一種用于提取植物有效成分的復合酶制劑及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶制劑制備技術領域，具體是一種用于提取人參皂甙、銀杏皂甙及萌 蘆科植物類原料中的多糖、皂甙等有效功能性成分的復合酶制劑及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 植物中含有豐富的活性成分，被廣泛用于藥品、保健品和化妝品中。我國的植物資 源十分豐富，是我國具有獨特開發(fā)利用優(yōu)勢和發(fā)展戰(zhàn)略產業(yè)的物資基礎。大力發(fā)展農產品 深加工，提高我國農產品加工業(yè)的技術創(chuàng)新能力和產品競爭力，是促進農業(yè)結構調整，增加 農村第二、三產業(yè)的就業(yè)崗位和提升食品加工工業(yè)的整體水平的重要途徑。人參皂甙、銀杏 皂甙及萌蘆科植物(苦瓜、南瓜、黃瓜等）中有效成分(多糖、皂甙等）在我國已成為支撐中藥 產業(yè)及健康產業(yè)發(fā)展的臺柱。
[0003] 植物的有效成分如多糖、皂甙等大多包裹在細胞壁中，對這些有效成分的提取，傳 統(tǒng)的提取方法如煎煮、有機溶劑浸出、醇處理方法等，提取時溫度高、提取率低、浪費提取 劑、成本高、不安全；而采用酶法提取選用適當的酶，可以通過酶反應溫和地將植物組織結 構分解，加速有效成分的釋放提取。選用相應的酶可將影響液體制劑澄清度的雜質如淀粉、 蛋白質、果膠等分解祛除，也可能使一些較低或無生理活性的成分結構發(fā)生轉變，成為高活 性分子，如可以使某些極性低的脂溶成分轉化成糖苷類易溶于水的成分而有利于提取。酶 法在植物有效成分的提取中有較大的應用潛力，但該技術也存在一定的局限性。目前常用 的均為單一的液體劑型酶品種，加酶時要分部加入，因而生產工藝復雜，不便掌握及規(guī)?；?生產。酶提取法對實驗條件要求比較高，為使酶發(fā)揮最大作用，需先通過實驗確定，掌握最 適合的pH值、溫度及作用時間等。還需綜合考慮酶及底物濃度、抑制劑和激動劑等對提取 得率的影響。
[0004] 苦瓜為萌蘆科苦瓜屬植物，原產于印度東部，廣泛分布于熱帶、亞熱帶和溫帶 地區(qū)，我國各地均有栽培?？喙衔犊嘈院?，無毒，其根、莖、葉、花、果實和種子在世界各地 均有藥用記載，有明顯的清火明目、解毒、降血糖、滋養(yǎng)、益氣之功效，是民間常用中藥，同 時也是一種常見的蔬菜。國內外對苦瓜藥用價值的研究已經取得了重要進展，已證實苦瓜 原汁、苦瓜的水提取物等具有抗菌、調節(jié)和提高機體免疫力、抗腫瘤、抑制愛滋病HIV的表 面活性等功效。國內外不少學者從不同地區(qū)、不同品種苦瓜及其種子中分離出了多種生理 活性物質，其中苦瓜多糖和苦瓜皂甙是苦瓜的兩個主要有效成分。
[0005] 皂甙是存在于植物界的一類比較復雜的甙類化合物，如人參、柴胡、三七、苦瓜、 麥門冬、木通、茶葉等均含有皂甙。它是由甙元和糖兩部分組成，由于分子量大、極性較 高，難以分離提純?？喙显磉笆强喙现杏行С煞种?，為四環(huán)三萜類化合物。
[0006] 多糖是植物細胞的組成成分。近年來，多糖及其復合物在生物體功能方面的研究 成為熱點問題之一。在研究過程中，人們發(fā)現(xiàn)多糖作為一種幾乎無毒副作用的天然提取 物，在治療腫瘤、免疫力低下、高血糖、衰老、病毒性疾病等方面療效獨特。苦瓜多糖是一 種由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成的雜多糖，含0 -D-吡喃糖苷 鍵，具有提高免疫力、降血糖、抑菌、抗氧化等作用，是苦瓜中主要生物活性成分之一。
【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明采用的提取植物有效成分的復合酶制劑由木聚糖酶、纖維素酶、果膠酶、 0 _葡聚糖酶、a-淀粉酶組成，是一種多菌種酶體系、固體劑型的新型食品級酶制劑。
[0008]植物細胞壁是由果膠質、纖維素和半纖維素等組成的網狀結構，可阻止細胞內有 效成分的滲出，要提取多糖、皂甙等植物有效成分，破除包圍在這些有效成分外的屏障 是要解決的首要問題。
[0009]本發(fā)明采用的植物提取復合酶的制備方法是由地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、黑 曲霉、綠色木霉按照一定比例經過共生培養(yǎng)，浸提、濃縮后加膨化植物蛋白載體，經低溫噴 霧制成。創(chuàng)新點在于將目前分步、添加單一酶種對人參皂甙、銀杏皂甙及萌蘆科植物類原料 的酶解過程，提升為多酶種的復合型酶制劑一步完成酶解過程，簡化生產過程及周期，提高 人參皂甙、銀杏皂甙及萌蘆科植物類原料中的多糖、皂甙等有效功能性成分的提取效率。
[0010] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開了如下的技術內容： 一種用于提取植物有效成分的復合酶制劑，其特征在于它是由木聚糖酶、纖維素酶、果 膠酶、葡聚糖酶、a-淀粉酶成分組成，其各酶種的活力如下： 木聚糖酶3000IU/g;纖維素酶2000IU/g; 果膠酶20000IU/g; 0 -葡聚糖酶5000IU/g;a_ 淀粉酶 3000IU/g。
[0011] 本發(fā)明所述用于提取植物有效成分的復合酶制劑的生產方法，其特征在于它是 由地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、綠色木霉經過共生培養(yǎng)，浸提、濃縮后加膨化植物 蛋白載體，經低溫噴霧制成，其各菌粉的重量份數如下： 地衣芽孢桿菌3-4份；枯草芽孢桿菌1-2份； 黑曲霉2-3份； 綠色木霉2-3份； 其中各組分的活菌含量分別為： 復合發(fā)酵劑活力總數彡l〇scfu/g。
[0012] 具體包括：斜面菌種一液體種子培養(yǎng)一種子罐發(fā)酵一發(fā)酵罐發(fā)酵一離心分離菌體 細胞一陶瓷膜超濾濃縮酶液一添加膨化植物蛋白載體一低溫噴霧干燥一過篩一固體復合 酶產品。
[0013] 更加詳細的描述如下： (1)各菌株來源： 地衣芽抱桿菌 編號CGMCC1970 ; 枯草芽抱桿菌 編號ASL1229 ; 黑曲霉 供'，編號IFFI. 02439 ; 綠色木霉rricAot/eiwaKirit/e，編號CCTCCAF. 93252。
[0014](2)斜面菌種培養(yǎng)： 地衣芽孢桿菌使用斜面培養(yǎng)基（g/L):牛肉膏5,蛋白胨10,酵母膏5,NaCl5,瓊脂30， 自來水配制，pH7. 5,在28~30°C條件下靜止培養(yǎng)20~24小時； 枯草芽孢桿菌使用斜面培養(yǎng)基（g/L):蛋白胨10,牛肉膏5,氯化鈉5,瓊脂20,pH值為 7. 2,在28~30°C條件下靜止培養(yǎng)20~24小時； 黑曲霉菌種使用斜面培養(yǎng)基（g/L): 土豆200,葡萄糖20,磷酸氫二鉀3,七水硫酸鎂 1. 5,pH自然，在28~30°C條件下靜止培養(yǎng)20~48小時； 綠色木霉使用斜面培養(yǎng)基（g/L):羧甲基纖維素鈉（CMC-Na)7. 5，蛋白胨5.0，吐 溫-80 2. 0mL，MgS04 ? 7H20 0? 3,CaCl2 0? 3,FeS04 ? 7H20 5. 0mg，MnS04 ?H20 1. 6mg， ZnS04 ? 7H20 1. 4mg，CoCl2 ? 6H20 2. 0mg，自然pH，在 28 ~30°C條件下靜止培養(yǎng) 48 ~72 小時； (3) 液體種子培養(yǎng)： 地衣芽孢桿菌搖瓶放大培養(yǎng)基（g/L):魔芋粉30,骨胨30,玉米漿5,（NH4)2S04 5，Na2HP04 4,KH2P04 0 . 3,MgCl20.6,CaCl2 3,FeS04 0 . 01，Na2C03 3,pH7.0,溫度 30°C，轉速 250 ~360r/min，培養(yǎng) 48 ~72h。
[0015] 枯草芽孢桿菌搖瓶放大培養(yǎng)基（g/L):牛肉膏5,蛋白胨10,氯化鈉5,pH值為 7. 2,溫度 30°C，轉速 140r/min，培養(yǎng) 24h; 黑曲霉搖瓶放大培養(yǎng)基（g/L):半纖維素15~20,NH4N032~4,酵母粉2~4,KCL0. 4~ 0? 6,K2HP040 . 5 ~1. 5,FeS040 . 01 ~0? 03,MgS04 ? 7H200. 3 ~0? 6,C〇CL20. 01 ~0? 03,吐溫 0? 5~1. 5,pH5. 5。溫度28~30°C，轉速180~250轉/分鐘，培養(yǎng)48~60h; 綠色木霉搖瓶放大培養(yǎng)基（g/L):蛋白胨11. 0,硫酸銨13,葡萄糖6,KH2P04 10. 5,稻草粉13.4，。&(：120.8，]\%504.711 20 0.6，卩6504.71120 5,211504.71120 1.4 11^，(：〇(：12.611203.7 mg，MnS04.H20 1.6mg，吐溫-80 0. 3mL，接種斜面培養(yǎng)的孢子，28°C，150r/min，振蕩培 養(yǎng)72h左右； (4) 種子罐發(fā)酵： 種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):黃豆餅粉10. 1、玉米淀粉16. 9、蛋白胨1. 1、葡萄糖2. 4、硫酸 銨8. 0、硫酸鎂0? 45、磷酸氫二鉀0? 45、氯化鈉4. 50，自然pH。
[0016] 發(fā)酵罐內溫度28~30°C，通風量9~13m3/h，發(fā)酵罐壓0? 02~0? 09Mpa，地衣 芽孢桿菌接種量10 %、枯草芽孢桿菌接種量3 %、黑曲霉接種量6 %、綠色木霉接種量6 %， 發(fā)酵48h。
[0017] (4)發(fā)酵罐發(fā)酵： 種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L):骨胨30,玉米漿5,（NH4) 2S04 5,g，稻草粉13. 4g，Na2HP04 4,H2P04 0? 3,MgCl2 0? 6,CaCl23,FeS04 0? 01，Na2C03 3,吐溫-80 0? 3mL，pH7. 0,消泡油 4， 自來水配制； 發(fā)酵罐內溫度28~30 °C，通風量8~10m3/h，發(fā)酵罐壓0.02~0.09Mpa攪拌速率 270r/min，接種量 10%，發(fā)酵 68 ~72h; (5) 離心分離菌體細胞：發(fā)酵液經管式離心機分離，收集濾液于儲罐。
[0018] (6)陶瓷膜超濾濃縮酶液：將儲罐中濾液進行超濾膜濃縮，超濾壓力小于0.IMpa， 濃縮時間3小時/6噸濾液； (7)添加載體：向濃縮酶液中加入膨化大豆顆粒作為載體，使其在濃縮酶液中的終濃度 達到10%，并于勻漿中充分攪拌混勻； (8)低溫噴霧干燥：將已加入載體的濃縮酶液經過高速氣流濃縮低溫噴霧干燥機進行 噴霧干燥制成固體復合酶產品。復合酶的有效成分收率90%以上。
[0019] 本發(fā)明更進一步公開公開了用于提取植物有效成分的復合酶制劑在制備提高人 參皂甙、銀杏皂甙及萌蘆科植物類原料中的多糖、皂甙有效功能性成分提取率方面的應用。 本發(fā)明將目前分步、添加單一酶種對人參皂甙、銀杏皂甙及萌蘆科植物類原料的酶解過程， 提升為多酶種的復合型酶制劑一步完成酶解過程，簡化生產過程及周期，提高人參皂甙、銀 杏皂甙及萌蘆科植物類原料中的多糖、皂甙等有效功能性成分的提取效率。實驗結果顯示： 采用本發(fā)明的復合酶制劑對人參皂甙、銀杏皂甙及萌蘆科植物類原料中的多糖、皂甙等有 效功能性成分的提取效率可提高近10%。
[0020] 本發(fā)明制備的固體復合酶制劑產品的測定指標如下： (1)產品酶活力木聚糖酶3000IU/g ;纖維素酶2000IU/g ;果膠酶20000I