專利名稱：一種昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)合成酶1基因片段及其dsRNA和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)合成酶1基因片段及其dsRNA和 dsRNA致死害蟲(chóng)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)為害是我國(guó)農(nóng)業(yè)產(chǎn)量的重要制約因素，長(zhǎng)期施用化學(xué)殺蟲(chóng)劑導(dǎo)致一系列 問(wèn)題1)昆蟲(chóng)出現(xiàn)抗藥性，用藥劑量加大，防治成本提高；2)農(nóng)藥殘留導(dǎo)致環(huán)境污染嚴(yán)重； 3)對(duì)非靶標(biāo)生物有較大影響?，F(xiàn)有生物殺蟲(chóng)劑在害蟲(chóng)防治中應(yīng)用較廣，但殺蟲(chóng)時(shí)間較長(zhǎng)且 效果緩慢。RNA干擾(RNAi)是一種由雙鏈RNA分子引起的特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，2006 年獲諾貝爾獎(jiǎng)。RNAi的發(fā)現(xiàn)不僅為基因的功能研究提供了方法上的突破，同時(shí)也為人類疾 病治療和作物害蟲(chóng)防治開(kāi)辟了新的途徑。2007年，“Nature Biotechnology”雜志先后兩篇 論文報(bào)道了施用表達(dá)靶向害蟲(chóng)重要致死基因V-ATPase A，CYP6AE14 and GSTl的dsRNA轉(zhuǎn) 基因植物作為一種控制病蟲(chóng)害的新方法(Baum et al,2007 ；Mao et al，2007)。2008年， Price和Gatehouse提出了基于RNAi的害蟲(chóng)防治策略。基于RNA干擾技術(shù)的害蟲(chóng)防治具有 如下優(yōu)勢(shì)1)選擇對(duì)害蟲(chóng)專一的基因進(jìn)行干擾，對(duì)高等動(dòng)物和人類是安全的；2)抗蟲(chóng)具有 專一性，對(duì)非靶標(biāo)生物無(wú)殺傷作用；3)對(duì)環(huán)境無(wú)毒無(wú)害。研究表明，RNA干擾技術(shù)能夠有效控制特殊的植物害蟲(chóng)，在害蟲(chóng)防治領(lǐng)域具有重要 的發(fā)展前景。而實(shí)現(xiàn)基于RNAi進(jìn)行害蟲(chóng)有效控制的關(guān)鍵是篩選對(duì)昆蟲(chóng)高效致死的dsRNA。幾丁質(zhì)合成和代謝是昆蟲(chóng)等節(jié)肢動(dòng)物特有的生物學(xué)現(xiàn)象，由于人類和其它高等動(dòng) 物沒(méi)有幾丁質(zhì)，因此昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)合成系統(tǒng)已被公認(rèn)為新型殺蟲(chóng)劑作用的靶標(biāo)。幾丁質(zhì)合 成酶在昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)合成的最后一步起著關(guān)鍵作用，采用RNA干擾技術(shù)，開(kāi)展幾丁質(zhì)合成酶 dsRNA在害蟲(chóng)防治中的應(yīng)用具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)合成酶1基因片段及其dsRNA和dsRNA在致 死害蟲(chóng)中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的一種昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)合成酶1基因片段，其核苷酸序列是SEQ ID NO :1。本發(fā)明提供的一種昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)合成酶1基因片段獲得的方法，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中 登錄號(hào)分別為GU067730和GU067731的兩條幾丁質(zhì)合成酶序列的共同部分，設(shè)計(jì)上游引物 序列為SEQ ID NO :2，下游引物序列為SEQ ID NO :3，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得SEQ ID NO :1。以昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)合成酶1基因片段為模板，通過(guò)試劑盒合成dsRNA。dsRNA在致死害蟲(chóng)中的應(yīng)用注射dsRNA到昆蟲(chóng)體腔，結(jié)果表明dsRNA可以特異 性地沉默昆蟲(chóng)體內(nèi)幾丁質(zhì)合成酶1基因的mRNA表達(dá)，昆蟲(chóng)蛻皮困難死亡。


圖1 :2齡東亞飛蝗若蟲(chóng)注射dsRNA后對(duì)昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的影響。(1為注射dsGFP的 對(duì)照組，2和3均為注射dsRNA的實(shí)驗(yàn)組)。注射dsRNA的實(shí)驗(yàn)組昆蟲(chóng)因蛻皮困難死亡。 圖2 2齡東亞飛蝗若蟲(chóng)注射dsRNA后對(duì)幾丁質(zhì)合成酶1 (LmCHSl)基因轉(zhuǎn)錄的影 響。β -actin為內(nèi)參基因(1為注射dsGFP的對(duì)照組，2為注射dsRNA的實(shí)驗(yàn)組)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 東亞飛蝗幾丁質(zhì)合成酶1基因片段及其dsRNA的獲得1)東亞飛蝗幾丁質(zhì)合成酶1基因片段的獲得根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)分別為⑶067730和⑶067731的兩條幾丁質(zhì)合成酶基 因序列的共同部分，采用primer premier5. 0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物序列為SEQ ID NO :2，下游引物序列為SEQ ID NO :3，所有引物均由上海英濰捷基生物有限公司合成。選取 大小一致雌雄各半東亞飛蝗5齡若蟲(chóng)，四頭一組，冷凍于液氮中，待提取RNA，提取RNA的具 體操作步驟參照TaKaRa Trizol試劑盒。M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶將所提RNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA， 以此為模板，PCR擴(kuò)增獲得幾丁質(zhì)合成酶1基因片段，Wizard SV Gel and PCRClean-Up System(Promega)試劑盒將所獲幾丁質(zhì)合成酶1基因片段進(jìn)行純化。2)東亞飛蝗幾丁質(zhì)合成酶1基因片段合成的dsRNA的獲得以1)步驟獲得的幾丁質(zhì)合成酶1基因片段為模板，按照T7RiboMAX Express RNAiSystem(Promega)試劑盒說(shuō)明，體外轉(zhuǎn)錄合成dsRNA。得到的dsRNA用1. 5%的瓊脂糖 凝膠電泳檢測(cè)其單一性，用酶標(biāo)儀(Molecular Devices SpectraMax 190,Menlo Park,CA, USA)將其定量至終濃度為1 μ g/μ L。保存至_70°C備用。實(shí)施例2 幾丁質(zhì)合成酶1基因片段合成的dsRNA致死東亞飛蝗實(shí)驗(yàn)1、東亞飛蝗幾丁質(zhì)合成酶1基因片段合成的dsRNA注射選取2齡東亞飛蝗第四天大小均一、健康狀況一致的若蟲(chóng)用于注射上述合成的 dsRNA。25μ 1規(guī)格微量注射器用于注射，注射時(shí)不可用力過(guò)大，順著血液流動(dòng)的方向，側(cè)腹 部第2至3腹節(jié)的連接處作為注射點(diǎn)，要避開(kāi)氣門。注射幾丁質(zhì)合成酶1基因片段的dsRNA 的量為3 μ g，并設(shè)置dsGFP (3 μ g)的對(duì)照組，每組15頭蟲(chóng)子，3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共計(jì)45頭。注 射完畢后，將蟲(chóng)子用IL的燒杯至于人工氣候箱中進(jìn)行飼養(yǎng)(光照黑暗時(shí)間=14h IOh, 溫度30士2°C，濕度60% )，給以新鮮小麥幼苗和適當(dāng)?shù)墓庹?，噴水保持濕度?、注射dsRNA后東亞飛蝗表型的觀察若蟲(chóng)注射完畢后繼續(xù)飼養(yǎng)，并及時(shí)地觀察。注射dsRNA東亞飛蝗實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組 在取食量、體型變化及體重增長(zhǎng)并無(wú)顯著差異。對(duì)照組飛蝗均可順利蛻皮，從脊線開(kāi)裂至身 體完全蛻出只需短短幾分鐘，注射dsRNA實(shí)驗(yàn)組若蟲(chóng)中，有部分若蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育出現(xiàn)畸形，因 蛻皮困難死亡。表型見(jiàn)圖1。3、東亞飛蝗幾丁質(zhì)合成酶1基因沉默效果檢測(cè)取上述畸形但未死亡的3齡若蟲(chóng)，每組收蟲(chóng)6只，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均取3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采用Trizol法提取總RNA，采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶獲得第一鏈cDNA，以此為 模板進(jìn)行RT-PCR，檢測(cè)幾丁質(zhì)合成酶ImRNA的表達(dá)量是否降低。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組幾丁質(zhì)合 成酶ImRNA的表達(dá)量顯著降低。見(jiàn)圖2。
4、注射dsRNA后東亞飛蝗死亡情況的觀察注射dsRNA的東亞飛蝗實(shí)驗(yàn)組死亡率為98 %。這與注射 dsGFP的對(duì)照組(死亡率 為0% )相比，致死效果明顯。
權(quán)利要求
一種昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)合成酶1基因片段，其核苷酸序列是SEQ ID NO1。
2.如權(quán)利要求1所述的一種昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)合成酶基因1片段合成的dsRNA。
3.如權(quán)利要求2所述的一種昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)合成酶基因1片段合成的dsRNA在致死害蟲(chóng)中 的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)合成酶1基因片段及其dsRNA和應(yīng)用，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)分別為GU067730和GU067731的兩條幾丁質(zhì)合成酶基因序列的共同部分獲得序列為SEQ ID NO1的幾丁質(zhì)合成酶基因1片段，由該片段合成dsRNA。將上述合成的dsRNA注入昆蟲(chóng)體腔后，昆蟲(chóng)因蛻皮困難死亡。為安全無(wú)公害的害蟲(chóng)防治方法的研制提供新的途徑。
文檔編號(hào)C12N15/52GK101818159SQ20101016362
公開(kāi)日2010年9月1日 申請(qǐng)日期2010年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月30日
發(fā)明者劉曉健, 張建珍, 楊美玲, 郭亞平, 馬恩波 申請(qǐng)人:山西大學(xué)