本發(fā)明屬于多功能納米生物醫(yī)藥材料領(lǐng)域，具體涉及一種具有核磁共振和熒光雙模式靶向成像和光熱轉(zhuǎn)換功能的納米復(fù)合材料的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

具備多重模式結(jié)合、高效特異性主動(dòng)靶向的生物探針能夠集成靶向識(shí)別、超靈敏檢測(cè)和高效治療于一體，為腫瘤的早期診斷和治療帶來(lái)了新的契機(jī)，具有重要的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。目前，核磁共振成像和光學(xué)成像是最具發(fā)展?jié)摿Φ脑\斷方式。光學(xué)成像是目前發(fā)展起來(lái)的新興研究領(lǐng)域。其突出特點(diǎn)是非侵入性地對(duì)活體內(nèi)參與生理和病理過(guò)程的分子事件進(jìn)行可視化觀察，是目前公認(rèn)的開展活體內(nèi)分子事件研究的主流手段之一，在生命科學(xué)研究領(lǐng)域具有重大應(yīng)用前景。但光學(xué)成像同時(shí)也具有分辨率低、背景干擾大、清晰度不高等缺點(diǎn)。另外一種成像模式核磁共振成像在影像的采集過(guò)程中可以自由選擇，它對(duì)于體內(nèi)的部位幾乎都可以進(jìn)行掃描，甚至可以做到只針對(duì)某些組織區(qū)域顯像，這個(gè)優(yōu)勢(shì)對(duì)于癌細(xì)胞的早期發(fā)現(xiàn)和診療是有益的。更重要的是核磁共振成像具有高靈敏性、高分辨率和無(wú)電離輻射等優(yōu)點(diǎn)，能夠彌補(bǔ)光學(xué)成像的不足，是目前臨床上精確監(jiān)控組織病變的一種無(wú)創(chuàng)三維立體成像模式。若將二者進(jìn)行有效地結(jié)合，將對(duì)癌癥的診斷和治療具有非常重要的意義。

超順磁性的過(guò)渡金屬氧化物是一種重要的核磁共振成像造影劑，在外磁場(chǎng)存在的情況下能夠表現(xiàn)極大的磁敏感性，通過(guò)縮短t2弛豫時(shí)間使得t2加權(quán)圖像變暗，表現(xiàn)出負(fù)增強(qiáng)效果，可有效提高mri成像的對(duì)比度。

目前，基于fe3o4納米顆粒與au組裝形成核殼納米結(jié)構(gòu)主要依賴于種子介導(dǎo)法，在此過(guò)程中，帶有大量負(fù)電荷的金納米球通過(guò)靜電作用吸附于納米顆粒表面并生長(zhǎng)為完整金殼。但由于靜電作用不穩(wěn)定，被吸附的金納米球易脫落，導(dǎo)致金殼的制備過(guò)程重復(fù)性不好。因此提高復(fù)合納米材料的核磁共振造影效果、可控調(diào)節(jié)其近紅外吸收峰、增強(qiáng)特異性識(shí)別能力、提高分散性和可重復(fù)性等仍然是其在腫瘤診療應(yīng)用中亟需解決的難題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種新型的具有核磁共振和熒光雙模式靶向成像和光熱轉(zhuǎn)換功能的納米復(fù)合材料。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：

一種雙模式靶向成像和光熱轉(zhuǎn)換功能的納米復(fù)合材料，納米復(fù)合材料為核殼型結(jié)構(gòu)；其中，內(nèi)核為具有強(qiáng)磁敏感性的超順磁性fe3o4納米顆粒與摻雜熒光分子的sio2層組裝形成復(fù)合納米核，外殼為具有較強(qiáng)的光熱轉(zhuǎn)換能力的偶聯(lián)特異性配體的金納米粒子靶向探針。

所述具有較強(qiáng)的光熱轉(zhuǎn)換能力的偶聯(lián)特異性配體的金納米粒子靶向探針為能夠特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞的多肽配體。

所述具有較強(qiáng)的光熱轉(zhuǎn)換能力的金納米粒子偶聯(lián)特異性配體的探針為融合pviii蛋白。

一種雙模式靶向成像和光熱轉(zhuǎn)換功能的納米復(fù)合材料的制備方法，

1)復(fù)合納米粒子：將溶劑熱法合成的fe3o4納米顆粒分散于0.1m鹽酸中，超聲處理、離心，洗滌得沉淀，沉淀再溶于去離子水中，超聲分散；加入無(wú)水乙醇并混勻，隨后在攪拌條件下加入正硅酸乙酯，條件保持弱堿性，室溫下攪拌均勻，而后加入活化的熒光分子，繼續(xù)攪拌、經(jīng)離心，洗滌，干燥，制得復(fù)合納米粒子fe3o4@rhb/sio2；

2)復(fù)合材料進(jìn)行巰基化：將上述獲得fe3o4@rhb/sio2納米顆粒的溶液中逐滴加入3-巰丙基三甲氧基硅烷，室溫下攪拌混合均勻；

3)納米金連接：將納米金溶液與上述表面巰基功能化的fe3o4@rhb/sio2納米顆粒混勻，超聲振蕩，然后室溫靜置；利用磁鐵將偶聯(lián)有納米金的fe3o4@rhb/sio2納米顆粒分離，洗滌沉淀即為fe3o4@rhb/sio2-aunps，并將其重懸于水中，待用；

4)將碳酸鉀溶液與氯金酸溶液室溫?cái)嚢杌靹?，混勻后與上述fe3o4@rhb/sio2-aunps納米球混勻，再次混勻后加入抗壞血酸溶液，振蕩產(chǎn)物經(jīng)磁鐵分離，洗滌，洗滌后再次重復(fù)步驟4)的操作，產(chǎn)物記為fe3o4@rhb/sio2@au；

5)將采用蛋白活化劑和羧基端活化劑活化的融合pviii蛋白與上述合成的fe3o4@rhb/sio2@au納米球連接，即可得到fe3o4@rhb/sio2@au@fusion-pviii多功能納米復(fù)合材料。

所述經(jīng)無(wú)水乙醇混勻后加入正硅酸乙酯使體系為弱堿性，室溫下攪拌6小時(shí)，攪拌后加入適量的3-氨丙基三乙氧基硅烷，繼續(xù)攪拌，而后加入濃度為1mm活化的熒光分子，繼續(xù)攪拌8小時(shí)，再次逐滴加入與3-氨丙基三乙氧基硅烷等量的正硅酸乙酯并攪拌6小時(shí)，經(jīng)離心，洗滌，干燥，制得復(fù)合納米粒子fe3o4@rhb/sio2。

所述步驟4)經(jīng)磁鐵分離后檢測(cè)其近紅外吸收光譜，經(jīng)反復(fù)操作后檢測(cè)其近紅外吸收光譜范圍605-747nm。

一種雙模式靶向成像功能的納米復(fù)合材料的應(yīng)用，所述納米復(fù)合材料fe3o4@rhb/sio2@au@fusion-pviii用于靶向熒光共聚焦成像。

一種雙模式靶向成像功能的納米復(fù)合材料的應(yīng)用，所述納米復(fù)合材料fe3o4@rhb/sio2@au@fusion-pviii用于靶向核磁共振成像。

一種雙模式靶向成像功能的納米復(fù)合材料的應(yīng)用，所述納米復(fù)合材料fe3o4@rhb/sio2@au@fusion-pviii在用于腫瘤細(xì)胞的光熱中的應(yīng)用。

所述腫瘤細(xì)胞為結(jié)腸癌細(xì)胞。

本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明納米復(fù)合材料同時(shí)具有雙模式靶向成像與光熱功能，其具有典型的內(nèi)核和雙外殼層的核殼結(jié)構(gòu)；制備過(guò)程中采用溶劑熱法制備具有強(qiáng)磁敏感性的超順磁性fe3o4納米顆粒并與熒光分子組裝形成復(fù)合納米核；合成蔗糖穩(wěn)定的單分散的金納米球，利用au-s鍵將其組裝于納米核表面并生長(zhǎng)，構(gòu)筑穩(wěn)定且重復(fù)性高的金殼結(jié)構(gòu)；所形成的納米核殼材料可同時(shí)作為核磁共振成像和熒光成像的造影劑。通過(guò)調(diào)節(jié)復(fù)合納米材料的吸收峰至近紅外區(qū)域，并通過(guò)酰胺鍵將復(fù)合材料與sw620細(xì)胞特異性配體融合pviii蛋白實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)。本發(fā)明所制得的材料通過(guò)核磁共振和熒光雙模式具有可提高核磁共振造影效果、可控調(diào)節(jié)其近紅外吸收峰、增強(qiáng)特異性識(shí)別能力、提高分散性和可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性檢測(cè)和高效的光熱治療。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例制得fe3o4@rhb/sio2@au納米顆粒的uv-vis-nir吸收光譜變化圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例fe3o4@rhb/sio2@au納米顆粒的透射電鏡圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例中所制得fe3o4、fe3o4@rhb/sio2和fe3o4@rhb/sio2@au納米顆粒的磁滯回線；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例制得的不同濃度f(wàn)e3o4@rhb/sio2@au@融fusion-pviii納米復(fù)合材料的mri圖像(a)，t2弛豫效率與不同鐵濃度的關(guān)系(b)。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例制得的fe3o4@rhb/sio2@au@fusion-pviii納米顆粒與sw620細(xì)胞、hek293t細(xì)胞和hepg2細(xì)胞孵育4h后的激光共聚焦圖片；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例制得的fe3o4@rhb/sio2@au@fusion-pviii納米顆粒與sw620細(xì)胞、hepg2細(xì)胞和hek293t細(xì)胞孵育6h，采用功率為3w/cm²的808nm激光器照射不同時(shí)間細(xì)胞的存活率。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整的描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明采用溶劑熱法制備具有強(qiáng)磁敏感性的超順磁fe3o4納米顆粒并與熒光分子組裝形成復(fù)合納米核；將穩(wěn)定的單分散金納米球，利用au-s鍵將其組裝于納米核表面并生長(zhǎng)，構(gòu)筑穩(wěn)定且重復(fù)性高的金殼結(jié)構(gòu)；所形成的納米核殼材料可同時(shí)作為核磁共振成像和熒光成像的造影劑。通過(guò)調(diào)節(jié)復(fù)合納米材料的吸收峰至近紅外區(qū)域，并通過(guò)酰胺鍵將復(fù)合材料與sw620細(xì)胞特異性配體融合pviii蛋白實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)。本發(fā)明所制得的復(fù)合材料通過(guò)核磁共振和熒光雙模式成像功能實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性檢測(cè)和高效的光熱現(xiàn)象。

實(shí)施例1

取20mg溶劑熱法合成的fe3o4納米顆粒，加入10ml濃度為0.1m的鹽酸，超聲處理10min，然后倒入50ml離心管中，9000rpm離心20min，除去上清，用去離子水洗滌沉淀三次，最終所得沉淀溶于4ml去離子水中，超聲分散。向含有fe3o4納米顆粒的水溶液中加入16ml無(wú)水乙醇并混勻，然后逐滴加入200μl濃氨水，攪拌5min，在攪拌條件下逐滴加入200μlteos，于室溫下攪拌6h，即可得到fe3o4@sio2納米顆粒。

吸取20μlaptes加入至溶液中，繼續(xù)攪拌反應(yīng)12h，然后將20μl濃度為1mm活化的rhb熒光分子加入至溶液中，繼續(xù)攪拌8h，再次逐滴加入200μlteos并攪拌6h，然后將納米材料轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，9000rpm離心20min，除去上清，沉淀用無(wú)水乙醇和去離子水洗滌多次，最終溶于水中，置于60℃真空干燥箱中干燥過(guò)夜，所得固體粉末表征后備用。

fe3o4@rhb/sio2納米顆粒表面巰基化：向上述所得fe3o4@rhb/sio2納米顆粒的溶液中按照mptms:teos＝1:5的比例逐滴加入mptms，室溫?cái)嚢?4h。

將納米金球負(fù)載于fe3o4@rhb/sio2納米顆粒表面，并生長(zhǎng)為金殼，最終得到fe3o4@rhb/sio2@au納米結(jié)構(gòu)。取15ml金納米球溶液，與1ml表面功能化的fe3o4@rhb/sio2納米顆粒混勻，超聲10min，然后室溫靜置2h。利用磁鐵將偶聯(lián)有金納米球的fe3o4@rhb/sio2納米顆粒分離，并用水洗滌三次，去除多余的金納米球，沉淀重懸于1ml水中。配制8ml濃度為10mgml^-1的k2co3溶液，與300μl濃度為10mmhaucl4溶液混勻，室溫?cái)嚢?0min，然后加入上述得到的fe3o4@rhb/sio2-aunps納米顆粒并混勻，向溶液中加入75μl濃度為0.1m的抗壞血酸，振蕩反應(yīng)2h，所得產(chǎn)物經(jīng)磁鐵分離洗滌，檢測(cè)其吸收光譜。多次重復(fù)此操作，至fe3o4@rhb/sio2@au納米顆粒的吸收峰移動(dòng)至近紅外區(qū)，如圖1所示，顯示了在合成過(guò)程中，隨著表面金納米顆粒的生長(zhǎng)，fe3o4@rhb/sio2@au的吸收峰逐漸紅移，當(dāng)?shù)谝淮我詅e3o4@rhb/sio2-aunps表面附著的金納米顆粒為種子，在其表面還原h(huán)aucl4時(shí)，其吸收峰紅移至605nm，四次重復(fù)此操作以后，吸收峰紅移至747nm。最終產(chǎn)物的電鏡表征如圖2所示，完整的au殼包裹于fe3o4@rhb/sio2納米顆粒表面形成了單一分散的fe3o4@rhb/sio2@au納米復(fù)合材料。x-射線能量色散譜分析結(jié)果顯示fe、si和au的同時(shí)存在，進(jìn)一步證明我們已成功獲得fe3o4@rhb/sio2@au多層核殼納米結(jié)構(gòu)。

活化已分離的sw620細(xì)胞特異性融合pviii蛋白。稱取0.5mg融合pviii蛋白至10ml離心管中并加入50μldh2o，逐漸滴加thf至溶液澄清，總體積約150μl。向溶液中加入二碳酸二叔丁酯(boc)，使其終濃度為2mm，冰上振蕩20min，轉(zhuǎn)移至室溫振蕩3h，于4℃冰箱中靜置過(guò)夜。將50mm的edc和30mm的nhs混勻，然后取15μl加入至上述融合pviii蛋白溶液中，室溫避光靜置5h，使融合pviii蛋白的羧基端活化。

將活化的融合pviii蛋白與合成的fe3o4@rhb/sio2@au納米顆粒連接。向上述制備的1ml含有fe3o4@rhb/sio2@au納米顆粒溶液中加入30μl濃度為1mm的半胱氨酸，超聲混勻，然后避光攪拌5h。將已活化的pviii蛋白與半胱氨酸修飾的fe3o4@rhb/sio2@au納米顆?；旌?，置于4℃冰箱中過(guò)夜反應(yīng)。然后按照tfa:boc＝5:1的比例向上述體系中加入0.175μltfa，冰浴條件下振蕩10min，轉(zhuǎn)移至室溫，繼續(xù)攪拌5h，即可得到fe3o4@rhb/sio2@au@fusion-pviii多功能納米復(fù)合材料。

圖3為所制得fe3o4、fe3o4@rhb/sio2和fe3o4@rhb/sio2@au納米顆粒的磁滯回線。在室溫條件下，測(cè)量所得fe3o4@rhb/sio2@au納米顆粒的磁飽和強(qiáng)度。與fe3o4和fe3o4@sio2納米顆粒相比，fe3o4@rhb/sio2@au納米顆粒的ms值顯著降低，減小至10.837emu/g，但依然能被外部磁鐵吸附并分離。對(duì)磁滯回線的局部放大，fe3o4@rhb/sio2@au納米顆粒的磁滯回線仍然經(jīng)過(guò)原點(diǎn)，無(wú)矯頑力和剩磁力，是一種超順磁納米材料。因此，最終構(gòu)筑的多功能核殼結(jié)構(gòu)fe3o4@rhb/sio2@au仍然具有一定強(qiáng)度的ms，能被磁鐵吸附分離，具備超順磁性的特點(diǎn)，是臨床腫瘤核磁共振成像的理想造影劑。

圖4為不同濃度f(wàn)e3o4@rhb/sio2@au@fusion-pviii納米復(fù)合材料的核磁共振圖像(a)，t2弛豫效率與不同鐵濃度的關(guān)系(b)。fe3o4@rhb/sio2@au@fusion-pviii復(fù)合納米材料水溶液的圖像隨著材料濃度的增加而逐漸變暗，推測(cè)是由于納米材料有效縮短了其周圍水中氫質(zhì)子的弛豫時(shí)間，表現(xiàn)出顯著的負(fù)增強(qiáng)效果。fe3o4@rhb/sio2@au@fusion-pviii復(fù)合納米材料的r²值高達(dá)176.2mm^-1s^-1(圖b)，可作為一種理想的t2加權(quán)造影劑應(yīng)用于腫瘤核磁共振檢測(cè)。

圖5為制得的fe3o4@rhb/sio2@au@fusion-pviii納米顆粒與sw620腫瘤細(xì)胞、hek293t細(xì)胞和hepg2細(xì)胞孵育4h后的激光共聚焦圖片。在550nm激光照射下，結(jié)腸腫瘤細(xì)胞sw620呈現(xiàn)紅色熒光，而對(duì)照組hek293t細(xì)胞和hepg2細(xì)胞未呈現(xiàn)熒光信號(hào)。因此，推測(cè)sw620細(xì)胞的熒光信號(hào)是由進(jìn)入細(xì)胞的rhb分子在激發(fā)光下產(chǎn)生紅色熒光，而對(duì)照組細(xì)胞中不存在熒光分子，所以沒(méi)有出現(xiàn)熒光信號(hào)。由于熒光分子rhb包裹于sio2殼中，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不存在泄露進(jìn)入細(xì)胞產(chǎn)生假陽(yáng)性的情況，因此sw620細(xì)胞中的rhb熒光信號(hào)能夠準(zhǔn)確說(shuō)明fe3o4@rhb/sio2@au@fusion-pviii納米材料與靶標(biāo)特異性結(jié)合并進(jìn)入圖6為制得的fe3o4@rhb/sio2@au@fusion-pviii納米顆粒與sw620細(xì)胞、hepg2細(xì)胞和hek293t細(xì)胞孵育6h，采用功率為3w/cm²的808nm激光器照射不同時(shí)間細(xì)胞的存活率。由于細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中的組分對(duì)近紅外光無(wú)吸收，而fe3o4@rhb/sio2@au@fusion-pviii納米材料具有近紅外光吸收的特性，當(dāng)808nm激光照射時(shí)，能夠有效地將吸收的光能通過(guò)電子的震動(dòng)轉(zhuǎn)化為熱量，一定照射時(shí)間后，納米材料產(chǎn)生的過(guò)高熱能夠?qū)е录?xì)胞死亡。據(jù)此，sw620細(xì)胞的死亡是由于其吸收f(shuō)e3o4@rhb/sio2@au@fusion-pviii納米材料產(chǎn)生的過(guò)高熱引起，而對(duì)照細(xì)胞沒(méi)有吸收納米材料，對(duì)入射光無(wú)吸收且不能產(chǎn)生熱量，其生存狀態(tài)不受影響。這充分說(shuō)明fe3o4@rhb/sio2@au@fusion-pviii納米復(fù)合材料能夠特異性識(shí)別并在3w/cm²的激光照射下殺傷腫瘤細(xì)胞，對(duì)腫瘤的靶向光熱治療具有重要價(jià)值。

由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明同時(shí)具有雙模式靶向成像與光熱功能的納米復(fù)合材料，所述的納米復(fù)合材料具有典型的內(nèi)核和雙外殼層的核殼結(jié)構(gòu)。其制備采用溶劑熱法制備具有強(qiáng)磁敏感性的超順磁性fe3o4納米顆粒并與熒光分子組裝形成復(fù)合納米核；將穩(wěn)定的單分散金納米球，利用au-s鍵將其組裝于納米核表面并生長(zhǎng)，構(gòu)筑穩(wěn)定且重復(fù)性高的金殼結(jié)構(gòu)；所形成的納米核殼材料可同時(shí)作為核磁共振成像和熒光成像的造影劑。通過(guò)調(diào)節(jié)復(fù)合納米材料的吸收峰至近紅外區(qū)域，并通過(guò)酰胺鍵將復(fù)合材料與sw620細(xì)胞特異性配體融合pviii蛋白實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)。本發(fā)明所制得的造影劑通過(guò)核磁共振和熒光雙模式成像功能實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性檢測(cè)和高效的光熱治療。

上面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明優(yōu)選的具體實(shí)施方式和實(shí)施例作了詳細(xì)的說(shuō)明，但是本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式和實(shí)施例，靶向探針也不限于特異性配體融合pviii蛋白，其可能能夠和待檢測(cè)的腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合的抗體、靶向多肽配體或適配體等，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮說(shuō)明書及實(shí)踐這里公開的發(fā)明后，將容易想到本發(fā)明的其它實(shí)施方案。本申請(qǐng)旨在涵蓋本發(fā)明的任何變型、用途或者適應(yīng)性變化，這些變型、用途或者適應(yīng)性變化遵循本發(fā)明的一般性原理并包括本發(fā)明未公開的本技術(shù)領(lǐng)域中的公知常識(shí)或慣用技術(shù)手段。說(shuō)明書和實(shí)施例僅被視為示例性的，本發(fā)明的真正范圍和精神由權(quán)利要求指出。