基于基因沉默技術(shù)的舞毒蛾幾丁質(zhì)酶基因及dsRNA的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種昆蟲幾丁質(zhì)酶5基因的基因片段及其dsRNA的應(yīng)用，通過對(duì)舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因的克隆和測(cè)序，得到核苷酸序列為SEQIDNO：1的全長(zhǎng)幾丁質(zhì)酶5基因，從中選出序列為SEQIDNO：2的幾丁質(zhì)酶5基因片段，用于dsRNA的合成。將上述dsRNA注入舞毒蛾的體腔后，舞毒蛾因蛻皮困難死亡。為安全無公害的害蟲防治方法的研制提供新的途徑。
【專利說明】基于基因沉默技術(shù)的舞毒蛾幾丁質(zhì)酶基因及dsRNA

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及基于基因沉默技術(shù)的舞毒蛾致死基因片段Chitinase5及其dsRNA和dsRNA在致死害蟲中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]在我國(guó)，化學(xué)藥劑連續(xù)單一長(zhǎng)期使用已導(dǎo)致昆蟲對(duì)多種農(nóng)藥產(chǎn)生了不同程度的抗藥性，例如，對(duì)于害蟲舞毒蛾需要不斷加大農(nóng)藥使用量才能達(dá)到滿意的防治效果，造成了更為嚴(yán)重的環(huán)境污染，形成惡性循環(huán)。另外，舞毒蛾還會(huì)影響人類健康，當(dāng)人們直接接觸舞毒蛾時(shí)，常會(huì)發(fā)生紅腫發(fā)癢現(xiàn)象，嚴(yán)重者甚至產(chǎn)生皮疹。因此，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中，急需化學(xué)農(nóng)藥之外的替代防治手段。
[0003]RNA干擾(RNA interference, RNAi )是一種由雙鏈RNA介導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象，雙鏈RNA最終被加工成大小約為22nt的小RNA (siRNA)，通過序列配對(duì)的方式與蛋白編碼基因結(jié)合，根據(jù)序列配對(duì)的程度降解靶標(biāo)基因mRNA或抑制基因的蛋白翻譯過程。RNAi廣泛地存在于真菌、植物和動(dòng)物中。2006年Andre Fire和Craig Mello因發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象被授予諾貝爾醫(yī)學(xué)與生理獎(jiǎng)。
[0004]在生物體中，一些重要的基因?qū)S持生命是必須的。因此，從理論上而言，如果利用RNA干擾技術(shù)將農(nóng)業(yè)害蟲中重要基因的表達(dá)進(jìn)行干擾，則會(huì)引起害蟲的致畸或致死，從而達(dá)到控制害蟲的目的。
[0005]幾丁質(zhì)降解和代謝是昆蟲等節(jié)肢動(dòng)物體內(nèi)特有的生物學(xué)現(xiàn)象，由于人類和其他高等動(dòng)物體內(nèi)不含幾丁質(zhì)，因此昆蟲幾丁質(zhì)降解系統(tǒng)已被公認(rèn)為新型殺蟲劑作用的靶標(biāo)。幾丁質(zhì)酶在昆蟲幾丁質(zhì)的降解過程中起著關(guān)鍵作用，采用RNA干擾技術(shù)，開展幾丁質(zhì)酶dsRNA在害蟲防治中的應(yīng)用具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的提供一種昆蟲舞毒蛾的幾丁質(zhì)酶5基因和其致死基因片段，由該基因片段合成的dsRNA和dsRNA在致死害蟲舞毒蛾中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
一種舞毒蛾的幾丁質(zhì)酶5基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；是通過設(shè)計(jì)昆蟲幾丁質(zhì)酶的簡(jiǎn)并引物后，PCR擴(kuò)增獲得其保守區(qū)，通過RACE-PCR擴(kuò)增獲得全長(zhǎng)，命名為L(zhǎng)dCHT5。其全長(zhǎng)為1895bp，其中可讀框1737bp，編碼578個(gè)氨基酸，5丨-UTR和3丨-UTR的長(zhǎng)度分別為42bp和116bp。
[0008]上述舞毒蛾的幾丁質(zhì)酶5基因的致死片段，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，是根據(jù)SEQ ID NO:1設(shè)計(jì)上游引物SEQ ID NO:3和下游引物SEQ ID NO:4，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得。
[0009]進(jìn)一步利用相關(guān)試劑盒，根據(jù)舞毒蛾的幾丁質(zhì)酶5基因致死片段合成dsRNA。
[0010]dsRNA在致死害蟲中的應(yīng)用:注射dsRNA到舞毒蛾的預(yù)蛹期幼蟲體腔，結(jié)果表明:在昆蟲體內(nèi)，dsRNA可以特異性的沉默幾丁質(zhì)酶5基因的mRNA表達(dá)，致使舞毒蛾因蛻皮困難死亡。
[0011]本發(fā)明設(shè)計(jì)合理，獲得了舞毒蛾的幾丁質(zhì)酶5基因的致死基因片段，及由該基因片段合成的dsRNA，提供了針對(duì)害蟲舞毒蛾的一種生物學(xué)防治方法，有望減少農(nóng)藥的大量使用，保護(hù)環(huán)境，降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)收益，具有市場(chǎng)應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1表示預(yù)蛹期舞毒蛾幼蟲注射dsRNA后對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育的影響。注射dsRNA的實(shí)驗(yàn)組(圖中A、B)出現(xiàn)蛻皮困難無法化為成蟲而死亡的表型，注射DEPC處理水的對(duì)照組(圖中C、D)發(fā)育正常。

【具體實(shí)施方式】
[0013]實(shí)施例1
舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因全長(zhǎng)的獲得方法如下:
(1)、PCR引物的設(shè)計(jì)
根據(jù)已知的昆蟲幾丁質(zhì)酶5的氨基酸保守序列，設(shè)計(jì)了如下簡(jiǎn)并性引物如下:
上游引物:CHT5F 5’ -GAYTGGGAGTACCCHGG-3’，
下游引物:CHT5R 5’-TCCATRTCRATRGCCCA-3’ ；
(2)、舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因RACE引物的設(shè)計(jì)基于上述得到的片段設(shè)計(jì)引物如下:
5’ RACE 上游引物:5’ - CGCTACGTAACGGCATGACAGTG(C) 16-3’
5’ RACE 下游引物:5’ - GGTGTACGGAGCAGGATCGCCACC-3’
3’ RACE 上游引物:5’ - GCTGGATGCTATCCACGTGATGTCG-3’
3’ RACE 下游引物:5’ - CGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T) 18-3’
所有引物均由上海英濰捷基生物有限公司合成。
[0014](3)舞毒蛾總RNA的獲得
選取大小一致的舞毒蛾4齡幼蟲，3頭一組，冷凍于液氮中，待提取總RNA，提取總RNA的具體操作步驟按照TaKaRa的Trizol試劑盒。
[0015](4)、舞毒蛾cDNA第一鏈的合成
cDNA 第一鏈的合成的操作步驟參照 PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNAEraser試齊[J盒。
[0016](5)、PCR 擴(kuò)增
以上述cDNA第一鏈為模板，根據(jù)Taq酶(TIANGEN)說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將所擴(kuò)增的片段進(jìn)一步克隆、測(cè)序。
[0017](6)序列分析
利用ExPASy分析所獲得的序列，并在NCBI網(wǎng)站中使用BLAST功能進(jìn)行序列同源性比對(duì)，確定所獲得的基因片段為舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因。
[0018]上述舞毒蛾的幾丁質(zhì)酶5基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0019]實(shí)施例2
舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因致死片段的獲得方法如下: 根據(jù)實(shí)施例1獲得的舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因的核苷酸序列,采用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性的引物，上游引物序列為SEQ ID NO:3，下游引物序列為SEQ ID N0:4，所有引物均由上海英濰捷基生物有限公司合成；其中，上游引物和下游引物需要針對(duì)實(shí)施例1獲得的舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因的核苷酸序列進(jìn)行設(shè)計(jì)， 申請(qǐng)人:經(jīng)過對(duì)多個(gè)上下游引物設(shè)計(jì)和多個(gè)基因片段的認(rèn)真篩選后，才最終確定了具有實(shí)際應(yīng)用效果的致死基因片段。
[0020]將成功連接實(shí)施例1獲得的舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因的重組pEASY-Tl質(zhì)粒做為模板，PCR擴(kuò)增獲得舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因致死片段，使用MicroElute Cycle Pure Kit(OMEGA)試劑盒進(jìn)行純化。
[0021]上述舞毒蛾的幾丁質(zhì)酶5基因致死片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0022]實(shí)施例3
舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因致死片段的dsRNA的獲得
用實(shí)施例2獲得的幾丁質(zhì)酶5基因致死片段，按照T7RiboMAX Express RNAi System(Promega)試劑盒說明書，體外轉(zhuǎn)錄合成dsRNA。得到的dsRNA用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其單一性，用酶標(biāo)儀(Thermo Scientific Multiskan GO, Thermo Fisher Scientific,USA)檢測(cè)其濃度，并濃縮至終濃度Ιμ8/μ?保存至-80°c備用。
[0023]實(shí)施例4
dsRNA在致死害蟲舞毒蛾中的應(yīng)用如下:
舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因致死片段的dsRNA的致死舞毒蛾實(shí)驗(yàn)
(I)舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因片段的dsRNA注射
選取預(yù)蛹期幼蟲用于注射上述合成的dsRNA。5ul規(guī)格的微量注射器用于注射，注射時(shí)不可用力過大，側(cè)腹部作為注射點(diǎn)，注意避開氣門。注射dsRNA的量為5Pg，并設(shè)置注射等量的DEPC處理的水的對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各20頭。注射完畢后，將幼蟲放置于生化培養(yǎng)箱中用購(gòu)自中國(guó)林科院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所進(jìn)行飼養(yǎng)(光照:黑暗時(shí)間=16h:8h，溫度 26±1°C，濕度 70%)。
[0024](2)、注入dsRNA后舞毒蛾表型的觀察
幼蟲注射完畢后繼續(xù)飼養(yǎng)，并及時(shí)地觀察。注射dsRNA舞毒蛾的實(shí)驗(yàn)組有部分幼蟲因無法蛻蛹化為成蟲而死亡。
[0025](3)、注入dsRNA后舞毒蛾死亡情況的觀察
注射dsRNA的舞毒蛾實(shí)驗(yàn)組死亡率為25%，這與注射DEPC處理的對(duì)照組(死亡率為
1.67%)相比，致死效果明顯。
【權(quán)利要求】
1.一種舞毒蛾的幾丁質(zhì)酶5基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.—種舞毒蛾的幾丁質(zhì)酶5基因致死片段，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3.—種權(quán)利要求1所述的舞毒蛾的幾丁質(zhì)酶5基因的獲得方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)、PCR引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)已知的昆蟲幾丁質(zhì)酶5的氨基酸保守序列，設(shè)計(jì)了如下簡(jiǎn)并性引物如下: 上游引物:CHT5F 5’ -GAYTGGGAGTACCCHGG-3’， 下游引物:CHT5R 5’-TCCATRTCRATRGCCCA-3’ ； (2)、舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因RACE引物的設(shè)計(jì) 基于上述得到的片段設(shè)計(jì)引物如下:
5’ RACE 上游引物:5’ - CGCTACGTAACGGCATGACAGTG (C) 16-3’
5’ RACE 下游引物:5’ - GGTGTACGGAGCAGGATCGCCACC-3’
3’ RACE 上游引物:5’ - GCTGGATGCTATCCACGTGATGTCG-3’
3’ RACE 下游引物:5’ - CGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T) 18-3’ (3)、舞毒蛾總RNA的獲得 提取總RNA的具體操作步驟按照TaKaRa的Trizol試劑盒； (4)、舞毒蛾cDNA第一鏈的合成 cDNA 第一鏈的合成的操作步驟參照 PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNAEraser試齊[J盒； (5)、PCR擴(kuò)增 以上述cDNA第一鏈為模板，根據(jù)Taq酶說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將所擴(kuò)增的片段進(jìn)一步克隆、測(cè)序； (6)、序列分析 利用ExPASy分析所獲得的序列，并在NCBI網(wǎng)站中使用BLAST功能進(jìn)行序列同源性比對(duì)，確定所獲得的基因片段為舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
4.一種權(quán)利要求2所述的舞毒蛾的幾丁質(zhì)酶5基因致死片段的獲得方法，其特征在于:包括如下步驟: 根據(jù)權(quán)利要求3獲得的舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)上游引物序列為SEQID NO:3，下游引物序列為SEQ ID NO:4 ;將成功連接權(quán)利要求3獲得的舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因的重組pEASY-Tl質(zhì)粒做為模板，PCR擴(kuò)增獲得幾丁質(zhì)酶5基因致死片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，使用MicroElute Cycle Pure Kit試劑盒進(jìn)行純化。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求2所述的昆蟲幾丁質(zhì)酶5基因致死片段合成的dsRNA。
6.權(quán)利要求5所述的利用舞毒蛾幾丁質(zhì)酶5基因致死片段合成的dsRNA在致死害蟲舞毒蛾中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/56GK104293810SQ201410439310
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年9月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月1日
【發(fā)明者】范曉軍, 張建棟, 趙秋勇, 張常, 劉建紅, 糜艷霞 申請(qǐng)人:太原理工大學(xué)