1-9，Kluwer學(xué)術(shù)出版社，Dordrecht，荷蘭(1991))?？梢酝ㄟ^聚合酶鏈反應(yīng)和DNA凝膠印跡分析T0和T1轉(zhuǎn)基因植物中AVP1和AtNHX1轉(zhuǎn)基因的存在和拷貝數(shù)。在T1的種子中，經(jīng)過每一個后代的分離分析，可以鑒定雜合子和純合子植株。可以分析純合子植株的鹽耐受性以及生理學(xué)參數(shù)，例如鈉含量和分布?？梢栽O(shè)計基于存在于AVP1和AtNHX1同系源物中的保守序列的退化寡核甘酸(oligous)。這些退化引物可以用于與cDNAs的RT-PCR反應(yīng)，其中cDNAs是從西紅柿的含聚腺苷酸的核糖核酸(poly(A)+RNA)制成。產(chǎn)生的PCR片段可以用作探針來從商業(yè)文庫中分離全長的cDNA克隆(即Stratagene產(chǎn)品號936004)。Caboche和合作者描述了類似的策略(A.Quesada等，植物分子生物學(xué)(Plant Mol.Biol.)，34265-274(1997))。
結(jié)果陽性試驗結(jié)果可能表明，本文描述的隔離模型也可應(yīng)用于重要的農(nóng)作物。
圖7是種植于含鹽分高的土壤中的野生型植株(WT)對過表達(dá)AVP1(1’和2’)的代表性的轉(zhuǎn)基因植株中的鈉離子和鉀離子含量圖。五株野生型植物(WT)和兩株AVP1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因系(1’和2’)植物在10小時明暗周期下種植于土壤。以稀釋的營養(yǎng)液(1/8MS鹽)澆灌植物6星期，然后以添加了氯化鈉的稀釋營養(yǎng)液澆灌。Nacl初始濃度為100mM，并每4天增加50mM。照片對應(yīng)于在第10天的植物，其時存在300mM氯化鈉。在存在200mM氯化鈉24小時后，收獲地面之上的植物部分并稱量其新鮮重量(fresh weigh)。在75℃下48小時后，稱量其干重。通過原子吸收測定鈉離子和鉀離子含量。圖4中的數(shù)值是平均值+/-SE(標(biāo)準(zhǔn)誤差)(n＝4)。如從圖中可見看到的，轉(zhuǎn)基因系(1’和2’)中的鈉離子和鉀離子含量顯著高于野生型對應(yīng)物中的鈉離子和鉀離子含量。
圖8是鈣攝入圖4中2’的35SAVP-1轉(zhuǎn)基因液泡膜小泡(方塊)對鈣攝入圖4中野生型(WT)的小泡的曲線圖。野生型植株(空心圓(open circles))和來自圖4的2’系的轉(zhuǎn)基因植物在10小時光周期下水培9周。液泡膜小泡加入緩沖液中，該緩沖液包括250mM山梨醇、25mM pH8.0的BTP-Hepes、50mM氯化鉀、1.5nM硫酸鎂、和10μM二價鈣離子。在加入200μM焦磷酸前，該混合物在20℃下保溫10分鐘，以啟動反應(yīng)。加入鈣離子載體A23187至終濃度5μg/ml，以消散鈣離子梯度。在指定時間過濾等分試樣(200μl)，并如(11)所述以冷緩沖液洗滌。如圖可見，來自2′系的轉(zhuǎn)基因植物比野生型植物具有更大的鈣攝取。
上述數(shù)據(jù)與以下假說一致過表達(dá)AVP-1的轉(zhuǎn)基因植物在其細(xì)胞膜具有增強(qiáng)的氫離子泵性能力，并且通過氫離子驅(qū)動的離子轉(zhuǎn)運蛋白的作用增強(qiáng)的氫離子供給導(dǎo)致液泡中更高的離子積累。為進(jìn)一步支持該理論，測定了野生型和轉(zhuǎn)基因液泡膜小泡的鈣離子攝取能力。
有許多文件證明，鈣離子通過鈣離子/氫離子反向轉(zhuǎn)運載體進(jìn)入植物液泡(K.S.Schumaker、H.Sze，植物生理學(xué)(PlantPhysiol.)，79，1111-1117(1985))。此外，編碼擬南芥(A.thaliana)鈣離子/氫離子反向轉(zhuǎn)運載體CAX1和CAX2的基因已被分離并表征(K.D.Hirschi、R.-G.Zhen、K.W.Cunningham、P.A.Rea、G.R.Fink，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，93，8782-8786(1996))。圖8表明，在35SAVP-1轉(zhuǎn)基因液泡膜小泡中鈣攝取較來自野生型的小泡高36％。運用鈣離子載體A23可將45鈣離子的計數(shù)降至本底水平，這表明該小泡的密閉性(圖8)(K.S.Schumaker、H.Sze，植物生理學(xué)(PlantPhysiol.)，79，1111-1117(1985))。
雖然不局限于此理論，但在圖9A和9B中描述了與過表達(dá)AVP-1基因的轉(zhuǎn)基因植物的增強(qiáng)的干旱和凍害耐受性相一致的模型。該模型描述在轉(zhuǎn)基因植物的液泡中AVP-1泵數(shù)量的增加如何能夠提供更多的氫離子，使得次級轉(zhuǎn)運蛋白可以輸入更多的陽離子進(jìn)入液泡腔。更高數(shù)量的陽離子賦予更大的滲透壓(見圖14)，其導(dǎo)致植物更高的保留水的能力，這幫助植物抵抗土壤的低水勢。
實施例10具有35S AVP1和35S AtNHX1的雙重轉(zhuǎn)基因植物焦磷酸驅(qū)動的液泡膜質(zhì)子泵AVP1的過表達(dá)很可能會增加液泡腔內(nèi)的氫離子可獲得性，而AtNHX1鈉離子/氫離子反向轉(zhuǎn)運載體利用這些氫離子，以將鈉離子隔離在液泡內(nèi)。因此，這些轉(zhuǎn)運蛋白的較高表達(dá)很可能將液泡的隔離能力最大化。
為產(chǎn)生過表達(dá)AVP1和AtNHX1兩種基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物，可將T3 35S AVP1植物作為母本并將T3 35S AtNHX1植物作為父本。母本植株可經(jīng)手工去雄，并收獲來自供體植物的新鮮的花藥。用這些花藥，通過使花藥與柱頭接觸，則可以給去雄的植物授粉。授粉的花可做標(biāo)記，并將同一雌株上的任何留下的已開或未開的花去除，以避免收獲時的任何混淆。收獲的種子應(yīng)使用50％的次氯酸鈉液滅菌并劇烈混合5分鐘，然后用水充分洗滌。經(jīng)滅菌的種子可在4℃下保存在軟瓊脂中過夜。然后可將它們散種于凝固的卡那霉素-潮霉素選擇培養(yǎng)基。該35S AVP1組件含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II基因，其賦予植物卡那霉素耐受性，而35S AtNHX1組件含有經(jīng)修飾的潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶，其賦予植物潮霉素耐受性?？剐缘拿缈梢砸浦驳酵寥酪约八d培養(yǎng)基中以檢驗它們的耐鹽表型。
利用上述35A啟動子的相同的雙串聯(lián)增強(qiáng)子(R.Topfer等，核酸研究(Nucl.Acid Res.)，155890(1997))可以設(shè)計過表達(dá)A.thaliane功能獲得突變體基因AVP1-D的轉(zhuǎn)基因擬南芥(Arabdopsis thaliana)植物(R.G.Zhen等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，27222340-22348(1997))。過表達(dá)功能獲得突變體基因的植物將可能表現(xiàn)出增強(qiáng)的表型。這些植物可以與35SAVP1、35S AtNHX單和雙轉(zhuǎn)基因植物同時進(jìn)行表征。A.thaliana的功能獲得突變體基因AVP1-D可以亞克隆進(jìn)攜帶有35S啟動子和CaMV的聚腺苷酸化信號的pRT103質(zhì)粒(R.Topfer等，核酸研究(Nucl.Acid Res.)，155890(1987))。含有嵌合35SAVP-D基因的HindIII片段可以亞克隆進(jìn)pBIBhyg(D.Becker，核酸研究(Nucl.Acid Res.)，18203(1990))。生成的T-DNA(轉(zhuǎn)化DNA)載體可以通過電穿孔轉(zhuǎn)化進(jìn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101株，并且可以用于后面的A.thaliana ecotype Columbia的真空滲入(infiltration)(N.Bechtold等，C.R.Jeances Acad.Sci.Ser.III Sci.Vie，3161194-1199(1993))。可通過T3植物的DNA印跡和在陽性T3植物的RNA印跡上檢測的表達(dá)來證實整合。
實施例11野生型和35SAVP1轉(zhuǎn)基因植物的根液泡的轉(zhuǎn)運比較研究可進(jìn)行研究以確定35S AVP1轉(zhuǎn)基因植物的液泡是否表現(xiàn)出依賴于焦磷酸的高更的質(zhì)子轉(zhuǎn)運活性。這些測定可用分別來自水培植物的根和芽組織進(jìn)行。該轉(zhuǎn)基因可表現(xiàn)出組織特異性調(diào)控，與35S啟動子無關(guān)。
為比較野生型和35S AVP1轉(zhuǎn)基因植物的焦磷酸依賴的氫離子轉(zhuǎn)運活性，可以制備來自上述植物的根和葉的密封的富含液泡膜的小泡?？刹捎肦ea和Turner所描述的均化和差速離心程序(P.A.Rea等，“液泡膜ATP和無機(jī)焦磷酸酶”(TonoplastAdenosine Triphosphate and Inorganic Pyrophosphatase)，在《植物生化方法》(Meth.Plant Biochem)一書中，pp.385-405，學(xué)術(shù)出版有限公司，倫敦(1990))。在含有液泡膜富集小泡的分析介質(zhì)中，可用吖啶橙(2.5μM)作為跨膜pH差異指示劑來熒光分析氫離子轉(zhuǎn)運(R.G.Zhen等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，27222340-22348(1997))。該分析介質(zhì)含有300μM的三羥甲基氨基甲烷-焦磷酸(Tris-PPi)、50mM的氯化鉀、2.5μM的吖啶橙、5mM Tris(三羥甲基氨基甲烷)-Mes(2-(N-嗎啉)-乙基磺酸？)(pH8.0)。可添加1.3mM硫酸鎂來啟動囊泡內(nèi)的酸化，而用添加質(zhì)子載體FCCP(羰基氰對三氟甲氧基苯腙)至2.5μM來終止反應(yīng)。可分別在495和540nM的激發(fā)發(fā)射波長測量熒光，其中采用5nM的狹縫寬度(R.G.Zhen等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，26923342-23350(1994))。可用添加特異性抑制劑氨基亞甲基二膦酸(aminomethylenediphosphonate)的進(jìn)一步試驗來支持氫離子轉(zhuǎn)運是AVP1驅(qū)動的觀點(R.G.Zhen等，植物生理學(xué)(Plant Physiol.)，104153-159(1994))。
實施例12檢測轉(zhuǎn)基因植物的葉和莖中的鈉離子/鉀離子比例氯化鈉的毒性濃度首先在充分展開的葉中積累，其中氯化鈉被區(qū)室化于液泡中。暴露于氯化鈉可干擾或減少鉀離子攝取，這導(dǎo)致鉀離子缺乏和生長抑制(S.J.Wu等，植物細(xì)胞(Plant Cell)，8617-627(1996)。減少的鉀離子含量和較高的鈉離子含量的細(xì)胞溶質(zhì)后果是抑制重要的酶。.這些酶的例子是酵母的3’(2’)，5’-二磷酸核苷酸酶，當(dāng)鉀離子含量較低時，其活性對鈉離子更加敏感(J.R.Murguia等，科學(xué)(Science)，267232-234(1995))。
可進(jìn)行測量來驗證本文所述的轉(zhuǎn)基因植物具有增強(qiáng)的將鈉離子隔離在其葉細(xì)胞或其它地方的液泡能力。為檢測葉和莖中鈉離子/鉀離子的比例，可水培野生型和35S AVP1/35S AtNHX1雙和單轉(zhuǎn)基因植物(D.M.Gibeaut等，植物生理學(xué)(Plant Physiol.)，317-319(1997))?？芍饾u將氯化鈉加入生長培養(yǎng)基(growthmedia)，從50mM開始，直至250mM(M.Apse等，科學(xué)(Science)，2851256-1258(1999))。在每一時間點.可收集經(jīng)處理植物的蓮座葉叢和莖，并稱重。樣本應(yīng)在80℃烘箱中干燥并稱量其干重。該干燥樣本應(yīng)于確定體積的水中煮沸，并通過原子吸收分光光度法測定其鈉離子和鉀離子含量(M.Apse，等，科學(xué)(science)，2851256-1258(1999)；R.Gaxiola等，EMBO雜志(EMBO J.)，113157-3164(1992))。
實施例13確定35S AVP1轉(zhuǎn)基因植物更大的原因是否是由于其細(xì)胞更大或由于其具有更多的細(xì)胞，亦或兼而有之芽分生組織標(biāo)記指數(shù)可與野生型植物的芽分生組織標(biāo)記指數(shù)進(jìn)行比較?？蛇M(jìn)行形態(tài)和解剖觀察，即測量和計數(shù)葉、根、和莖的細(xì)胞。為確定35S AVP1轉(zhuǎn)基因植物是否因為其具有更多的細(xì)胞而更大，可將它們的芽分生組織標(biāo)記指數(shù)與野生型的芽分生組織標(biāo)記指數(shù)相比較。
為測定DNA合成或細(xì)胞增值，可采用5-溴-2’-脫氧尿苷(BrdU)，其可以代替胸苷摻入DNA。在DNA中摻入了5-溴-2’-脫氧尿苷的細(xì)胞可用抗5-溴-2’-脫氧尿苷單克隆抗體的單克隆抗體和抗小鼠Ig(免疫球蛋白)-堿性磷酸酶作為第二抗體來檢測。結(jié)合的抗5-溴-2’-脫氧尿苷的單克隆抗體可用光學(xué)顯微術(shù)目視觀察，并建立二脒基苯基吲哚(DPAI)著色的和5-溴-2’-脫氧尿苷正片(positives)之間的比例。此方法是Chiatante和合作者所發(fā)表方法(M.Levi等，植物生理學(xué)(Physiol.Plant)，7168-72(1987))和5-溴-2’-脫氧尿苷標(biāo)記和檢測試劑盒II(來自Boehringer Mannheim公司)的改進(jìn)。該植物可暴露于5-溴-2’-脫氧尿苷標(biāo)記的培養(yǎng)基不同的時間，然后可進(jìn)行固定、石蠟包埋、和切片，如Meyerowitz和合作者所描述的(G.Drews等，植物分子生物學(xué)報道(Plant Mol.Biol.Rep.)，5242-250(1998))。
為觀察葉組織，新鮮組織可包埋于5％的瓊脂糖中，并用顯微切片刀對其切片。對初步根觀察而言，苗可于室溫在50％乙醇、5％乙酸、和3.7％甲醛中固定4小時，在分級乙醇系列中脫水，用二甲苯對其滲透，再浸以石蠟。.8微米的切片可用0.05％甲苯胺藍(lán)染色，并可在顯微鏡下對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。作為目視觀察和確定細(xì)胞大小的替換方法，可采用Greenberg和合作者所描述的方法(Rate等，植物細(xì)胞(The Plant Cell)，111695-1708(1999))。
結(jié)果通過顯微鏡觀察表明，轉(zhuǎn)基因擬南芥植物的細(xì)胞并不更大，但其細(xì)胞數(shù)較野生型更多。肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，在AVP-12′系中，在蓮座葉叢中比野生型平均多8片葉。F1植物是通過轉(zhuǎn)基因植物株系1’和2’的雜交而產(chǎn)生，其蓮座葉叢比野生型植物具有更大和數(shù)目更多的葉子。圖10是野生型和過表達(dá)AVP1的轉(zhuǎn)基因(1’和2’)擬南芥植物的葉子，這些植物在20℃并在16小時的全白熒光/8小時暗周期下生長。當(dāng)植物開始抽苔時，用解剖刀小心地將描述的葉切下(sectored)，然后按大小排列以供比較。雖然轉(zhuǎn)基因植物比野生型植物具有更大和更多數(shù)目的葉子，但未見轉(zhuǎn)基因植物有更大的細(xì)胞。這些資料與下述假說相一致在AVP-1過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物中分生活性更高。
水培轉(zhuǎn)基因擬南芥植物的干重，當(dāng)與相似生長情況下的野生型植物比較時，進(jìn)一步表明細(xì)胞質(zhì)量的增加與植物水?dāng)z取的任何增加無關(guān)。在根、蓮座葉叢、和莖結(jié)構(gòu)中可以看到質(zhì)量干重(drymass weight)的增加，如下面的表1所示，其中數(shù)值為6株植物的平均值。
表1水培養(yǎng)的擬南芥植物部分的干重
實施例14AVP-1的過表達(dá)對激素活性的影響可通過激素的增多與AVP-1過表達(dá)同時作用來產(chǎn)生增加的分生活性和/或芽的器官發(fā)生。
為判定過表達(dá)AVP-1對激素活性的影響，小心地用解剖刀從野生型和過表達(dá)AVP-1的轉(zhuǎn)基因(1’，2’)擬南芥植物剪下真葉。平皿中將葉放置于蒸餾水飽和的5層濾紙上。該平皿于20℃在冷白熒光下并在16小時光照/8小時暗周期下培育。從圖11A(在平皿中的葉子)和11B(來自圖11A平皿中的葉子，進(jìn)行放置從而更清楚地描繪發(fā)育自葉子的根結(jié)構(gòu))可以看到，轉(zhuǎn)基因植物的葉子依然更綠并具有增強(qiáng)的生根能力。增強(qiáng)的生根能力表明，增加的植物生長素含量和延緩的衰老與增加的細(xì)胞分裂素水平相一致。
實施例15AVP-1的過表達(dá)對矮牽牛外植體中愈傷組織誘導(dǎo)的影響方法矮牽牛外植體培養(yǎng)于MS培養(yǎng)基，其包括MS鹽(Gibco BRL公司)、添加1mg/L的煙酸、1mg/L的鹽酸吡哆酸(pyrodoxinHCl)、1mg/L的硫胺素、100mg/L的肌醇、3％蔗糖、1mg/L的2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)、和0.5mg/L的6-BA(6-芐氨基嘌呤)。該培養(yǎng)基在高壓滅菌前用0.7％瓊脂凝固，并調(diào)節(jié)pH值至5.8。該培養(yǎng)物在培養(yǎng)箱中于25℃并在黑暗中培養(yǎng)。
結(jié)果如圖15所示，轉(zhuǎn)基因矮牽牛外植體(35-S AVP-1)在培育6周后，表現(xiàn)出明顯增強(qiáng)的愈傷組織誘導(dǎo)。
實施例16AVP-1的過表達(dá)對葉片段中芽再生的影響已知生長于適當(dāng)培養(yǎng)基中的葉片段可以產(chǎn)生芽的生長。進(jìn)行了研究以確定35-S AVP-1的過表達(dá)對矮牽牛葉片中芽再生的影響。
來自再生轉(zhuǎn)化(35-S AVP-1)和對照矮牽牛的葉片被用作芽再生的外植體。用鋒利的手術(shù)刀片將葉切成約1厘米寬的片。該外植體培養(yǎng)于MS培養(yǎng)基中，該MS培養(yǎng)基包括MS鹽(Gibco公司)、B5維生素(1mg/L煙酸、1mg/L鹽酸吡哆酸、1mg/L硫胺素、和100mg/L肌醇)、3％蔗糖、2mg/L 6-芐氨基嘌呤、和0.01mg/L萘并吡咯酸(naptnaleneacitic acid)、0.7％瓊脂，pH5.8。該培養(yǎng)的片段在冷白熒光、25℃下，并在16小時光照/8小時黑暗周期下培養(yǎng)。
如圖12所示，在組成型啟動子下用AVP-1基因(35S AVP-1平皿)轉(zhuǎn)化的矮牽牛葉，表現(xiàn)出較野生型矮牽牛葉片段(WT)具有更強(qiáng)的芽再生能力，這與轉(zhuǎn)基因擬南芥植物的結(jié)果類似。這些結(jié)果與下述觀點一致此液泡質(zhì)子泵的過表達(dá)將改善任何植物的芽再生能力。
用AVP-1可譯框架作為探針進(jìn)行的同源性比較分析(blastearch)表明，此基因非常保守(稻谷＝86％同一性；煙草＝89％同一性；大麥＝86％同一性；葡萄＝82％同一性；大麥＝86％同一性(校重復(fù))；和玉米＝90％)。后者表明，AVP-1基因的過表達(dá)在其它植物類型中會類似地產(chǎn)生這樣的結(jié)果。
實施例17AVP-1的過表達(dá)對擬南芥子葉的芽和根再生的影響已知用合適的培養(yǎng)基，芽和根可由子葉再生。針對野生型(WT)和AVP-1轉(zhuǎn)基因擬南芥(1’和2’)，鑒定了來自子葉的芽和根再生。
5日齡的子葉用作再生的外植體。外植體培養(yǎng)于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(SIM)，培養(yǎng)條件為20℃、16小時光照/8小時黑暗周期。該SIM包括MS鹽(Gibco公司)、B5維生素(包括1mg/L煙酸、1mg/L鹽酸吡哆酸、1mg/L硫胺素、和100mg/L肌醇)、3％蔗糖、1mg/L 6-(γ，γ-二甲烯丙基氨基)嘌呤核苷(6-(gama-gama-dimethylallylamino)purine riboside)(2-磷酸)、和0.1mg/L萘并吡咯酸，并用0.7％瓊脂凝固。把培養(yǎng)基的pH調(diào)至5.8。在高壓滅菌后，對2-磷酸(2-iP)過濾滅菌并加入該培養(yǎng)基中。
如在圖13A和13B所見，來自轉(zhuǎn)基因植物(1’和2’)的外植體再生芽和根的頻率高于以及時間早于野生型(WT)，這與更高的分生組織感受態(tài)相一致。轉(zhuǎn)化子葉和野生型子葉之間差異的證據(jù)在23天(圖13A)非常明顯，而在培養(yǎng)后37天更加明顯(圖13B)。
實施例18AVP-1的過表達(dá)對來自擬南芥植物的根和子葉外植體的芽再生的影響把來自野生型(WT)和轉(zhuǎn)基因(1’和2’)AVP-1過表達(dá)擬南芥植物的根和子葉(5日齡)外植體置于芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，如在實施例16中所述。如圖6所示，來自轉(zhuǎn)基因植物(1’和2’)的外植體早于野生型產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)，這與更高的分生組織感受態(tài)相一致。
實施例19在轉(zhuǎn)運蛋白中突變體的分離在分析復(fù)雜生物性狀方面，基因?qū)W方法非常有效(R.Serrano等，植物科學(xué)評論(Crit.Rev.Plant Sci.)，13121-138(1994))。對于植物生物學(xué)家來說，反向遺傳學(xué)是非常重要的新工具。由Sussman和合作者制備的一系列標(biāo)記敲除系(P.Krysan等，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，938145-8150(1996))為分析擬南芥的遺傳紊亂(gene disruption)打開了非常重要的途徑。
威斯康星麥迪遜大學(xué)的擬南芥敲除設(shè)施(網(wǎng)址biotech.wisc.edu/NewServicesAndResearch/Arabidopsis)可用來在60，480個擬南芥(ecotype WS)系(其已用T-DNA載體pD991進(jìn)行轉(zhuǎn)化)中搜尋在AtCLC-c、AtCLC-d、AVP1、AtNHX1及其同源物內(nèi)的T-DNA插入片斷。上述基因敲除的植物的表型將為理解這些轉(zhuǎn)運蛋白在正常和應(yīng)激情況下的生理作用提供線索?；蚯贸参锏某跫壉碚靼z測其鹽耐受性和其鈉離子/鉀離子比例。通過雜交產(chǎn)生的雙重敲除植物有助于進(jìn)一步了解轉(zhuǎn)運蛋白之間的相互作用以及與35S AVP1和35S AtNHX1轉(zhuǎn)基因植物的雜交。
為搜尋擬南芥基因敲除，可參照威斯康星大學(xué)網(wǎng)站詳細(xì)說明的指導(dǎo)設(shè)計PCR(聚合酶鏈反應(yīng))引物?？蓪y試引物送到威斯康星大學(xué)麥迪遜分校，其中可以進(jìn)行62個PCR反應(yīng)，其是送給我們用于DNA印跡分析。將陽性PCR產(chǎn)物測序。如果該序列表明有T-DNA插入該基因，則此基因特異性引物用另一組PCR反應(yīng)以確定225個中的9個可能庫的哪一個含有該基因敲除(knockout)。當(dāng)鑒定了感興趣的庫后，將篩選掃描25管種子以尋找攜帶T-DNA敲除的植株。
實施例20植物細(xì)胞中的陽離子解毒本文描述的研究結(jié)合其它證據(jù)有利地說明，酵母和植物具有相同的從高爾基體網(wǎng)轉(zhuǎn)運小泡到液泡的途徑和信號(R.Gaxiola等，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，961480-1485(1999)；F.Marty，“液泡的生物發(fā)生來自顯微鏡的觀察”(“The Biogenesis of VacuolesInsights from Microscopy”)，發(fā)表于《植物液泡》(The Plant Vacuole)，1-42，R.A.Leigh和D.Sanders，學(xué)術(shù)出版社，圣地亞哥(1997)；D.C.Bassham等，植物生理學(xué)(Plant Physiol.)，117407-415(1998))。
不希望為理論所局限，本發(fā)明者多半相信，在兩個系統(tǒng)中，前液泡室是動態(tài)的實體，它可以解毒細(xì)胞質(zhì)中的陽離子，并將其負(fù)荷(cargo)運輸至液泡或直接到細(xì)胞外。gef1氯離子通道和Nhx1鈉離子/氫離子交換體都被定位于酵母前液泡室(R.A.Gaxiola等，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，961480-1485(1999))。已監(jiān)測gef1-GFP嵌合體在活體酵母細(xì)胞內(nèi)的行為，表明其定位隨環(huán)境條件而變化。此外，已表明4種A.thaliana CLC氯離子通道基因中的兩種CLC-c和CLC-d可以抑制gef1突變表型，這暗示相似的定位(R.A.Gaxiola等，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，954046-4050(1998))。
為了探明在植物細(xì)胞中這種陽離子解毒作用如何及在何處發(fā)生，可在體內(nèi)監(jiān)測AVP1、AtNHX1、和AtCLC-c和-d的GFP(綠色熒光蛋白)嵌合體的細(xì)胞內(nèi)定位(B.Hong等，植物生理學(xué)(Plant Physiol.)，1191165-1175(1999))。也可用共焦顯微鏡來確定不同轉(zhuǎn)運蛋白的共定位。為達(dá)到此目的，需要所研究轉(zhuǎn)運蛋白的HA標(biāo)記的變體(versions)或抗體(Guiltinan M.J.等，細(xì)胞生物學(xué)方法(Meth.Cell Biol.)，49143-151(1995)；JauhG.-Y.等，植物細(xì)胞(Plant Cell)，111867-1882(1999)；MullenR.T.等，植物雜志(Plant J.)，12313-322(1997))。
為構(gòu)建GFP嵌合體，可采用Davis和Viestra報道的在擬南芥(A.thaliana)中具有改善熒光的可溶性GFP變體(versionsGFP)(S.J.Davies和R.D.Viestra，用于擬南芥(Arabidopsisthaliana)的綠色熒光蛋白(GFP)的可溶性衍生物，網(wǎng)址http//brindabella.mrc-lmb.cam.ac.uk/IndexGFP.html(1998))。可得到兩種類型的GFP嵌合體，即一種由天然啟動子調(diào)控，另一種由35S啟動子調(diào)控。通過電穿孔，將生成的含有GFP嵌合體的T-NDA載體轉(zhuǎn)化入根癌農(nóng)桿菌GV3101菌株，并用于隨后的擬南芥(Arabidopsis thaliana)ecotype Columbia的真空滲入(Bechtold N.等，C.R.Jeances Acad.Sci.Ser.III Sci.Vie，3161194-1199(1993))。為標(biāo)記血細(xì)胞凝集素(HA)抗原表位，可采用PCR策略，該策略是為酵母而設(shè)計，但經(jīng)改造可用于標(biāo)記在酵母載體中表達(dá)的的植物基因。Futcher和合作者設(shè)計了含有URA3酵母基因的載體，該基因被抗原表位標(biāo)記(HA)的同向重復(fù)單位翼側(cè)包圍(B.L.Schneider等，酵母(Yeast)，111265-1274(1995))。通過PCR，該標(biāo)記-URA3-標(biāo)記盒可以擴(kuò)增，從而生成的PCR片段在每個末端與目的基因具有同源性。然后可利用酵母中的體內(nèi)重組，來引導(dǎo)PCR-嵌合體整合入含有植物目的ORF(可譯框架)的質(zhì)粒，用URA+(鳥嘧啶野生型)表型選擇轉(zhuǎn)化體。當(dāng)陽性轉(zhuǎn)化體在5-氟乳清酸存在下培養(yǎng)時，URA3基因可被“剔除”。攜帶該植物基因的載體具有與URA3基因不同的選擇標(biāo)記。
總之，在經(jīng)濟(jì)上重要的作物中，對液泡焦磷酸酶的操作可為作物改善提供重要的途徑。耐旱和耐凍害的植物可為由于干旱或極少降雨而荒廢的地區(qū)提供新的耕作方法，以及為農(nóng)民提供保護(hù)，使其免受未曾預(yù)期的凍害(凍雨等)的影響。這類作物還可能生長于對于野生型作物來說鹽分過高的土壤中。
雖然本發(fā)明已經(jīng)參考其優(yōu)選的具體實施例而加以描述，但是對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，可以做多種的改變和/或修改，而不偏離本發(fā)明的精神或范圍。所有這些改動均在所附的本發(fā)明專利申請權(quán)利要求范圍內(nèi)。所有在本說明書中引用的參考文獻(xiàn)結(jié)合于此作為參考文獻(xiàn)。
權(quán)利要求
1.制造具有提高的分生活性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括將可以改變所述植物中液泡焦磷酸酶表達(dá)的外源核酸引入植物的一個或多個細(xì)胞，來增加液泡焦磷酸酶活性，并在所述植物中產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞，由此產(chǎn)生具有提高的分生活性的轉(zhuǎn)基因植物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括從所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生植物，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物并選擇具有提高的分生活性的轉(zhuǎn)基因植物，由此產(chǎn)生具有改善的分生活性的轉(zhuǎn)基因植物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述外源核酸編碼AVP1或其同源物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述AVP1或AVP1同源物是存在于為過表達(dá)AVP1而設(shè)計的組件中。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述組件包括所述AVP1基因或AVP1同源物，是可操作連接于嵌合啟動子，所述啟動子是為過表達(dá)AVP1或其同源物而設(shè)計。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述AVP1基因或其同源物是可操作連接于嵌合啟動子，所述嵌合啟動子選自由組織特異性啟動子、組成型啟動子、誘導(dǎo)性啟動子、和其組合組成的組。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述AVP1基因或AVP1同源物是可操作連接于35S啟動子的雙串聯(lián)增強(qiáng)子。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是來源于野生型植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是來源于轉(zhuǎn)基因植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是來源于突變體植物。
11.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是人工合成獲得。
12.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是天然以及人工合成獲得。
13.通過根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物。
14.制造具有提高的分生組織活力的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括將可以改變液泡焦磷酸酶表達(dá)的外源核酸引入植物的一個或多個細(xì)胞，來增加在所述植物中的液泡焦磷酸酶活性，并在所述植物中產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞，由此產(chǎn)生具有提高的分生組織活力的轉(zhuǎn)基因植物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，進(jìn)一步包括從所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生植物，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物并選擇具有提高的分生活性的轉(zhuǎn)基因植物，由此產(chǎn)生具有改善的分生活性的轉(zhuǎn)基因植物。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述外源核酸編碼AVP1或其同源物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述AVP1或AVP1同源物是存在于為過表達(dá)AVP1而設(shè)計的組件中。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述組件包括所述AVP1基因或AVP1同源物，是可操作連接于嵌合啟動子，所述啟動子是為過表達(dá)AVP1或其同源物而設(shè)計。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述AVP1基因或其同源物是可操作連接于嵌合啟動子，所述嵌合啟動子選自由組織特異性啟動子、組成型啟動子、誘導(dǎo)性啟動子、和其組合組成的組。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述AVP1基因或AVP1同源物是可操作連接于35S啟動子的雙串聯(lián)增強(qiáng)子。
21.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是來源于野生型植物。
22.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是來源于轉(zhuǎn)基因植物。
23.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是來源于突變體植物。
24.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是人工合成獲得。
25.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是天然以及人工合成獲得。
26.制造具有提高的生物量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括將可以改變液泡焦磷酸酶表達(dá)的核酸組件引入植物的一個或多個細(xì)胞，來增加在所述細(xì)胞中的液泡焦磷酸酶活性，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞，由此產(chǎn)生具有提高的生物量的轉(zhuǎn)基因植物。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，進(jìn)一步包括從所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生植物，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物并選擇具有提高的生物量的轉(zhuǎn)基因植物。
28.通過根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物。
29.制備較其相應(yīng)的野生型植物具有提高的生物量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所述提高的生物量涉及植物部分的所述生物量的增加，所述植物部分選自由葉、莖、根、種子、花、和果實組成的組，所述方法包括將可以改變液泡焦磷酸酶表達(dá)的外源核酸引入植物的一個或多個細(xì)胞，來增強(qiáng)在所述植物中的所述液泡焦磷酸酶的活性，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞，由此產(chǎn)生具有提高的生物量的轉(zhuǎn)基因植物。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，進(jìn)一步包括從所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生植物，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物并選擇比其相應(yīng)野生型植物更大的轉(zhuǎn)基因植物，由此產(chǎn)生具有提高的生物量的轉(zhuǎn)基因植物。
31.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述外源核酸編碼AVP1或其同源物。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是存在于為過表達(dá)AVP1或其同源物而設(shè)計的組件中。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述組件包括所述AVP1基因或其同源物，其可操作連接于嵌合啟動子，所述啟動子是為過表達(dá)AVP1而設(shè)計。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述AVP1基因或其同源物是可操作連接于嵌合啟動子，所述嵌合啟動子選自由組織特異性啟動子、組成型啟動子、誘導(dǎo)性啟動子、和其組合組成的組。
35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述AVP1基因或其同源物是可操作連接于35S啟動子的雙串聯(lián)增強(qiáng)子。
36.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是來源于野生型植物。
37.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是來源于轉(zhuǎn)基因植物。
38.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是來源于突變體植物。
39.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是生長于土壤中。
40.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是水生培植。
41.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中來自所述轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)胞是生長于培養(yǎng)物中。
42.通過根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物。
43.產(chǎn)生具有比野生型更粗的莖結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括將可以改變液泡焦磷酸酶表達(dá)的外源核酸引入植物的一個或多個細(xì)胞，來增強(qiáng)在所述植物中的液泡焦磷酸酶活性，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞，由此產(chǎn)生具有變粗莖結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因植物。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述莖結(jié)構(gòu)是選自由木質(zhì)層、樹皮、和形成層組成的組。
45.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，進(jìn)一步包括從所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生植物，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物并選擇具有變粗莖結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因植物，由此產(chǎn)生具有變粗莖結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因植物。
46.制備較其相應(yīng)的野生型植物具有增加的根結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括將可以改變液泡焦磷酸酶表達(dá)的外源核酸引入植物的一個或多個細(xì)胞，來增強(qiáng)在所述植物中的液泡焦磷酸酶活性，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞，由此產(chǎn)生具有增加的根結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因植物。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述外源核酸編碼AVP1或其同源物。
48.通過根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物。
49.制備較其相應(yīng)的野生型植物具有增加的芽再生能力的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括將可以改變液泡焦磷酸酶表達(dá)的核酸引入植物的一個或多個細(xì)胞，來增強(qiáng)在所述植物中的液泡焦磷酸酶活性，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞，由此產(chǎn)生具有增加的芽再生能力的轉(zhuǎn)基因植物。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，進(jìn)一步包括從所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生植物，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物并選擇具有增加的芽再生能力的轉(zhuǎn)基因植物，由此產(chǎn)生具有改善的芽再生能力的轉(zhuǎn)基因植物。
51.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述外源核酸編碼AVP1或其同源物。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中所述AVP1或AVP1同源物是存在于為過表達(dá)AVP1而設(shè)計的組件中。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中包括所述AVP1基因或AVP1同源物的所述組件是可操作連接于嵌合啟動子，所述啟動子是為過表達(dá)AVP1或其同源物而設(shè)計。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述AVP1基因或其同源物是可操作連接于嵌合啟動子，所述嵌合啟動子選自由組織特異性啟動子、組成型啟動子、誘導(dǎo)性啟動子、和其組合組成的組。
55.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述AVP1基因或AVP1同源物是可操作連接于35S啟動子的雙串聯(lián)增強(qiáng)子。
56.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是來源于野生型植物。
57.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是來源于轉(zhuǎn)基因植物。
58.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是來源于突變體植物。
59.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是人工合成獲得。
60.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是天然以及人工合成獲得。
61.通過根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物。
62.制備較其相應(yīng)的野生型植物具有增加的根再生能力的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括將可以改變液泡焦磷酸酶表達(dá)的核酸引入植物的一個或多個細(xì)胞，來增強(qiáng)在所述植物中的液泡焦磷酸酶活性，從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞，由此產(chǎn)生具有增加的根結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因植物。
63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，進(jìn)一步包括從所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生植物，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物并選擇具有增加的根再生能力的轉(zhuǎn)基因植物，由此產(chǎn)生具有改善的根再生能力的轉(zhuǎn)基因植物。
64.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中所述外源核酸編碼AVP1或其同源物。
65.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中所述AVP1或AVP1同源物是存在于為過表達(dá)AVP1而設(shè)計的組件中。
66.根據(jù)權(quán)利要求65所述的方法，其中包括所述AVP1基因或AVP1同源物的所述組件是可操作連接于嵌合啟動子，所述啟動子是為過表達(dá)AVP1或其同源物而設(shè)計。
67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中所述AVP1基因或其同源物是可操作連接于嵌合啟動子，所述嵌合啟動子選自由組織特異性啟動子、組成型啟動子、誘導(dǎo)性啟動子、和其組合組成的組。
68.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中所述AVP1基因或AVP1同源物是可操作連接于35S啟動子的雙串聯(lián)增強(qiáng)子。
69.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是來源于野生型植物。
70.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是來源于轉(zhuǎn)基因植物。
71.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是來源于突變體植物。
72.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是人工合成獲得。
73.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中所述AVP1或其同源物是天然以及人工合成獲得。
74.通過根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物。
全文摘要
具有增強(qiáng)的分生活性和感受態(tài)的轉(zhuǎn)基因植物，其具有更大的葉片、莖、花、果實和根結(jié)構(gòu)，包括引起液泡焦磷酸酶上調(diào)控表達(dá)的多核苷酸序列。
文檔編號C12N5/04GK1469705SQ01817236
公開日2004年1月21日 申請日期2001年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月18日
發(fā)明者羅伯托·A·加克西奧拉, 羅伯托 A 加克西奧拉 申請人:康涅狄格州大學(xué), 懷特黑德研究研究所