專(zhuān)利名稱：人幾丁質(zhì)酶,其重組生產(chǎn),其分解幾丁質(zhì)的用途及其在治療和預(yù)防感染性疾病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于抗含幾丁質(zhì)的生物體感染的人類(lèi)個(gè)體的治療和預(yù)防領(lǐng)域，以及生產(chǎn)用于上述療法的物質(zhì)的重組DNA技術(shù)。本發(fā)明還與另幾方面有關(guān)如診斷、基因治療，從含幾丁質(zhì)的藥物載體或植入物的受控藥物釋放；化妝品，牙用品，甚至食品。
背景技術(shù)：
感染性疾病與天然防御人類(lèi)經(jīng)常處于被各種病原感染的危險(xiǎn)中，所述的病原例如病毒、細(xì)菌、真菌、原生蟲(chóng)和多細(xì)胞寄生蟲(chóng)。一些相關(guān)的感染性疾病是嚴(yán)重致殘甚至致命的。在哺乳動(dòng)物中存在著被稱作免疫反應(yīng)的針對(duì)這些病原體的許多防御機(jī)制。關(guān)于這個(gè)問(wèn)題可見(jiàn)參考文獻(xiàn)1中的1，2，15和16章。
在天然的(或非適應(yīng)性的)免疫反應(yīng)與適應(yīng)性的免疫反應(yīng)之間是有區(qū)別的。后一類(lèi)的反應(yīng)是對(duì)某一特定病原體具有高度特異性的，并且與感染原的每一次后繼接觸都會(huì)使這一反應(yīng)增強(qiáng)。適應(yīng)性免疫反應(yīng)由各種各樣的淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，天然的免疫反應(yīng)基本上由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。這些更為原始的反應(yīng)不是基于高度特異性識(shí)別作用，只是作為抵抗感染的第一道防線。一類(lèi)重要的巨噬細(xì)胞是長(zhǎng)壽細(xì)胞(單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞)，屬于單核吞噬細(xì)胞。單核細(xì)胞形成于骨髓干細(xì)胞并進(jìn)入血液。當(dāng)分化成各種類(lèi)型的組織巨噬細(xì)胞后，這些細(xì)胞就可以遷移到組織之中。這方面的例子有大腦中的微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，肺中的肺泡巨噬細(xì)胞，肝中的枯否式細(xì)胞，腎中的腎小球膜吞噬細(xì)胞，脾臟巨噬細(xì)胞，淋巴結(jié)駐留及重循環(huán)巨噬細(xì)胞和滑膜細(xì)胞。第二類(lèi)吞噬細(xì)胞由多形核嗜中性粒細(xì)胞形成，它們壽命短暫，而且構(gòu)成了血液淋巴細(xì)胞的主體。
吞噬細(xì)胞在防御中的作用已被很好地證明的是吞噬細(xì)胞在對(duì)細(xì)菌感染的免疫中所起的關(guān)鍵作用。吞噬細(xì)胞被細(xì)菌感染趨化性地吸引，與細(xì)菌的吸附可以通過(guò)多種相互作用，例如補(bǔ)體介導(dǎo)的、抗體介導(dǎo)的、或甘露糖結(jié)合蛋白介導(dǎo)的、或是通過(guò)外源凝集素寡糖的相互作用。隨后，微生物就暴露在吞噬體和溶酶體中的一系列殺傷機(jī)制之下，最重要的是氧依賴性殺傷機(jī)制，它產(chǎn)生超氧離子并隨之產(chǎn)生其它的有毒性的活性氧中間體。最近發(fā)現(xiàn)了在嗜中性粒細(xì)胞中通過(guò)氧化氮途徑的殺傷作用的重要性。氧依賴性殺傷作用的介導(dǎo)是通過(guò)防衛(wèi)因子，小的陽(yáng)離子多肽，溶酶體酶，溶菌酶，和乳肝褐質(zhì)。吞噬細(xì)胞在針對(duì)真菌和寄生蟲(chóng)的免疫作用方面的確切的作用還未十分了解，但認(rèn)為與對(duì)細(xì)菌感染的抵抗作用類(lèi)似。
除了直接殺死微生物之外，巨噬細(xì)胞在對(duì)外來(lái)微生物的免疫方面還起著其它一些重要作用。首先，這些細(xì)胞在呈遞抗原給T淋巴細(xì)胞并隨之引起免疫系統(tǒng)的更進(jìn)一步反應(yīng)上是十分有效的。其次，巨噬細(xì)胞與微生物產(chǎn)物的接觸能夠伴隨著細(xì)胞因子的釋放，影響免疫系統(tǒng)的其它成分。第三，巨噬細(xì)胞應(yīng)答T淋巴細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子。例如，在一些寄生蟲(chóng)感染中，通過(guò)把寄生蟲(chóng)阻擋在發(fā)炎細(xì)胞的囊膜外，可以減輕機(jī)體受到的損傷。這種T淋巴細(xì)胞依賴性過(guò)程導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的局部性富集，這些巨噬細(xì)胞釋放能刺激肉芽組織形成的纖維化因子的釋放并最終導(dǎo)致纖維變性。
對(duì)感染性疾病的干預(yù)對(duì)病原體的天然防御機(jī)制對(duì)防止臨床并發(fā)癥的發(fā)生并非總是有效的，因此，要求對(duì)其(預(yù)防性)干預(yù)。
一種預(yù)防方法是免疫接種，例如，通過(guò)在宿主體內(nèi)預(yù)先接種病原體(或其成分)來(lái)刺激防御機(jī)制。為了達(dá)到效果，疫苗必須誘導(dǎo)來(lái)自產(chǎn)生強(qiáng)烈細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)的相應(yīng)種類(lèi)的T淋巴細(xì)胞的長(zhǎng)期反應(yīng)。雖然接種已被證明對(duì)于某些病原體是有效的，但這種方法也伴隨著一些固有的問(wèn)題。最重要的是，必須避免接種的抗原產(chǎn)生錯(cuò)誤的免疫反應(yīng)，如抑制或甚至自身免疫。對(duì)于某些感染來(lái)說(shuō)，免疫接種需要在特異性的體內(nèi)部位獲得免疫性并由局部免疫或口服免疫進(jìn)行。由于免疫系統(tǒng)的復(fù)雜性，病原體的不均一性，以及部分病原體逃避特異免疫應(yīng)答的能力，對(duì)病原體的有效接種免疫的統(tǒng)一性方法是不可能有的。對(duì)于特殊的感染性疾病的種種對(duì)策仍然在不斷摸索研究。
另外一種干預(yù)感染性疾病的方法是使用藥物，阻止病原體的進(jìn)一步繁殖與存活。就此而論最好是使用在病原體的水平特異性作用而不影響宿主的化合物。這種特異性的基礎(chǔ)在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞與其致病性入侵者之間在組成與需求方面的區(qū)別。青霉素與頭孢菌素是細(xì)菌細(xì)胞壁合成的特異性的抑制劑。氨基糖苷，氯霉素，四環(huán)素，大環(huán)內(nèi)酯是細(xì)菌蛋白質(zhì)合成的抑制因子。利福平，4-喹酮是細(xì)菌DNA復(fù)制的特異性抑制劑。兩性霉素B和制霉菌素通過(guò)結(jié)合真菌細(xì)胞膜上的特異性固醇，引起細(xì)胞成分的流失，而具有殺死真菌的作用。
針對(duì)宿主細(xì)胞中不存在的特異靶來(lái)干預(yù)病原體的藥物學(xué)方法在自然界也是存在的。一個(gè)很好的例子就是水解酶溶菌酶，和在無(wú)脊椎動(dòng)物中一樣，它也存在于脊椎動(dòng)物體內(nèi)。很多細(xì)菌的細(xì)胞壁中含有胞壁酸和N-乙酰葡糖胺的交聯(lián)聚合物。水解酶溶菌酶能夠裂解胞壁酸和N-乙酰葡糖胺殘基之間的糖苷鍵，隨之使細(xì)胞壁解體。而溶菌酶的存在不會(huì)傷害宿主，因?yàn)樵诜羌?xì)菌細(xì)胞內(nèi)不存在類(lèi)似的結(jié)構(gòu)。
幾丁質(zhì)幾丁質(zhì)是一種多糖，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中并不存在，但存在于多種引起人類(lèi)感染疾病的微生物中。因而，幾丁質(zhì)就成為選擇性攻擊這類(lèi)病原體的一個(gè)有吸引力的靶。
幾丁質(zhì)是β(1-4)鍵連接的N-乙酰-D-葡糖胺單位的聚合物。它還可能以不同的比例含有葡萄糖胺單位。主要去乙酰幾丁質(zhì)稱作幾丁糖。關(guān)于此問(wèn)題可參考文獻(xiàn)2-5。
幾丁質(zhì)及其衍生物是地球上含量最豐富的大分子生物產(chǎn)物之一。估計(jì)每年的產(chǎn)量約有一百億至一千億噸。幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)組分，也是幾乎所有無(wú)脊椎動(dòng)物(除了海綿動(dòng)物，大多數(shù)珊瑚蟲(chóng)，和棘皮動(dòng)物)的外骨骼的組分，但不存在于脊椎動(dòng)物和自養(yǎng)生物中。幾丁質(zhì)有很多功能保護(hù)細(xì)胞和生物體免受環(huán)境的機(jī)械或化學(xué)損傷，而且還能保持和確定它們的形態(tài)。N-乙酰葡萄糖胺鏈的長(zhǎng)度可能從100至800單位。聚合物橫向排列形成微纖絲，依靠一條鏈上的糖的氨基與相鄰鏈上的糖的羧基間的強(qiáng)烈的氫鍵作用而穩(wěn)定?？梢宰R(shí)別出幾丁質(zhì)的三種晶狀形態(tài)。在α-幾丁質(zhì)中(是真菌和節(jié)肢動(dòng)物中最豐富的形式)，相鄰的鏈之間是反平行方向排列的。在β-幾丁質(zhì)中是平行方向排列的，而在γ-幾丁質(zhì)中，兩條鏈?zhǔn)瞧叫械?，第三條鏈?zhǔn)欠雌叫械摹Ｔ诩讱ぞV和真菌中微纖絲的直徑常常為20-25nm。在大多數(shù)結(jié)構(gòu)中，幾丁質(zhì)是與其它物質(zhì)結(jié)合在一起，在真菌細(xì)胞壁中結(jié)合的化合物是β-葡聚糖。在動(dòng)物的外骨骼中，幾丁質(zhì)與蛋白質(zhì)的結(jié)合最占優(yōu)勢(shì)。在甲殼綱中基質(zhì)是由于碳酸鈣和磷酸鈣的淤積而變得堅(jiān)硬，在昆蟲(chóng)中基質(zhì)是通過(guò)與酚類(lèi)衍生物的革化而變得堅(jiān)硬的。在原生動(dòng)物中的幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)中還存在著糖蛋白與粘多糖。
幾丁質(zhì)及有關(guān)化合物有很多應(yīng)用，脫乙酰幾丁質(zhì)用作繩索、纖維、膠片和凝膠的成分。在農(nóng)用工業(yè)中，莊稼可以用含幾丁質(zhì)衍生物的薄膜保護(hù)，免受真菌的傷害。在食品工業(yè)中，脫乙酰幾丁質(zhì)用來(lái)制備果汁和可溶性咖啡。日常工業(yè)品生產(chǎn)的香波，膠質(zhì)，冰激淋甚至海綿中都用了脫乙酰幾丁質(zhì)。在制藥工業(yè)和醫(yī)學(xué)上，脫乙酰幾丁質(zhì)可用于制造隱形眼鏡片，藥物賦形劑和燒傷敷料。
幾丁質(zhì)合成與幾丁質(zhì)酶對(duì)其的降解真菌中的幾丁質(zhì)合成了解得最清楚，基本的前體是從葡萄糖合成的UDP-N-乙酰葡萄糖胺。幾丁質(zhì)合成酶作為轉(zhuǎn)膜蛋白被運(yùn)輸透過(guò)細(xì)胞膜后將從供體UDP-N-乙酰葡萄糖胺上得到的N-乙酰葡萄糖胺加到形成中的多糖鏈上。真菌的合成酶可以被UDP-N-乙酰葡萄糖胺的類(lèi)似物，多氧菌素(由可可鏈霉菌產(chǎn)生)和煙霉素(由唐德鏈霉菌產(chǎn)生)競(jìng)爭(zhēng)性地抑制。
其它物種中的幾丁質(zhì)合成還未十分明白。有人說(shuō)在昆蟲(chóng)和甲殼綱中，幾丁質(zhì)的合成起始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)的糖基化，幾丁質(zhì)長(zhǎng)鏈在高爾基體內(nèi)加到該蛋白質(zhì)上，該幾丁質(zhì)蛋白質(zhì)隨后被運(yùn)出到細(xì)胞表面。在節(jié)肢動(dòng)物中的幾丁質(zhì)合成似乎是涉及脂質(zhì)連接的中間體的兩步驟過(guò)程。節(jié)肢動(dòng)物中的合成可被苯甲酰基苯基脲類(lèi)殺蟲(chóng)劑特異性地抑制，但其機(jī)理尚不清楚。另外，在這些生物體內(nèi)，蛋白質(zhì)合成及N-糖基化作用的抑制劑(膜霉素)抑制幾丁質(zhì)的合成。更多的證據(jù)表明，原生動(dòng)物中的幾丁質(zhì)合成發(fā)生于細(xì)胞表面，極似真菌中的過(guò)程。
所有含幾丁質(zhì)的生物都有使其能降解幾丁質(zhì)聚合物而形態(tài)發(fā)生，即其形狀的基本修飾的酶系統(tǒng)。另外，許多高等植物，魚(yú)類(lèi)，食蟲(chóng)動(dòng)物(包括脊椎動(dòng)物)都能產(chǎn)生降解幾丁質(zhì)的酶類(lèi)。一些酶解系統(tǒng)具有這些方面的特征i)β-己胺酶能從多糖的非還原末端去除末端N-乙酰葡萄糖胺部分；ii)一些具有廣譜特異性的溶菌酶(如蛋清溶菌酶)也能從幾丁質(zhì)糖聚合物內(nèi)部切開(kāi)；iii)外切幾丁質(zhì)酶能從多糖的非還原末端裂解二乙酰幾丁質(zhì)二糖；iv)專(zhuān)一性內(nèi)切幾丁質(zhì)酶沿著幾丁質(zhì)鏈隨機(jī)地切開(kāi)糖苷鍵，最終的主產(chǎn)物為二乙酰幾丁質(zhì)二糖，還有一些三乙酰幾丁質(zhì)三糖。外切和內(nèi)切幾丁質(zhì)酶通常統(tǒng)稱為幾丁質(zhì)酶。在此也使用此名稱。
在自然界中，幾丁質(zhì)酶分布廣泛，在一些病毒、細(xì)菌、真菌、植物、無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中都有發(fā)現(xiàn)。幾丁質(zhì)酶構(gòu)成糖基化水解酶的18、19家族。Henrissat提出的這種分類(lèi)基于氨基酸序列的相似性(6)。19家族僅含植物幾丁質(zhì)酶；例如來(lái)自大麥的幾丁質(zhì)酶，其三維結(jié)構(gòu)已被解釋。僅僅所謂的III類(lèi)植物幾丁質(zhì)酶才屬于18家族。在糖基化水解酶的第18家族中的幾丁質(zhì)酶的推斷活性位點(diǎn)區(qū)域存在著一定的同源性。催化結(jié)構(gòu)域的假想結(jié)構(gòu)是8股a/β桶式結(jié)構(gòu)(“TIM桶”)(7，8)，其作用機(jī)理類(lèi)似于溶菌酶和其它的糖基化水解酶，如普通的酸堿催化(8)。
由含幾丁質(zhì)病原體引起的人類(lèi)感染性疾病由含幾丁質(zhì)生物體引起的人類(lèi)感染性疾病有許多種。最顯著的幾種列于表1。一種基于病原體類(lèi)型的分類(lèi)是i)真菌感染；ii)原生動(dòng)物感染；以及iii)蠕蟲(chóng)感染。關(guān)于此問(wèn)題可見(jiàn)參考文獻(xiàn)9。
表1幾種由含幾丁質(zhì)病原體引起的感染性疾病I真菌感染-皮真菌病-皮下真菌病-肺部真菌病-念珠菌病II.原生動(dòng)物感染-弓漿蟲(chóng)病-瘧疾(瘧原蟲(chóng))-利什曼病(利什曼蟲(chóng))-Chagas病，嗜睡癥(錐蟲(chóng))III.蠕蟲(chóng)感染-血吸蟲(chóng)病-毛線蟲(chóng)病-絲蟲(chóng)病-Ochocerciasis真菌感染現(xiàn)有的有限數(shù)量的抗真菌藥物通常并不十分有效。真菌感染通常發(fā)病于免疫缺陷人群，現(xiàn)在最常見(jiàn)的是艾滋病患者中。大多數(shù)皮膚真菌感染用局部藥劑治療，內(nèi)臟感染和表皮感染需長(zhǎng)期全身性治療。最常見(jiàn)的真菌感染是由白色念珠菌引起的。該生物體是一種口腔粘膜和陰道粘膜內(nèi)共生菌，但在嚴(yán)重患病的患者中，以及在那些特異性免疫缺陷的患者中，和那些接受了廣譜抗生素治療的患者中對(duì)損傷的皮膚有致病性。念珠菌感染的最嚴(yán)重后果是肺炎，心內(nèi)膜炎，敗血癥甚至死亡。唯一有效的治療方法是靜脈注射兩性霉素B。注射這種藥物可能引起低血壓和虛脫等副反應(yīng)。因此第一次注射時(shí)需要注射少量進(jìn)行耐受實(shí)驗(yàn)。5-氟胞嘧啶是一種合成的氟化嘧啶，它能夠進(jìn)入真菌細(xì)胞通過(guò)干擾DNA和RNA合成抑制代謝。該化合物在治療系統(tǒng)性真菌感染時(shí)和兩性霉素B同時(shí)使用。當(dāng)單獨(dú)注射時(shí)，對(duì)5-氟胞嘧啶的抗性迅速產(chǎn)生。
在人類(lèi)中能引起嚴(yán)重的感染疾病的其他種屬的真菌，如曲霉，隱球菌，球孢子菌，副球孢子菌，芽生菌，孢子絲菌，和莢膜組織胞漿菌。
組織胞漿菌病的臨床癥狀可能有很大區(qū)別。莢膜組織胞漿菌感染巨噬細(xì)胞，其致病原因類(lèi)似于結(jié)核病。在正常宿主中肺部感染通常伴隨著咳嗽和胸痛，肌痛和體重減輕。在某些肺部結(jié)構(gòu)性缺陷的個(gè)體中，可能會(huì)發(fā)生肺部慢性破壞性疾病，類(lèi)似于結(jié)核病。在免疫損害的宿主中可能發(fā)展成傳播性組織胞漿菌病，伴隨著發(fā)燒，肝脾大，貧血，白血病，血小板癥和敗血癥。兩性霉素B是治療的通常選擇。由于它的毒性，研究了對(duì)各種真菌感染治療的其它藥物。
原生動(dòng)物和蠕蟲(chóng)感染原生動(dòng)物是單細(xì)胞生物，在人體內(nèi)能引起大量的嚴(yán)重的感染性疾病。(見(jiàn)表1)。幸運(yùn)的是對(duì)于大多數(shù)的這類(lèi)病原體，有效地藥物治療是可行的。對(duì)于克氏錐蟲(chóng)引起的Chagas病的治療，目前尚未讓人滿意。心臟與腸道是被這種疾病以慢性形式嚴(yán)重影響的器官。對(duì)鼠弓形體的組織損傷的有效治療還是不可能的。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫能力減弱后，可引起疾病的復(fù)發(fā)。蠕蟲(chóng)感染一般地可用特效藥物非常有效地治愈。在這方面的難題是由班氏線蟲(chóng)和Brugia引起的淋巴絲蟲(chóng)病。在此病的高級(jí)階段，在用藥物乙胺嗪(DEC)殺死微絲蚴的同時(shí)，會(huì)由于大量蠕蟲(chóng)死亡引起并發(fā)癥。
通過(guò)在幾丁質(zhì)水平的相互作用得到對(duì)含幾丁質(zhì)病原體的改善的抗性幾丁質(zhì)在生物體中的不同分布使人產(chǎn)生這樣一個(gè)想法對(duì)于含幾丁質(zhì)病原體的感染的控制，幾丁質(zhì)代謝是一個(gè)很有吸引力的靶。在此有兩種獨(dú)特的實(shí)驗(yàn)方法應(yīng)該提到1.幾丁質(zhì)合成的抑制(綜述見(jiàn)參考文獻(xiàn)2)真菌細(xì)胞壁合成抑制劑作為殺真菌劑的價(jià)值在植物中已得到大量證明。多氧菌素已被廣泛地用作出色的農(nóng)用殺真菌劑。由于結(jié)構(gòu)上與UDP-N-乙酰葡萄糖胺的相似性，多氧菌素成為幾丁質(zhì)合成的一組競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。最近，作為機(jī)理相近的潛在抑制劑，煙霉素也已得到檢驗(yàn)。
苯甲酰芳香基脲是商業(yè)殺昆蟲(chóng)劑，它們是昆蟲(chóng)中幾丁質(zhì)合成的強(qiáng)力抑制劑，但在真菌中則不然。
以上化合物在人體中的醫(yī)用價(jià)值尚未能得到說(shuō)明。
2.幾丁質(zhì)酶作為疫苗幾丁質(zhì)酶在原生動(dòng)物生命周期中的重要性，提示研究者考慮將原生生物幾丁質(zhì)酶作為免疫接種的有吸引力的抗原(10-13)。還有一個(gè)原因是(錯(cuò)誤地)認(rèn)為在人體內(nèi)不存在類(lèi)似的蛋白質(zhì)(見(jiàn)參考文獻(xiàn)13)在抗含幾丁質(zhì)微生物的過(guò)程中，以上所闡述的實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)點(diǎn)可能比設(shè)想的要少。
第一，合成的化合物對(duì)幾丁質(zhì)合成的抑制作用的特異性和有效性可能比所希望的要小。還不能有結(jié)論說(shuō)抑制劑干擾哺乳動(dòng)物細(xì)胞的內(nèi)源性反應(yīng)過(guò)程因而產(chǎn)生副作用。當(dāng)原始化合物向一種有毒產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化作用發(fā)生時(shí)，毒性也有可能上升。另外，由于這些藥物會(huì)通過(guò)尿液排出體外，因而也要求長(zhǎng)期注射大量這類(lèi)藥物。另外，在微生物體內(nèi)可能存在或發(fā)展出幾丁質(zhì)的替代合成途徑，使其完全抑制變得復(fù)雜。
第二，使用源于病原微生物的幾丁質(zhì)酶作為疫苗可能產(chǎn)生一些未知的有害副作用。不能排除因這些幾丁質(zhì)酶的片段與內(nèi)源蛋白質(zhì)同源而引發(fā)的不希望的免疫反應(yīng)。這一點(diǎn)可能是個(gè)事實(shí)而非僅僅是一種理論上的難題，因?yàn)槿藥锥≠|(zhì)酶與其它物種的幾丁質(zhì)酶具有很高的同源性(見(jiàn)下)。
幾丁質(zhì)酶在植物和魚(yú)類(lèi)中抵抗含幾丁質(zhì)病原體中的作用許多植物幾丁質(zhì)酶被認(rèn)為是與致病性(PR)有關(guān)的蛋白質(zhì)，這些酶可被病原體的存在或其它的應(yīng)力所誘導(dǎo)。有些植物幾丁質(zhì)酶己被證明有抗真菌作用。見(jiàn)參考文獻(xiàn)14。最令人吃驚的是有報(bào)道說(shuō)，用一種來(lái)自粘質(zhì)沙雷氏菌的在大腸桿菌中表達(dá)的細(xì)菌幾丁質(zhì)酶(ChiA)處理植物可產(chǎn)生對(duì)真菌的抗性(15)。然而很清楚，對(duì)大多數(shù)真菌的更有效的抑制作用要求幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶同時(shí)存在。在植物中，后一種酶也因應(yīng)答應(yīng)力被誘導(dǎo)。
據(jù)報(bào)道，魚(yú)類(lèi)的白細(xì)胞富含幾丁質(zhì)酶活性并在防御系統(tǒng)中起著作用(16)。這種作用的證據(jù)最近已得到，確認(rèn)從大比目魚(yú)中純化的幾丁質(zhì)酶對(duì)含幾丁質(zhì)的真菌大毛霉有抑制作用。
現(xiàn)在普遍的認(rèn)識(shí)是人類(lèi)吞噬細(xì)胞中不存在類(lèi)似的幾丁質(zhì)酶。但是，如下面將要討論到的，最近我們發(fā)現(xiàn)在人工培養(yǎng)的人類(lèi)巨噬細(xì)胞中存在著類(lèi)似的一種酶。
本發(fā)明的簡(jiǎn)述鑒于現(xiàn)有的抗含幾丁質(zhì)的病原體的方法的局限性，在此提出一種新的方法，解決困擾人類(lèi)健康的這一難題。該方法基于新近發(fā)現(xiàn)的一種人幾丁質(zhì)酶的運(yùn)用，該酶能通過(guò)重組DNA技術(shù)(生物工程)生產(chǎn)，并作為一種安全而有效的抗含幾丁質(zhì)病原體的藥劑，干預(yù)由含幾丁質(zhì)病原體引起的感染性疾病。該方法的簡(jiǎn)介及其發(fā)展述于其后。
本發(fā)明提供了一種基本上是分離的或純化的幾丁質(zhì)酶，所說(shuō)的幾丁質(zhì)酶是人類(lèi)的幾丁質(zhì)酶，它具有基本上與圖1或圖2的氨基酸順序相應(yīng)的氨基酸序列，或是所說(shuō)的人幾丁質(zhì)酶的修飾形式，它具有基本上相似的幾丁質(zhì)水解活性。優(yōu)選的是，這種新的人幾丁質(zhì)酶通過(guò)一種基因工程化的宿主細(xì)胞生產(chǎn)，從所說(shuō)的宿主細(xì)胞中或是培養(yǎng)所說(shuō)的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中純化，并且這種酶的氨基酸序列由基本上與圖1或圖2中的核酸序列相應(yīng)的核酸序列所編碼。本發(fā)明特別地包括這樣的幾丁質(zhì)酶，它具有基本上與圖1中的氨基酸序列相應(yīng)的氨基酸序列，并且它的分子量大約50kDa，本發(fā)明還包括一種氨基酸序列基本上與圖2中所示的氨基酸序列相應(yīng)的，分子量約為39kDa的幾丁質(zhì)酶。
術(shù)語(yǔ)“基本上分離的或純化的”表明這種幾丁質(zhì)酶從其天然存在的環(huán)境中分離，或是從應(yīng)用重組DNA技術(shù)或用化學(xué)合成法生產(chǎn)或分泌幾丁質(zhì)酶的環(huán)境中分離，本發(fā)明意在包括“基本上分離形式”的幾丁質(zhì)酶，在此形式中，它基本上是與所說(shuō)的環(huán)境中的其它成分分開(kāi)的，而且優(yōu)選的是幾丁質(zhì)酶是“基本上純化的”，即意味著它已純凈到足以將其應(yīng)用于醫(yī)藥用途，即是藥學(xué)可接受的。
雖然本發(fā)明已包括了從天然來(lái)源，如經(jīng)適當(dāng)活化的人類(lèi)巨噬細(xì)胞中分離幾丁質(zhì)酶的可能性，但通過(guò)重組DNA技術(shù)或通過(guò)化學(xué)合成來(lái)生產(chǎn)是優(yōu)選方案，特別是通過(guò)一種基因工程化宿主或宿主細(xì)胞生產(chǎn)，并從所說(shuō)的宿主或宿主細(xì)胞或是從培養(yǎng)所說(shuō)的宿主或宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中分離的方法。
術(shù)語(yǔ)“基本上與……相應(yīng)”意味著允許微小的序列變異，例如不會(huì)顯著影響酶的活性的天然產(chǎn)生的變異。人幾丁質(zhì)酶的氨基酸序列中的某些氨基酸可能會(huì)被其它的氨基酸所取代，或是缺失，而不會(huì)因此而顯著影響酶的功能，活性和耐受能力，有時(shí)甚而會(huì)因此使酶的性質(zhì)得到改進(jìn)。一般地，這類(lèi)序列上的變異是十分有限的，大約少于全部氨基酸的30％，常常是少于20％，甚至是少于10％。即是說(shuō)，與圖1或圖2中的序列比較，變體通常有高于大約70％，通常是高于80％或甚至是高于90％的同源性。共同的是它們都有幾丁質(zhì)酶活性的功能特征，該活性可用典型的幾丁質(zhì)酶底物，如4-甲基傘形酰-幾丁質(zhì)三苷來(lái)測(cè)定。
術(shù)語(yǔ)“具有基本上相似的幾丁質(zhì)水解活性的修飾形式的人幾丁質(zhì)酶”意味著包括了其氨基酸序列與圖1或圖2中所示的序列有顯著差異但卻仍然具有相似的幾丁質(zhì)酶活性的變體。具有相似的甚至是有所改進(jìn)的性質(zhì)的這種修飾形式可在人幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行設(shè)計(jì)，例如缺失一個(gè)與功能無(wú)關(guān)甚至有害的結(jié)構(gòu)域，以及構(gòu)建含有兩個(gè)或更多拷貝的希望存在的結(jié)構(gòu)域的變體。
術(shù)語(yǔ)“具有基本上相似的幾丁質(zhì)水解活性”意味著最低的要求是具有與圖1或圖2中所示的幾丁質(zhì)酶相比至少是相等的幾丁質(zhì)酶活性?！跋嗟取敝傅氖窃诘孜锓秶系戎?，即等質(zhì)性，以及在活性上等值，即等量性。
本發(fā)明還提供一種藥物組合物，它包括本文描述的新的人幾丁質(zhì)酶，以及一種藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑，更具體的是一種用于抗含幾丁質(zhì)病原體引起的感染的治療的藥物組合物，它包括一種治療或預(yù)防有效量的新的人幾丁質(zhì)酶和一種藥學(xué)可接受載體或稀釋劑。優(yōu)選的藥物組合物還包括治療或預(yù)防有效量的人β-1，3-葡聚糖酶。
本發(fā)明還提供了包括新的人幾丁質(zhì)酶和一種載體或稀釋劑的非藥物組合物。例如，這種組合物可以是來(lái)自培養(yǎng)細(xì)胞尤其是人類(lèi)細(xì)胞的培養(yǎng)基，或者是化妝品(如體膚露)，牙用品(牙膏，漱口水)或食物(如奶，奶酪，及其它乳制品)。
另外，本發(fā)明提供了包括幾丁質(zhì)水解量的新的人幾丁質(zhì)酶的幾丁質(zhì)基制品。例如，幾丁質(zhì)基制品可以是含藥物的藥物載體或是控制藥物釋放的植入物，或是瞬時(shí)功能植入物。
本發(fā)明還提供了一種人類(lèi)個(gè)體抗含幾丁質(zhì)病原體引起的感染的治療或預(yù)防方法，包括給予所述的人類(lèi)個(gè)體含有有效治療或預(yù)防量的新的人幾丁質(zhì)酶的組合物。本發(fā)明還提供了一種制備人幾丁質(zhì)酶的方法，該酶有著基本上與圖1或圖2中所示氨基酸序列相應(yīng)的氨基酸序列，或是有基本上相似的幾丁質(zhì)水解活性的所說(shuō)的人幾丁質(zhì)酶的修飾形式，該方法包括培養(yǎng)能夠產(chǎn)生所說(shuō)的人幾丁質(zhì)酶或其修飾形式的基因工程化宿主或宿主細(xì)胞，以及從所說(shuō)的宿主或宿主細(xì)胞或培養(yǎng)所說(shuō)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中分離所產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶。在此方法中，優(yōu)選的是所說(shuō)的幾丁質(zhì)酶的氨基酸序列是由基本上與圖1或圖2中所示的核苷酸序列相應(yīng)的核苷酸序列所編碼的。
本發(fā)明還提供了一種能夠生產(chǎn)人幾丁質(zhì)酶的基因工程化宿主細(xì)胞，該幾丁質(zhì)酶具有基本上與圖1與圖2中所示氨基酸序列相應(yīng)的氨基酸序列，或是有基本上相似的幾丁質(zhì)水解活性的所說(shuō)的人幾丁質(zhì)酶的修飾形式。
本發(fā)明還提供一種重組的核酸，它包括編碼基本上與圖1或圖2中所示氨基酸序列相應(yīng)的氨基酸序列的核苷酸序列，或是其互補(bǔ)序列。優(yōu)選的，所說(shuō)的核苷酸序列基本上與圖1或圖2中所示的核苷酸序列相應(yīng)，或基本上與其互補(bǔ)。
術(shù)語(yǔ)“基本上互補(bǔ)于”意味著包括了所有與圖1或圖2中所示核苷酸序列雜交的變體，尤其是在嚴(yán)格雜交條件下。術(shù)語(yǔ)“基本上相應(yīng)”意味著包括了編碼同一或相當(dāng)?shù)?指幾丁質(zhì)酶活性)氨基酸序列并被宿主或宿主細(xì)胞表達(dá)的所有變體。
本發(fā)明還包括至少有大約8個(gè)核苷酸的寡核苷酸，它有與圖1或圖2中所示的核苷酸序列相應(yīng)或互補(bǔ)的核苷酸序列，能夠在嚴(yán)格(即要求完全互補(bǔ))條件下與編碼新的人幾丁質(zhì)酶的核酸雜交結(jié)合。這類(lèi)寡核苷酸可用于多種目的，例如，作為用于核酸擴(kuò)增方法如PCR，NASBA等的引物，或是作為雜交分析的探針。其長(zhǎng)度通常取決于所希望的用途，當(dāng)作為引物時(shí)，正常的長(zhǎng)度在12個(gè)核苷酸左右，優(yōu)選是15，以及25，最佳選擇是20個(gè)核苷酸。當(dāng)用作探針時(shí)，通常要更長(zhǎng)一些，例如，從大約15或20至大約40或50個(gè)核苷酸，或甚至到完整的編碼序列。
類(lèi)似的，本發(fā)明還包括至少大約8個(gè)氨基酸殘基的肽，它含有衍生于圖1或圖2中所示的氨基酸序列的氨基酸序列，并代表或模擬新的人幾丁質(zhì)酶的抗原決定簇，特別是那些具有與圖1或圖2中所示氨基酸序列相應(yīng)的氨基酸序列并具有抗原性的肽類(lèi)。通常，這些肽類(lèi)的長(zhǎng)度至少為大約10個(gè)氨基酸殘基，甚至至少大約15個(gè)，多至40個(gè)氨基酸殘基，而優(yōu)選的是長(zhǎng)度為約30個(gè)氨基酸殘基。所說(shuō)的肽類(lèi)可用于診斷目的，或用于免疫接種方案中以產(chǎn)生人幾丁質(zhì)酶特異性抗體。
本發(fā)明還包括能夠結(jié)合到新的人幾丁質(zhì)酶上的抗體，尤其是單克隆抗體。這類(lèi)抗體有多種用途，例如可用來(lái)分離和/或純化(親和層析)人幾丁質(zhì)酶，或是用于診斷目的。
本發(fā)明還提供一種診斷試劑盒，它包括一種上述人幾丁質(zhì)酶結(jié)合抗體，或是人幾丁質(zhì)酶肽，或是本文所述的新的人幾丁質(zhì)酶本身，還包括一套用于檢測(cè)抗原或抗體的診斷試劑盒的常規(guī)組分；以及另一種診斷試劑盒，它包括本文所述的人幾丁質(zhì)酶特異性的寡核苷酸或編碼重組人幾丁質(zhì)酶的核酸序列，隨之的還有一套常規(guī)的檢測(cè)核酸的診斷試劑盒所應(yīng)有的組分。
另外，本發(fā)明還提供一種降解幾丁質(zhì)的方法，包括在幾丁質(zhì)水解條件下，應(yīng)用新的人幾丁質(zhì)酶接觸所說(shuō)的幾丁質(zhì)。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1.chi.50 cDNA克隆的核苷酸序列以及相應(yīng)蛋白質(zhì)的推測(cè)氨基酸序列圖2.chi.39 cDNA克隆的核苷酸序列以及相應(yīng)蛋白質(zhì)的推測(cè)氨基酸序列圖3.巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的幾種不同的幾丁質(zhì)三苷酶圖4.幾種幾丁質(zhì)酶蛋白質(zhì)家族成員中推定的活性中心區(qū)域的序列對(duì)比圖5.從脾臟中純化的39kDa和50kDa幾丁質(zhì)三苷酶和轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞生產(chǎn)的39和50kDa幾丁質(zhì)三苷酶的免疫滴定。
本發(fā)明的詳細(xì)描述人類(lèi)不斷地暴露于幾丁質(zhì)(或含幾丁質(zhì)微生物)面前這一事實(shí)強(qiáng)烈地提示著人類(lèi)應(yīng)該也具有降解這類(lèi)材料的能力。否則，在生命進(jìn)程中就會(huì)不可避免地逐漸引起幾丁質(zhì)的溶酶體積累，例如在不斷與含幾丁質(zhì)微生物接觸的肺泡巨噬細(xì)胞中。但是，這種幾丁質(zhì)的積累從未見(jiàn)到過(guò)。這一現(xiàn)象促使我們?nèi)パ芯咳祟?lèi)巨噬細(xì)胞中幾丁質(zhì)酶活性的存在。事實(shí)上，如下所述，我們能夠確定，與以前的見(jiàn)解相反，巨噬細(xì)胞能產(chǎn)生一種與其它非哺乳動(dòng)物生物中見(jiàn)到的幾丁質(zhì)酶活性相似的幾丁質(zhì)酶(17，18)，該酶具有很高的水解幾丁質(zhì)的活性，而且顯示出幾丁質(zhì)酶的其它一些共有的特征?；谧畛蹊b定這種新酶所用的底物，如4-甲基傘形酰-幾丁質(zhì)三苷，人幾丁質(zhì)酶被命名為幾丁質(zhì)三苷酶(chitotriosidase)(17)。
最近在我們實(shí)驗(yàn)室討論了大量的有關(guān)幾丁質(zhì)三苷酶的新發(fā)現(xiàn)，這些信息增加了這種新發(fā)現(xiàn)的酶在將來(lái)的前景。
中等水平的幾丁質(zhì)三苷酶可在溶酶體或特殊的嗜中性粒細(xì)胞顆粒中檢測(cè)到，在紅細(xì)胞，血小板，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞中未能發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)三苷酶活性。我們觀察到，中性粒細(xì)胞暴露于脂多糖(LPS)導(dǎo)致幾丁質(zhì)三苷酶的釋放。健康的志愿者注射GM-CSF也會(huì)導(dǎo)致血漿中幾丁質(zhì)三苷酶活性的暫時(shí)上升，已被假定是由于中性粒細(xì)胞分泌酶所引起的。幾丁質(zhì)三苷酶的釋放是模仿乳褐質(zhì)在分離的血液中性粒細(xì)胞中沒(méi)能檢測(cè)到幾丁質(zhì)三苷酶mRNA。它提示這種酶在骨髓中這些細(xì)胞的前體中生產(chǎn)的。
幾丁質(zhì)三苷酶可以在巨噬細(xì)胞中大批地產(chǎn)生和分泌。在培養(yǎng)的單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的分化過(guò)程中，幾丁質(zhì)三苷酶的產(chǎn)生是一個(gè)晚期事件在細(xì)胞培養(yǎng)一周之后，第一條mRNA及相應(yīng)的酶活性才被檢測(cè)出來(lái)，而其它的巨噬細(xì)胞標(biāo)記例如酒石酸抗性酸性磷酸酶在分化過(guò)程中的極早期就已被誘導(dǎo)出來(lái)。在外周血液來(lái)源的細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中，自發(fā)發(fā)生的巨噬細(xì)胞的一種特定的活化，已被發(fā)現(xiàn)是幾丁質(zhì)三苷酶的誘導(dǎo)所必需的。分離的大鼠外周巨噬細(xì)胞即使經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的培養(yǎng)，也不產(chǎn)生幾丁質(zhì)三苷酶。因此假設(shè)某些類(lèi)型的已分化的組織巨噬細(xì)胞已不再能合成幾丁質(zhì)三苷酶。另外，并非每個(gè)引起巨噬細(xì)胞激活的因子都同時(shí)會(huì)誘導(dǎo)幾丁質(zhì)三苷酶的表達(dá)。我們注意到帶有脂多糖(LPS)的單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞的活化事實(shí)上會(huì)降低幾丁質(zhì)三苷酶的分泌。
一種使巨噬細(xì)胞產(chǎn)生幾丁質(zhì)三苷酶的有力促進(jìn)因子明顯的是由于溶酶體(糖)脂類(lèi)的積累。已注意到在各種溶酶體脂沉積中幾丁質(zhì)三苷酶的活性升高，例如，Nieman-Pick癥，Krabbe癥，GMI神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥，以及Wolmann癥，雖然比Gaucher癥中要少。有趣的是，以特異性寡糖或粘多糖的積累為特征的溶酶體儲(chǔ)存失調(diào)不與幾丁質(zhì)三苷酶升高相伴。已經(jīng)很清楚的是在Gaucher癥患者的細(xì)胞中葡腦糖苷脂酶的缺乏不會(huì)引起幾丁質(zhì)三苷酶的過(guò)量產(chǎn)生。Gaucher癥前期癥狀或非Gaucher癥沒(méi)有顯示出異常的幾丁質(zhì)三苷酶水平。異常的酶水平實(shí)際與Gaucher癥的臨床癥狀；即在組織和骨髓中脂負(fù)載巨噬細(xì)胞的發(fā)生有關(guān)。
最近發(fā)現(xiàn)血漿中幾丁質(zhì)三苷酶顯著上升是對(duì)處于某種活化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞的存在的一種反映。上升的酶水平在遺傳性溶酶體脂沉積患者，內(nèi)腔利什曼癥患者和肉樣瘤病患者中都能觀察到。令人感興趣的是注意到利什曼寄生蟲(chóng)也存在于巨噬細(xì)胞的溶酶體中，并且可能流出類(lèi)糖脂結(jié)構(gòu)。肉樣瘤病的病因?qū)W仍未了解，一種可能是由于霉菌類(lèi)感染因子引起的疾病，涉及具有巨噬細(xì)胞特征的含有多核性巨大細(xì)胞的免疫性肉芽腫的形成。
幾丁質(zhì)三苷酶可能是其它有病理性巨噬細(xì)胞參與的疾病狀態(tài)的一種有用的標(biāo)記。一個(gè)有吸引力的候選者是由動(dòng)脈粥樣硬化形成的，其特征是存在膽固醇負(fù)載巨噬細(xì)胞。而且，我們還注意到X連鎖的腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良和多硬化癥患者的腦脊髓中幾丁質(zhì)三苷酶的水平升高。據(jù)信在這兩種病中被激活的腦巨噬細(xì)胞(微神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)是疾病發(fā)生的基本特征。
很清楚，幾丁質(zhì)三苷酶可用作Gaucher癥和其它的溶酶體脂沉積的診斷標(biāo)記。另外，檢測(cè)血漿中酶的水平的升高可以用來(lái)診斷肉樣瘤病癥，腦脊液中酶水平的上升可診斷一些神經(jīng)系統(tǒng)的異常。而在治療過(guò)程中酶的水平的測(cè)定則是檢測(cè)治療效果的一個(gè)重要工具。
要使用人幾丁質(zhì)酶(幾丁質(zhì)三苷酶)作為體內(nèi)抗含幾丁質(zhì)微生物的藥劑，還必須具備一些條件。
很重要的一點(diǎn)是機(jī)體對(duì)幾丁質(zhì)三苷酶的耐受能力，如上所述，據(jù)信人體內(nèi)不含內(nèi)源性幾丁質(zhì)。與溶菌酶相似，幾丁質(zhì)酶活性可能對(duì)人體無(wú)害。由于幾丁質(zhì)三苷酶是循環(huán)系統(tǒng)中產(chǎn)生的內(nèi)源性蛋白質(zhì)，似乎對(duì)人體給予這種酶不會(huì)引起免疫反應(yīng)。Gaucher癥患者的循環(huán)系統(tǒng)中可能有高濃度的幾丁質(zhì)三苷酶，該癥為獲得性遺傳的溶酶體儲(chǔ)存失調(diào)，其以各種組織中大量產(chǎn)生葡糖神經(jīng)酰胺負(fù)載巨噬細(xì)胞為特征(17)。Gaucher癥患者血漿中超量的酶沒(méi)有其它任何可見(jiàn)的有害并發(fā)癥。這一點(diǎn)提示人體可以很好地耐受循環(huán)系統(tǒng)中超常量的幾丁質(zhì)三苷酶，滿足了將其用于抗含幾丁質(zhì)病原體的一個(gè)重要前提。
為了能用作抗含幾丁質(zhì)病原體的藥物，幾丁質(zhì)三苷酶還必須是能以均一形式大量可得的。對(duì)于人幾丁質(zhì)酶沒(méi)有一種遍在的天然來(lái)源。在尿液和胎盤(pán)中該酶的含量很低。這使得我們嘗試去分離編碼幾丁質(zhì)三苷酶的cDNA。由于巨噬細(xì)胞中幾丁質(zhì)三苷酶基因的專(zhuān)一性表達(dá)，所有其它被試的細(xì)胞類(lèi)型的cDNA文庫(kù)都是幾丁質(zhì)三苷酶cDNA陰性的。然而，從能大量分泌幾丁質(zhì)三苷酶的長(zhǎng)期培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞mRNA中構(gòu)建的cDNA文庫(kù)，已被證明富含編碼幾丁質(zhì)三苷酶的cDNA(占總cDNAs的0.1％)。以這種方式已有兩種cDNAs被鑒定和克隆。
這兩種不同的cDNA的產(chǎn)生是由于RNA的可變拼接方式所致，產(chǎn)生了兩種不同但都有功能的mRNA。在COS細(xì)胞中表達(dá)這兩種cDNA，合成并分泌了兩種不同的幾丁質(zhì)三苷酶蛋白質(zhì)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)得的表觀分子量分別為39kDa和50kDa。這兩種重組產(chǎn)生的幾丁質(zhì)三苷酶同工酶，分別命名為幾丁質(zhì)酶50和幾丁質(zhì)酶39，都具有酶活性。對(duì)它們進(jìn)一步的性質(zhì)分析表明它們的比，即單位量抗原的酶活性，與從組織中分離出來(lái)的或是存在于血漿中的幾丁質(zhì)三苷酶的比活性是相同的。
如同在“試驗(yàn)數(shù)據(jù)”一部分中所詳述的，兩種幾丁質(zhì)三苷酶蛋白質(zhì)大部分相同，僅僅在C-端部分有區(qū)別。同工酶含有屬于糖基水解酶18家族的幾丁質(zhì)酶的高度保守的催化中心區(qū)域(19)?？寺〉腸DNA的核苷酸序列預(yù)示這兩種幾丁質(zhì)三苷酶蛋白質(zhì)都缺失了N-鍵合的聚糖。事實(shí)上，39kDa形式的酶中未能發(fā)現(xiàn)任何聚糖的存在。而50kDa形式中不能排除O-糖基化的存在。
這些發(fā)現(xiàn)表明使用傳統(tǒng)技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)這兩種重組人幾丁質(zhì)三苷酶是可行的。而且，不僅在真核細(xì)胞中生產(chǎn)是可行的，而且在原核細(xì)胞中也可生產(chǎn)，因?yàn)檫@些微生物也能自發(fā)生產(chǎn)與之高度同源的蛋白，例如粘質(zhì)沙雷氏菌。一套純化幾丁質(zhì)三苷酶的方法已開(kāi)發(fā)成功(18及下述)。因此，獲得適于人用的純的、單一態(tài)的大量的這兩種重組人幾丁質(zhì)三苷酶是可能的。
39kDa幾丁質(zhì)酶不是糖基化蛋白質(zhì)，所以它在真核細(xì)胞中的生產(chǎn)肯定是可行的。在提供一種正確的前導(dǎo)序列后，能夠產(chǎn)生和分泌高度同源性幾丁質(zhì)酶的細(xì)菌原則上應(yīng)能分泌正確折疊的人類(lèi)幾丁質(zhì)三苷酶到胞外空間。另外，還可以考慮使用酵母細(xì)胞生產(chǎn)重組幾丁質(zhì)三苷酶，至少是39kDa的幾丁質(zhì)酶。雖然如此，卻不能排除這種可能，即50kDa幾丁質(zhì)酶不僅能在高等真核細(xì)胞中產(chǎn)生，而且也能在低等真核細(xì)胞甚至在原核細(xì)胞中生產(chǎn)。
用傳統(tǒng)技術(shù)在昆蟲(chóng)細(xì)胞，植物細(xì)胞或脊椎動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶應(yīng)該是可能的。最后，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可望成為在其乳汁中大量生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的生產(chǎn)者。已觀察到在37℃時(shí)，加到牛奶中的幾丁質(zhì)酶在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)是完全穩(wěn)定的。
一種酶作為治療藥物使用時(shí)的另一種限制是由于它在體內(nèi)的生存和功能發(fā)揮所形成的。因而把注意力集中到了幾丁質(zhì)三苷酶的性質(zhì)上了。
兩種形式的重組幾丁質(zhì)三苷酶(幾丁質(zhì)酶39和50)都被證明是對(duì)各種蛋白酶穩(wěn)定的。只是在變性之后才成功地對(duì)其完成了蛋白水解，如在SDS存在時(shí)加熱的條件下。37℃時(shí)血清或組織液的延時(shí)培養(yǎng)并未導(dǎo)致酶活性的可檢測(cè)的損失，暗示該酶是對(duì)血清蛋白酶不敏感的。類(lèi)似的，37℃時(shí)，在含有大量各種其它分泌的裂解酶的巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基中，幾丁質(zhì)三苷酶也是穩(wěn)定的。
還有分析揭示在pH范圍3-8內(nèi)幾丁質(zhì)三苷酶是相當(dāng)穩(wěn)定和具有酶解活性的。而且在50℃時(shí)，該酶完全穩(wěn)定，將酶液點(diǎn)在濾紙上室溫放置數(shù)天后，酶活性仍可恢復(fù)。在-20℃或-70℃儲(chǔ)存并經(jīng)過(guò)重復(fù)的凍融過(guò)程后酶活性無(wú)損失。
所有這些觀察結(jié)果說(shuō)明幾丁質(zhì)三苷酶異構(gòu)是真正穩(wěn)定的酶，本質(zhì)上對(duì)變性作用有高度抗性，而且顯示出在各種環(huán)境下都能強(qiáng)有力地發(fā)揮功能。
幾丁質(zhì)三苷酶的靜脈應(yīng)用的前提是它的清除。在血液中，占優(yōu)勢(shì)的同工酶是50kDa蛋白質(zhì)。而在組織中39kDa同工酶占優(yōu)勢(shì)。這一現(xiàn)象的形成可能是由于50kDa蛋白被吸收隨之被水解成在溶酶體環(huán)境中顯著穩(wěn)定的39kDa形式。大鼠中的實(shí)驗(yàn)表明在血液循環(huán)中50kDa形式的半壽期比39Kda的要長(zhǎng)。根據(jù)靜脈注射過(guò)的大鼠血液中人幾丁質(zhì)三苷酶活性消失的測(cè)定結(jié)果，其消除速度并不快，半壽期大約為1個(gè)小時(shí)。每日僅有極少量的幾丁質(zhì)三苷酶被近管排到尿液中。據(jù)猜測(cè)可能有些酶被近管上皮細(xì)胞重新有效地吸收了，因?yàn)樵谀I臟中發(fā)現(xiàn)能夠富集許多“溶酶體加工的”39kDa酶。這些觀察提示靜脈注射可以在血液循環(huán)系統(tǒng)中較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持高水平的人幾丁質(zhì)酶活性，從而，允許酶到達(dá)不同的組織之中。
純化的幾丁質(zhì)三苷酶能很好地水解幾丁質(zhì)和人工合成的類(lèi)幾丁質(zhì)底物如PNP-幾丁質(zhì)三苷，PNP-幾丁質(zhì)二苷，4-甲基傘形酰-幾丁質(zhì)三苷和4-甲基傘形酰-幾丁質(zhì)二苷。而且，注意到在真菌(毛霉)中加入幾丁質(zhì)三苷酶能抑制其生長(zhǎng)。由于幾丁質(zhì)三苷酶與其它物種的幾丁質(zhì)酶之間的高同源性，這些發(fā)現(xiàn)是預(yù)料之中的事。
總之，兩種幾丁質(zhì)三苷酶都有作為藥物使用的優(yōu)勢(shì)。兩種酶都較易通過(guò)傳統(tǒng)的重組技術(shù)生產(chǎn)。在各種條件下酶都極其穩(wěn)定而且有酶解活性。重組幾丁質(zhì)酶39和幾丁質(zhì)酶50，以及組織幾丁質(zhì)三苷酶都不會(huì)立即從血液循環(huán)中消除(至少在大鼠模型中如此)，而且原則上能到達(dá)各種組織部位。
以上有關(guān)幾丁質(zhì)三苷酶的發(fā)現(xiàn)促使我們?cè)诖诵Q天然的及重組的幾丁質(zhì)三苷酶(幾丁質(zhì)酶)是一種有吸引力的能用作抗含幾丁質(zhì)或能被這些酶水解的相關(guān)結(jié)構(gòu)的微生物感染的疾病的藥物。
兩種幾丁質(zhì)三苷酶，幾丁質(zhì)酶50和幾丁質(zhì)酶39，它們的酶活性質(zhì)總是一致的，即比活性，適用pH值范圍和穩(wěn)定性。兩種幾丁質(zhì)酶都可以用作抗含幾丁質(zhì)病原體(見(jiàn)表1)的藥物。含幾丁質(zhì)病原體的感染可能發(fā)生在身體的各個(gè)部位。由于它們的獨(dú)特性質(zhì)，幾丁質(zhì)酶被認(rèn)為是適用于各個(gè)身體部位的。
局部應(yīng)用被認(rèn)為是治療發(fā)生于皮膚表面的真菌感染。通過(guò)局部給藥，還可以治療眼部、生殖道及腸道的含幾丁質(zhì)微生物的感染。呼吸系統(tǒng)的相關(guān)感染可以通過(guò)含酶的霧劑治療。口服給藥可以用來(lái)抗口腔或胃腸道的含幾丁質(zhì)微生物的感染。最后如前文所述，靜脈給藥可以抗血液或組織中的病原體，無(wú)論是細(xì)胞內(nèi)還是細(xì)胞外的。另外應(yīng)有研究揭示通過(guò)使用特異性的幾丁質(zhì)酶異構(gòu)體是否可能有更專(zhuān)一性的定位。
本發(fā)明還包括一些變體和修飾，特別是如下的可能性A.重組人幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶的混合使用在植物和魚(yú)類(lèi)中幾丁質(zhì)酶在抗真菌感染方面的重要作用已有詳盡報(bào)道。在植物中，由于真菌細(xì)胞壁是由幾丁質(zhì)和β-葡聚糖原纖(15)混合物組成的，所以幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶是協(xié)同作用的。據(jù)信人類(lèi)既不生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶也不產(chǎn)生β-葡聚糖酶，已注意到長(zhǎng)期培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞不僅能夠分泌幾丁質(zhì)裂解酶，而且能具有裂解染料標(biāo)記的β-葡聚糖的酶活性。因此我們猜想，與植物中的情形類(lèi)似，將人幾丁質(zhì)酶和β-葡聚糖酶混合使用應(yīng)該比單獨(dú)使用其中的一種酶更加有效。分離長(zhǎng)期培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的β-葡聚糖酶，隨后克隆其相應(yīng)的cDNA，應(yīng)該使重組人β-葡聚糖酶的生產(chǎn)成為可能。
B.修飾的重組人幾丁質(zhì)酶的使用對(duì)幾丁質(zhì)三苷酶的三維結(jié)構(gòu)及其各結(jié)構(gòu)域功能的深入了解可以為了一些特殊的用途而對(duì)酶進(jìn)行工程化的修飾。例如，缺失了對(duì)酶的活性和專(zhuān)一性無(wú)關(guān)的結(jié)構(gòu)域的重組酶的生產(chǎn)，可以使得核心蛋白更小但活性仍在，因而能更容易地滲透到身體的某些特殊部位。有關(guān)18家族和19家族的糖基化水解酶現(xiàn)有的和迅速擴(kuò)展的知識(shí)，提示著工程化的修飾形式的幾丁質(zhì)酶是確切可行的。
除了治療用途之外，本發(fā)明還包括預(yù)防方面的用途。
我們觀察到血漿中幾丁質(zhì)三苷酶的活性隨著年齡增長(zhǎng)而上升，60歲以上的人體內(nèi)血漿中的水平比小孩的要平均高幾倍。另外，我們發(fā)現(xiàn)大約每十五個(gè)人中有一人不能產(chǎn)生有活性的幾丁質(zhì)三苷酶(見(jiàn)文獻(xiàn)17)。這些個(gè)體的血漿和尿液中，以及淋巴細(xì)胞、長(zhǎng)期培養(yǎng)的源于外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞的巨噬細(xì)胞中，都缺乏酶活性。在Gaucher癥患者和正常個(gè)體中幾丁質(zhì)三苷酶缺乏的發(fā)生頻率是相似的。酶活性缺乏的患者和那些血漿酶活性升高了幾千倍的患者的臨床表現(xiàn)是一致的。它表明幾丁質(zhì)三苷酶的升高是Gaucher癥的臨床表現(xiàn)的一種信號(hào)而不是前提條件。
我們注意到幾丁質(zhì)三苷酶缺乏具有遺傳性。從幾丁質(zhì)三苷酶缺乏的個(gè)體的外周血液?jiǎn)魏思?xì)胞中得到的巨噬細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中，可見(jiàn)同蛋白質(zhì)一樣，幾丁質(zhì)三苷酶mRNA的水平也是大大降低了的。殘存的幾丁質(zhì)三苷酶蛋白質(zhì)表現(xiàn)出正常的大小，但卻喪失了酶的活性，這一事實(shí)表明至少在這些情形下實(shí)質(zhì)的缺陷是在幾丁質(zhì)三苷酶基因上的一些突變。代謝標(biāo)記和Northern雜交分析表明這些突變導(dǎo)致了催化能力受損的幾丁質(zhì)三苷酶蛋白的合成的減少。
不能排除由于幾丁質(zhì)三苷酶的缺乏會(huì)伴隨一些不利。例如，對(duì)含幾丁質(zhì)病原體的抗性會(huì)降低，巨噬細(xì)胞中溶酶體對(duì)幾丁質(zhì)的降解作用會(huì)減弱，從而導(dǎo)致細(xì)胞的異常行為。仍需繼續(xù)研究以弄清幾丁質(zhì)三苷酶的缺乏是否會(huì)真的帶來(lái)什么危險(xiǎn)。如果這一點(diǎn)被證實(shí)，可以考慮給幾丁質(zhì)三苷酶缺乏癥患者進(jìn)行預(yù)防性注射。
其它可能導(dǎo)致幾丁質(zhì)三苷酶的活性的功能性缺乏的情形是免疫缺陷狀態(tài)。我們注意到在由于艾滋病毒(HIV)感染而引起免疫缺陷的患者中，平均說(shuō)來(lái)其血漿中幾丁質(zhì)三苷酶的水平都下降了。另外，還注意到對(duì)肉樣瘤病患者的皮質(zhì)類(lèi)固醇治療會(huì)引起幾丁質(zhì)三苷酶活性的迅速下降。很明顯，活化的巨噬細(xì)胞的存在是保持循環(huán)中正常幾丁質(zhì)三苷酶水平的一個(gè)重要因素?？梢钥紤]對(duì)免疫功能不全因而被含幾丁質(zhì)病原體感染的危險(xiǎn)大增的個(gè)體提供重組幾丁質(zhì)三苷酶。
重組幾丁質(zhì)三苷酶的局部應(yīng)用，還可以考慮用在外傷上，以降低真菌感染的危險(xiǎn)。
人幾丁質(zhì)酶還可以被開(kāi)發(fā)成用于醫(yī)學(xué)目的的降解注入的或植入的幾丁質(zhì)基結(jié)構(gòu)的工具。
例如，藥物可以摻在幾丁質(zhì)基膠囊中(“幾丁質(zhì)體”)。同時(shí)在膠囊中存在的一定量的人幾丁質(zhì)酶能夠確保藥物的可控制的釋放。當(dāng)藥物儲(chǔ)存在幾丁質(zhì)基質(zhì)中時(shí)可望得到緩慢地逐漸地釋放。在此系統(tǒng)中使用人類(lèi)的酶可以實(shí)現(xiàn)幾丁質(zhì)基膠囊的分解而又不至于引起免疫反應(yīng)。用于這一系統(tǒng)中的藥物可以從小分子化合物到用于酶學(xué)和基因治療目的的蛋白質(zhì)和核酸片段。幾丁質(zhì)(或其類(lèi)似物)已被用作藥物的載體(20)。
另一種相關(guān)的用途是將幾丁質(zhì)三苷酶用于含有幾丁質(zhì)作為結(jié)構(gòu)單元的植入物的迅速降解。在植入物只是臨時(shí)不得不完成其功能時(shí)這一點(diǎn)是很有用的，給予重組幾丁質(zhì)三苷酶可使之很方便地被“溶解”掉。
重組幾丁質(zhì)三苷酶還可以在來(lái)自體內(nèi)條件下用作殺真菌的化合物。例如，當(dāng)某種人類(lèi)細(xì)胞需要在無(wú)抗生素時(shí)培養(yǎng)并且將被重注入人體內(nèi)時(shí)，其培養(yǎng)基中就可以加入重組幾丁質(zhì)三苷酶(或是與β-1，3-葡聚糖酶混合使用)。這方面的例子可以是用于基因治療目的的細(xì)胞的來(lái)自體內(nèi)培養(yǎng)或是用作傷口愈合目的的角質(zhì)細(xì)胞的來(lái)自體內(nèi)的培養(yǎng)。
最后，重組人類(lèi)幾丁質(zhì)三苷酶(或是與β-1，3-葡聚糖酶的混合物)還可以用作牙膏和體膚露的添加劑，以防止真菌感染。
下面將通過(guò)一些實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明，這些實(shí)施例僅僅是為了解釋而不是要限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1編碼人幾丁質(zhì)三苷酶的cDNA的克隆與組成用下列策略克隆編碼人幾丁質(zhì)三苷酶的cDNA。從1型Gaucher癥患者脾臟中純化幾丁質(zhì)三苷酶，因?yàn)樵撈鞴僦袠O富幾丁質(zhì)三苷酶活性(18)。測(cè)定幾丁質(zhì)三苷酶的N端氨基酸序列，并將該信息應(yīng)用于幾丁質(zhì)三苷酶cDNA的克隆。首先，應(yīng)用已知的幾丁質(zhì)三苷酶的N-端氨基酸序列設(shè)計(jì)一條簡(jiǎn)并的有義寡核苷酸5’-TGYTAYTTYACNAAYTGGGC-3’。其次，根據(jù)幾丁質(zhì)三苷酶中推測(cè)為催化活性中心的高度保守的結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)一條簡(jiǎn)并的反義核苷酸5’-CCARTCIARRTYIACICCRTCRAA-3’。
通過(guò)RT-PCR技術(shù)，這些寡核苷酸被用來(lái)擴(kuò)增一個(gè)DNA片段。為此目的，從大量分泌幾丁質(zhì)三苷酶的長(zhǎng)期培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中提取了總RNA。使用Super ScriptTM RNAseH反轉(zhuǎn)錄酶和寡dT，開(kāi)始合成cDNA的第一條鏈。堿水解后，用乙醇沉淀cDNA，備用做模板。PCR按標(biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行。通過(guò)RT-PCR得到的DNA片段大小是所預(yù)期的(根據(jù)同幾丁質(zhì)家族的其它成員同源性推測(cè))。片段純化后，用T4DNA聚合酶處理，克隆進(jìn)載體pUC19中的HindII位點(diǎn)。通過(guò)雙脫氧核苷酸終止法測(cè)得的序列和純化的人幾丁質(zhì)三苷酶的N-端氨基酸序列完全吻合，使之可以用作鑒定完整長(zhǎng)度的幾丁質(zhì)三苷酶cDNA的探針。
用來(lái)自培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中的總RNA制備了cDNA文庫(kù)。用GIBCO-BRL公司的Super Script Choice System cDNA合成試劑盒從RNA出發(fā)制備了雙鏈巨噬細(xì)胞cDNA。雙鏈的cDNA與過(guò)量的非回文結(jié)構(gòu)的Bst XI連接子連接，并用低熔點(diǎn)膠分離。將超過(guò)500bp的cDNA純化后連到載體pcDNA1(InVitrogen)中的BstXI位點(diǎn)。連接混合物電穿孔轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株MC106/P3，得到巨噬細(xì)胞cDNA文庫(kù)。
通過(guò)隨機(jī)引物方法，用放射性標(biāo)記的部分幾丁質(zhì)三苷酶cDNA探針進(jìn)行克隆雜交，篩選cDNA文庫(kù)。與探針的雜交在1mM EDTA，0.5M磷酸氫二鈉緩沖液(pH7.2)中，并在7％(w/v)的SDS存在下于65℃進(jìn)行4小時(shí)。隨后，用含0.1％SDS的150mM氯化鈉，15mM檸檬酸鈉(pH7.0)洗滌膜兩次。然后放射自顯影。大約有0.1％的克隆對(duì)部分幾丁質(zhì)三苷酶cDNA克隆的雜交顯陽(yáng)性。按上述方法對(duì)約20個(gè)克隆測(cè)序。用這種方式鑒別出了兩個(gè)不同的全序列的幾丁質(zhì)三苷酶cDNA。這兩個(gè)克隆分別被稱作chi.50和chi.39。
chi.50的cDNA序列顯示的開(kāi)放讀框起始密碼子ATG位于第13位而終止密碼子TGA位于第1410位(見(jiàn)圖1)。該開(kāi)放讀框編碼的蛋白質(zhì)具有一個(gè)特征性的N-端ER信號(hào)肽，緊接著已確定的幾丁質(zhì)三苷酶的N-端序列。cDNA序列并未指明有可能的N-糖基化位點(diǎn)的存在，這一點(diǎn)與分離的幾丁質(zhì)三苷酶中不存在N-鍵合葡聚糖一致。所預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)，在去掉信號(hào)肽后長(zhǎng)度為445個(gè)氨基酸殘基，計(jì)算分子量為49kDa。用培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞的代謝標(biāo)記試驗(yàn)揭示，這些細(xì)胞優(yōu)先合成和分泌的幾丁質(zhì)三苷酶蛋白質(zhì)在SDS存在的還原條件下經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)得表觀分子量為50kDa。預(yù)測(cè)的50kDa的人幾丁質(zhì)三苷酶的C-端部分富含絲氨酸殘基，理論上能形成O-糖基化。在50kDa的人幾丁質(zhì)三苷酶中這種類(lèi)型的聚糖尚未被排除或確認(rèn)。
chi.39的cDNA的核苷酸序列顯示了一個(gè)編碼387個(gè)氨基酸殘基的幾乎相同的幾丁質(zhì)三苷酶蛋白的開(kāi)放讀框(見(jiàn)圖2)。在去掉疏水性的前導(dǎo)肽后，chi.39 cDNA預(yù)期的蛋白質(zhì)有366個(gè)氨基酸殘基，分子量為39kDa。信號(hào)肽和起始384個(gè)氨基酸和chi.50 cDNA編碼的幾丁質(zhì)三苷酶蛋白質(zhì)中的相應(yīng)部分是相同的。39kDa的和50kDa的幾丁質(zhì)三苷酶之間的區(qū)別僅僅在于C端的3個(gè)氨基酸殘基。
比較兩種cDNA的核苷酸序列表明在chi.39 cDNA中插入了一段額外的核苷酸序列。
另外，chi.39 cDNA編碼的幾丁質(zhì)三苷酶中沒(méi)有預(yù)測(cè)到N-糖基化作用。
不同形式的幾丁質(zhì)三苷酶之間的關(guān)系示于圖3。
兩種克隆的幾丁質(zhì)三苷酶cDNA的組成強(qiáng)烈地暗示可變拼接方式產(chǎn)生了兩種不同的mRNA。與chi.50 cDNA相比，chi.39 cDNA含有一個(gè)附加的幾丁質(zhì)三苷酶基因外顯子，這點(diǎn)已被試驗(yàn)證實(shí)?；蚪M幾丁質(zhì)三苷酶cDNA已被克隆且被部分測(cè)序，序列表明確實(shí)有內(nèi)含子-外顯子轉(zhuǎn)換，與這兩種不同的cDNA克隆(代表不同的mRNA)是幾丁質(zhì)三苷酶RNA的可變拼接而形成的這一假設(shè)相對(duì)應(yīng)。
培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞的代謝標(biāo)記試驗(yàn)表明，起始合成的是大量的50kDa幾丁質(zhì)三苷酶和極少量的39kDa蛋白質(zhì)。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，RNA酶保護(hù)試驗(yàn)揭示了在巨噬細(xì)胞中chi.50 RNA和少量的chi.39RNA的共同存在。還注意到分泌的50kDa的幾丁質(zhì)三苷酶在被巨噬細(xì)胞吸收后能夠被水解成38-39kDa的蛋白質(zhì)。有可能一些剛合成的幾丁質(zhì)三苷酶尚未被分泌，而是直接到達(dá)溶酶體中，在那里發(fā)生水解。
從Gaucher癥患者的脾臟中至少可分離到兩種幾丁質(zhì)三苷酶的異構(gòu)體。在SDS存在下的PAGE電泳測(cè)得的表觀分子量是50和39kDa。使用電噴射質(zhì)譜精確測(cè)定了從組織中分離的39kDa幾丁質(zhì)三苷酶的分子量，這種分析指示39kDa組織酶(其有正常的N-端)經(jīng)受過(guò)C-端的蛋白水解過(guò)程。應(yīng)該注意到同50kDa前體(除去C-端83個(gè)氨基酸)一樣，39kDa(除去C-端4個(gè)氨基酸)也可能產(chǎn)生組織酶。
對(duì)EMBL和Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索揭示了在兩種人類(lèi)幾丁質(zhì)三苷酶和一組從不同物種中得到的幾丁質(zhì)酶以及有關(guān)蛋白質(zhì)之間有顯著同源性。所有這些同源蛋白質(zhì)都屬于“幾丁質(zhì)酶蛋白質(zhì)家族”(18，19)。
注意到同源性最強(qiáng)的區(qū)域是推測(cè)為幾丁質(zhì)酶催化活性中心的基本單元的區(qū)域(見(jiàn)圖4)。還鑒別了幾丁質(zhì)家族的另外的同源區(qū)域。在圖1中，用黑體字標(biāo)出了39kDa幾丁質(zhì)三苷酶與幾丁質(zhì)酶蛋白質(zhì)家族9個(gè)成員中的至少6個(gè)相同的氨基酸。
50kDa人幾丁質(zhì)三苷酶的預(yù)測(cè)的C-端部分顯示僅僅與分別從Manduca sexta和Brugia malayi中得到的兩種幾丁質(zhì)酶同源。在后者中報(bào)道過(guò)O-糖基化作用(12)。
實(shí)施例2人幾丁質(zhì)三苷酶的重組生產(chǎn)通過(guò)DEAE-Dextran方法(見(jiàn)21)用兩種幾丁質(zhì)三苷酶cDNA轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞。通過(guò)測(cè)量分泌的酶的活性來(lái)計(jì)量幾丁質(zhì)三苷酶的生產(chǎn)。培養(yǎng)基中的幾丁質(zhì)三苷酶的活性測(cè)定使用前述的產(chǎn)生熒光的底物4--甲基傘形酰-幾丁質(zhì)三苷。
COS-1細(xì)胞培養(yǎng)基中，無(wú)論是用chi.50還是用chi.39轉(zhuǎn)染過(guò)的，都在轉(zhuǎn)染7天后含有大量的幾丁質(zhì)三苷酶活性(5-20IU/ml)。而在無(wú)轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞或是轉(zhuǎn)染了以無(wú)義的方向插入的相同cDNA的COS-1細(xì)胞中都未檢測(cè)到活性。
使用抗人幾丁質(zhì)三苷酶的兔抗血清的免疫滴定，分析了COS細(xì)胞的幾丁質(zhì)三苷酶的產(chǎn)生。這種抗血清能夠抑制人類(lèi)幾丁質(zhì)三苷酶的活性。圖5顯示，與分離的脾幾丁質(zhì)三苷酶一樣，抗血清可以使幾丁質(zhì)三苷酶失活。這個(gè)發(fā)現(xiàn)表明在每單位抗原的酶活性方面，這兩種重組幾丁質(zhì)三苷酶與脾中的酶是相似的。
這兩種重組幾丁質(zhì)三苷酶(50和39幾丁質(zhì)酶)與脾臟幾丁質(zhì)三苷酶相比較，其pH適應(yīng)范圍，穩(wěn)定性，對(duì)于4-甲基傘形酰-幾丁質(zhì)三苷和4-甲基傘形酰-幾丁質(zhì)二苷的Km值沒(méi)有顯著的差別。
代謝標(biāo)記實(shí)驗(yàn)表明，分別用chi.50 cDNA和chi.39 cDNA轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞產(chǎn)生的是預(yù)期分子量分別為50kDa和39kDa的幾丁質(zhì)三苷酶蛋白質(zhì)。
實(shí)施例3在此之前我們?cè)_(kāi)發(fā)了一套從Gaucher癥患者的脾臟中得到的幾丁質(zhì)三苷酶的純化方法。該方法可以得到純化的39kDa幾丁質(zhì)三苷酶和部分純化的50kDa的酶。
簡(jiǎn)而言之，是將不含去污劑的提取物加到多緩沖液交換柱(PBE94，Pharmacia Biotech Inc.)，交換柱用25mM的Tris-緩沖液(pH8.5)平衡和洗脫。收集活性最高的洗脫峰并用超濾法濃縮。然后上Sephadex C-1000柱并用25mM的Tris緩沖液(pH8.0)洗脫。收集活性峰值部分，濃縮后進(jìn)行制備型等電聚焦電泳，電泳使用Pharmacia公司的含0.5％(v/v)Triton X-100和0.1％(w/v)的兩性電解質(zhì)(pH4-9范圍，Serva公司產(chǎn))的Ultrodex(Pharmacia)進(jìn)行。電泳在10℃，400V進(jìn)行一夜后，分離膠條并用水提取。等電點(diǎn)8.0的部分含有在SDS-PAGE電泳中表觀分子量為39kDa的純的幾丁質(zhì)三苷酶。等電點(diǎn)在7.2左右的部分含有混雜了其它蛋白的50kDa的幾丁質(zhì)三苷酶。
不純的50kDa的幾丁質(zhì)三苷酶的完全純化可以這樣進(jìn)行，將酶制劑與幾丁質(zhì)顆粒在4℃時(shí)于pH5.2的檸檬酸/磷酸緩沖液中保溫，稍后用含4M氯化鈉的同種緩沖液在室溫下洗脫。污染物將不會(huì)結(jié)合，或用含0.1M的氯化鈉和0.5％(v/v)的Triton X-100的冰預(yù)冷的磷酸緩沖液洗滌幾丁質(zhì)顆粒將其完全除去。
同樣的分離方法可以用來(lái)從幾丁質(zhì)三苷酶cDNA轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中分離重組幾丁質(zhì)三苷酶(幾丁質(zhì)酶)。
純化的39kDa和50kDa的重組幾丁質(zhì)三苷酶的比活性和純化的組織中的酶是一樣的，即，在前述條件下，使用人工合成的4-甲基傘形酰-幾丁質(zhì)三苷作為底物，其活性為6-6.5mmol底物水解/mg蛋白×小時(shí)。
實(shí)施例4幾丁質(zhì)的降解純化的50kDa和39kDa的組織幾丁質(zhì)三苷酶，以及純化的重組技術(shù)生產(chǎn)的39kDa和50kDa的幾丁質(zhì)三苷酶，都能水解4-甲基傘形酰-幾丁質(zhì)三苷和4-甲基傘形酰-幾丁質(zhì)二苷。對(duì)幾丁質(zhì)二苷的活性和對(duì)幾丁質(zhì)三苷的活性的比為大約0.7。而且，對(duì)硝基苯-幾丁質(zhì)三苷和對(duì)硝基苯-幾丁質(zhì)二苷也能夠被有效水解。
幾丁質(zhì)苯胺藍(lán)(Sigma)溶于pH5.2，終濃度為10mg/ml的檸檬酸/磷酸緩沖液。用它來(lái)檢測(cè)幾丁質(zhì)酶的活性。測(cè)550nm波長(zhǎng)下的吸光確定可溶性苯胺藍(lán)的釋放來(lái)檢測(cè)幾丁質(zhì)的降解(18)。用Sigma公司的源于粘質(zhì)沙雷氏菌的幾丁質(zhì)作為對(duì)照。人幾丁質(zhì)三苷酶的對(duì)于4-甲基傘形酰-幾丁質(zhì)三苷的水解活性與細(xì)菌幾丁質(zhì)酶的活性作了比較，見(jiàn)文獻(xiàn)18。
人幾丁質(zhì)三苷酶對(duì)溶壁微球菌的細(xì)胞壁懸液未測(cè)到明顯活性，說(shuō)明此酶缺少溶菌酶活性。
實(shí)施例5為了試驗(yàn)人幾丁質(zhì)三苷酶能否發(fā)揮抗真菌作用，在覆有一層Cellophane膜的平板(含麥芽提取物，蛋白胨，葡萄糖和瓊脂)上培養(yǎng)含幾丁質(zhì)真菌(大毛霉)，覆蓋膜是為了防止菌絲破壞平板瓊脂表面(見(jiàn)參考文獻(xiàn)16)。切下個(gè)別的扇區(qū)，在顯微鏡下計(jì)數(shù)。純化的幾丁質(zhì)酶50和幾丁質(zhì)酶39對(duì)0.5M氯化鈉透析。將含酶溶液的樣品和0.15M氯化鈉加到菌絲尖部。顯微鏡分析表明，酶的使用立即中止了菌絲的生長(zhǎng)，形態(tài)也發(fā)生了變形。用氯化鈉則沒(méi)有這種效果。即使是用的酶的濃度只有0.005mg/ml這么少，也檢測(cè)到了它對(duì)菌絲生長(zhǎng)的負(fù)效應(yīng)。


圖1.chi.50 cDNA克隆的核苷酸序列及相應(yīng)蛋白質(zhì)的推測(cè)氨基酸序列。
下劃線的是疏水性信號(hào)肽(氨基酸1-21)。與幾丁質(zhì)酶家族9個(gè)成員中的至少6個(gè)相同的幾丁質(zhì)三苷酶的氨基酸用黑體字印出。除了從苜蓿銀紋夜蛾病毒和Nicotiana tabacum中得到的幾丁質(zhì)酶之外，所用的幾丁質(zhì)酶家族的9個(gè)成員列于圖4的說(shuō)明中。
圖2.chi.39 cDNA克隆的核苷酸序列及相應(yīng)蛋白質(zhì)的推測(cè)氨基酸序列。
下劃線的是疏水性信號(hào)肽(氨基酸1-21)。
圖3.在巨噬細(xì)胞中產(chǎn)生的不同幾丁質(zhì)酶異構(gòu)體的圖示。
由于拼接方式的不同，產(chǎn)生了兩種不同的mRNA，翻譯成表觀分子量為39kDa和50kDa的幾丁質(zhì)三苷酶蛋白質(zhì)。然而，有些酶可能直接進(jìn)入到溶酶體或是通過(guò)內(nèi)吞到達(dá)那里。在溶酶體中，在C端可能發(fā)生另外的裂解過(guò)程。產(chǎn)生大約38-39kDa的形式。這兩種前體(39-50kDa)能用這種方式成為同一種溶酶體內(nèi)的形式。不能排除50kDa幾丁質(zhì)三苷酶中的C-端含有O-連接的聚糖。39kDa的前體和溶酶體中的幾丁質(zhì)三苷酶則不含聚糖。
圖4.在某些幾丁質(zhì)酶蛋白家族成員中推測(cè)的活性中心區(qū)域的序列對(duì)比這些蛋白質(zhì)包括人幾丁質(zhì)三苷酶；來(lái)源于苜蓿銀紋夜蛾病毒的幾丁質(zhì)酶(GenBank L22858)；來(lái)源于煙草角蟲(chóng)Manduca sexta的幾丁質(zhì)酶(GenBank U02270)；來(lái)源于線蟲(chóng)Brugia malayi的內(nèi)源幾丁質(zhì)酶(GenBank M73689)；一種人輸卵管糖蛋白(GenBankU09550)；HCgp-39，一種由人軟骨細(xì)胞和滑液細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白(GenBank M80927)；YM-1，一種被激活的小鼠巨噬細(xì)胞中的分泌性蛋白(Pir S27879)；一種源于真菌Aphanocladium album的幾丁質(zhì)酶(SwissPort P32470)；一種源于絲狀真菌Trichoderma harzianum的幾丁質(zhì)酶(GenBank L14614)；源于原核環(huán)狀芽孢桿菌的幾丁質(zhì)酶Al(SwissPort P20533)；以及從植物Nicotiana tabacum中得到的V類(lèi)幾丁質(zhì)酶(GenBank X77110)。與幾丁質(zhì)三苷酶相同的殘基用陰文字體給出。蛋白HCgp-39和YM-1預(yù)計(jì)為是不能裂解幾丁質(zhì)的。
圖5.從脾臟中純化的39和50kDa幾丁質(zhì)酶以及轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞生產(chǎn)的39和50kDa的酶的免疫滴定。
含有純化的39kDa脾臟幾丁質(zhì)三苷酶，或是由chi.50 cDNA轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞生產(chǎn)的50kDa幾丁質(zhì)酶，或由chi.39 cDNA轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞生產(chǎn)的39kDa的幾丁質(zhì)酶的制劑，與不同量的兔(抗人脾臟幾丁質(zhì)三苷酶)抗血清在室溫、磷酸鹽緩沖液中保溫1小時(shí)。
抗體與幾丁質(zhì)三苷酶的結(jié)合引起酶活性的喪失。將酶制劑與抗血清保溫后的殘留酶活力可以通過(guò)測(cè)定其對(duì)底物4-甲基傘形酰-幾丁質(zhì)三苷的活性來(lái)確定(18)。不同幾丁質(zhì)三苷酶的免疫滴定曲線的相似性表明在單位抗原酶活方面這些酶是相同的。
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序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)名稱阿姆斯特丹大學(xué)(B)街道Spui21(C)城市阿姆斯特丹(D)州Noord-Holland(E)國(guó)家荷蘭(F)郵政編碼1012WX(A)姓名約翰內(nèi)斯·馬麗亞·弗朗西斯庫(kù)斯·赫拉爾杜斯·阿爾特斯(B)街道Sandbergstraat3(C)城市Abcoude(D)州Utrecht(E)國(guó)家荷蘭(F)郵政編碼1391EJ(ii)發(fā)明名稱人幾丁質(zhì)酶，其重組生產(chǎn)，其分解幾丁質(zhì)的用途及其在治療和預(yù)防感染性疾病中的應(yīng)用(iii)序列數(shù)目16(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒介類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，#1.30版(EPO)(v)本申請(qǐng)數(shù)據(jù)申請(qǐng)?zhí)朥S08/486,839(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類(lèi)型其它核酸(iii)假設(shè)無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO1TGYTAYTTYA CNAAYTGGGC 20(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類(lèi)型其它核酸(iii)假設(shè)無(wú)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵misc-特征(B)位置6..15(D)其它信息/產(chǎn)物＝“N代表肌苷”(xi)序列描述SEQ ID NO2CCARTCNARR TYNACNCCRT CRAA24(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1643個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)
(xi)序列描述SEQ ID NO3CTGAGCTGCA TCATGGTGCG GTCTGTGGCC TGGGCAGGTT TCATGGTCCT GCTGATGATC60CCATGGGGCT CTGCTCCAAA ACTGGTCTGC TACTTCACCA ACTGGGCCCA GTACAGACAG120GGGGAGGCTC GCTTCCTGCC CAAGGACTTG GACCCCAGCC TTTGCACCCA CCTCATCTAC180GCCTTCGCTG GCATGACCAA CCACCAGCTG AGCACCACTG AGTGGAATGA CGAGACTCTC240TACCAGGAGT TCAATGGCCT GAAGAAGATG AATCCCAAGC TGAAGACCCT GTTAGCCATC300GGAGGCTGGA ATTTCGGCAC TCAGAAGTTC ACAGATATGG TAGCCACGGC CAACAACCGT360CAGACCTTTG TCAACTCGGC CATCAGGTTT CTGCGCAAAT ACAGCTTTGA CGGCCTTGAC420CTTGACTGGG AGTACCCAGG AAGCCAGGGG AGCCCTGCCG TAGACAAGGA GCGCTTCACA480ACCCTGGTAC AGGACTTGGC CAATGCCTTC CAGCAGGAAG CCCAGACCTC AGGGAAGGAA540CGCCTTCTTC TGAGTGCAGC GGTTCCAGCT GGGCAGACCT ATGTGGATGC TGGATACGAG600GTGGACAAAA TCGCCCAGAA CCTGGATTTT GTCAACCTTA TGGCCTACGA CTTCCATGGC660TCTTGGGAGA AGGTCACGGG ACATAACAGC CCCCTCTACA AGAGGCAAGA AGAGAGTGGT720GCAGCAGCCA GCCTCAACGT GGATGCTGCT GTGCAACAGT GGCTGCAGAA GGGGACCCCT780GCCAGCAAGC TGATCCTTGG CATGCCTACC TACGGACGCT CCTTCACACT GGCCTCCTCA840TCAGACACCA GAGTGGGGGC CCCAGCCACA GGGTCTGGCA CTCCAGGCCC CTTCACCAAG900GAAGGAGGGA TGCTGGCCTA CTATGAAGTC TGCTCCTGGA AGGGGGCCAC CAAACAGAGA960ATCCAGGATC AGAAGGTGCC CTACATCTTC CGGGACAACC AGTGGGTGGG CTTTGATGAT1020GTGGAGAGCT TCAAAACCAA GGTCAGCTAT CTGAAGCAGA AGGGACTGGG CGGGGCCATG1080GTCTGGGCAC TGGACTTAGA TGACTTTGCC GGCTTCTCCT GCAACCAGGG CCGATACCCC1140CTCATCCAGA CGCTACGGCA GGAACTGAGT CTTCCATACT TGCCTTCAGG CACCCCAGAG1200CTTGAAGTTC CAAAACCAGG TCAGCCCTCT GAACCTGAGC ATGGCCCCAG CCCTGGACAA1260GACACGTTCT GCCAGGGCAA AGCTGATGGG CTCTATCCCA ATCCTCGGGA ACGGTCCAGCl320TTCTACAGCT GTGCAGCGGG GCGGCTGTTC CAGCAAAGCT GCCCGACAGG CCTGGTGTTC1380AGCAACTCCT GCAAATGCTG CACCTGGAAT TGAGTCGTAA AGCCCCTCCA GTCCAGCTTT1440GAGGCTGGGC CTAGGATCAC TCTACAGCCT GCCTCCTGGG TTTTCCTGGG GGCCGCAATC1500TGGCTCCTGC AGGCCTTTCT GTGGTCTTCC TTTATCCAGG CTTTCTGCTC TCAGCCTTGC1560CTTCCTTTTT TCTGGGTCTC CTGGGCTGCC CCTTTCACTT GCAAAATAAA TCTTTGGTTT1620GTGCCCCTCT TCAAAAAAAA AAA1643(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度466個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈性未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Val Arg Ser Val Ala Trp Ala Gly Phe Met Val Leu Leu Met Ile1 5 10 15Pro Trp Gly Ser Ala Ala Lys Leu Val Cys Tyr Phe Thr Asn Trp Ala20 25 30Gln Tyr Arg Gln Gly Glu Ala Arg Phe Leu Pro Lys Asp Leu Asp Pro35 40 45Ser Leu Cys Thr His Leu Ile Tyr Ala Phe Ala Gly Met Thr Asn His50 55 60Gln Leu Ser Thr Thr Glu Trp Asn Asp Glu Thr Leu Tyr Gln Glu Phe65 70 75 80Asn Gly Leu Lys Lys Met Asn Pro Lys Leu Lys Thr Leu Leu Ala Ile85 90 95Gly Gly Trp Asn Phe Gly Thr Gln Lys Phe Thr Asp Met Val Ala Thr100 105 110Ala Asn Asn Arg Gln Thr Phe Val Asn Ser Ala Ile Arg Phe Leu Arg115 120 125Lys Tyr Ser Phe Asp Gly Leu Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Gly Ser130 135 140Gln Gly Ser Pro Ala Val Asp Lys Glu Arg Phe Thr Thr Leu Val Gln145 150 155 160Asp Leu Ala Asn Ala Phe Gln Gln Glu Ala Gln Thr Ser Gly Lys Glu165 170 175Arg Leu Leu Leu Ser Ala Ala Val Pro Ala Gly Gln Thr Tyr Val Asp180 185 190Ala Gly Tyr Glu Val Asp Lys Ile Ala Gln Asn Leu Asp Phe Val Asn195 200 205Leu Met Ala Tyr Asp Phe His Gly Ser Trp Glu Lys Val Thr Gly His210 215 220Asn Ser Pro Leu Tyr Lys Arg Gln Glu Glu Ser Gly Ala Ala Ala Ser225 230 235 240Leu Asn Val Asp Ala Ala Val Gln Gln Trp Leu Gln Lys Gly Thr Pro245 250 255
Ala Ser Lys Leu Ile Leu Gly Met Pro Thr Tyr Gly Arg Ser Phe Thr260 265 270Leu Ala Ser Ser Ser Asp Thr Arg Val Gly Ala Pro Ala Thr Gly Ser275 280 285Gly Thr Pro Gly Pro Phe Thr Lys Glu Gly Gly Met Lau Ala Tyr Tyr290 295 300Glu Val Cys Ser Trp Lys Gly Ala Thr Lys Gln Arg Ile Gln Asp Gln205 310 315 320Lys Val Pro Tyr Ile Phe Arg Asp Asn Gln Trp Val Gly Phe Asp Asp225 330 335Val Glu Ser Phe Lys Thr Lys Val Ser Tyr Leu Lys Gln Lys Gly Leu340 345 350Gly Gly Ala Met Val Trp Ala Leu Asp Leu Asp Asp Phe Ala Gly Phe355 360 365Ser Cys Asn Gln Gly Arg Tyr Pro Leu Ile Gln Thr Leu Arg Gln Glu370 375 380Leu Ser Leu Pro Tyr Leu Pro Ser Gly Thr Pro Glu Leu Glu Val Pro385 390 395 400Lys Pro Gly Gln Pro Ser Glu Pro Glu His Gly Pro Ser Pro Gly Gln405 410 415Asp Thr Phe Cys G1n Gly Lys Ala Asp Gly Leu Tyr Pro Asn Pro Arg420 425 430Glu Arg Ser Ser Phe Tyr Ser Cys Ala Ala Gly Arg Leu Phe Gln Gln435 440 445Ser Cys Pro Thr Gly Leu Val Phe Ser Asn Ser Cys Lys Cys Cys Thr450 455 460Trp Asn465(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1713個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)鏈性未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假設(shè)無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO5CTGAGCTGCA TCATGGTGCG GTCTGTGGCC TGGGCAGGTT TCATGGTCCT GCTGATGATC60CCATGGGGCT CTGCTCCAAA ACTGGTCTGC TACTTCACCA ACTGGGCCCA GTACAGACAG120GGGGAGGCTC GCTTCCTGCC CAAGGACTTG GACCCCAGCC TTTGCACCCA CCTCATCTAC180GCCTTCGCTG GCATGACCAA CCACCAGCTG AGCACCACTG AGTGGAATGA CGAGACTCTC240TACCAGGAGT TCAATGGCCT GAAGAAGATG AATCCCAAGC TGAAGACCCT GTTAGCCATC300GGAGGCTGGA ATTTCGGCAC TCAGAAGTTC ACAGATATGG TAGCCACGGC CAACAACCGT360CAGACCTTTG TCAACTCGGC CATCAGGTTT CTGCGCAAAT ACAGCTTTGA CGGCCTTGAC420CTTGACTGGG AGTACCCAGG AAGCCAGGGG AGCCCTGCCG TAGACAAGGA GCGCTTCACA480ACCCTGGTAC AGGACTTGGC CAATGCCTTC CAGCAGGAAG CCCAGACCTC AGGGAAGGAA540CGCCTTCTTC TGAGTGCAGC GGTTCCAGCT GGGCAGACCT ATGTGGATGC TGGATACGAG600GTGGACAAAA TCGCCCAGAA CCTGGATTTT GTCAAACTTA TGGCCTACGA CTTCCATGGC660TCTTGGGAGA AGGTCACGGG ACATAACAGC CCCCTCTACA AGAGGCAAGA AGAGAGTGGT720GCAGCAGCCA GCCTCAACGT GGATGCTGCT GTGCAACAGT GGCTGCAGAA GGGGACCCCT780GCCAGCAAGC TGATCTTGG CATGCCTACC TACGGACGCT CCTTCACACT GGCCTCCTCAa40TCAGACACCA GAGTGGGGGC CCCAGCCACA GGGTCTGGCA CTCCAGGCCC CTTCACCAAG900GAAGGAGGGA TGCTGGCCTA CTATGAAGTC TGCTCCTGGA AGGGGGCCAC CAAACAGAGA960ATCCAGGATC AGAAGGTGCC CTACATCTTC CGGGACAACC AGTGGGTGGG CTTTGATGAT1020GTGGAGAGCT TCAAAACCAA GGTCAGCTAT CTGAAGCAGA AGGGACTGGG CGGGGCCATG1080GTCTGGGCAC TGGACTTAGA TGACTTTGCC GGCTTCTCCT GCAACCAGGG CCGATACCCC1140CTCATCCAGA CGCTACGGCA GGAACTGAAT GGGTAAAGCC TTAACTGCCT GTCACATGTG1200AGGCCAGGTG TTGCCTGTGG CACTGTGCTT CAGCTGTAGG TCTTCCATAC TTGCCTTCAG1260GCACCCCAGA GCTTGAAGTT CCAAAACCAG GTCAGCCCTC TGAACCTGAG CATGGCCCAA1320GCCCTGGACA AGACACGTTC TGCCAGGGCA AAGCTGATGG GCTCCATCCC AATCCTCGGG1380AACGGTCCAG CTTCTACAGC TGTGCAGCGG GGCGGCTGTT CCAGCAAAGC TGCCCGACAG1440GCCTGGTGTT CAGCAACTCC TGCAAATGCT GCACCTGGAA TTGAGTCGTA AAGCCCCTCC1500AGTCCAGCTT TGAGGCTGGG CCCAGGATCA CTCTACAGCC TGCCTCCTGG GTTTTCCTGG1560GGGCCCCAAT CTGGCTCCTG CAGGCCTTTC TGTGGTCTTC CTTTATCCAG GCTTTCTGCT1620CTCAGCCTTG CCTTCCTTTT TTCTGGGTCT CCTGGGCTGC CCCTTTCACT TGCAAAATAA1680ATCTTTGGTT TGTGCCCCTC AAAAAAAAAA AAA 1713(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度387個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈性未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Val Arg Ser Val Ala Trp Ala Gly Phe Met Val Leu Leu Met Ile1 5 10 15Pro Trp Gly Ser Ala Ala Lys Leu Val Cys Tyr Phe Thr Asn Trp Ala20 25 30Gln Tyr Arg Gln Gly Glu Ala Arg Phe Leu Pro Lys Asp Leu Asp Pro35 40 45Ser Leu Cys Thr His Leu Ile Tyr Ala Phe Ala Gly Met Thr Asn His50 55 60Gln Leu Ser Thr Thr Glu Trp Asn Asp Glu Thr Leu Tyr Gln Glu Phe65 70 75 80Asn Gly Leu Lys Lys Met Asn Pro Lys Leu Lys Thr Leu Leu Ala Ile85 90 95Gly Gly Trp Asn Phe Gly Thr Gln Lys Phe Thr Asp Met Val Ala Thr100 105 110Ala Asn Asn Arg Gln Thr Phe Val Asn Ser Ala Ile Arg Phe Leu Arg115 120 125Lys Tyr Ser Phe Asp Gly Leu Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Gly Ser130 135 140Gln Gly Ser Pro Ala Val Asp Lys Glu Arg Phe Thr Thr Leu Val Gln145 150 155 160Asp Leu Ala Asn Ala Phe Gln Gln Glu Ala Gln Thr Ser Gly Lys Glu165 170 175Arg Leu Leu Leu Ser Ala Ala Val Pro Ala Gly Gln Thr Tyr Val Asp180 185 190Ala Gly Tyr Glu Val Asp Lys Ile Ala Gln Asn Leu Asp Phe Val Asn195 200 205Leu Met Ala Tyr Asp Phe His Gly Ser Trp Glu Lys Val Thr Gly His210 215 220Asn Ser Pro Leu Tyr Lys Arg Gln Glu Glu Ser Gly Ala Ala Ala Ser225 230 235 240Leu Asn Val Asp Ala Ala Val Gln Gln Trp Leu Gln Lys Gly Thr Pro245 250 255Ala Ser Lys Leu Ile Leu Gly Met Pro Thr Tyr Gly Arg Ser Phe Thr260 265 270Leu Ala Ser Ser Ser Asp Thr Arg Val Gly Ala Pro Ala Thr Gly Ser275 280 285Gly Thr Pro Gly Pro Phe Thr Lys Glu Gly Gly Met Leu Ala Tyr Tyr290 295 300Glu Val Cys Ser Trp Lys Gly Ala Thr Lys Gln Arg Ile Gln Asp Gln305 310 315 320Lys Val Pro Tyr Ile Phe Arg Asp Asn Gln Trp Val Gly Phe Asp Asp325 330 335Val Glu Ser Phe Lys Thr Lys Val Ser Tyr Leu Lys Gln Lys Gly Leu340 345 350Gly Gly Ala Met Val Trp Ala Leu Asp Leu Asp Asp Phe Ala Gly Phe355 360 365Ser Cys Asn Gln Gly Arg Tyr Pro Leu Ile Gln Thr Leu Arg Gln Glu370 375 380Leu Asn Gly385(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度11個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈性未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO7Phe Asp Gly Leu Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro1 5 10(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度11個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈性未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO8Phe Asp Gly Val Asp Ile Asp Trp Glu Phe Pro1 5 10(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度11個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈性未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO9Phe Asp Gly Phe Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro1 5 10(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度11個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈性未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO10Phe Asp Gly Leu Asp Leu Phe Phe Leu Tyr Pro1 5 10(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度11個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈性未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO11Phe Asp Gly Leu Asp Leu Ala Trp Leu Tyr Pro1 5 10(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度11個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈性未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO12Phe Asp Gly Leu Asn Leu Asp Trp Gln Tyr Pro1 5 10(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度11個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈性未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO13Phe Asp Gly Ile Asp Ile Asp Trp Glu Tyr Pro1 5 10(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度11個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈性未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO14Phe Asp Gly Ile Asp Val Asp Trp Glu Tyr Pro15 10(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度11個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈性未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO15Phe Asp Gly Val Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro1 5 10(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度11個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈性未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ii)分子類(lèi)型蛋白質(zhì)(iii)假設(shè)無(wú)(xi)序列描述SEQ ID NO16Phe His Gly Leu Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro1 5 10
權(quán)利要求
1.一種基本上分離或純化的幾丁質(zhì)酶，所說(shuō)的幾丁質(zhì)酶是人幾丁質(zhì)酶，具有與圖1中所示的氨基酸序列或圖2中所示的氨基酸序列基本上相應(yīng)的氨基酸序列，或者是具有基本上相似的幾丁質(zhì)水解活性的所說(shuō)人幾丁質(zhì)酶的修飾形式。
2.權(quán)利要求1的幾丁質(zhì)酶，其用基因工程化宿主細(xì)胞生產(chǎn)并從所說(shuō)的宿主細(xì)胞或培養(yǎng)所說(shuō)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中分離出來(lái)，其中該酶的氨基酸序列是由與圖1中的核苷酸序列或與圖2中的核苷酸序列基本上相應(yīng)的核苷酸序列所編碼的。
3.權(quán)利要求1的幾丁質(zhì)酶，具有基本上與圖1中所示的氨基酸序列相應(yīng)的氨基酸序列并且分子量大約為50kDa。
4.權(quán)利要求1的幾丁質(zhì)酶，具有基本上與圖2中所示的氨基酸序列相應(yīng)的氨基酸序列并且分子量大約為39kDa。
5.一種藥物組合物，包括權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的幾丁質(zhì)酶以及一種藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
6.一種用于人類(lèi)個(gè)體中抗含幾丁質(zhì)病原體感染的治療或預(yù)防用的藥物組合物，包括治療或預(yù)防有效量的權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的幾丁質(zhì)酶以及一種藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
7.權(quán)利要求6的藥物組合物，進(jìn)一步包括治療或預(yù)防有效量的人類(lèi)β-1，3-葡聚糖酶。
8.一種非藥物組合物，包括權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的幾丁質(zhì)酶以及一種載體或稀釋劑。
9.權(quán)利要求8的組合物，它是一種培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基。
10.權(quán)利要求8的組合物，它是一種培養(yǎng)人類(lèi)細(xì)胞的培養(yǎng)基。
11.權(quán)利要求8的組合物，它是一種化妝品如體膚露，牙用品如牙膏，漱口水，或食品如牛奶，奶酪或其它乳制品。
12.一種幾丁質(zhì)基制品，它包括幾丁質(zhì)水解量的權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的幾丁質(zhì)酶。
13.權(quán)利要求12的幾丁質(zhì)基制品，它是一種控制藥物釋放的含有藥物的藥物載體或植入物。
14.權(quán)利要求12的幾丁質(zhì)基制品，它是一種起暫時(shí)功能的植入物。
15.一種用于人類(lèi)個(gè)體中抗含幾丁質(zhì)病原體感染的治療或預(yù)防方法，包括給予所說(shuō)的人類(lèi)個(gè)體權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)所述的藥物組合物。
16.一種制備人幾丁質(zhì)酶的方法，所述的酶具有與圖1中所示的氨基酸序列或圖2中所示的氨基酸序列基本上相應(yīng)的氨基酸序列，或者是具有基本上相似的幾丁質(zhì)水解活性的所說(shuō)人幾丁質(zhì)酶的修飾形式，所述方法包括培養(yǎng)能夠生產(chǎn)所說(shuō)的人幾丁質(zhì)酶或其修飾形式的基團(tuán)工程化宿主或宿主細(xì)胞，以及從所說(shuō)的宿主或宿主細(xì)胞中或從培養(yǎng)所說(shuō)宿主或宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中分離所生產(chǎn)的幾丁質(zhì)酶。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所說(shuō)的幾丁質(zhì)酶的氨基酸序列是由與圖1的核苷酸序列或與圖2的核苷酸序列基本上相應(yīng)的核苷酸序列所編碼的。
18.一種能夠生產(chǎn)人幾丁質(zhì)酶的基因工程化宿主細(xì)胞，所說(shuō)的幾丁質(zhì)酶具有與圖1中所示的氨基酸序列或圖2中所示的氨基酸序列基本上相應(yīng)的氨基酸序列，或者是具有基本上相似的幾丁質(zhì)水解活性的所說(shuō)人幾丁質(zhì)酶的修飾形式。
19.一種重組核酸，包括一種編碼與圖1中所示的氨基酸序列或圖2中所示的氨基酸序列基本上相應(yīng)的氨基酸序列的核苷酸序列，或是互補(bǔ)于該核苷酸序列的核苷酸序列。
20.權(quán)利要求19的重組核酸，其中所說(shuō)的核苷酸序列基本上相應(yīng)于，或基本上互補(bǔ)于，圖1中所示的核苷酸序列或圖2中所示的核苷酸序列。
21.一種至少有8個(gè)核苷酸的寡核苷酸，具有基本上相應(yīng)于或基本上互補(bǔ)于圖1中所示的核苷酸序列或圖2中所示的核苷酸序列的核苷酸序列，并且能夠在嚴(yán)格雜交條件下與編碼權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的人幾丁質(zhì)酶的核酸通過(guò)雜交結(jié)合。
22.一種至少含有8個(gè)氨基酸殘基的肽，含有源于圖1中所示的氨基酸序列或圖2中所示的氨基酸序列的氨基酸序列并且代表或模擬權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的人幾丁質(zhì)酶的一個(gè)抗原決定簇。
23.權(quán)利要求22的肽，具有與圖1中所示的氨基酸序列或圖2中所示的氨基酸序列相應(yīng)的氨基酸序列且具有抗原性。
24.一種能夠與權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的人幾丁質(zhì)酶結(jié)合的抗體。
25.權(quán)利要求24的抗體，其是一種單克隆抗體。
26.一種診斷試劑盒，包括權(quán)利要求24或25的抗體，以及檢測(cè)抗原或抗體的診斷試劑盒的常規(guī)組分。
27.一種診斷試劑盒，包括權(quán)利要求22或23的肽，以及檢測(cè)抗原或抗體的診斷試劑盒的常規(guī)組分。
28.一種診斷試劑盒，包括權(quán)利要求21的寡核苷酸，以及檢測(cè)核酸的診斷試劑盒的常規(guī)組分。
29.一種診斷試劑盒，包括權(quán)利要求19或20的重組核酸，以及檢測(cè)核酸的試劑盒的常規(guī)組分。
30.一種診斷試劑盒，包括權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的人幾丁質(zhì)酶，以及檢測(cè)抗原或抗體的試劑盒的常規(guī)組分。
31.一種分解幾丁質(zhì)的方法，包括使所說(shuō)的幾丁質(zhì)與權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的人幾丁質(zhì)酶在使幾丁質(zhì)水解的條件下接觸。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種具有圖1或圖2中所示的氨基酸序列的新的人幾丁質(zhì)酶,及其具有相似的幾丁質(zhì)水解活性的修飾形式,以及呈現(xiàn)其一個(gè)抗原決定簇的抗原性肽。還公開(kāi)了通過(guò)工程宿主或宿主細(xì)胞生產(chǎn)重組人幾丁質(zhì)酶的方法,以及編碼該酶的重組核酸,和人幾丁質(zhì)酶特異性寡核苷酸。本發(fā)明也描述了用于對(duì)人體含幾丁質(zhì)病原體感染的治療或預(yù)防的方法,或是用于分解如幾丁質(zhì)基制品中的幾丁質(zhì)的方法,與人幾丁質(zhì)酶結(jié)合的抗體,包括人幾丁質(zhì)酶、其抗原性肽、人幾丁質(zhì)酶抗體、重組核酸或寡核苷酸的診斷試劑盒。
文檔編號(hào)A61K8/00GK1193352SQ96195511
公開(kāi)日1998年9月16日 申請(qǐng)日期1996年6月6日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月7日
發(fā)明者約翰內(nèi)斯·馬麗亞·弗郎西斯庫(kù)斯·, 赫拉爾杜斯·阿爾特斯 申請(qǐng)人:阿姆斯特丹大學(xué)