專利名稱：核酸酶p1的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于制備核酸酶Pl的方法，具體而言，本發(fā)明涉及從麥芽根中提 取核酸酶Pl的方法。
背景技術(shù)：
核酸酶Pl (5’ -磷酸二酯酶)是一種重要的特種酶制劑，其主要應(yīng)用于兩個領(lǐng)域， 一是分子生物學(xué)領(lǐng)域，在該領(lǐng)域中要求使用高純度的核酸酶P1，其在國內(nèi)外很多試劑公 司都能買到；另一個重要領(lǐng)域就是醫(yī)藥核苷酸及食品呈味核苷酸的生產(chǎn)，即將核酸降解為 5’-核苷酸。一方面，5’-核苷酸具有調(diào)節(jié)機(jī)體機(jī)能的功效，可作為醫(yī)藥的輔助添加劑使用； 另一方面，在呈味食品的生產(chǎn)中，核酸酶Pl水解核酸產(chǎn)生的5’ -核苷酸是食物鮮味的主要 成分，特別是鳥苷一磷酸(GMP)和肌苷一磷酸(IMP)可以顯著增加食品的鮮味。目前，全球 僅有阿瑪諾天野特種酶制劑一家公司可以生產(chǎn)食品級核酸酶P1，并且該公司生產(chǎn)的核酸酶 Pl價格昂貴。從目前已有文獻(xiàn)來看，核酸酶Pl主要通過兩種方式生產(chǎn)一是利用微生物發(fā)酵生 產(chǎn)，這種方式工藝復(fù)雜，產(chǎn)品容易被霉菌孢子污染；二是從啤酒大麥芽生產(chǎn)的副產(chǎn)物麥芽根 中提取，但從麥芽根中提取的粗酶液中除了核酸酶Pl (5’ -磷酸二酯酶)以外，還含有磷酸 單酯酶及3’ -磷酸二酯酶，因而在實際應(yīng)用中造成產(chǎn)物雜質(zhì)較多的缺陷?，F(xiàn)有技術(shù)中，從麥芽根提取核酸酶Pl的工藝路線基本一致，通常為以新鮮麥芽 根為原料，經(jīng)過粉碎過篩、浸提、壓濾除渣、以及離心分離等步驟獲得核酸酶P1。雖然目前已 有多篇文獻(xiàn)報道了對核酸酶Pl提取工藝參數(shù)(例如，篩目大小、浸提溫度、PH值等)的優(yōu) 化選擇，但目前所能獲得的核酸酶P 1的酶活最高只能達(dá)到474U/ml (麥芽根中5’-磷酸二 酯酶的制備及性質(zhì)，華東理工大學(xué)學(xué)報，2002，8)。在將通過現(xiàn)有技術(shù)獲得的核酸酶Pl用于 生產(chǎn)呈味核苷酸時，酵母抽提物中呈味核苷酸的含量最高僅為16000mg/kg，這導(dǎo)致在呈味 核苷酸實際生產(chǎn)過程中核酸酶Pl的用量較大，通常在30-50% (體積濃度)以上，很難被生 產(chǎn)企業(yè)所接受。因此，需要對現(xiàn)有技術(shù)中從麥芽根提取核酸酶Pl的方法進(jìn)行改進(jìn)，找到一種制備 核酸酶Pi的新方法，以生產(chǎn)出活性顯著提高的核酸酶P1。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述問題，本發(fā)明提供一種用于制備核酸酶Pl的方法，具體而言，提供一種 從麥芽根中提取核酸酶Pl的方法。通過本發(fā)明方法所獲得的核酸酶，與現(xiàn)有技術(shù)相比，酶 活性顯著提高，因而能夠用于高效生產(chǎn)呈味核苷酸。根據(jù)本發(fā)明用于制備核酸酶Pl的方法，包括以下步驟(1)將麥芽根粉碎過篩，向 過篩后的麥芽根粉末中添加水，并在混勻后加入無機(jī)鹽，將PH值調(diào)至5. 5-6. 0，在33-37°C 下攪拌提取8-16小時；(2)對上述提取液進(jìn)行壓濾以除去大顆粒濾渣，收集濾過液；(3)離 心所述濾過液，收集上清液，以得到核酸酶Pl提取液。
根據(jù)本發(fā)明用于制備核酸酶Pl的方法，在一種實施方式中，向麥芽根水溶液中同 時加入MgSO4和SiSO4兩種無機(jī)鹽，并且MgSO4和SiSO4的添加濃度分別為4_10g/L和l_3g/ L0根據(jù)本發(fā)明用于制備核酸酶Pl的方法，在一種實施方式中，在離心收集上清液后 還包括以下步驟(4)使上清液經(jīng)0. 5微米膜除去大分子雜質(zhì)，收集透過液；(5)使透過液 經(jīng)截留分子量為5-10KD的膜進(jìn)行超濾濃縮，收集截留液，得到濃縮的核酸酶Pl提取液。根據(jù)上述制備核酸酶Pl的方法，其中，所使用的膜為有機(jī)卷式膜。根據(jù)本發(fā)明用于制備核酸酶Pl的方法，在一種實施方式中，在經(jīng)膜濃縮后還包 括(6)向截留液中加入l"6g/L的ZnSO4,在30-45°C、真空度-0. 08 -0. 12MPa條件下進(jìn) 行濃縮，以得到高度濃縮的核酸酶Pl提取液。根據(jù)本發(fā)明用于制備核酸酶Pl的方法，在一種實施方式中，還包括(7)將高度濃 縮的核酸酶Pl提取液在60-70°C條件下處理10-15分鐘，以滅除核酸酶Pl提取液中的雜酶。在本發(fā)明的方法中，采用33_37°C，優(yōu)選34_36°C，更優(yōu)選35°C溫度對核酸酶Pl進(jìn) 行浸提，這與現(xiàn)有技術(shù)中優(yōu)化選擇的40°C浸提溫度(“5'-核苷酸制備工藝的優(yōu)化”，楊 翠竹，中國優(yōu)秀碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫，2008年01期，B016-97, 2008-01-15)相比，能夠 出乎預(yù)料地提高核酸酶Pl的得率；本發(fā)明同時添加兩種無機(jī)鹽，MgSO4和SiSO4，對核酸酶 Pl進(jìn)行浸提，與現(xiàn)有技術(shù)中僅使用MgSO4相比，能夠顯著改善浸提效果，提高核酸酶Pl的得 率；此外，現(xiàn)有技術(shù)中因考慮到核酸酶Pl在高溫下容易失活而多采用冷凍干燥、噴霧干燥 方式對核酸酶Pl進(jìn)行濃縮，此種方法耗能較大，產(chǎn)品成本較高，本發(fā)明首次采用真空條件 下濃縮的方式對核酸酶Pi進(jìn)行純化，經(jīng)實驗證明，能夠獲得高活性的核酸酶Pi產(chǎn)品，這為 核酸酶Pl的生產(chǎn)開辟了新途徑。綜上所述，本發(fā)明通過添加無機(jī)鹽進(jìn)行浸提而得到核酸酶Pl粗酶液，通過膜微 濾、超濾和真空濃縮得到活性單位較高的濃縮酶液，并利用核酸酶Pl本身的特點，對雜酶 進(jìn)行滅除，解決了常規(guī)技術(shù)提取核酸酶Pl單位酶活較低的問題。并且，將通過本發(fā)明得到 的核酸酶產(chǎn)品應(yīng)用于高呈味核苷酸酵母抽提物的生產(chǎn)中，能夠顯著提高酵母抽提物中的呈 味核苷酸含量。因此，本發(fā)明通過一種低成本工藝生產(chǎn)高活性的核酸酶P1，并將其用于酵母 抽提物的生產(chǎn)中，可大大提高經(jīng)濟(jì)效益，具有廣闊的應(yīng)用前景和市場需求。
具體實施例方式本發(fā)明以麥芽根為原料，通過粉碎過篩、添加無機(jī)離子、水浸提后離心、微濾膜除 雜、超濾膜濃縮、蒸發(fā)濃縮、滅除雜酶等工藝得到活性顯著提高的濃縮酶液。本發(fā)明的核酸 酶Pl的提取濃縮工藝可簡要表示為新鮮麥芽根——粉碎過篩——浸提——壓濾除渣——離心分離——微 濾除雜——超濾濃縮——蒸發(fā)濃縮——滅除雜酶——濃縮酶液。以下對提取濃縮工藝中的各個步驟進(jìn)行詳細(xì)描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明了，以 下詳細(xì)描述僅為說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，在不違反本發(fā)明的精神的情況 下對其做出的各種修改和變化均應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)1、粉碎過篩挑選新鮮去殼的啤酒大麥麥芽根，顏色偏黃最佳，用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過60-100目篩備用。通過粉碎能夠破壞麥芽根的組織結(jié)構(gòu)、增大麥芽根的比表面積，使 麥芽根充分與以下浸提液接觸，以利于麥芽根中酶的溶出。本發(fā)明選擇過60-100目篩，可 改善浸提效果，進(jìn)而提高浸提后核酸酶Pl的得率。2、提取將上述過篩后的麥芽根粉末以原料與水的比例為1 10 1 6添加工 藝水，攪拌使之混合均勻，然后添加4-10g/L的硫酸鎂和l_3g/L的硫酸鋅，調(diào)pH為5. 5 6. 0，在33-37°C，優(yōu)選34-36°C，更優(yōu)選在約35°C條件下攪拌提取8_16小時。在該步驟中， 本發(fā)明選擇在33-37°C，優(yōu)選34-36°C，更優(yōu)選在約35°C溫度下，同時采用兩種無機(jī)鹽，硫酸 鎂和硫酸鋅，對核酸酶Pl進(jìn)行浸提，這與現(xiàn)有技術(shù)中在40°C、單一添加硫酸鎂的浸提工藝 相比，能夠出乎預(yù)料地提高核酸酶Pl的得率。3、壓濾將核酸酶Pl提取液用單層濾布壓濾以除去大部分大顆粒濾渣，直至濾渣 較為干燥即可，收集濾過液。4、離心將上述收集的濾過液經(jīng)離心機(jī)在14000-16000rpm離心分離10_30min，收集上清液。5、微濾、超濾將上述離心分離得到的上清液經(jīng)0. 5微米的有機(jī)卷式膜除去大分 子顆粒雜質(zhì)，收集透過液；再經(jīng)截留分子量為5-10KD的有機(jī)卷式膜進(jìn)行超濾濃縮，收集截 留液。通過該步驟，核酸酶Pl的濃縮倍數(shù)可達(dá)5-6倍。6、蒸發(fā)濃縮向上述超濾截留液添加l_6g/L的硫酸鋅，在30-45 °C、真空 度-0. 08 -0. 12MPa條件下濃縮至膏狀，至固形物含量達(dá)到35%以上。7、滅除雜酶將上述已高度濃縮的核酸酶Pl提取液在60_70°C條件下處理10_15 分鐘，以滅除其中的雜酶。由于麥芽根中除了含有核酸酶Pl外，還含有磷酸單酯酶及3’-磷 酸二酯酶，有必要對其進(jìn)行滅除以提高核酸酶Pl的純度?，F(xiàn)有文獻(xiàn)中并沒有報道對雜酶的有效去除，而經(jīng)典的離子交換樹脂分離純化法成 本高，工藝復(fù)雜，酶損失也較大。本發(fā)明在制備核酸酶Pi的方法中增加高溫處理滅除雜酶 的步驟，該步驟對于核酸酶Pl的活性沒有影響，不僅可提高核酸酶Pi的酶純度和作用效 果，同時能夠節(jié)省成本。以下以示例性方式列舉本發(fā)明方法的實驗例，以具體說明本發(fā)明的有益效果。實驗例1采用34-36°C浸提溫度對核酸酶Pl提取的影響將粉碎過60目篩的啤酒大麥麥芽根以原料與水的比例為1 10添加工藝水，混 勻后加入6g/L的硫酸鎂和2g/L的硫酸鋅，調(diào)pH值為5. 5，分別在約30°C、約35°C、約40°C 條件下攪拌提取16h。每種溫度下進(jìn)行三次重復(fù)試驗。對各種處理獲得的酶提取液進(jìn)行酶 活力的測定。核酸酶Pl活力的測定方法①熱變性RNA底物的制備稱取1. 500g酵母核酸，加適量雙蒸水溶解，微沸20min 使核酸變性，調(diào)PH至6. 5左右，用pH為6. 5的磷酸緩沖溶液定容至50ml。②測定方法離心管中加入1. 9ml上述熱變性底物，68°C下保溫lOmin，加酶液 0. 1ml，保溫15min后取出離心管，在冰水浴中振蕩，并迅速加入2. Oml預(yù)冷的核酸沉淀劑 (O. 25%鉬酸銨+2. 5%高氯酸)。冰水浴中冷卻20min，離心分離。取0. 2ml上清液加雙蒸 水定容于50ml容量瓶中，在260nm處測定吸光度值A(chǔ)。
空白對照離心管中加入1. 9ml上述熱變性底物，在68°C下保溫25min，加入預(yù)冷 核酸沉淀劑2. 0ml，再加酶液0. 1ml，余下步驟相同。測定吸光度值A(chǔ)O。③酶活的計算在一定的測定條件下，每分鐘所生成的核苷酸量使其在260nm處 的光密度差為1. 0時定義為一個活力單位?；盍?U/min)= (A-A0) X (4/0. 1) X (50/0. 2)+15具體結(jié)果如表1所示。表 權(quán)利要求
1.一種從麥芽根中提取核酸酶Pi的方法，其特征在于包括以下步驟(1)將麥芽根粉碎過篩，向過篩后的麥芽根粉末中添加水，并在混勻后加入無機(jī)鹽，將 pH調(diào)至5. 5-6. 0，在33-37°C下攪拌提取8-16小時；(2)對上述提取液進(jìn)行壓濾以除去大顆粒濾渣，收集濾過液；(3)離心所述濾過液，收集上清液，以得到核酸酶Pl提取液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟(1)是在34-36°C下攪拌提取8-16小時。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟(1)是在35°C下攪拌提取8-16小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其中，所述無機(jī)鹽為4-10g/L的MgSO4* l-3g/L 的 ZnS04。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法在步驟C3)后還包括 以下步驟(4)使所述上清液經(jīng)0.5微米膜除去大分子雜質(zhì)，收集透過液；(5)使所述透過液經(jīng)截留分子量為5-10KD的膜進(jìn)行超濾濃縮，收集截留液，得到濃縮 的核酸酶Pl提取液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述膜為有機(jī)卷式膜。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法在步驟( 后還包括以下步驟(6)向所述截留液中加入l_6g/L的SiSO4,在30-45°C、真空度-0.08 -0. 12MPa條件 下進(jìn)行濃縮，以得到高度濃縮的核酸酶Pl提取液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法在步驟(6)后還包括以下步驟(7)將所述高度濃縮的核酸酶Pl提取液在60-70°C條件下處理10-15分鐘，以滅除所 述核酸酶Pl提取液中的雜酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法在步驟C3)后還包括以下步驟(4)使所述上清液經(jīng)0.5微米膜除去大分子雜質(zhì)，收集透過液；(5)使所述透過液經(jīng)截留分子量為5-10KD的膜進(jìn)行超濾濃縮，收集截留液，得到濃縮 的核酸酶Pl提取液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述膜為有機(jī)卷式膜。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法在步驟( 后還包括以下步驟(6)向所述截留液中加入l_6g/L的SiSO4,在30-45°C、真空度-0.08 -0. 12MPa條件 下進(jìn)行濃縮，以得到高度濃縮的核酸酶Pl提取液。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法在步驟(6)后還包括以下步驟(7)將所述高度濃縮的核酸酶Pl提取液在60-70°C條件下處理10-15分鐘，以滅除所 述核酸酶Pl提取液中的雜酶。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于制備核酸酶P1的方法，包括以下步驟(1)將麥芽根粉碎過篩，向過篩后的麥芽根粉末中添加水，并在混勻后加入無機(jī)鹽，將pH值調(diào)至5.5-6.0，在33-37℃下攪拌提取8-16小時；(2)對上述提取液進(jìn)行壓濾以除去大顆粒濾渣，收集濾過液；(3)離心所述濾過液，收集上清液，以得到核酸酶P1提取液。通過本發(fā)明的方法，能夠獲得活性顯著提高的核酸酶P1。
文檔編號C12N9/22GK102051349SQ20091020960
公開日2011年5月11日 申請日期2009年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月30日
發(fā)明者余明華, 俞學(xué)鋒, 姚鵑, 朱昌雄, 李知洪, 趙劼, 鄧怡熹 申請人:安琪酵母股份有限公司