專利名稱：：法呢基焦磷酸合成酶rna干擾重組慢病毒載體構(gòu)建及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬分子生物學(xué)，生物醫(yī)藥及基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，主要涉及針對(duì)法呢基焦磷酸合成酶(Farnesylpyrophosphatesynthase,FDS)基因的RNA干擾重組慢病毒載體(LV-sh-FDS)的構(gòu)建及其在心肌肥厚和膽固醇代謝調(diào)控中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：目前研究表明小G蛋白參與心肌肥厚的發(fā)生。RhoA屬于小G蛋白的超家族成員，有GDP結(jié)合的非活性態(tài)和GTP結(jié)合的活性態(tài)兩種形式。目前很多研究表明RhoA參與心肌肥厚的發(fā)生如血管緊張素II(AngII)誘導(dǎo)的心肌肥厚。有研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Rho-GDI(Rho-GDP分離抑制體)及Rho抑制劑C3exeoeZyme可以明顯抑制AngII誘導(dǎo)的心肌肥厚。法呢基焦磷酸合成酶(Farnesylpyrophosphatesynthase,FDS)是甲羥戊酸途徑中的關(guān)鍵酶，甲羥戊酸途徑是哺乳動(dòng)物體內(nèi)膽固醇合成的唯一途徑。同時(shí)FDS也是異戊二烯途徑中的關(guān)鍵酶，分解產(chǎn)生的類異戊二烯中間產(chǎn)物為RhoA活化進(jìn)而發(fā)揮功能提供了重要的底物。我們前期的實(shí)驗(yàn)表明在培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞用ΙμΜAngII誘導(dǎo)的心肌肥厚模型及自發(fā)性高血壓大鼠(SHRs)肥厚心肌(該模型心肌中含有高濃度的AngII)，F(xiàn)DS抑制劑阿倫磷酸鈉可以通過(guò)明顯抑制RhoA活性來(lái)抑制心肌肥厚。這些充分顯示了FDS在心肌中調(diào)節(jié)RhoA活性及在心肌肥厚中的可能重要作用。另外我們的研究也表明在培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞中用ΙμΜAngII孵育12-48h，F(xiàn)DS基因得到上調(diào)，尤其在24h最為明顯。同時(shí)在18周自發(fā)性高血壓大鼠(SHRs)肥厚心肌中也發(fā)現(xiàn)了FDS基因的上調(diào)。這些前期研究表明了FDS在心肌肥厚中可能的重要作用。FDS在其他領(lǐng)域的研究中也表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)闹匾?。生物學(xué)研究顯示通過(guò)抑制FDS的表達(dá)，寄生蟲(chóng)生長(zhǎng)速度下降直至最后死亡。另外也有研究表明大鼠前列腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)FDS高表達(dá)。另研究顯示下調(diào)FDS的表達(dá)能通過(guò)Vγ9Vδ2T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫監(jiān)視作用來(lái)靶向治療腫瘤細(xì)胞。所有這些證據(jù)表明抑制FDS基因的表達(dá)可能阻止AngII相關(guān)的心肌細(xì)胞/組織肥厚反應(yīng)。RNA干擾(RNAinterference,RNAi)技術(shù)是抑制基因表達(dá)的常用手段，又叫基因沉默。RNA干擾的原理是當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象。RNA干擾過(guò)程主要有兩個(gè)步驟一、雙鏈RNA被細(xì)胞源性雙鏈RNA特異性的核酸酶切成21-23個(gè)堿基對(duì)的短雙鏈RNA,即小干擾RNA(smallinterferenceRNA,siRNA)二、siRNA的反義鏈與核酸酶形成了沉默復(fù)合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)，該復(fù)合體具有識(shí)別結(jié)合與小干擾RNA有同源序列的mRNA，并在特異位點(diǎn)將該mRNA切斷。RNA干擾技術(shù)目前在基因治療及研究中得到了廣泛的應(yīng)用，同時(shí)那些在靶標(biāo)實(shí)驗(yàn)中證明有效的siRNA/shRNA本身可以進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成為RNAi藥物。shRNA即短發(fā)夾RNA(shorthairpinRNA)包含兩個(gè)短反向重復(fù)序列(其中一個(gè)與目的基因互補(bǔ))，中間loop序列分隔組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在體內(nèi)shRNA被加工成siRNA有效降解目的基因抑制其表達(dá)。但是要將該技術(shù)應(yīng)用于臨床治療，需要解決RNA干擾片段表達(dá)持續(xù)及表達(dá)效率等重要問(wèn)題。目前基因治療的載體主要有非病毒載體及病毒載體，然而非病毒載體無(wú)法滿足長(zhǎng)時(shí)間的表達(dá)，這一缺陷無(wú)疑被病毒載體填補(bǔ)。近年來(lái)慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)在研究中已經(jīng)取得了良好的開(kāi)端。慢病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，具有逆轉(zhuǎn)錄病毒的基本結(jié)構(gòu)，但又有不同逆轉(zhuǎn)錄病毒的組分特性，該病毒既可以轉(zhuǎn)染分裂細(xì)胞又可以轉(zhuǎn)染非分裂細(xì)胞。病毒基因組可以整合宿主中，使得基因長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定的表達(dá)，并且慢病毒具有較低的免疫源性，這使得慢病毒成為RNA干擾的最佳載體，目前廣泛用于基因表達(dá)調(diào)控，基因治療等領(lǐng)域。我們選用的是第三代復(fù)制缺陷型慢病毒載體是自殺性病毒(SIN)，在體內(nèi)可以較長(zhǎng)期的表達(dá)且安全性高。因此慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾效應(yīng)在靶細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期存在，可為更好發(fā)揮干擾作用創(chuàng)造條件。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種干擾載體，即法呢基焦磷酸合成酶(Farnesylpyrophosphatesynthase,FDS)基因RNA干擾重組慢病毒載體(LV-sh-FDS)。所述載體含有慢病毒骨架質(zhì)粒重組載體pGCSIL-sh-FDS，所述的重組載體是在p-GCSIL-GFP骨架質(zhì)粒載體的MCS中連接了針對(duì)shRNA的雙鏈DNA片段，針對(duì)的靶序列為1#-GACAGCTTTCTACTCTTTC，合成的DNA片段信息為1#-1:5，-CcggaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTTCAAGAGAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCttTTTTTg-3，，1#-2:5，-aattcaaaaaaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTCTCTTGAAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCtt-3，。該載體能有效轉(zhuǎn)染細(xì)胞或組織后特異性降低FDS基因的表達(dá)，從而應(yīng)用于基因治療或基因功能研究。本發(fā)明提供的LV-sh-FDS最重要特征在于提供靶向性FDS抑制效應(yīng)，并用重組慢病毒載體作為載體，使得干擾效果得到持續(xù)性作用。整個(gè)制備過(guò)程全部使用質(zhì)粒，避免傳統(tǒng)方法腺病毒污染。本發(fā)明中針對(duì)的靶基因FDS是甲羥戊酸途徑中的關(guān)鍵酶，也是異戊二烯途徑中的關(guān)鍵酶，產(chǎn)生的異戊二烯化中間產(chǎn)物為小G蛋白家族包括RhoA活化及功能學(xué)提供了重要的底物。甲羥戊酸途徑是哺乳動(dòng)物體內(nèi)膽固醇合成的唯一途徑。通過(guò)抑制FDS的表達(dá)進(jìn)而降低RhoA的活性，從而有效抑制AngII相關(guān)的心肌肥厚。另外通過(guò)降低FDS表達(dá)，也減少了甲羥戊酸途徑中膽固醇的產(chǎn)生。本發(fā)明通過(guò)篩選最有效FDS干擾序列，合成其雙鏈DNA，連接到慢病毒骨架質(zhì)粒載體中，與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染工具細(xì)胞(293T細(xì)胞)制備出FDS干擾重組慢病毒載體LV-sh-FDS。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述載體的制備方法，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)針對(duì)FDS基因干擾有效序列的合成、篩選及鑒定；(2)FDS基因干擾慢病毒骨架質(zhì)粒重組載體pGCSIL-sh-FDS的構(gòu)建和鑒定；(3)FDS基因干擾重組慢病毒載體LV-sh-FDS的包裝、收集、純化、鑒定和滴度測(cè)定。步驟(1)中FDS基因有效干擾序列的篩選，主要分以下幾步(a)、購(gòu)買FDScDNA(imaGenes,Germany)，通過(guò)酶切測(cè)序成功克隆GFP-FDS-FLAG融合蛋白質(zhì)粒；(b)按照RNA干擾序列設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)四個(gè)針對(duì)FDS的四個(gè)RNA干擾(RNAi)靶點(diǎn)，靶向序列(TargetSeq)分另Ij為1#:5，-GACAGCTTTCTACTCTTTC-3；2#:5，-CACGCTAATGCCCTGAAGA-3，；3#5’-CTGTAGGAGGCAAGTACAA-3；4#:5’-CTGGTGGAACCAAGGAAAC-3’(FDSmRNANM_031840GenBankGI13929205)，并分別合成其雙鏈DNA，序列分別為1#-15'-GATCCCaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTTCAAGAGAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCttTTTTTGGAT-3'1#-25'-AGCTATCCAAAAAaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTCTCTTGAAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCttGG-3'2#-1:5，-GATCCC-aaCACGCTAATGCCCTGAAGATTCAAGAGATCTTCAGGGCATTAGCGTGttTTTTTGGAT-3’2#-25’-AGCTATCCAAAAAaaCACGCTAATGCCCTGAAGATCTCTTGAATCTTCAGGGCATTAGCGTGttGG-3'3#-1:5’-GATCCCaCTGTAGGAGGCAAGTACAATTCAAGAGATTGTACTTGCCTCCTACAGtTTTTTGGAT-3'3#-2:5’-AGCTATCCAAAAAaCTGTAGGAGGCAAGTACAATCTCTTGAATTGTACTTGCCTCCTACAGtGG-3'4#-1:5，-GATCCCaaCTGGTGGAACCAAGGAAACTTCAAGAGAGTTTCCTTGGTTCCACCAGttTTTTTGGAT-3'4#-2:5，-AGCTATCCAAAAAaaCTGGTGGAACCAAGGAAACTCTCTTGAAGTTTCCTTGGTTCCACCAGttGG-3’；并合成陰性對(duì)照(NC)，DNA片段信息如下NC-I:5，-GATCCCCTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTT-3，；NC-2:5，-AGCTAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAAGGG-3’。然后連接到酶切后的質(zhì)粒pGC-Ue/Neo/DsRed(質(zhì)粒載體含有RFP紅色熒光標(biāo)記，便于觀察)。pGC-U6/Neo/DsRed重組載體構(gòu)建框架NO.5，STEMPLoopSTEMP1#-1GATCCCaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTTCAAGAGAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCttTTTTTGGAT1#-2AGCTATCCAAAAAaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTCTCTTGAAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCttGG2#_1GATCCCaaCACGCTAATGCCCTGAAGATTCAAGAGATCTTCAGGGCATTAGCGTGttTTTTTGGAT2#_2AGCTATCCAAAAAaaCACGCTAATGCCCTGAAGATCTCTTGAATCTTCAGGGCATTAGCGTGttGG3#_1GATCCCaCTGTAGGAGGCAAGTACAATTCAAGAGATTGTACTTGCCTCCTACAGtTTTTTGGAT3#_2AGCTATCCAAAAAaCTGTAGGAGGCAAGTACAATCTCTTGAATTGTACTTGCCTCCTACAGtGG4#-lGATCCCaaCTGGTGGAACCAAGGAAACTTCAAGAGAGTTTCCTTGGTTCCACCAGttTTTTTGGAT3#_2AGCTATCCAAAAAaaCTGGTGGAACCAAGGAAACTCTCTTGAAGTTTCCTTGGTTCCACCAGttGGNC-IGATCCCCTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTNC-2AGCTAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAAGGG(c)將構(gòu)建好的FDS融合蛋白和四個(gè)不同靶點(diǎn)的RNAi載體質(zhì)粒或陰性對(duì)照質(zhì)粒(NS，編碼無(wú)序序列，無(wú)干擾效果)，共同轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)狀態(tài)良好的工具細(xì)胞293T細(xì)胞，36到48小時(shí)后分別采用免疫熒光及免疫印跡的方法觀察GFP/RFP表達(dá)和檢測(cè)FLAG蛋白的表達(dá)情況，判斷不同靶點(diǎn)的干擾效果。步驟(2)中，本發(fā)明采用的慢病毒載體構(gòu)建系統(tǒng)(吉?jiǎng)P，上海)由骨架質(zhì)粒pGCSIL-GFP，攜帶病毒gag、pol、及rev基因的輔助質(zhì)粒pHelper1.0及含有NSN-G的輔助質(zhì)粒pHelper2.0組成。FDS干擾質(zhì)粒pGCSIL-sh_FDS的構(gòu)建和鑒定步驟在前(1)外源篩靶結(jié)果中獲得最有效序列為1#設(shè)計(jì)并合成其shRNA的雙鏈DNA。1^'-CcggaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTTCAAGAGAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCttTTTTTg-3‘；2:5’-aattcaaaaaaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTCTCTTGAAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCtt-3，，與pGCSIL-GFP慢病毒骨架質(zhì)粒載體連接。連接后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5大腸桿菌后PCR及測(cè)序鑒定(上海美季公司)。PCR鑒定陽(yáng)性克隆的引物為Primer:Up:5，-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3‘；Down:5，-GTAATACGGTTATCCACGCG-3。慢病毒骨架質(zhì)粒重組載體構(gòu)建框架<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>連接產(chǎn)物PCR鑒定循環(huán)條件<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>步驟(3)FDS干擾重組慢病毒載體LV-sh-FDS的包裝、收集、純化、鑒定和滴度測(cè)定。高純度無(wú)內(nèi)毒素抽提三種質(zhì)粒pGCSIL-GFP，pHelper1.0和pHelper2.0，制備三種DNA溶液吸取pGCSIL-sh-FDS(20μg)，pHelper1.0(15μg)和pHelper2.0(10μg)按Invitrogen公司Lipofectamine2000使用說(shuō)明進(jìn)行共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立重組病毒的陽(yáng)性對(duì)照。轉(zhuǎn)染后8h更換為完全培養(yǎng)基，于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液。本發(fā)明的再一目的是提供該基因藥物L(fēng)V-sh-FDS在心肌肥厚中的應(yīng)用。在AngII(1μΜ)誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥厚模型中，LV-sh-FDS的應(yīng)用在有效抑制FDS表達(dá)的同時(shí)，有效逆轉(zhuǎn)了心肌細(xì)胞對(duì)血管緊張素II所致的心肌肥厚反應(yīng)(具體包括細(xì)胞面積減小，β-MHC、BNP等肥厚標(biāo)記基因的減少等)。在自發(fā)性高血壓大鼠中通過(guò)心肌注射LV-sh-FDS，在降低心肌組織FDS表達(dá)水平的同時(shí)也減輕了i3_MHC、BNP等肥厚標(biāo)記基因的表達(dá)，并部分逆轉(zhuǎn)心臟指數(shù)包括全心/體重(HW/BW)、左室重/體重(LVW/BW)，不同程度改善了心超指標(biāo)IVSD，EF,FSLV-sh-FDS除了應(yīng)用于基因治療外，還能夠用于小G蛋白相關(guān)的研究，例如通過(guò)western及Rho活性試劑盒檢測(cè)到，LV-sh-FDS預(yù)孵育心肌細(xì)胞能有效抑制AngII(IyM)誘導(dǎo)的RhoA活性增加，總RhoA蛋白的表達(dá)量沒(méi)有改變，進(jìn)而揭示了在AngII(IyM)誘導(dǎo)的心肌肥厚中，F(xiàn)DS與RhoA之間的關(guān)系。LV-sh-FDS也能用于研究甲羥戊酸途徑中的關(guān)鍵酶FDS的功能，例如通過(guò)商業(yè)化試劑盒發(fā)現(xiàn)自發(fā)性高血壓大鼠血清中的總膽固醇水平(TC)，低密度脂蛋白(LDL-C)得到下降，同時(shí)肝臟組織中FDS也得到了抑制。本發(fā)明的載體能有效轉(zhuǎn)染細(xì)胞或組織后特異性降低FDS基因的表達(dá)，從而應(yīng)用于基因治療或基因功能研究。本發(fā)明提供的LV-sh-FDS最重要特征在于提供靶向性FDS抑制效應(yīng)，并用重組慢病毒載體作為載體，使得干擾效果得到持續(xù)性作用。整個(gè)制備過(guò)程全部使用質(zhì)粒，避免傳統(tǒng)方法腺病毒污染。本發(fā)明中針對(duì)的靶基因FDS是甲羥戊酸途徑中的關(guān)鍵酶，也是異戊二烯途徑中的關(guān)鍵酶，產(chǎn)生的異戊二烯化中間產(chǎn)物為小G蛋白家族包括RhoA活化及功能學(xué)提供了重要的底物。甲羥戊酸途徑是哺乳動(dòng)物體內(nèi)膽固醇合成的唯一途徑。通過(guò)抑制FDS的表達(dá)進(jìn)而降低RhoA的活性，從而有效抑制AngII相關(guān)的心肌肥厚。另外通過(guò)降低FDS表達(dá)，也減少了甲羥戊酸途徑中膽固醇的產(chǎn)生。同時(shí)本發(fā)明的LV-sh-FDS帶有熒光標(biāo)記EGFP便于檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)表明，LV-sh-FDS可以有效的轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞及心肌組織，細(xì)胞水平轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明MOI為20時(shí)，心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率可以達(dá)到80%以上。同時(shí)給藥途徑可采用直接心肌注射也可靜脈給藥冠脈給藥等多種方式。本發(fā)明的藥效實(shí)驗(yàn)表明，LV-sh-FDS能有效抑制心肌細(xì)胞及心肌組織中FDS基因的表達(dá)。本發(fā)明的有益之處是1本發(fā)明針對(duì)FDS靶基因根據(jù)在線原則設(shè)計(jì)出四個(gè)有效干擾序列，為克服原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低及靶基因無(wú)商業(yè)化抗體，構(gòu)建出四個(gè)FDS干擾質(zhì)粒與FDS融合基因質(zhì)粒通過(guò)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記蛋白篩選出最有效干擾片段，并在靶細(xì)胞中得到驗(yàn)證，為進(jìn)一步有關(guān)FDS基因研究奠定良好實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。2.本發(fā)明中在構(gòu)建出最有效的FDS干擾質(zhì)?；A(chǔ)上進(jìn)一步通過(guò)重組的慢病毒干擾載體構(gòu)建系統(tǒng)，構(gòu)建包裝獲得LV-sh-FDS，不僅克服非病毒載體的低轉(zhuǎn)染效率，也避免了重組腺病毒產(chǎn)生的免疫原性，表達(dá)時(shí)間較短等缺點(diǎn)，這種重組的慢病毒載體是“自殺性”病毒比較安全能整合到宿主的基因組中，使得干擾作用更加持續(xù)，能廣泛用于體內(nèi)基因治療及基因功能研究。3.本發(fā)明中的LV-sh-FDS本身帶有EGFP標(biāo)記在轉(zhuǎn)染后表達(dá)“增強(qiáng)熒光蛋白”便于轉(zhuǎn)染后的檢測(cè)快捷方便。4.本發(fā)明構(gòu)建的LV-sh-FDS能有效轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，F(xiàn)DS的mRNA水平得到明顯抑制(78.56%)，心肌細(xì)胞對(duì)AngII(IyM)誘導(dǎo)的肥厚反應(yīng)得到了明顯的抑制。在自發(fā)性高血壓大鼠心肌注射LV-sh-FDS11周后，F(xiàn)DS的mRNA水平得到抑制(37.25%)的同時(shí)，肥厚基因β-MHC、BNP得到明顯抑制，心臟指數(shù)(冊(cè)/BW，LVW/BW)部分逆轉(zhuǎn)，同時(shí)心超指標(biāo)(IVSD,EF,FS%)得到部分改善。預(yù)示該載體為心肌肥厚的研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)資源。5.本發(fā)明LV-sh-FDS心肌注射有效轉(zhuǎn)染心肌組織，肥厚反應(yīng)改善的同時(shí)，血清TCLDL-C也有不同程度減輕，肝臟組織FDS水平也能有效抑制，預(yù)示LV-sh-FDS可能通過(guò)血液循環(huán)影響肝臟FDS的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控膽固醇代謝，預(yù)示該載體可以通過(guò)心肌注射靜脈注射冠脈注射等多種方式實(shí)施。6.本發(fā)明能有效轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞，在MOI為20時(shí)，轉(zhuǎn)染效率可以達(dá)到80%以上，活體研究中心肌注射LV-sh-FDS得到高效表達(dá)，適用于細(xì)胞活體內(nèi)基因功能研究及基因治療等領(lǐng)域的應(yīng)用。圖1為pGC_U6/Neo/DsRed載體結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為pEGFP-Cl載體結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為慢病毒骨架質(zhì)粒pGCSIL-GFP載體結(jié)構(gòu)示意圖。圖4為外源篩靶有效靶點(diǎn)干擾效果圖片。圖5為pGCSIL-sh-FDS瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖。圖6為pGCSIL-sh-FDS測(cè)序鑒定圖。圖7為L(zhǎng)V-sh-FDS在心肌細(xì)胞及心肌組織中的轉(zhuǎn)染效率圖片。圖8為L(zhǎng)V-sh-FDS有效下調(diào)心肌細(xì)胞/組織中FDSmRNA圖片。圖9為L(zhǎng)V-sh-FDS有效改善血管緊張素II相關(guān)的心肌細(xì)胞肥厚反應(yīng)圖片。圖10為L(zhǎng)V-sh-FDS改善自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥厚反應(yīng)圖片。圖11為L(zhǎng)V-sh-FDS影響自發(fā)性高血壓大鼠心臟超聲圖片。圖12為L(zhǎng)V-sh-FDS影響RhoA活性及表達(dá)的圖片。圖13為L(zhǎng)V-sh-FDS影響自發(fā)性高血壓大鼠肝臟FDSmRNA圖片。具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1:FDS融合基因質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染工具細(xì)胞篩選FDS干擾最有效靶序列siRNA—、按照設(shè)計(jì)原則，根據(jù)在線RNAi系列設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)4個(gè)干擾靶點(diǎn)，并合成其雙鏈DNA連接到BamHI和HindIII酶切線性化的pGC-U6/Neo/DsRed載體(購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，參見(jiàn)圖1)后鑒定正確的克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提備用。靶點(diǎn)序列(TargetSeq)如下1#:GACAGCTTTCTACTCTTTC2#:CACGCTAATGCCCTGAAGA3#:CTGTAGGAGGCAAGTACAA4#:CTGGTGGAACCAAGGAAAC同時(shí)各自的DNA合成片段信息如下1#-1:5，-GATCCCaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTTCAAGAGAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCttTTTTTGGAT-3'1#-25'-AGCTATCCAAAAAaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTCTCTTGAAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCttGG-3'2#-1:5，-GATCCC-aaCACGCTAATGCCCTGAAGATTCAAGAGATCTTCAGGGCATTAGCGTGttTTTTTGGAT-3’2#-2:5，-AGCTATCCAAAAAaaCACGCTAATGCCCTGAAGATCTCTTGAATCTTCAGGGCATTAGCGTGttGG-3'3#-1:5，-GATCCCaCTGTAGGAGGCAAGTACAATTCAAGAGATTGTACTTGCCTCCTACAGtTTTTTGGAT-3'3#-2:5，-AGCTATCCAAAAAaCTGTAGGAGGCAAGTACAATCTCTTGAATTGTACTTGCCTCCTACAGtGG-3'4#-1:5，-GATCCCaaCTGGTGGAACCAAGGAAACTTCAAGAGAGTTTCCTTGGTTCCACCAGttTTTTTGGAT-3'4#-2:5，-AGCTATCCAAAAAaaCTGGTGGAACCAAGGAAACTCTCTTGAAGTTTCCTTGGTTCCACCAGttGG-3’，并合成陰性對(duì)照(NC)，DNA片段信息如下NC-15，-GATCCCCTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTT-3，；NC-2:5，-AGCTAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAAGGG-3，。二、FDS融合蛋白質(zhì)粒載體的制備購(gòu)買FDScDNA文庫(kù)(imaGenes，Germany)，利用PCR方法釣取其目的基因與表達(dá)載體pEGFP-ClVector(clonetech，#632465，參見(jiàn)圖2)分別進(jìn)行雙酶切后定向連接并在表達(dá)載體的C端加上FLAG標(biāo)記蛋白，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行PCR鑒定測(cè)序分析比對(duì)正確構(gòu)建成功的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒載體PEGFP-FDS-FLAG，并進(jìn)行超純?nèi)?nèi)毒素抽提備用。三、外源共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞篩選FDSRNAi最有效靶序列培養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的工具細(xì)胞(即293T細(xì)胞)，將構(gòu)建好的FDS過(guò)表達(dá)融合基因質(zhì)粒(Iyg)和針對(duì)不同靶點(diǎn)的RNAi載體質(zhì)粒(Iyg)及陰性參照質(zhì)粒(lyg)，按Invitrogen公司的Iipofectamine2000使用說(shuō)明共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，36h后在熒光顯微鏡下觀察GFP/RFP的表達(dá)，初步判斷不同靶點(diǎn)的干擾效果，同時(shí)轉(zhuǎn)染效率大于70%以上的實(shí)驗(yàn)組才可進(jìn)入后續(xù)檢測(cè)，48h后采用Westernblot的方法同時(shí)檢測(cè)FLAG蛋白的表達(dá)情況，進(jìn)而進(jìn)一步確認(rèn)最有效的靶點(diǎn)為1號(hào)(參見(jiàn)圖4)。圖4中A免疫熒光觀察293細(xì)胞過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染GFP/RFP的變化，其中a綠色熒光(GFP)，b紅色熒光(RFP)，c平光顯微鏡；B:ffestern-blot檢測(cè)293細(xì)胞過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒蛋白共轉(zhuǎn)染后FLAG蛋白改變，其中OV過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，NC陰性病毒轉(zhuǎn)染組，α-Tubilin:內(nèi)參照。實(shí)施例2慢病毒重組質(zhì)粒pGCSIL-sh-FDS的構(gòu)建和鑒定外源篩靶獲得的最有效靶序列為1號(hào)GACAGCTTTCTACTCTTTC，合成其shRNA的雙鏈DNA，合成片段信息如下1:CcggaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTTCAAGAGAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCttTTTTTg；2:aattcaaaaaaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTCTCTTGAAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCtt。連接到經(jīng)AgeI和EcoRI雙酶切后的線性pGCSIL-GFP載體(購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，參見(jiàn)圖3)，連接反應(yīng)體系酶切回收的載體DNAdOOng/μ1)1μ1，退火的雙鏈DNA(100ng/y1)1μ1，10ΧΤ4噬菌體DNA連接酶緩沖液1μ1，Τ4噬菌體DNA連接酶1μ1，(ΜΗ207μ1，于4°C連接12h后，然后37°C培養(yǎng)16h轉(zhuǎn)化到DH5大腸桿菌，提取陽(yáng)性克隆菌后行PCR及測(cè)序鑒定。PCR鑒定陽(yáng)性克隆的引物為Primer=Up5，-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3，；Down5'-GTAATACGGTTATCCACGCG-3，細(xì)菌克隆的PCR產(chǎn)物鑒定結(jié)果(圖5)和測(cè)序結(jié)果(圖6)確證了pGCSIL-sh-FDS插入方向和序列的正確性。測(cè)序后進(jìn)行陽(yáng)性克隆質(zhì)粒抽提，獲得的重組質(zhì)粒pGCSIL-sh-FDS，用于制備慢病毒載體。圖5中泳道1是陰性對(duì)照(ddH20)，泳道2是陰性對(duì)照(空載體組)306bp，泳道3是MarkerIOkb,8kb,6kb,5kb,4kb,3.5kb，3kb，2.5kb，2kb，1.5kb,lkb,750bp,500bp,250bp,泳道4-8是連接入pGCSIL-shFDS載體的陽(yáng)性克隆343bp。PCR循環(huán)條件(表2):940C30sec94°C30secη60°C30secL30cycle72°C30secJ72°C6min實(shí)施例3=FDS基因RNA干擾重組慢病毒載體(LV_sh_FDS)的制備本慢病毒載體構(gòu)建系統(tǒng)(購(gòu)于上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司)由骨架質(zhì)粒載體pGCSIL-GFP，攜帶病毒gag、pol、及rev基因的輔助質(zhì)粒pHelperl.0及含有NSN-G的輔助質(zhì)粒pHelper2.0組成。制備編碼慢病毒顆粒的重組病毒質(zhì)粒及輔助質(zhì)粒即pGCSIL-sh-FDS，pHelperl.0和pHelper2.0質(zhì)粒，分別進(jìn)行高純度無(wú)內(nèi)毒素抽提。吸取質(zhì)粒pGCSIL-sh-FDS(20μg)，pHelper1·O(15μg)禾口pHelper2·O(10μg),按Invitrogen公司Lipofectamine2000使用說(shuō)明進(jìn)行共轉(zhuǎn)染293Τ細(xì)胞成功包裝FDS)基因RNA干擾重組慢病毒(LV_sh_FDS)，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照，即pGCSIL-NS(陰性參照)(20μg)，pHelper1.0(15μg)和pHelper2.O(10μg)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞構(gòu)建陰性對(duì)照重組慢病毒載體，轉(zhuǎn)染后8h更換為完全培養(yǎng)基，于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液。4°C，4000g離心IOmin除去細(xì)胞碎片后并以0.45μM濾器過(guò)濾上清液獲得慢病毒備用可滿足一般細(xì)胞試驗(yàn)。若要獲得較高濃度的慢病毒可對(duì)其進(jìn)一步濃縮純化后得到高滴度的慢病毒濃縮液，分裝病毒濃縮液-80度長(zhǎng)期保存，取其中一支進(jìn)行病毒生物學(xué)滴度測(cè)定。實(shí)施例4=FDS基因RNA干擾重組慢病毒載體(LV_sh_FDS)用于血管緊張素II相關(guān)的心肌肥厚模型基因治療研究。一、LV-sh-FDS在體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞肥厚的應(yīng)用取1-3日齡新生WKYs鼠的心室剪成lmm2左右小塊碎，同時(shí)用0.125%胰酶與0.05%膠原酶II型混合物重復(fù)消化，200目鋼網(wǎng)過(guò)濾IOOOg離心6min后收集細(xì)胞，5%CO2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)Ih后，除去貼壁細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整至5X10E5-1X10E6/mL接種于六孔板種培養(yǎng)。按照病毒與細(xì)胞比值(MOI)為20加入LV-sh-FDS及陰性病毒顆粒(對(duì)照)，感染乳鼠心肌細(xì)胞，24h后換完全培養(yǎng)基，感染48h后在熒光顯微鏡下通過(guò)觀察GFP表達(dá)判斷轉(zhuǎn)染效率(效率約80%以上)，參見(jiàn)圖7A，感染72h后換無(wú)血清培養(yǎng)基24h后加入AngII(1μΜ)孵育24h后結(jié)束實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示LV_sh-FDS有效抑制乳鼠心肌細(xì)胞中FDS的表達(dá)，Ang11(1μΜ)共孵時(shí)這種抑制作用更加明顯，陰性病毒顆粒對(duì)FDS的表達(dá)沒(méi)有影響，參見(jiàn)圖8A(i)。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LV-sh-FDS能有效抑制心肌細(xì)胞對(duì)AngII(1μM)的肥厚反應(yīng)，表現(xiàn)為細(xì)胞面積的逆轉(zhuǎn)及肥厚基因ΒΝΡ、β-MHC表達(dá)的下調(diào)。參見(jiàn)圖9;另外預(yù)孵LV-sh-FDS可以明顯抑制AngII(1μM)(孵育15min)誘導(dǎo)的RhoA活性增加，RhoA蛋白表達(dá)量不改變，參見(jiàn)圖12。圖7A免疫熒光鏡觀察轉(zhuǎn)染后的心肌細(xì)胞(IOX)(Μ0Ι=20)；Bjestern-blot檢測(cè)心肌組織中GFP蛋白表達(dá)，其中a:SHR大鼠未注射病毒液組，b:SHR大鼠陰性病毒轉(zhuǎn)染組，c:SHR大鼠干擾病毒敲除組，d:WKY大鼠組。圖8數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤表示。圖8A細(xì)胞水平其中1:未轉(zhuǎn)染組，2:陰性病毒轉(zhuǎn)染組，3干擾病毒敲除組，4陰性病毒轉(zhuǎn)染心肌肥厚模型組(AngII孵育)，5干擾病毒轉(zhuǎn)染心肌肥厚模型(AngII孵育)，sP<0.05and##P<0.Olvs.2group.**P<0.01vs.4group；圖8B心肌組織，其中b:SHR大鼠陰性病毒轉(zhuǎn)染組，c:SHR大鼠干擾病毒敲除組，d=WKY大鼠組，*P<0.05and**P<0.01vs.bgroup。圖9的數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤表示。圖9中A細(xì)胞面積，B肥厚標(biāo)記基因β-MHC，C肥厚標(biāo)記基因BNP；其中橫坐標(biāo)的1是陰性病毒感染組，2是干擾病毒敲除組；##Ρ<0.01vs.1group(AngII-)and**P<0.01vs.1group(Ang11+)。圖12的數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤表示。圖中1陰性病毒轉(zhuǎn)染組，2陰性病毒轉(zhuǎn)染心肌肥厚模型組(AngII孵育)，3干擾病毒轉(zhuǎn)染心肌肥厚模型組(AngII孵育)。sP<0.05vs.1groupand*P<0.05vs.2group。二、LV-sh-FDS用于自發(fā)性高血壓大鼠(SHRs)心肌肥厚的研究7周齡SHR大鼠共12只及7周齡WKYs大鼠6只入組，水合氯醛(400mg/kg/mg)腹腔注射全身麻醉，取仰臥位，氣管切開(kāi)，連接動(dòng)物呼吸機(jī)，打開(kāi)胸腔，暴露心臟，吸取LV-sh-FDS或者陰性病毒顆粒SOuL(約5XIO7TU)于心尖及左心室壁取3-4點(diǎn)注射重組病毒，其中WKYs大鼠心肌注射以同劑量生理鹽水以正常對(duì)照。關(guān)閉胸腔，撤除呼吸機(jī)。大鼠清醒后于清潔級(jí)環(huán)境普通飼料飼養(yǎng)11周后予以心臟超聲檢查，大鼠稱重后取心臟稱重留取左心室予以逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)FDS、BNP、β-MHC的基因檢測(cè)。結(jié)果顯示LV_sh-FDS能明顯下調(diào)FDS的轉(zhuǎn)錄(圖8B)，同時(shí)肥厚基因ΒΝΡ、β-MHC降低，心臟指數(shù)(HW/BW和LVW/BW)部分減輕，參見(jiàn)圖10。另外心超結(jié)果也有不同程度的改善，參見(jiàn)圖11。圖10數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤表示。圖10的A:HW/BW(心臟重/體重)，B:LVW/Bff(左室重/體重)，C肥厚標(biāo)記基因β-MHC,D肥厚標(biāo)記基因BNP。各圖中b:SHR大鼠陰性病毒轉(zhuǎn)染組，c:SHR大鼠干擾病毒敲除組，d:WKY大鼠組；#P<0.05vs.dgroup。*P<0.05and**P<0.01vs.bgroup。圖11數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤表示。圖11的A:IVSD(舒張末期室間隔壁厚度)，BLVPWD(舒張末期心室后壁厚度)，C:FS(短軸縮短率)，D:EF(射血分?jǐn)?shù))。各圖中b:SHR大鼠陰性病毒轉(zhuǎn)染組，c:SHR大鼠干擾病毒敲除組，d:WKY大鼠陰性對(duì)照組。sP<0.05and##P<0.01vs.dgroup；*P<0.05and**P<0.01vs.bgroup。實(shí)施例5LV-sh-FDS在膽固醇代謝調(diào)控中的研究7周齡SHR大鼠共12只及7周齡WKYs大鼠6只入組，水合氯醛(400mg/kg/mg)腹腔注射全身麻醉，取仰臥位，氣管切開(kāi)，連接動(dòng)物呼吸機(jī)，打開(kāi)胸腔，暴露心臟，吸取LV-sh-FDS或者陰性病毒顆粒SOuL(約5XIO7TU)于心尖及左心室壁取3-4點(diǎn)注射重組病毒，其中WKYs大鼠心肌注射以同劑量生理鹽水以正常對(duì)照。關(guān)閉胸腔，撤除呼吸機(jī)。大鼠清醒后于清潔級(jí)環(huán)境普通飼料飼養(yǎng)11周后取大鼠全血，3000g離心15min后取血清分裝后置-80度保存。取500uL血清檢測(cè)大鼠血清膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)。結(jié)果顯示LV-sh-FDS心肌注射有效轉(zhuǎn)染心肌組織，肥厚反應(yīng)改善的同時(shí)，血清TCLDL-C有不同程度減輕，同時(shí)肝臟組織FDSmRNA水平也得到有效抑制，分別參見(jiàn)表1和圖13，預(yù)示LV-sh-FDS可能通過(guò)血液循環(huán)影響肝臟FDS的表達(dá)，進(jìn)而影響膽固醇代謝，血清膽固醇濃度下降，也預(yù)示該載體可能可以通過(guò)心肌注射靜脈注射冠脈注射等多種方式實(shí)施。表1:LV-sh-FDS影響自發(fā)性高血壓大鼠血清膽固醇數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤表示；b:SHR大鼠陰性病毒轉(zhuǎn)染組；c:SHR大鼠干擾病毒敲除組；d=WKY大鼠陰性對(duì)照組。；#P<0.05and##P<0.01vs.dgroupand*P<0.05vs.bgroup。圖13中b:SHR大鼠陰性病毒轉(zhuǎn)染組，c:SHR大鼠干擾病毒敲除組，d:WKY大鼠陰性對(duì)照組。sP<0.01vs.dgroupand*P<0.05vs.bgroup。本發(fā)明涉及的序列<110>浙江大學(xué)<120>法呢基焦磷酸合成酶RNA干擾慢病毒載體構(gòu)建及用途<160>14<210>1<211>66<212>DNA<213>人工序列<220><221>Targetseq<222>9-27<223>人工設(shè)計(jì)的正義鏈<400>1gatcccaagacagctttctactctttcttcaagagagaaagagtagaaagctgtctttttttggat66<210>2<211>66<212>DNA<213>人工序列<220><221>Targetseq<222>16-34<223>人工設(shè)計(jì)的反義鏈<400>2Agctatccaaaaaaagacagctttctactctttctctcttgaagaaagagtagaaagctgtcttgg66<210>3<211>66<212>DNA<213>人工序列<220><221>Targetseq<222>9-27<223>人工設(shè)計(jì)的正義鏈<400>3Gatcccaacacgctaatgccctgaagattcaagagatcttcagggcattagcgtgtttttttggat66<210>4<211>66<212>DNA<213>人工序列<220><221>Targetseq<222>16-34<223>人工設(shè)計(jì)的反義鏈<400>4Agatatccaaaaaaacacgctaatgccctgaagatctcttgaatcttcagggcattagcgtgttgg66<210>5<211>64<212>DNA<213>人工序列<220><221>Targetseq<222>8-26<223〉人工設(shè)計(jì)的正義鏈<400>5Gatcccactgtaggaggcaagtacaattcaagagattgtacttgcctcctacagttttttggat64<210>6<211>64<212>DNA<213>人工序列<220><221>Targetseq<222>15-33<223>人工設(shè)計(jì)的反義鏈<400>6Agctatccaaaaaactgtaggaggcaagtacaatctcttgaattgtacttgcctcctacagtgg64<210>7<211>66<212>DNA<213>人工序列<220><221>Targetseq<222>9-27<223>人工設(shè)計(jì)的正義鏈<400>7Gatcccaactggtggaaccaaggaaacttcaagagagtttccttggttccaccagtttttttggat66<210>8<211>66<212>DNA<213>人工序列<220><221>Targetseq.<222>16-34<223>人工設(shè)計(jì)的反義鏈<400>8Agctatccaaaaaaactggtggaaccaaggaaactctcttgaagtttccttggttccaccagttgg66<210>9<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><221>Targetseq<222>8-26<223>人工設(shè)計(jì)的正義鏈<400>9Gatccccttctccgaacgtgtcacgtttcaagagaacgtgacacgttcggagaatttttt60<210>10<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><221>Targetseq<222>8-26<223>人工設(shè)計(jì)的反義鏈<400>10Agctaaaaaattctccgaacgtgtcacgttctcttgaaacgtgacacgttcggagaaggg60<210>11<211>61<212>DNA<213>人工序列<220><221>Targetseq<222>7-25<223>人工設(shè)計(jì)的正義鏈<400>11Ccggaagacagctttctactctttcttcaagagagaaagagtagaaagctgtctttttttg61<210>12<211>61<212>DNA<213>人工序列<220><221>Targetseq<222>13-31<223>人工設(shè)計(jì)的反義鏈<400>12Aattcaaaaaaagacagctttctactctttctctcttgaagaaagagtagaaagctgtctt61<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>用于PCR反應(yīng)的上游引物<400>13Cctatttcccatgattccttcata24<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>用于PCR反應(yīng)的下游引物<400>14Gtaatacggttatccacgcg20權(quán)利要求一種針對(duì)法呢基焦磷酸合成酶RNA干擾重組慢病毒載體，其特征在于，所述載體含有慢病毒骨架質(zhì)粒重組載體pGCSIL-sh-FDS，所述的重組載體是在p-GCSIL-GFP骨架質(zhì)粒載體的MCS中連接了針對(duì)shRNA的雙鏈DNA片段，針對(duì)的靶序列為1#-GACAGCTTTCTACTCTTTC，合成的DNA片段信息為1#-15’-CcggaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTTCAAGAGAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCttTTTTTg-3’，1#-25’-aattcaaaaaaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTCTCTTGAAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCtt-3’。2.一種針對(duì)法呢基焦磷酸合成酶RNA干擾重組慢病毒載體制備方法，其特征在于，根據(jù)FDSmRNA序列，設(shè)計(jì)合成了針對(duì)shRNA的雙鏈DNA片段如下正義鏈5，-CcggaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTTCAAGAGAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCttTTTTTg-3，反義鏈5’-aattcaaaaaaaGACAGCTTTCTACTCTTTCTCTCTTGAAGAAAGAGTAGAAAGCTGTCtt-3'然后將上述DNA片段連接到慢病毒骨架質(zhì)粒載體pGCSIL-GFP中MCS中建成pGCSIL-sh-FDS重組載體，再將pGCSIL-sh-FDS重組載體、pHelper1.OpHelper2.0共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得所述的重組慢病毒載體(LV-sh-FDS)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的針對(duì)FDS基因的RNA干擾的重組慢病毒載體的制備方法，其特征在于，在合成的DNA片段末端引入AgeI和EcoRI酶切位點(diǎn)。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的針對(duì)FDS基因的RNA干擾重組慢病毒載體的制備方法，其特征在于，用AgeI和EcoRI酶將pGCSIL-GFP酶切消化，回收大片段后將其與DNA片段連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌，獲得重組陽(yáng)性克隆。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的針對(duì)法呢基焦磷酸合成酶RNA干擾重組慢病毒載體在制備治療心肌肥厚藥物中的應(yīng)用。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的針對(duì)法呢基焦磷酸合成酶RNA干擾重組慢病毒載體在制備膽固醇代謝調(diào)控藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供一種針對(duì)法呢基焦磷酸合成酶RNA干擾重組慢病毒載體的構(gòu)建，在工具細(xì)胞293T細(xì)胞中篩選出FDS基因RNAi最有效靶序列，合成最有效靶序列的雙鏈DNA連接到pGCSIL-GFP載體，通過(guò)酶切測(cè)序鑒定成功構(gòu)建該重組載體。研究表明所構(gòu)建的RNA干擾載體LV-sh-FDS在新生乳鼠心肌細(xì)胞中可下調(diào)FDSmRNA水平的表達(dá)，同時(shí)也能下調(diào)心肌肥厚標(biāo)記如細(xì)胞面積和標(biāo)記基因beta-MHC及BNP的表達(dá)，另外在下調(diào)FDS的同時(shí)也能有效抑制RhoA的活性，可在制備治療心肌肥厚疾病的藥物中應(yīng)用。也可在制備膽固醇代謝調(diào)控藥物中的應(yīng)用。文檔編號(hào)C12N15/113GK101805750SQ200910156609公開(kāi)日2010年8月18日申請(qǐng)日期2009年12月29日優(yōu)先權(quán)日2009年12月29日發(fā)明者葉煬,胡申江申請(qǐng)人:浙江大學(xué)