專利名稱：高敏感的內(nèi)切核酸酶的生產(chǎn)方法、內(nèi)切核酸酶的新制品及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鑒定和制備具有高活性和敏感性以及寬底物特異性的錯(cuò)配特異的內(nèi)切核酸酶。
背景技術(shù)：
上個(gè)世紀(jì)初，對(duì)通過輻射或化學(xué)品在DNA內(nèi)部誘導(dǎo)突變的可能性的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)為理解活體內(nèi)基因功能帶來了相當(dāng)大的希望。自那時(shí)起，誘變作用和自然序列變化已經(jīng)被廣泛地用于鑒定新功能、對(duì)應(yīng)于特異功能的基因以及一個(gè)特異蛋白質(zhì)內(nèi)部的活性位點(diǎn)。
實(shí)施這個(gè)方法的一個(gè)關(guān)鍵方面，特別是在點(diǎn)突變的情況下，是對(duì)突變檢測(cè)方法的選擇，這些方法被設(shè)計(jì)為對(duì)大段的DNA進(jìn)行篩選而不減少診斷敏感性或特異性，并且同時(shí)能提供有關(guān)突變位點(diǎn)的信息。最常用的工具當(dāng)中有基于不完全配對(duì)的DNA的方法，該DNA能夠通過兩個(gè)DNA分子的變性和復(fù)性在試管內(nèi)產(chǎn)生。使用如溝結(jié)合劑等化學(xué)品或能夠在錯(cuò)配位點(diǎn)上特異地剪切單鏈DNA的分子在這些異源雙鏈分子中檢測(cè)到錯(cuò)配?？商娲?，單鏈特異的內(nèi)切核酸酶已經(jīng)被用于在錯(cuò)配位點(diǎn)剪切DNA。目前已被描述的絕大多數(shù)內(nèi)切核酸酶屬于S1/P1類核酸酶。
例如S1、P1和綠豆核酸酶等核酸酶，屬于被命名為“S1/P1族核酸酶”或?yàn)椤癝1族核酸酶”的同一族，已知能用于在單鏈區(qū)域切開DNA。但是這些核酸酶所具有的酸性pH最佳值是在4.0-5.0的范圍內(nèi)。
這對(duì)于錯(cuò)配檢測(cè)是不利的，因?yàn)榈蚿H值有利于DNA脫嘌呤并且使得DNA雙鏈體不穩(wěn)定，導(dǎo)致非特異的DNA降解，并且降低檢測(cè)的敏感性和特異性。
幾年前，OLEYKOWSKI等人(Nucleic Acids Res，26，4597-4602，1998)從不同的植物提取物中檢測(cè)到一個(gè)錯(cuò)配內(nèi)切核酸酶的活性，其具有中性的pH最佳值(大約pH 8)并在錯(cuò)配位點(diǎn)的3’端完成一個(gè)單鏈切開。這些作者報(bào)道了該錯(cuò)配內(nèi)切核酸酶的活性與苜蓿芽、蘆筍、芹菜和西紅柿的提取物中的甘露糖基糖蛋白(mannosyl glycoproteins)有關(guān)。芹菜中的酶，稱之為CEL I，是通過連續(xù)的硫酸銨沉淀步驟從芹菜莖中提純，結(jié)合到一個(gè)刀豆體球蛋白A-瓊脂糖柱并且被[α]-d+-甘露糖洗提，結(jié)合到一個(gè)磷酸纖維素柱并且被線性梯度的KCl洗提，并且用尺寸排阻色譜法分級(jí)分離。因此獲得的CEL I制品包含幾個(gè)34-39KDa的蛋白帶。
YANG等人(Biochemistry，39，3533-3541，2000)和PCT申請(qǐng)WO 01/62974描述了一種改進(jìn)的CEL I提純，它是通過在提純緩沖液中使用α-甲基甘露糖苷來克服CEL I與內(nèi)源性選擇素的聚集反應(yīng)。這些文件還披露了CEL IcDNA的克隆。以序列數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，CEL I被指定為S1/P1族核酸酶的一個(gè)亞族，并且鑒定出幾個(gè)用擬南芥(Arabidopsis thaliana)的BFN1(GenBank核苷酸(nucleotide)AY040016)、百日草屬植物的ZEN1(GenBank核苷酸AB003131)和萱草的DSA6(GenBank核苷酸AF082031)的基因進(jìn)行編碼的可能的同系物。
CEL I內(nèi)切核酸酶活性已經(jīng)顯示出對(duì)于堿基替換的錯(cuò)配以及由于插入/缺失情況引起的錯(cuò)配是高度特異的，并且獨(dú)立于側(cè)翼序列環(huán)境。因此它在包括突變篩選等不同的方法中作為突變檢測(cè)試劑是很有用的。CEL I錯(cuò)配檢測(cè)系統(tǒng)是一個(gè)簡(jiǎn)單的測(cè)定法，它需要靶序列的聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增(PCR擴(kuò)增)、變性和退火，以允許在野生型和突變體等位基因之間生成異源雙鏈體，酶的錯(cuò)配剪切，以及通過凝膠電泳法的產(chǎn)品分析。因?yàn)樗趯?duì)大段DNA中的錯(cuò)配進(jìn)行檢測(cè)時(shí)的特異性和敏感性，它比其他流行的錯(cuò)配檢測(cè)系統(tǒng)有利，比如變性HPLC。
通過實(shí)施例，OLEYKOWSKI等人和YANG等人(上面引用的出版物)報(bào)道將其用于檢測(cè)人類與家族性乳腺癌有關(guān)的基因(BRCA1基因)的序列改變，并且SOKURENKO等人(Nucl.Acids Res.，29，e111，2001)披露了將其用于檢測(cè)大范圍基因組DNA的突變和多態(tài)性。CEL I也在TILLING(基因組中靶向誘導(dǎo)的局部損害(Targeting Induced Local Lesions IN Genomes))的高產(chǎn)率篩選中得到使用，其中化學(xué)誘變之后對(duì)基因點(diǎn)突變進(jìn)行篩選，或?qū)⑵溆糜跈z測(cè)自然群體中的多態(tài)現(xiàn)象，也被稱作“Ecotilling”( 等人，Plant Journal，37，778-786，2004)。它已經(jīng)被用在植物(COLBERT等人，Plant Physiology 126，480-484，2001；TILL等人，GenomeResearch 13，524-530，2003；PERRY等人，Plant Physiology 131，866-871，2003)和動(dòng)物中，例如斑馬魚(WIENHOLDS等人，Genome Res.，13，2700-2707，2003)。PCT申請(qǐng)WO 03/066809提出在相關(guān)聚核苷酸之中重新配置序列變化的一種方法中使用CEL I，該方法稱作“通過解決錯(cuò)配的基因重排列”(″Genetic Reassortment by Mismatch Resolution″(GRAMMR))。
但是CEL I的缺點(diǎn)是所具有的剪切效率由一個(gè)錯(cuò)配到另一個(gè)錯(cuò)配而變化在具有單一核苷酸插入的DNA環(huán)的情況下，OLEYKOWSKI等人(Nucleic Acids Res.1998 Oct15；26(20)4597-602)報(bào)道了CEL I底物優(yōu)選特性為G＞A＞C＞T；在堿基替換的錯(cuò)配情況下，CEL I底物優(yōu)選特性為C/C≥C/A～C/T≥G/G＞A/C～A/A～T/C＞T/G～G/T～G/A～A/G＞T/T。它的功效在錯(cuò)配C/A，C/C，C/T，G/G是很明顯的。在其他的錯(cuò)配上觀察到活性降低，它對(duì)于錯(cuò)配T/T幾乎無效。當(dāng)需要在一個(gè)DNA庫中對(duì)某一等位基因進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，這種剪切功效上的變化可能會(huì)導(dǎo)致在檢測(cè)某些突變時(shí)的較低正確率。
限制CEL I應(yīng)用的另一個(gè)不便之處是可用的提純法的低產(chǎn)率。OLEYKOWSKI等人從含有大約350克蛋白質(zhì)的7千克芹菜莖開始獲得了3ml的0.1μg/μl的CEL I；由YANG等人和PCT WO 01/62974中披露的提純過程得到5μg純化的CEL I，特異活性為3.1×107 CEL I單位/毫克蛋白質(zhì)，從105千克芹菜莖開始。
為了獲得更大量的CEL I，已經(jīng)提出它可以通過重組DNA技術(shù)來生產(chǎn)。PCT申請(qǐng)WO03/066809提出了一個(gè)可能合適的載體和宿主細(xì)胞的很大的清單，包括幾乎任何已知的原核或真核生物表達(dá)系統(tǒng)；但是，這個(gè)文件中實(shí)際披露的唯一表達(dá)系統(tǒng)是基于煙草花葉病毒組的載體。通過在所述載體中將融合到一個(gè)編碼為6-組氨酸標(biāo)簽的該CEL I的cDNA進(jìn)行克隆的構(gòu)造已經(jīng)被用于感染煙草植物。重組CEL I從被感染植物的細(xì)胞內(nèi)液中回收，在鎳-NTA樹脂上通過金屬親和層析法提純。PCT WO 03/066809對(duì)于提純的酶的產(chǎn)率沒有敘述。它表明其在GRAMMR反應(yīng)中的活性與芹菜中提純的某一個(gè)天然酶近似。這個(gè)系統(tǒng)的一個(gè)不便之處是病毒傾向于重組，部分或全部失去該表達(dá)基因。這帶來除了完整長(zhǎng)度的CEL I之外還會(huì)產(chǎn)生截短的形式，降低了該酶的特異活性。
PCT申請(qǐng)WO2004/035771涉及一種在酵母中生產(chǎn)CEL I的方法。對(duì)于這個(gè)作用，對(duì)CELI編碼的一個(gè)合成基因是按照酵母中密碼子的使用通過修飾CEL I的天然DNA序列而構(gòu)成。這個(gè)文件表明由該合成基因生產(chǎn)的重組CEL I能夠識(shí)別所有可能的錯(cuò)配組和，并且用例證說明了錯(cuò)配A/A的識(shí)別和剪切。另一方面，它對(duì)所述重組CEL I的錯(cuò)配優(yōu)選特性沒有敘述。
從上面看來目前可用的生產(chǎn)重組CEL I的各種方法并沒有提供與從芹菜生產(chǎn)天然CEL I相比較的任何重大的改進(jìn)。另外他們沒有提及天然CEL I底物優(yōu)選特性的問題。
并且，希望能有像CELI的其他內(nèi)切核酸酶能夠在中性pH下剪切異源雙鏈DNA模板的單堿基對(duì)錯(cuò)配，但是它們具有不同的錯(cuò)配優(yōu)選特性，或優(yōu)選地，能對(duì)所有錯(cuò)配進(jìn)行同樣良好的剪切。但是，直到現(xiàn)在尚未鑒定出這樣的內(nèi)切核酸酶。
像CEl I的內(nèi)切核酸酶活性的存在已經(jīng)在許多植物中被報(bào)道(cf.例如上面引用的OLEYKOWSKI等人，1998)。但是帶來這些活性的酶還沒有進(jìn)行特征標(biāo)記，它們的生化特性例如底物優(yōu)選特性還沒有被研究，并且它們的序列還沒有被鑒定。另一方面，CEL I的結(jié)構(gòu)同系物已經(jīng)在計(jì)算機(jī)硅片上(in silico)被確認(rèn)(上面引用的YANG等人，TILL等人NucleicAcids Res.，32，2632-41，2004)。它們中的三個(gè)(擬南芥的BFN1，百日草屬的ZEN1和萱草的DSA6)已經(jīng)有報(bào)道涉及植物枯萎(PEREZ-AMADOR等人，Plant Physiol.122，169-180 2000)。但是，它們沒有被提純，保持生化上未進(jìn)行特征標(biāo)記特別是試管內(nèi)識(shí)別異源雙鏈DNA錯(cuò)配的效率還沒有被試驗(yàn)。已經(jīng)從菠菜中提純出被稱作SP的一種內(nèi)切核酸酶，基于其活性它已經(jīng)被歸屬為S1/P1族，并且它具有中性的pH最佳值。像CEL I，該酶剪切插入/缺失和堿基替換的錯(cuò)配；但是它不識(shí)別那些包含鳥嘌呤殘基的錯(cuò)配(OLEYKOWSKI等人，Biochemistry，38，2200-5，1999)。
在尋找獲得重組CEL I的替代方法的過程中，諸位發(fā)明人已經(jīng)嘗試了通過土壤桿菌屬介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)在植物中(in planta)對(duì)其進(jìn)行表達(dá)。
他們已經(jīng)在農(nóng)桿菌浸潤(rùn)的(agroinfiltrated)煙葉上表達(dá)了重組CEL I，并且用硫酸銨沉淀法從葉子提取物中將其提純。他們已經(jīng)驚訝地發(fā)現(xiàn)，他們獲得了具有高活性的重組CEL I的非常高的產(chǎn)率，另外，比之現(xiàn)有技術(shù)中已知的CEL I的制品，該重組CEL I制品以更寬的特異性和更高的敏感性來識(shí)別錯(cuò)配，即使對(duì)例如T/T這樣的錯(cuò)配也允許清楚地檢測(cè)，而它們被認(rèn)為用CEL I是很難識(shí)別的。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于這些結(jié)果，諸位發(fā)明人已經(jīng)想到使用該方法通過在試管內(nèi)測(cè)試它們的活性來篩選在計(jì)算機(jī)芯片上被鑒別為屬于S1/P1族的各個(gè)內(nèi)切核酸酶。
因此本發(fā)明提供了從少量的起始材料獲得大量?jī)?nèi)切核酸酶，特別是S1/P1核酸酶的一種簡(jiǎn)單快速的方法，并且還提供了一種在試管內(nèi)評(píng)價(jià)候選內(nèi)切核酸酶活性的方法，特別是為了鑒定錯(cuò)配特異的內(nèi)切核酸酶。
一個(gè)錯(cuò)配特異的內(nèi)切核酸酶在此處定義為一種能夠特定地剪切所有堿基替代的錯(cuò)配(即A/A，G/G，C/C，T/T，A/G，A/C，G/T，C/T，G/A，C/A，T/C，T/G)以及一個(gè)或多個(gè)核苷酸的插入/缺失的內(nèi)切核酸酶。
因此本發(fā)明的一個(gè)目的就是提供生產(chǎn)重組內(nèi)切核酸酶的一種方法，其中所述方法包括-在宿主植物細(xì)胞中表達(dá)所述重組內(nèi)切核酸酶，由包含表達(dá)載體的土壤桿菌屬菌株瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，該表達(dá)載體包括對(duì)所述內(nèi)切核酸酶進(jìn)行編碼的聚核苷酸；-從所述宿主植物細(xì)胞中分離出所述重組內(nèi)切核酸酶。
所述植物細(xì)胞可以是細(xì)胞懸液或者組織或器官培養(yǎng)的一部分。在這種情況下，該酶能夠從上清液和/或從培養(yǎng)的細(xì)胞或組織或器官中收集。優(yōu)選地，它們是整個(gè)植物或由此分離的器官的一部分；在這種情況下，以土壤桿菌屬菌株的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化將通過農(nóng)桿菌浸潤(rùn)(agroinfiltration)來實(shí)現(xiàn)。
農(nóng)桿菌浸潤(rùn)是基于將包含有關(guān)基因的農(nóng)桿菌送入完整的植物組織中的一種瞬時(shí)表達(dá)方法。
一個(gè)包括有關(guān)基因的DNA結(jié)構(gòu)被克隆成為一個(gè)二元載體并且被轉(zhuǎn)移進(jìn)一個(gè)選定的土壤桿菌屬菌株，并且該經(jīng)轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或者飽和并且用與常規(guī)土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化相同的方法進(jìn)行收集。經(jīng)典地，農(nóng)桿菌浸潤(rùn)是通過將被轉(zhuǎn)化的土壤桿菌屬細(xì)胞的懸浮液或者用沒有針頭的注射器注射進(jìn)選定植物的一個(gè)器官(通常是葉子)，或者通過幾分鐘的真空浸潤(rùn)。將該真空釋放后，該器官或整個(gè)植物被放在一個(gè)生長(zhǎng)室內(nèi)。該有關(guān)的表達(dá)蛋白質(zhì)從浸潤(rùn)的器官提取，一般在浸潤(rùn)后一至四天。各個(gè)農(nóng)桿菌浸潤(rùn)方案在不同的發(fā)表物上有披露，例如KAPILA等人，(Plant Sci.122，101-108，1997)；BENDAHMANE等人，(Plant Cell，11，781-792，1999)；SCOFIELD等人，(Science.，274，2063-5，1996)；TANG等人，(Science.，274，2060-3，1996)；MARILLONNET等人，(Proc Natl Acad Sci USA，101，6852-7，2004)；WROBLEWSKI等人，(Plant Biotech.J.，3，pp.259-273，2005)。
用于土壤桿菌屬介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)的、特別是用于農(nóng)桿菌浸潤(rùn)的經(jīng)典方案能夠用在本發(fā)明的實(shí)踐中。具有二元載體的土壤桿菌屬菌株以及控制有關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控元素有很大的選擇范圍，一位本領(lǐng)域有技能的人士可以在它們中間選擇更適合的、例如按照計(jì)劃使用的宿主植物。
在以下實(shí)施例中披露的實(shí)驗(yàn)中，諸位發(fā)明人使用了一個(gè)pBIN19-衍生的二元載體，pBIN61，和潛伏了高毒性pCH32質(zhì)粒的土壤桿菌屬菌株C58C1，并且cDNA或基因組編碼序列已經(jīng)在CaMV 35S啟動(dòng)子下進(jìn)行了表達(dá)。但是，其他二元載體、其他土壤桿菌屬菌株和其他構(gòu)成或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子能夠被用于到達(dá)同樣的結(jié)果。
有利的是，農(nóng)桿菌浸潤(rùn)將在葉子中進(jìn)行，它能夠任選地在浸潤(rùn)之前或之后立即從所述植物分離。
能夠在本發(fā)明的方法中使用的宿主植物包括與土壤桿菌屬轉(zhuǎn)化相容的任何植物。優(yōu)選的植物特別包括煙草屬的那些植物，尤其是本塞姆氏煙草(Nicotiana benthamiana)和普通煙草(Nicotiana tabacum)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，通過包含下列步驟的方法從農(nóng)桿菌浸潤(rùn)的植物器官，特別是從農(nóng)桿菌浸潤(rùn)的葉子中分離出所述內(nèi)切核酸酶-從表達(dá)所述內(nèi)切核酸酶的農(nóng)桿菌浸潤(rùn)的器官提取細(xì)胞內(nèi)含物；-將終濃度為30％或以上的硫酸銨加入到所述提取物中，并從上清液中分離蛋白質(zhì)沉淀物；-將終濃度為80％或以上的硫酸銨加入到所述上清液中，并回收含內(nèi)切核酸酶的蛋白質(zhì)沉淀物。
所述蛋白質(zhì)沉淀物在一個(gè)合適的緩沖液中被再次懸浮，例如是一個(gè)包含Tris HCl(pH 8)、PMSF和10％甘油的緩沖液。它可以直接使用，或者在-80℃下保存至使用。
可替代地，上面表明的該第一個(gè)步驟之后所獲得的全部提取物可以如此使用，而不用進(jìn)行多個(gè)硫酸銨沉淀的步驟。
可任選地，本發(fā)明的方法生產(chǎn)的內(nèi)切核酸酶能夠用本身已知的任何適當(dāng)方法進(jìn)一步提純，例如柱親和提純法，其中用一個(gè)標(biāo)簽將CEL I標(biāo)記為在柱中對(duì)某一特殊成分具有親和力。按照一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的CEL I被標(biāo)以6-組氨酸標(biāo)簽，用在鎳-NTA上的金屬親和層析法提純。
本發(fā)明還提供了一種方法，用于測(cè)試候選內(nèi)切核酸酶是否為錯(cuò)配特異的內(nèi)切核酸酶，其中所述方法包括a)用如上定義的本發(fā)明的方法以重組方式生產(chǎn)所述候選內(nèi)切核酸酶；b)對(duì)所述重組內(nèi)切核酸酶的降解單鏈DNA的能力進(jìn)行測(cè)試；c)對(duì)所述重組內(nèi)切核酸酶在一個(gè)預(yù)定的錯(cuò)配位點(diǎn)剪切試驗(yàn)異源雙鏈DNA片段的能力進(jìn)行測(cè)試；d)對(duì)所述重組內(nèi)切核酸酶剪切攜帶所有類型錯(cuò)配(即堿基替代錯(cuò)配A/A，G/G，C/C，T/T，A/G，A/C，G/T，C/T，G/A，C/A，T/C，T/G，以及插入或缺失錯(cuò)配)的異源雙鏈DNA片段的能力進(jìn)行測(cè)試。
如果內(nèi)切核酸酶通過了步驟b)、c)和d)的測(cè)試(即如果它能夠降解單鏈DNA，能夠在預(yù)定的錯(cuò)配位點(diǎn)剪切試驗(yàn)異源雙鏈DNA片斷，并且能夠剪切攜帶所有類型錯(cuò)配的異源雙鏈DNA片斷)，它就被認(rèn)為是錯(cuò)配特異的內(nèi)切核酸酶。
本發(fā)明還提供了一種篩選錯(cuò)配特異的內(nèi)切核酸酶的方法，其中所述方法包括a)用如上定義的本發(fā)明的方法以重組方式生產(chǎn)所述候選內(nèi)切核酸酶；b)對(duì)所述重組內(nèi)切核酸酶降解單鏈DNA的能力進(jìn)行測(cè)試；c)對(duì)該重組內(nèi)切核酸酶能夠降解單鏈DNA進(jìn)行測(cè)試，并且對(duì)它們?cè)谝阎⑶矣辛己锰卣鳂?biāo)記的錯(cuò)配位點(diǎn)剪切試驗(yàn)異源雙鏈DNA片段的能力進(jìn)行測(cè)試；d)選擇能夠在已知并且有良好特征標(biāo)記的錯(cuò)配位點(diǎn)剪切試驗(yàn)異源雙鏈DNA片段的重組內(nèi)切核酸酶，并對(duì)它們剪切攜帶所有類型錯(cuò)配的異源雙鏈DNA片斷的能力進(jìn)行測(cè)試；e)選擇通過步驟b)、c)和d)測(cè)試的重組內(nèi)切核酸酶。
按照上面定義的方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，它們還包含一個(gè)步驟，它包括在過量的野生型等位基因的存在下測(cè)試在DNA庫中檢測(cè)突變體等位基因的能力來對(duì)所述內(nèi)切核酸酶測(cè)試它們的敏感性，并且選擇在至少9倍過量(即10個(gè)一群中有一個(gè)突變體等位基因)的野生型等位基因存在下能夠檢測(cè)出所述突變體等位基因的內(nèi)切核酸酶，優(yōu)選至少14倍過量存在，還更加優(yōu)選至少19倍過量存在，并且按照增加的優(yōu)選特性的順序，29倍過量、39倍過量、49倍過量、59倍過量的野生型等位基因。
優(yōu)選地，以上定義的試驗(yàn)是在具有pH值7至8，更有利7.4至7.8，并含有5至20mM，更有利10mM的MgCl2的反應(yīng)混合物中進(jìn)行。有利的是，所述反應(yīng)混合物還包括0.5mM至2mM，優(yōu)選1mM的DTT。諸位發(fā)明人還已經(jīng)觀察到在2％至10％(w/v)，特別是5％的最終反應(yīng)混合物中添加PEG-8000，增加了該內(nèi)切核酸酶的總體活性。
能夠用本發(fā)明的方法試驗(yàn)的候選內(nèi)切核酸酶能夠在該S1/P1族之中找到。在PFAM數(shù)據(jù)庫中(BATEMAN等人，Nucleic Acids Res.32，D138-41，2004)，該族被指定為PFAM 02265。例如可以使用從PFAM 02265建立的HMM分布(隱含馬爾代夫模型(Hidden Markov Models))作為探針來篩選可用的DNA序列數(shù)據(jù)庫，使用HMMER軟件在不同的植物中識(shí)別候選內(nèi)切核酸酶。
可替代地，InterPro IPR003154代碼(對(duì)應(yīng)于S1/P1核酸酶)能被用于篩選數(shù)據(jù)庫內(nèi)容，例如使用下列地址http//www.ebi.ac.uk/interpro/ISpy？ipr＝IPR003154用此代碼篩選Trembl/Swissprot數(shù)據(jù)庫識(shí)別出了43個(gè)蛋白質(zhì)(表1)。
表1用IPR003154代碼篩選Trembl/Swissprot數(shù)據(jù)庫的結(jié)果


這個(gè)分析優(yōu)選通過在數(shù)據(jù)庫(blastp或tblastn)上執(zhí)行Blast完成，使用一個(gè)參考蛋白序列(例如CEL I序列)，選擇最佳命中數(shù)。
下面的各實(shí)施例將以更多的細(xì)節(jié)描述測(cè)試從擬南芥得到的五個(gè)候選內(nèi)切核酸酶。
諸位發(fā)明人發(fā)現(xiàn)這些內(nèi)切核酸酶之一，在所附序列表中表示在SEQ ID NO2名下(相應(yīng)的DNA序列表示在SEQ ID NO1名下)，并且它對(duì)應(yīng)于擬南芥的BFN1，具有一個(gè)不同的特異性，以及比CEL I有更大的敏感性。
作為一個(gè)錯(cuò)配特異的內(nèi)切核酸酶，BFN1特性的這個(gè)發(fā)現(xiàn)，它直到此前是未知的，允許將它提議作為突變檢測(cè)試劑來使用，以便檢測(cè)由于堿基替代，以及由于一個(gè)或多個(gè)核苷酸插入/缺失而造成的錯(cuò)配。
BFN1，以及任何根據(jù)本發(fā)明的方法可以確認(rèn)的錯(cuò)配特異的內(nèi)切核酸酶，均可用生產(chǎn)內(nèi)切核酸酶的方法大量獲得。
本發(fā)明還包括根據(jù)本發(fā)明的生產(chǎn)方法可獲得的重組體內(nèi)切核酸酶制品。這些特別是重組體CEL I制品和重組體BFN1制品。
本發(fā)明的重組體CEL I制品與現(xiàn)有技術(shù)的CEL I制品相比具有不同的錯(cuò)配特異性和更高的敏感性。本發(fā)明的重組體CEL I制品具有以下錯(cuò)配優(yōu)選特性T/G～A/G～G/G～G/T～T/T～G/A≥A/A～C/C≥T/C～C/T＞A/C～C/A，而現(xiàn)有技術(shù)的CEL I制品的錯(cuò)配優(yōu)選特性是C/C≥C/A～C/T≥G/G＞A/C～A/A～T/C＞T/G～G/T～G/A～A/G＞T/T。本發(fā)明的重組體CEL I制品能夠在23倍過量野生型等位基因存在下識(shí)別出突變體等位基因，而現(xiàn)有技術(shù)的CEL I制品在被稀釋超過8倍稀釋時(shí)不能有效地識(shí)別出突變體等位基因。
本發(fā)明的重組體BFN1制品與現(xiàn)有技術(shù)的CEL I制品和本發(fā)明的重組體CEL I制品相比也具有不同的錯(cuò)配特異性。本發(fā)明的重組體BFN1制品有以下錯(cuò)配優(yōu)選特性G/G～G/A～A/G～G/T～T/G＞T/T～A/A～C/C～T/C＞C/T～A/C～C/A。這些酶中的每一個(gè)的錯(cuò)配優(yōu)選特性總結(jié)在下面表2中。
表2錯(cuò)配識(shí)別優(yōu)選特性比較

*＝這些錯(cuò)配由BFN1(ENDO1)識(shí)別比由重組體Cel I更有效。**注意剪切效率估測(cè)只是半定量的；因此，基于它們被內(nèi)切核酸酶的識(shí)別，取決于研究者和/或試驗(yàn)，輕微的差異會(huì)出現(xiàn)在錯(cuò)配的排序中。
此外本發(fā)明的重組體BFN1制品比現(xiàn)有技術(shù)的CEL I制品和本發(fā)明的重組體CEL I制品均有更高的敏感性。本發(fā)明的重組體BFN1制品能夠在59-倍過量野生型等位基因存在下識(shí)別出一個(gè)突變體等位基因。
如上所述，本發(fā)明的重組體BFN1或CEL I內(nèi)切核酸酶制品能夠作為一種突變檢測(cè)試劑在涉及錯(cuò)配篩選的任何方法中使用。它們?cè)诨蚍中?，在TILLING、高產(chǎn)率TILLING、Ecotilling、GRAMMR等方面特別有利。
使用本發(fā)明的內(nèi)切核酸酶制品的方法基本上包括如現(xiàn)有技術(shù)中一樣的步驟，即靶序列的聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增(PCR擴(kuò)增)，擴(kuò)增產(chǎn)品的變性和退火以允許在野生型和突變體等位基因之間形成異源雙鏈，內(nèi)切核酸酶剪切該異源雙鏈，以及分析剪切產(chǎn)品。在實(shí)行這些方法時(shí)不同內(nèi)切核酸酶的混合能有利地被用于剪切這些異源雙鏈。
由于它們的高敏感性，本發(fā)明的內(nèi)切核酸酶制品還能夠?qū)嵭懈弋a(chǎn)率方法來鑒別一個(gè)樣品中的突變。例如，根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)切核酸酶制品能用于對(duì)一個(gè)大的多的樣本數(shù)目實(shí)行例如WO 01/75167中描述的方法，因?yàn)樗锌赡軐⒃S多樣本集中在一起進(jìn)行分析。
根據(jù)本發(fā)明，上述的內(nèi)切核酸酶制品能用于針對(duì)來自任何生物體或由其衍生的細(xì)胞系的一個(gè)很大數(shù)目的樣本在靶基因中對(duì)一個(gè)或多個(gè)突變進(jìn)行篩選，所執(zhí)行的步驟如下a)從所述種群的每一單體對(duì)所述靶基因或其一部分進(jìn)行擴(kuò)增，b)在2維或3維矩陣中對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)品進(jìn)行排序，包括行、列(2維矩陣)和柱(3維矩陣)，c)將所述擴(kuò)增產(chǎn)品集中，例如以此來獲得不同的庫，每個(gè)庫代表所述矩陣的一列、一行或一柱，d)向每個(gè)庫中添加從非變異基因中獲得的參考擴(kuò)增產(chǎn)品，在能夠形成異源雙鏈的環(huán)境下對(duì)這些庫進(jìn)行培養(yǎng)，e)用根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)切核酸酶制品對(duì)每個(gè)庫進(jìn)行培養(yǎng)，并且f)在所述培養(yǎng)的庫中對(duì)異源雙鏈的存在進(jìn)行檢測(cè)。
可替代地，以上方法能夠通過首先在矩陣中對(duì)樣本進(jìn)行排序，然后將它們(連同添加的參考)集中，并且實(shí)行擴(kuò)增、培養(yǎng)和檢測(cè)步驟。
取決于要篩選的樣本數(shù)目，該矩陣可以是2維或3維矩陣。例如，如果要篩選576個(gè)樣本，可以使用24×24矩陣。如果要篩選13824個(gè)樣本，那么3維矩陣可能會(huì)更合適(24×24×24)。僅需要72個(gè)反應(yīng)來篩選該種群，并且各突變的基因?qū)凑账鶎俚膸斓闹⒘泻托衼韱为?dú)區(qū)分。
該參考擴(kuò)增產(chǎn)品對(duì)應(yīng)于從該參考基因(與之對(duì)照來尋找突變)獲得的一個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)品，以與該種群中的靶基因相同的引物來擴(kuò)增。添加一個(gè)參考擴(kuò)增產(chǎn)品是很重要的。確實(shí)，盡管所有的樣本留存著與參考基因相比完全一樣的突變是非常不太可能的，但是這將確保如果該群包含了一個(gè)留存著突變的靶基因，那么異源雙鏈就可以形成。
本發(fā)明將由以下的進(jìn)一步描述來說明，其中參照的實(shí)施例展示了重組體CEL-I內(nèi)切核酸酶的制備和性能，對(duì)來自擬南芥的五個(gè)候選內(nèi)切核酸酶的測(cè)試，以及對(duì)BFN1(以下也被命名為ENDO1)作為錯(cuò)配特異的內(nèi)切核酸酶的鑒別。但是應(yīng)該理解，這些實(shí)施例僅用來解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)其任何形式的限制。


圖1瓊脂糖凝膠上的點(diǎn)突變檢測(cè)。(野生型和突變體DNA的)異源雙鏈已經(jīng)被由不同的重組體Cel I的稀釋液(D100～D1000)或不含蛋白質(zhì)(-)來培養(yǎng)。
圖2丙烯酰胺凝膠上的點(diǎn)突變檢測(cè)。WT+Mut來自野生型的DNA和突變體在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)之前已經(jīng)被混合在一起，因此產(chǎn)生異源雙鏈。WT僅有野生型DNA被用于PCR，因此僅產(chǎn)生同源雙鏈。Mut僅有突變體DNA被用于PCR，因此僅產(chǎn)生同源雙鏈。D100，D500和D1000重組體蛋白質(zhì)Cel I的稀釋液。
在凝膠上部指出了同源雙鏈的尺寸(661bp)。在405bp處的箭頭顯示由FAM熒光染料標(biāo)記的片斷。在256bp處的箭頭顯示由ROX熒光染料標(biāo)記的片斷。
圖3瓊脂糖凝膠上的基因組DNA中的點(diǎn)突變檢測(cè)。PCR產(chǎn)品按照以下實(shí)施例4的披露用引物4-960和4-721(SEQ ID Nos3和4)來獲得。然后它們用由硫酸銨沉淀法獲得的重組體CEL I制品的不同稀釋液來酶解(如實(shí)施例2披露)，并且在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分析。rms 1-13突變體和野生型等位基因的PCR產(chǎn)品的尺寸大約是500bp(確切的是481bp)。作為異源雙鏈DNA內(nèi)突變的檢測(cè)結(jié)果，獲得了大約200和300bp的兩個(gè)帶。即使在煙草產(chǎn)生的蛋白質(zhì)1/1000稀釋時(shí)這兩個(gè)帶也能在瓊脂糖凝膠內(nèi)看到。
1D100；2D500；3D1000；4沒有酶。
ATerese；Brms1.13；CT+rms1.13。
圖4所有錯(cuò)配類型的重組體Cel I活性分析?；赗x基因的一系列突變體通過PCR產(chǎn)生，并且異源雙鏈?zhǔn)峭ㄟ^將對(duì)應(yīng)于那些不同突變體的擴(kuò)增產(chǎn)品進(jìn)行混合而獲得。用IRD700和IRD800熒光基團(tuán)(MWS)標(biāo)記的寡核苷酸被用于PCR，并且錯(cuò)配檢測(cè)是在LICOR4300(LICOR)上進(jìn)行。該圖顯示IRD染料700(A)和IRD染料800(B)的運(yùn)行通路。通路A顯示204bp片斷的5’端片段被IRD-700-標(biāo)記，通路B顯示438bp片斷在3’端片斷用IRD-800染料標(biāo)記。
圖5煙草中產(chǎn)生的重組體Cel I蛋白質(zhì)的敏感性。1野生型豌豆(WtPea)；2 Le1；3 Wt+Le1；4 Wt+Le1+2DNAs；5 Wt+Le1+4DNAs；6 Wt+Le1+6DNAs；7 Wt+Le1+8DNAs；8 Wt+Le1+10DNAs。
圖6用五個(gè)候選內(nèi)切核酸酶在C-A/T-G錯(cuò)配位點(diǎn)剪切異源雙鏈DNA。(Ho)＝同源雙鏈DNA；(Ht)＝異源雙鏈DNA。
圖7用ENDO1和ENDO5對(duì)所有類型錯(cuò)配的特異識(shí)別的詳細(xì)分析。使用了與圖4相同的實(shí)驗(yàn)方案。
圖8測(cè)量ENDO1檢測(cè)敏感性的試驗(yàn)。突變體(Le-1)和野生型(Torstag)DNA的一個(gè)混合物按以下比例用作ENDO1活性的模板1個(gè)突變體對(duì)應(yīng)2，4，6，8，10，15，20，25，30，35，40，50和60個(gè)野生型(從左到右)。每個(gè)幅面的最后兩行是同源雙鏈(僅有突變體和僅有野生型)。左邊的幅面IRD700通路，檢測(cè)到的片斷尺寸＝338bp。右邊的幅面IRD800通路，檢測(cè)到的片斷尺寸＝300bp。
圖9用Cel 1和Endo1錯(cuò)配檢測(cè)的對(duì)比。第1，5，8和10行對(duì)應(yīng)同源雙鏈。被內(nèi)切核酸酶剪切得到的片斷為405bp(用藍(lán)色標(biāo)記)和256bp(用紅色標(biāo)記，在黑白畫面上不太明顯)。Endo1比Cel 1更有效地識(shí)別出錯(cuò)配。此外，用Endo1背景(非特異活性)更低。
圖10在兩種不同稀釋液中(D1000和D5000)用ENDO1在丙烯酰胺凝膠上對(duì)一個(gè)已知點(diǎn)突變的檢測(cè)。M5和M12是兩個(gè)含有Rx基因的質(zhì)粒；一個(gè)包含Wt型，另一個(gè)包含突變型。引物Rx21rox和Rx22fam(在該圖中，較小的剪切帶，用紅色標(biāo)記，在凝膠上顯示很明顯，但是在黑白圖上不太明顯)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1CEL I內(nèi)切核酸酶的克隆、提純和生產(chǎn)克隆CEL I的cDNA從芹菜中提取RNA嫩葉組織(1g)在液氮中用一個(gè)研棒和研缽磨碎。將粉末懸浮在10ml Trizol(Gibco)提取緩沖液中。該混懸液與2ml氯仿混合，在4C時(shí)12000rpm下離心15分鐘。該上清液與等體積的異丙醇混合，總RNA用離心沉淀法在4℃時(shí)12000rpm下沉淀10分鐘。該片狀沉淀物用80％的乙醇沖洗，風(fēng)干并且在200μl二乙基焦磷酰胺(DEPC)水中再次懸浮。
脫氧核糖核酸酶(DNase)處理進(jìn)行脫氧核糖核酸酶(DNase)處理來水解污染RNA制品的DNA。按照生產(chǎn)廠的條件(普洛麥格(Promega))將10μg總RNA用10個(gè)單位的DNase培養(yǎng)。
反應(yīng)在室溫下培養(yǎng)15分鐘，然后通過添加乙二胺四乙酸(EDTA)至最終濃度為25mM并通過在65℃時(shí)使DNase加熱失活10分鐘使反應(yīng)停止。
CEL I cDNA合成將10微升DNAse處理的RNA用于第一股(first strand)cDNA的合成。第一股cDNA合成用2皮克分子的20mers oligo dT引物來引發(fā)。50μl的反應(yīng)混合物(10μl的5x Superscript緩沖液[GIBCO-BRL]，5μl的100mM DTT，5μl的5mM dNTP)在70℃加熱10分鐘，然后在冰上冷卻。加入1μl的Superscript逆轉(zhuǎn)錄酶(200單位/μl；GIBCO-BRL)和1μl RNA酶抑制劑(RNase inhibitor)(37單位/μl，Pharmacia)，并且該反應(yīng)在42℃培養(yǎng)1小時(shí)。使用PCR擴(kuò)增將第一股cDNA轉(zhuǎn)化成雙鏈DNA，這是通過使用兩個(gè)對(duì)CEL I的5’和3’非翻譯區(qū)(UTR)特異的引物(見下面表3)的PCR擴(kuò)增。
克隆CEL I并且在煙葉上表達(dá)全長(zhǎng)CEL I開放讀碼框被PCR擴(kuò)增并且在二元載體pBin19的35S啟動(dòng)子和花椰菜花葉病毒(CaMV)轉(zhuǎn)錄終子之間插入，以此產(chǎn)生pBIN35S-CELI。另一個(gè)構(gòu)造pBIN35S-CELI8His也被創(chuàng)立。pBIN35S-CELI8His與pBIN35S-CELI完全相同，僅除外在CEL I蛋白質(zhì)C-端插入8個(gè)氨基酸的組氨酸標(biāo)簽。用于產(chǎn)生pBIN35S-CELI和pBIN35S-CELI8His的寡核苷酸在下面表3顯示。
表3

這些構(gòu)造被轉(zhuǎn)化進(jìn)入攜帶毒性輔助細(xì)胞質(zhì)粒pCH32的土壤桿菌屬菌種C58C1(Hamilton等人，PNAS，93(18)9975-9979，1996)。pCH32表達(dá)了VirG和VirE而且被用于促進(jìn)T-DNA轉(zhuǎn)化。土壤桿菌屬細(xì)胞被接種到添加了50μg/mL卡那霉素和5μg/mL四環(huán)素(tetracycline)的5mL的L肉湯培養(yǎng)基(Sambrook等人，1989)中，在28℃下生長(zhǎng)一夜。然后將添加了50μg/mL卡那霉素，5μg/mL四環(huán)素的L肉湯培養(yǎng)基(50mL)接種到5-mL過夜的培養(yǎng)液中，在29℃下生長(zhǎng)2天。細(xì)胞在一個(gè)包含10mM MgCl2，10mM MES，pH 5.6，以及150μM乙酰丁香酮的溶液中被沉淀和再次懸浮至最終濃度為0.5OD600。培養(yǎng)液在農(nóng)桿菌浸潤(rùn)進(jìn)入煙葉(Nicotianabenthamiana leaves)之前在室溫下培養(yǎng)2個(gè)小時(shí)。
土壤桿菌屬混懸液用一個(gè)沒有針頭的注射器注射進(jìn)葉子內(nèi)。
農(nóng)桿菌浸潤(rùn)的本塞姆氏煙草屬植物(Nicotiana benthamiana plants)在24℃下至少培養(yǎng)48小時(shí)，16小時(shí)光照，60％的濕度。為了測(cè)試農(nóng)桿菌浸潤(rùn)的效率，植物還用表達(dá)綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)的構(gòu)造進(jìn)行農(nóng)桿菌浸潤(rùn)。在收割這些葉子之前，使用紫外燈檢查每一片葉子的GFP表達(dá)強(qiáng)度。只有當(dāng)GFP被表達(dá)了，植物葉子才能收割。
通過硫酸銨沉淀法從煙葉中制備蛋白質(zhì)農(nóng)桿菌浸潤(rùn)的煙葉被收割并稱重。兩克農(nóng)桿菌浸潤(rùn)的葉子在含有0.1M Tris-HCl pH8，200μM PMSF，0.125mM β-巰基乙醇和10％甘油的7ml緩沖液內(nèi)進(jìn)行均質(zhì)處理，然后在3000g下離心25分鐘使細(xì)胞碎片成粒狀。對(duì)于上清液，加入100％的硫酸銨使最終濃度達(dá)到30％，然后將樣本在冰上培養(yǎng)1小時(shí)，在30000g下4℃時(shí)離心30分鐘使蛋白質(zhì)成粒狀，這些粒狀蛋白質(zhì)在30％的硫酸銨沉淀。對(duì)于上清液，加入100％的硫酸銨使最終濃度達(dá)到80％，然后將樣本再次在冰上培養(yǎng)1小時(shí)，如上離心使蛋白質(zhì)成粒狀，在80％的硫酸銨沉淀。包含在80％硫酸銨沉淀的蛋白質(zhì)的片狀沉淀物在600μl均質(zhì)化緩沖液中再次懸浮。蛋白質(zhì)濃度用考馬斯試劑分析試劑盒(kit Coomassie Plus Reagent Assay(Pierce))確定。均質(zhì)的片狀沉淀物包含14μg蛋白質(zhì)/μl。因此，從2克農(nóng)桿菌浸潤(rùn)的煙葉中收回8400μg蛋白質(zhì)。均質(zhì)的片狀沉淀物在含有50mM Tris-HCl pH8，10％甘油和100μM PMSF的緩沖液中稀釋至1μg/μl，等分樣本并在-80℃下保存。
用Ni-NTA親和色譜法提純His-6標(biāo)記的蛋白質(zhì)收集5克農(nóng)桿菌浸潤(rùn)的煙葉并且在含有磷酸鈉(100mM)，Tris HCl pH 8(10mM)，NaCl(200mM)，甲基重亞硫酸鈉(Sodium methabisulfite)(0.2％)，PMSF(1mM)，β巰基乙醇(10mM)的冰凍的緩沖液中進(jìn)行均質(zhì)處理。均質(zhì)化之后，樣本在6000g(Beckman，轉(zhuǎn)子JA 20)4℃下離心10分鐘。將咪唑(10mM)加入該上清液，用NaOH將pH調(diào)至9。該溶液在42,000g(Beckman，轉(zhuǎn)子JA 20)4℃下離心60分鐘。該上清液與預(yù)先用均質(zhì)化緩沖液+10mM咪唑pH9(緩沖液B)平衡的1ml Ni-NTA瓊脂糖(Quiagen)混合。該混合物在4℃均質(zhì)2個(gè)小時(shí)，以使蛋白質(zhì)結(jié)合到Ni-NTA瓊脂糖粒。將該粒被裝在1ml的聚丙烯柱內(nèi)(Quiagen)，樹脂用20ml的緩沖液B沖洗。該蛋白質(zhì)用5ml(5×1ml)的緩沖液B+250mM咪唑pH9洗脫。等分部分在提純過程中被保存來進(jìn)行酶的活性。為了避免高濃度咪唑?qū)τ诿富钚缘娜魏我种谱饔茫幌疵摰牟糠钟?升含有Tris-HCl pH8，0.1M，PMSF 100μM和ZnCl22μM的緩沖液在4℃透析一夜。這樣，回收1000μg蛋白質(zhì)。均質(zhì)的片狀沉淀物在含有50mM Tris-HCl pH8，10％甘油和100μM PMSF的緩沖液中稀釋至3μg/μl，等分樣本并且在-80℃保存。(稀釋D10,000)。
實(shí)施例2單鏈特異DNA降解該重組體Cel I降解單鏈DNA的活性如以前的描述來進(jìn)行(SUNG SC，LAKKOWSKI MSr.(1962)，J Biol Chem.1962 Feb；237506-11)。將30微克的脫氧核糖核酸酶(Dnase)、核糖核酸酶(Rnase)和無蛋白酶妁豌豆基因組DNA(protease free Pea genomic DNA)在一個(gè)含有50mM Tris-HCl(pH 7.6)，10mM MgCl2，1mM DTT和5％PEG-8000的緩沖液中用2μg蛋白質(zhì)提取物培養(yǎng)。為了終止反應(yīng)，加入0.2N HCl中的等體積的20mM LaCl3。樣本在21000g下離心40分鐘，使用分光光度計(jì)測(cè)量上清液在260nm的吸收度以確定變成可溶于酸的DNA的量。
實(shí)施例3煙草中產(chǎn)生的內(nèi)切核酸酶在瓊脂糖和丙烯酰胺凝膠上剪切異源雙鏈DNA以及檢測(cè)一個(gè)試驗(yàn)基因的已知點(diǎn)突變?yōu)榱藴y(cè)試在煙草中產(chǎn)生的CEL I內(nèi)切核酸酶是否能夠識(shí)別單個(gè)的點(diǎn)突變，通過硫酸銨沉淀法獲得的重組體CELI制品的活性對(duì)在單一點(diǎn)突變不同的兩個(gè)克隆的異源雙鏈DNA進(jìn)行了測(cè)試C-G至A-T轉(zhuǎn)變(Bendhamane等人，Plant Cell，11，781-792，1999)。使用兩個(gè)寡核苷酸R21和R22(R21 5′GAC ATA TGG ACT ACA GAA GCT TGG G 3′SEQ ID N°8；R22 5′GTT CAC GGG TCA CAT CAT GCA TTC C 3′SEQ ID N°9)在兩個(gè)克隆上進(jìn)行了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。用下列方案進(jìn)行了異源雙鏈DNA的PCR擴(kuò)增和重組在95℃下變性2分鐘，隨后進(jìn)行7個(gè)循環(huán)的94℃ 20秒，Tm(55℃)+3℃至Tm-4℃進(jìn)行15s，每個(gè)循環(huán)-1℃，以0.5℃/秒梯度降至72℃而且在72℃延長(zhǎng)1分鐘，然后進(jìn)行44個(gè)循環(huán)的94℃20秒，30℃的Tm -5℃，以0.5℃/秒梯度降至72℃而且在72℃延長(zhǎng)1分鐘，最后在72℃延長(zhǎng)5分鐘，并且在94℃進(jìn)行變性步驟10分鐘，然后降至40℃保持20秒，每個(gè)循環(huán)-0.3℃。
該P(yáng)CR產(chǎn)品(野生型和突變體DNA的混合物，或僅是野生型或突變體DNA)按如下用CEL I制品(1μg/μl母液被稀釋至1/100，1/500，或1/1000)培養(yǎng)例如，10μl的PCR產(chǎn)品(500ng)用總體積為25μl的2.5μl反應(yīng)緩沖液(Hepes 10mM，MgSO4 10mM，Triton X1000.002％，KCl10mM)和2.5μl稀釋的CEL I制品在37℃培養(yǎng)30分鐘。反應(yīng)用5μl的500mM EDTA終止，將該酶解產(chǎn)品在3％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分析。
如圖1所示，在異源雙鏈DNA上的試驗(yàn)基因Rx的點(diǎn)突變的檢測(cè)由稀釋至1/100，1/500和1/1000的大約200bp和400bp的兩個(gè)帶的出現(xiàn)所揭示。未加入酶時(shí)這些帶不會(huì)出現(xiàn)。
使用熒光標(biāo)記的引物獲得的而且用同上面一樣方法酶解的PCR產(chǎn)品在ABI377定序器上在丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行分析(圖2)。
如圖2所示，在256和405bp的這兩個(gè)帶只有當(dāng)Wt和Mut DNAs混合在一起時(shí)才出現(xiàn)，因?yàn)檫@兩個(gè)DNA之間形成了異源雙鏈。當(dāng)使用不同長(zhǎng)度波來使凝膠顯影時(shí)這就顯現(xiàn)得更清晰。特別是，當(dāng)使用WT+Mut混合作為PCR模板時(shí)，用ROX熒光染料(紅色)標(biāo)記的256bp帶就會(huì)清楚地呈現(xiàn)，而在黑白圖2上不是非常清楚地個(gè)別化，而且在其他情況下并不存在。
這些結(jié)果顯示植物內(nèi)(in planta)產(chǎn)生的CEL I蛋白質(zhì)能夠在DNA中識(shí)別錯(cuò)配。
實(shí)施例4用重組體CEL I檢測(cè)從豌豆中得到的基因組DNA中的點(diǎn)突變?yōu)榱嗽囼?yàn)從煙草提純的重組體CEL I是否能被用于檢測(cè)豌豆中的單個(gè)點(diǎn)突變，先前由Catherine Rameau進(jìn)行了特征標(biāo)記的(MORUS等人Plant Physiol 2001，1261205-1213.；RAMEAU等人，Plant Physiol 2002，115458-467)不同的豌豆rms和le突變體被用于實(shí)驗(yàn)；rms1.11包含G---->A位于基因序列中的不同位置；rms 1-12包含G---->A；rms 1-13包含G--->A。所有都是在同一基因rms1對(duì)G---->A發(fā)生突變，但位于不同位置。
為了擴(kuò)增rms位置(rms1-13，rms1-10，rms1-12)和le位置的野生型和突變體等位基因，50毫微克的豌豆基因組DNA被用作模板。在這個(gè)PCR擴(kuò)增中使用的引物總結(jié)于表4之中。
表4

PCR擴(kuò)增的程序是94℃ 1分鐘，(94℃ 15秒，55℃ 15秒，74℃ 1分鐘，X35)74℃ 7分鐘，8℃。該P(yáng)CR產(chǎn)品在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分析和用硫酸銨沉淀法獲得的重組體CEL I制品的不同稀釋如上面實(shí)施例2的披露進(jìn)行酶解。如圖3所示，rms1-13突變體和野生型突變體的PCR產(chǎn)品的尺寸大約為500bp(準(zhǔn)確地是481bp)。作為異源雙鏈DNA中突變檢測(cè)的結(jié)果，獲得了大約200和300bp的兩個(gè)帶。這兩個(gè)帶即使在煙草中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)1/1000的稀釋也能在瓊脂糖凝膠內(nèi)看到。這個(gè)結(jié)果顯示植物內(nèi)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)首先能夠識(shí)別基因組DNA中出現(xiàn)的點(diǎn)突變，其次因?yàn)榧词沟鞍踪|(zhì)被稀釋到1/1000酶解產(chǎn)品也能被看到，所以它是非常有活性的。
實(shí)施例5用重組體CEL I在不同錯(cuò)配之處剪切錯(cuò)配的效率為了測(cè)試根據(jù)本發(fā)明制備的重組體CEL I是否像從芹菜提純的CEL I一樣優(yōu)選地切斷某一類型的錯(cuò)配，創(chuàng)造了一系列基于Rx基因的突變體。為了那個(gè)目的，我們?cè)O(shè)計(jì)了不同的引物(稱作Rx-A，T，G或C)，每個(gè)包含一個(gè)不同的點(diǎn)突變。這些引物的每一個(gè)允許在Rx基因指定位置引進(jìn)4個(gè)基底中的一個(gè)(A，T，G或C)。異源雙鏈?zhǔn)峭ㄟ^混合用不同引物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)品來創(chuàng)造。
PCR混合物(總體積為50μl)包含模板DNA(50ng)，dNTP(0.2mM)，5μl PCR塞子Pfu(10X，Stratagene)，引物Rx 21(0.4μM)，引物Rx-A或Rx-T或Rx-G或Rx-C(0.4μM)，Pfu(5U，Stratagene，2.5單位/μl)。用于PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?4℃ 1分鐘，(94℃ 15秒，55℃ 15秒，74℃ 2分鐘，X35)74℃ 7分鐘，8℃過夜。用IRD700和IRD800熒光基團(tuán)(MWS)標(biāo)記的寡核苷酸被用于該P(yáng)CR以允許在LICOR4300(LICOR)上的錯(cuò)配檢測(cè)。
該P(yáng)CR產(chǎn)品在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分析，并在pGEM 3Zf內(nèi)進(jìn)行克隆。所有的克隆已經(jīng)被排序以確保正確的突變已經(jīng)被插入。PCR擴(kuò)增中作為模板的這些構(gòu)造的組合被用于重組所有類型的錯(cuò)配。
錯(cuò)配的PCR產(chǎn)品如上面實(shí)施例2披露的方法進(jìn)行培養(yǎng)，使用如上面實(shí)施例1披露的用硫酸銨沉淀法從煙葉中獲得的重組體CEL I制品。
各個(gè)酶解產(chǎn)品在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分析。使用了變性6.5％的丙烯酰胺凝膠，電泳條件是1500V，40W，40mA，45℃，掃描速度為1。
結(jié)果顯示在圖4上(Licor Gel)。
這些結(jié)果顯示本發(fā)明的CEL I制品識(shí)別出所有類型的錯(cuò)配，尤其是現(xiàn)有技術(shù)報(bào)道的直接從芹菜提純的CEL I所微弱識(shí)別的錯(cuò)配。確實(shí)，如上面表2所示，本發(fā)明的CEL I制品以非常高的特異性識(shí)別被現(xiàn)有技術(shù)的CEL I制品微弱識(shí)別的錯(cuò)配，如T/T，G/A，A/G，G/T，T/G，而且這個(gè)酶的錯(cuò)配優(yōu)選特性如下T/G～A/G～G/G～G/T＞T/T～G/A～A/A～C/C＞T/C～C/T～A/C～C/A。
當(dāng)CEL I反應(yīng)緩沖液補(bǔ)充進(jìn)5％PEG時(shí)，該特異活性還會(huì)被提高(未顯示數(shù)據(jù))。
實(shí)施例6重組體CEL I的敏感性為了驗(yàn)證本發(fā)明的重組體CEL I能被用于高流率基因分型，對(duì)它是否能夠在一個(gè)單體庫中識(shí)別出突變進(jìn)行了試驗(yàn)。
對(duì)應(yīng)于矮豌豆突變體Le1的具有一個(gè)已知SNP(C-->T)的基因組DNA和來自野生型豌豆栽培變種Torstag的基因組DNA已經(jīng)被用于擴(kuò)增Le1基因座。這些基因組DNA已經(jīng)在同源雙鏈和異源雙鏈的形成時(shí)用作對(duì)照。
為了產(chǎn)生異源雙鏈DNA，le1基因座的從豌豆植物同質(zhì)結(jié)合體得到的基因組DNA被用不同比例的Le1基因座的從豌豆植物同質(zhì)結(jié)合體得到的基因組DNA進(jìn)行稀釋，用被TET熒光染料(5’-TGATATTGTCGTGCAATATGATGAAAC-3’SEQ ID N°14)標(biāo)記的引物L(fēng)e2462和被ROX(MWG)熒光染料(5’-ATACCTATTTAGCCCACTTGGACAC-3’SEQ ID N°15)標(biāo)記的Le3082，將30ng用于PCR擴(kuò)增。該P(yáng)CR反應(yīng)如下進(jìn)行94℃ 1分鐘，(94℃ 15秒，55℃ 15秒，74℃ 1分鐘)X35，74℃ 7分鐘。從PCR產(chǎn)品重組的異源雙鏈DNA在上面描述的錯(cuò)配檢查測(cè)定法中被用作模板。
使用從煙草產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的這個(gè)集中實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在圖5顯示。如所期望的，無論何時(shí)在野生型鏈和突變體DNA鏈之間已經(jīng)形成異源雙鏈時(shí)，我們的重組體蛋白質(zhì)都能夠識(shí)別出SNPLe1。作為酶解的結(jié)果，已經(jīng)獲得了期望尺寸的兩個(gè)帶(300bp和338bp)，和符合未酶解同源雙鏈的第3個(gè)帶(638bp)。被標(biāo)記為紅色的這個(gè)338bp帶清楚地顯示在凝膠上(但是黑白圖上可見性差一些)。最有趣的是，即便使用了24個(gè)不同基因組DNA的一個(gè)庫(添加23種未知基因組DNA的Le1和野生型)時(shí)，該突變?nèi)阅軌虮坏鞍踪|(zhì)檢測(cè)到。
總之，植物內(nèi)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)具有高敏感性、允許從來自至少24個(gè)個(gè)體的基因組DNA擴(kuò)增的DNA序列之中鑒別出一個(gè)已知SNP。
實(shí)施例7擬南芥中不同內(nèi)切核酸酶的生物信息研究使用來自數(shù)據(jù)庫PFAM的蛋白質(zhì)序型(protein profile)PF02265，已經(jīng)做了來自編碼為內(nèi)切核酸酶的擬南芥的基因族的分析。該序型HMM被用作探針以靶向擬南芥基因組的所有27117預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)，并且為了避免自動(dòng)結(jié)構(gòu)注解效應(yīng)對(duì)全部基因組進(jìn)行了6次不同移碼的平移。在該分析中我們鑒定出5個(gè)候選基因At1g11190，At1g68290，At4g21590，At4g21585和At4g21600。
實(shí)施例8在煙葉中克隆和表達(dá)擬南芥候選基因每個(gè)候選基因的cDNA被PCR擴(kuò)增并插入35S啟動(dòng)子和二元載體pBin61中的轉(zhuǎn)錄端子的CaMV之間以產(chǎn)生pBIN35S-ENDO1，-ENDO2，-ENDO3，-ENDO4和-ENDO5，它們分別對(duì)應(yīng)著At1g11190，At1g68290，At4g21585，At4g21590和At4g21600(表5)。這些構(gòu)造被轉(zhuǎn)化成攜帶毒性輔助細(xì)胞質(zhì)粒pCH32的土壤桿菌屬菌株C58C1(HAMILTON CM，等人，(1996)ProcNatl Acad Sci USA.，93(18)9975-9)。pCH32表達(dá)了VirG和VirE而且被用作提高T-DNA轉(zhuǎn)移。土壤桿菌屬細(xì)胞被接種到2mL的L肉湯培養(yǎng)基中(SAMBROOK等人1989)，該培養(yǎng)基添加了50μg/mL卡那霉素和5μg/mL四環(huán)素并且在28℃生長(zhǎng)一整夜。細(xì)胞在一個(gè)包含10mM MgCl2，10mM MES，pH 5.6，和150μM乙酰丁香酮的溶液中被沉淀而且再次懸浮至最終濃度為0.5OD600。該培養(yǎng)液在農(nóng)桿菌浸潤(rùn)進(jìn)本塞姆氏煙葉之前在室溫下培養(yǎng)2小時(shí)。農(nóng)桿菌浸潤(rùn)的本塞姆氏煙草植物在24℃，16小時(shí)光照，60％濕度至少培養(yǎng)24小時(shí)。為了測(cè)試農(nóng)桿菌浸潤(rùn)的效率，植物還被用表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的構(gòu)造進(jìn)行農(nóng)桿菌浸潤(rùn)。在收割這些葉子之前，每片葉子GFP表達(dá)的強(qiáng)度使用紫外光燈檢查。這些植物葉子只有當(dāng)GFP被表達(dá)了才收割。候選蛋白質(zhì)用硫酸銨沉淀法提取，如實(shí)施例1所披露的。
表5用于克隆帶有或沒有組氨酸標(biāo)簽的候選內(nèi)切核酸酶的引物的序列

實(shí)施例9候選蛋白質(zhì)的生物化學(xué)特征。
作為一個(gè)簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)來判斷候選蛋白質(zhì)是否有活性，我們用不同稀釋的蛋白質(zhì)提取物(80％硫酸銨沉淀物)培養(yǎng)了一些超螺旋質(zhì)粒。作為蛋白質(zhì)提取物中內(nèi)切核酸酶存在的結(jié)果，該超螺旋結(jié)構(gòu)應(yīng)該被松弛，當(dāng)你在一個(gè)瓊脂糖凝膠上進(jìn)行培養(yǎng)基質(zhì)走膠時(shí)會(huì)出現(xiàn)一些新的DNA帶。使用不同的稀釋，我們能夠比較不同的內(nèi)切核酸酶而且能夠看出哪一個(gè)是最活躍的。對(duì)照組總是通過硫酸銨沉淀法制備的重組體Cel I內(nèi)切核酸酶，如上面實(shí)施例1所披露的。
為了篩選能夠在錯(cuò)配位點(diǎn)剪切異源雙鏈DNA的候選蛋白質(zhì)，我們還可以使用基于三個(gè)連續(xù)步驟的快速特征標(biāo)記系統(tǒng)。
在第一步中，測(cè)試該候選蛋白質(zhì)降解單鏈DNA的能力。對(duì)該條件進(jìn)行測(cè)試是因?yàn)楫愒措p鏈DNA錯(cuò)配位點(diǎn)的DNA是單鏈的。因此，一個(gè)不能酶解單鏈DNA的內(nèi)切核酸酶被預(yù)測(cè)為不能在錯(cuò)配位點(diǎn)剪切DNA。第二，該候選蛋白質(zhì)應(yīng)該在已知并很好地特征標(biāo)記了的錯(cuò)配位點(diǎn)上剪切一個(gè)試驗(yàn)異源雙鏈DNA。第三，對(duì)通過試驗(yàn)1和2的蛋白質(zhì)評(píng)估它們剪切攜帶所有類型錯(cuò)配的異源雙鏈DNA片段的效率。這是利用由一組很好地特征標(biāo)記了的質(zhì)粒構(gòu)造組成的DNA工具箱來進(jìn)行，這些質(zhì)粒構(gòu)造在插入的特定位置上包含四種可能核苷酸中的每一種。
降解單鏈DNA的能力該候選蛋白質(zhì)降解單鏈DNA的活性如實(shí)施例2描述的進(jìn)行。在該分析中所有五個(gè)候選蛋白質(zhì)顯示出核酸酶活性，而且從最活躍到不活躍被分級(jí)為ENDO1，ENDO5，ENDO2，ENDO3和ENDO4。
在C-A/T-G錯(cuò)配位點(diǎn)剪切異源雙鏈DNA為了測(cè)試煙草產(chǎn)生的該候選蛋白質(zhì)是否能夠識(shí)別出單個(gè)點(diǎn)突變，我們?cè)诎磳?shí)施例3的披露所產(chǎn)生的異源雙鏈DNA上測(cè)試了蛋白質(zhì)提取物的活性。包括每個(gè)或兩個(gè)等位基因的PCR產(chǎn)品用1/1000稀釋的蛋白質(zhì)提取物培養(yǎng)，這些蛋白質(zhì)提取物是從用候選內(nèi)切核酸酶基因或用GFP作為對(duì)照進(jìn)行農(nóng)桿菌浸潤(rùn)的葉子得來的，其方式如下500ng PCR產(chǎn)品在最終體積為25μl包含50mM Tris-HCl(pH 7.6)，10mM MgCl2，1mM DTT和5％PEG-8000的煙草蛋白質(zhì)提取物中在37℃培養(yǎng)30分鐘。這些反應(yīng)在最終濃度80mM用EDTA終止，并且在3％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分析。
如果這兩個(gè)寡核苷酸被熒光標(biāo)記了，該酶解產(chǎn)品在丙烯酰胺凝膠上用377Abi DNA序列測(cè)定儀進(jìn)行分析。在該實(shí)驗(yàn)中，我們預(yù)計(jì)如果蛋白質(zhì)提取物包含錯(cuò)配特異的內(nèi)切核酸酶，該異源雙鏈DNA將在錯(cuò)配位點(diǎn)被剪切，因此釋放出256bp和405bp兩個(gè)帶。
這些結(jié)果在圖6上顯示(注意，用紅色標(biāo)記的256bp帶在酶存在于異源雙鏈中時(shí)很清楚看到，若不存在就不清楚；該帶在黑白圖上不是很清晰)。
從這個(gè)生化分析中，我們的結(jié)論是這五個(gè)內(nèi)切核酸酶顯示出了錯(cuò)配特異的剪切活性。另外，具有更高單鏈DNA特異-核酸酶活性的三個(gè)酶ENDO1，ENDO5，ENDO2，也以更高效率在C-A/T-G錯(cuò)配位點(diǎn)剪切異源雙鏈DNA。而且，在這三個(gè)內(nèi)切核酸酶中，ENDO1和ENDO5是最活躍的。因此，這兩個(gè)核酸酶被選擇進(jìn)行更精確的特征標(biāo)記。
候選內(nèi)切核酸酶在不同錯(cuò)配位點(diǎn)的錯(cuò)配剪切效率這個(gè)任務(wù)的主要目標(biāo)是鑒別能夠剪切CEL-I不能有效識(shí)別的錯(cuò)配的內(nèi)切核酸酶。這是使用由一組很好地特征標(biāo)記了的質(zhì)粒構(gòu)造組成的DNA工具箱來進(jìn)行，這些質(zhì)粒構(gòu)造在插入的特定位置包含四種可能核苷酸中的每一種。這些構(gòu)造的組合作為PCR擴(kuò)增中的模板被用于重組所有類型的錯(cuò)配。
錯(cuò)配的PCR產(chǎn)品用候選內(nèi)切核酸酶如上進(jìn)行培養(yǎng)(見實(shí)施例5)并且在LICOR序列測(cè)定機(jī)器上進(jìn)行分析。
結(jié)果顯示于圖7。
在這個(gè)分析中，ENDO5像CEL-I一樣微弱地識(shí)別T/T型錯(cuò)配。相反，ENDO1高效率地識(shí)別幾乎所有類型的錯(cuò)配。從這個(gè)分析中我們可以得出結(jié)論ENDO1能夠識(shí)別CEL-I未檢測(cè)出的錯(cuò)配。
實(shí)施例10在一個(gè)DNA庫中ENDO1檢測(cè)突變體等位基因的敏感性ENDO1的敏感性已經(jīng)如實(shí)施例3的描述進(jìn)行了評(píng)估，用攜帶野生型等位基因的DNA的2，4，6，8，10，15，20，25，30，35，40，50或60倍稀釋。
該集中試驗(yàn)的結(jié)果呈現(xiàn)于圖8，它顯示了從一個(gè)同質(zhì)結(jié)合體野生型的60個(gè)等位基因中將來自一個(gè)同質(zhì)結(jié)合體突變體的一個(gè)等位基因檢測(cè)出來。已經(jīng)做了來自兩個(gè)有機(jī)體的PCR，而且擴(kuò)增子已經(jīng)在瓊脂糖凝膠上定量化，按照PCR擴(kuò)增子從1∶1到1∶60遞減的比例混合在一起。然后測(cè)定了在那些不同突變體∶野生型的比例下ENDO1的活性。
在相同的實(shí)驗(yàn)中，從芹菜中提純的CEL-I能夠以低靈敏度最多從16個(gè)當(dāng)中檢測(cè)出一個(gè)等位基因，只有當(dāng)稀釋不足或等于8倍時(shí)才能獲得正確的靈敏度。
總之，根據(jù)本發(fā)明的內(nèi)切核酸酶特別是ENDO1比Cel I具有更少的背景噪音，與Cel I相比能夠被用在非常高的稀釋度而且比Cel I內(nèi)切核酸酶具有更好的特異性和活性。
在丙烯酸胺凝膠上檢測(cè)點(diǎn)突變。
創(chuàng)造了基于Rx基因的一系列突變體。為了顯示ENDO1的特異性，我們已經(jīng)設(shè)計(jì)了包含每一種類型錯(cuò)配的不同質(zhì)粒。該P(yáng)CR混合物包含對(duì)質(zhì)粒特異的寡核苷酸。用ROX和FAM熒光基團(tuán)(MWG)標(biāo)記的寡核苷酸被用于PCR以允許在ABI377 MWG上進(jìn)行錯(cuò)配檢測(cè)。
如圖9所示，當(dāng)僅有同源雙鏈存在時(shí)ENDO1不會(huì)切開，例如線1或線5，而且我們?cè)谀z上所能夠看到的僅有的帶是凝膠頂端的同源雙鏈(大約600bp)。
任何時(shí)候我們?cè)跇颖局杏幸粋€(gè)錯(cuò)配時(shí)(來自兩個(gè)不同質(zhì)粒的兩個(gè)DNA鏈之間形成的異源雙鏈，例如在線2，3，4或6，7，和9)，ENDO1就能在錯(cuò)配位點(diǎn)上進(jìn)行識(shí)別和切開，導(dǎo)致出現(xiàn)對(duì)應(yīng)著兩個(gè)產(chǎn)品的兩個(gè)帶，每一個(gè)用一個(gè)熒光基團(tuán)標(biāo)記。由于該ENDO 1酶解，能夠在背景中看到減少，并且某些錯(cuò)配僅可被ENDO1檢測(cè)出來(例如線9)。
在兩個(gè)不同稀釋D1000和D5000中在ENDO 1的丙烯酸胺凝膠上對(duì)一個(gè)已知點(diǎn)突變的檢測(cè)使用了包含一個(gè)野生類型和一個(gè)突變類型的Rx基因的兩個(gè)質(zhì)粒。它們僅由一個(gè)已知的點(diǎn)突變來區(qū)別。該P(yáng)CR混合物包括對(duì)質(zhì)粒特異的寡核苷酸。用ROX和FAM熒光基團(tuán)(MWG)標(biāo)記的寡核苷酸被用于PCR以允許在ABI377 MWG上進(jìn)行錯(cuò)配檢測(cè)。
如圖10所示，任何時(shí)候在我們的樣本中出現(xiàn)異源雙鏈時(shí)(M5+M12)，ENDO1就能夠在該錯(cuò)配位點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別并且切開，導(dǎo)致出現(xiàn)熒光基團(tuán)標(biāo)記的兩個(gè)帶。當(dāng)只有M5或M12同源雙鏈出現(xiàn)時(shí)，ENDO1不切開而且我們?cè)谀z上能夠看到的僅有的帶是在凝膠頂端的同源雙鏈(大約600bp)。當(dāng)我們對(duì)ENDO1使用了D5000時(shí)能夠看到背景的改進(jìn)。因此，Endo1與本領(lǐng)域中已知的任何內(nèi)切核酸酶相比可以使用非常高的稀釋度。
序列表<110>法國(guó)植物基因組研究計(jì)劃-華萊法國(guó)國(guó)家農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院阿卜杜勒菲德·本達(dá)馬內(nèi)貝內(nèi)迪克特·斯圖勒保耶斯卡利內(nèi)·特里凱斯米歇爾·卡博什<120>高敏感的內(nèi)切核酸酶的生產(chǎn)方法、內(nèi)切核酸酶的新制品及其用途<130>MJP/bv1516-19<150>PCT/EP2004/009159<151>2004-07-30<150>PCT/EP2004/009166<151>2004-07-30<160>25<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>2640<212>DNA<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana)<220>
<221>misc_feature<223>ENDO1基因At1g11190<400>1aaattcgatg aggttgttat agacaagaga agacattttt atacaaaaga gtttatcatt 60atataagttt caaactttga agatatggca tcggctttta gatcatccac gaggttgatt120cttgtattag gtatactgat tttgtgttcg gtttcttctg tccgaagctg gagcaaagaa180ggtcatattc ttacttgtag aattgctcag gtaattaagt taatgatcta ttgtttgaag240caactatttt ggttattctt gtcttatata tgtattagtg agatatacct acaaattttt300
aattaggatt gacttttaaa ttgctatacg ttaccatgcc taacatctca tgtagatgat360catgaataca aacatgtcta atggcatatc aaattccaag tttttttggt agagatctga420gtcatttgac cgttataaga ttcataacaa aagttcgtat gtgtgtgttt ttgtggtgtg480accagaatct tttagaagcc ggaccagcac atgtagtaga gaatctgtta ccggattacg540tgaaaggaga tttatcagca ttgtgtgtgt ggcctgacca gatccgacat tggtacaagt600atcgttggac cagccatctc cattacatcg acactcccga ccaagcctgc tcttacgaat660actctagtaa gtcacaaccg agacattttc agataacctt aatccgtttt ctaattatct720tgaaccggag ttaaccaaaa aatcaattac aaataccaaa ccggattaaa aacaggggat780tgtcatgatc aacatggatt gaaggatatg tgtgtggatg gagcaatcca gaatttcacg840tctcagcttc agcattacgg tgaaggaaca tctgatcgta gatgtatgtc atcattttca900tttatttcat ataatgatga tatccaaagt gtaactgcgt attttgtatt ttgatgcata960acttaagttt ttaaaattat aatatatcct tgttcaatca catagataac atgaccgaag 1020cccttttgtt cttgtctcat ttcatgggag atattcatca ggtttattac tcatcatcga 1080ttcatttcac acctccacac atatagctct atttccatgt taaatattta attaacatgg 1140tttttttttt tttccttaaa aagccgatgc atgtgggatt cacaagtgat gaaggaggaa 1200acacgataga tttacgttgg tacaaacaca aatccaatct acatcatgta agcttcttct 1260tttgtctctt tcaactttaa atttcatcat gaaaacaaaa aaaaaattaa cgaaggaaac 1320aaaatatgta ggtatgggat agagagatca ttctcacggc tctaaaagaa aactacgaca 1380agaacttgga tcttctccaa gaggatcttg agaagaacat caccaatgta atagacacta 1440atttattcat attttactat aattttaaga atctttataa tggttatcat atattaggga 1500ttatggcacg acgatctatc ttcgtggaca gaatgcaacg atcttatcgc ttgtccacac 1560aagtaagttt taaattactt ggtttaagat tggcttgacg ctcgtttgaa gctagctaca 1620
aattttgata ctttttctgg tccaaaaatc ttacaaagat actgaaaata aaataatagg 1680ttttaaactt ttaatttatt tggagttgga taggattaag tttcactaac ttccaattca 1740aagtcaatta atagtagttt accatgatta gtgggttgac taatgtacca tatatattac 1800cttatatcac atcttatttc cgatgtgaga tttcttatga aacataatta gactcgaacc 1860ttttgtgttt cgatatatgt agtgtattca tgatcagaat cttattaagt ttacaactga 1920aaactaaaat attaacatca taattataga ttcttaagta ggttttgttt gggtggagaa 1980aatatccaat ttcgaataac attatataaa atattgaact aattttaatt gtatacgcag 2040gtatgcttca gagagtataa agttagcttg taaatgggga tacaaaggcg tcaagtctgg 2100tgaaacgtta tcaggtacgt tgtttgcttc ttctttttct cgtacgctaa caaaaatatt 2160taaaaataaa cccgaccaaa tgaagtttaa ttaatcggat taatgatttt taatagtcac 2220tacttttttt gtgtgggata tatgactgtc taatatataa ttttataaga aagctaaagg 2280atttgtttaa taatttccga taaataattt tgcagaagaa tatttcaata caaggttgcc 2340aatagtgatg aagagaatag ttcagggagg agttagacta gccatgatac taaaccgggt 2400ttttagtgac gatcatgcta ttgctggtgt tgctgccact tgaaccaaac ccgacatacc 2460ggggcatcaa agcatttgat taagagatta tttgatacat tcacaaaatt aattaaggct 2520gatcagacat tcttttcttt tagtagcttt atctatgtga cagctaatgc ctgtggactg 2580ctttgtttag aagtgtttag cattagatca tatgctaatt caatgttatt aattcatcgt 2640<210>2<211>305<212>PRT<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana)<220>
<221>misc_feature<223>蛋白質(zhì)ENDO1 At1g11190
<400>2Met Ala Ser Ala Phe Arg Ser Ser Thr Arg Leu Ile Leu Val Leu Gly1 5 10 15Ile Leu Ile Leu Cys Ser Val Ser Ser Val Arg Ser Trp Ser Lys Glu20 25 30Gly His Ile Leu Thr Cys Arg Ile Ala Gln Asn Leu Leu Glu Ala Gly35 40 45Pro Ala His Val Val Glu Asn Leu Leu Pro Asp Tyr Val Lys Gly Asp50 55 60Leu Ser Ala Leu Cys Val Trp Pro Asp Gln Ile Arg His Trp Tyr Lys65 70 75 80Tyr Arg Trp Thr Ser His Leu His Tyr Ile Asp Thr Pro Asp Gln Ala85 90 95Cys Ser Tyr Glu Tyr Ser Arg Asp Cys His Asp Gln His Gly Leu Lys100 105 110Asp Met Cys Val Asp Gly Ala Ile Gln Asn Phe Thr Ser Gln Leu Gln115 120 125His Tyr Gly Glu Gly Thr Ser Asp Arg Arg Tyr Asn Met Thr Glu Ala130 135 140Leu Leu Phe Leu Ser His Phe Met Gly Asp Ile His Gln Pro Met His145 150 155 160Val Gly Phe Thr Ser Asp Glu Gly Gly Asn Thr Ile Asp Leu Arg Trp165 170 175
Tyr Lys His Lys Ser Asn Leu His His Val Trp Asp Arg Glu Ile Ile180 185 190Leu Thr Ala Leu Lys Glu Asn Tyr Asp Lys Asn Leu Asp Leu Leu Gln195 200 205Glu Asp Leu Glu Lys Asn Ile Thr Asn Gly Leu Trp His Asp Asp Leu210 215 220Ser Ser Trp Thr Glu Cys Asn Asp Leu Ile Ala Cys Pro His Lys Tyr225 230 235 240Ala Ser Glu Ser Ile Lys Leu Ala Cys Lys Trp Gly Tyr Lys Gly Val245 250 255Lys Ser Gly Glu Thr Leu Ser Glu Glu Tyr Phe Asn Thr Arg Leu Pro260 265 270Ile Val Met Lys Arg Ile Val Gln Gly Gly Val Arg Leu Ala Met Ile275 280 285Leu Asn Arg Val Phe Ser Asp Asp His Ala Ile Ala Gly Val Ala Ala290 295 300Thr305<210>3<211>28<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>引物4-960
<400>3gtgtttgtcc agtaatagtg tcagcata28<210>4<211>26<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>引物4-721<400>4aggaacctga gaaaagactc gccagc 26<210>5<211>40<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>CEL N末端<400>5tatcgttcta gagggaatga cgcgattata ttctgtgttc 40<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>CEL C末端<400>6tatctgaatt catgccaaag aatgatc 27<210>7<211>50<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223>CEL C末端8 His<400>7aattcaatgg tgatggtggt gatggtgatg tgccaaagaa tgatctgcgg 50<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>引物(R21)<400>8gacatatgga ctacagaagc ttggg25<210>9<211>25<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>引物(R22)<400>9gttcacgggt cacatcatgc attcc25<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>引物4m118<400>10ttggttggac ttcactttga gc 22<210>11<211>22
<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>引物4m984<400>11cacaacaatc agcaatgaca gc 22<210>12<211>23<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>引物4-347<400>12gtgattgctc cacctccgcc acc23<210>13<211>30<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>引物4-134<400>13tacagcgatt gatataatat aaaattatcc30<210>14<211>27<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>引物le 2462<400>14tgatattgtc gtgcaatatg atgaaac 27
<210>15<211>25<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>引物le 3082<400>15atacctattt agcccacttg gacac 25<210>16<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>ENDO5的正向引物<400>16aaggatccga aagctctgtg tttcaga 27<210>17<211>28<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>ENDO5的反向引物<400>17ggagttgtta cgtgggttct caaggatc28<210>18<211>28<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>ENDO4的正向引物
<400>18ctggatccct gtttttaact ttggaaag 28<210>19<211>26<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>ENDO4的反向引物<400>19ggatgttcaa gtgattctcc tggatc 26<210>20<211>27<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>ENDO3的正向引物<400>20aaggatccat tcgacaaact ttgtaac 27<210>21<211>28<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>ENDO3的反向引物<400>21agagtggtct tgggaatatt tatctcag 28<210>22<211>26<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)
<220>
<223>ENDO2的正向引物<400>22acggatccca tttcaaagaa ctctga 26<210>23<211>26<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>ENDO2的反向引物<400>23gaccaatcat tatgctgtaa cttcag 26<210>24<211>25<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>ENDO1的正向引物<400>24caggatccaa gtttcaaact tgaag 25<210>25<211>26<212>DNA<213>人工序列(Artificial sequence)<220>
<223>ENDO1的反向引物<400>25cggtatgtcg ggtttggttc aagtgg 2權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)重組體內(nèi)切核酸酶的方法，其中所述方法包括-在宿主植物的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所述重組體內(nèi)切核酸酶，由包含表達(dá)載體的土壤桿菌屬菌株進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，該表達(dá)載體包括對(duì)所述內(nèi)切核酸酶進(jìn)行編碼的聚核苷酸；-從所述宿主植物細(xì)胞中分離出所述重組體內(nèi)切核酸酶。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物細(xì)胞是在完整植物內(nèi)或由其分離出來的器官內(nèi)，并且其中使用所述土壤桿菌屬菌株的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化是通過農(nóng)桿菌浸潤(rùn)來完成的。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述農(nóng)桿菌浸潤(rùn)是在所述宿主植物的葉子內(nèi)進(jìn)行。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述宿主植物屬于煙草屬(thegenus Nicotiana)。
5.如權(quán)利要求2至4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，通過包含下列步驟的方法從農(nóng)桿菌浸潤(rùn)的植物器官內(nèi)分離出所述內(nèi)切核酸酶-從表達(dá)所述內(nèi)切核酸酶的農(nóng)桿菌浸潤(rùn)的器官提取出細(xì)胞內(nèi)含物；-向所述提取物添加硫酸銨至最終濃度至少為30％，并從上清液中分離出蛋白質(zhì)沉淀；-向所述上清液添加硫酸銨至最終濃度至少為80％，并回收包含內(nèi)切核酸酶的蛋白質(zhì)沉淀。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，硫酸銨是在第一個(gè)沉淀步驟中添加至30％的最終濃度，并在第二個(gè)沉淀步驟中至80％的最終濃度。
7.一種測(cè)試S1/P1族(PFAM 02265)的候選內(nèi)切核酸酶是否為錯(cuò)配特異的內(nèi)切核酸酶的方法，其中所述方法包括a)用如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法生產(chǎn)重組體形式的所述候選內(nèi)切核酸酶；b)對(duì)所述重組體內(nèi)切核酸酶降解單鏈DNA的能力進(jìn)行試驗(yàn)；c)對(duì)所述重組體內(nèi)切核酸酶在預(yù)定的錯(cuò)配位點(diǎn)上剪切試驗(yàn)異源雙鏈DNA片段的能力進(jìn)行試驗(yàn)；d)對(duì)所述重組體內(nèi)切核酸酶剪切攜帶所有類型錯(cuò)配的異源雙鏈DNA片段的能力進(jìn)行試驗(yàn)。
8.一種篩選錯(cuò)配特異的內(nèi)切核酸酶的方法，其中所述方法包括a)用如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法生產(chǎn)重組體形式的候選內(nèi)切核酸酶；b)對(duì)所述重組體內(nèi)切核酸酶降解單鏈DNA的能力進(jìn)行試驗(yàn)；c)對(duì)能夠降解單鏈DNA的重組體內(nèi)切核酸酶進(jìn)行試驗(yàn)，并對(duì)它們?cè)谝阎液芎玫靥卣鳂?biāo)記了的錯(cuò)配位點(diǎn)上剪切試驗(yàn)異源雙鏈DNA片段的能力進(jìn)行試驗(yàn)；d)選擇出能夠在已知而且很好地特征標(biāo)記了的錯(cuò)配位點(diǎn)上剪切試驗(yàn)異源雙鏈DNA片段的重組體內(nèi)切核酸酶，并對(duì)它們剪切攜帶所有類型錯(cuò)配的異源雙鏈DNA片段的能力進(jìn)行試驗(yàn)；e)選擇出通過步驟b)、c)和d)的試驗(yàn)的重組體內(nèi)切核酸酶。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，進(jìn)一步包括一個(gè)試驗(yàn)所述重組體內(nèi)切核酸酶敏感度的步驟，這是在過量野生型等位基因存在下、對(duì)它們?cè)贒NA庫內(nèi)檢測(cè)出突變體等位基因的能力進(jìn)行試驗(yàn)，并且選擇在至少9倍過量野生型等位基因存在下能夠檢測(cè)出所述突變體等位基因的內(nèi)切核酸酶。
10.一種可通過如權(quán)利要求7至9中任一項(xiàng)所述方法獲得的重組體內(nèi)切核酸酶制品。
11.如權(quán)利要求10所述的重組體內(nèi)切核酸酶制品，其特征在于，所述內(nèi)切核酸酶選自來源于芹菜(Apium graveolens)的CELI和來源于擬南芥(Arabidopsis thaliana)的BFN1。
12.如權(quán)利要求11所述的重組體CELI內(nèi)切核酸酶制品，其特征在于，所述重組體CELI內(nèi)切核酸酶具有以下錯(cuò)配優(yōu)選特性T/T～T/G～A/G～G/G～G/A～G/T≥A/A～C/C≥T/C～C/T＞A/C～C/A，并且能夠在23倍過量野生型等位基因存在下識(shí)別突變體等位基因。
13.一種可由如權(quán)利要求7所述方法獲得的重組體BFN1內(nèi)切核酸酶制品，其中所述重組體BFN1具有以下錯(cuò)配優(yōu)選特性G/G～G/A～A/G～G/T～T/G＞T/T～A/A～C/C～T/C＞C/T～A/C～C/A，并且能夠在59倍過量野生型等位基因存在下識(shí)別突變體等位基因。
14.一種如權(quán)利要求10至13中任一項(xiàng)所述重組體內(nèi)切核酸酶制品的用途，用于檢測(cè)在DNA雙鏈體內(nèi)由堿基替代引起的錯(cuò)配，或者在所述雙鏈體中的一個(gè)鏈內(nèi)插入或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸引起的錯(cuò)配。
15.一種如權(quán)利要求10至13中任一項(xiàng)所述的重組體內(nèi)切核酸酶制品在基因組中靶向誘導(dǎo)的局部損害(Targeting-Induced Local Lesions IN Genomes，TILLING)錯(cuò)配剪切方案中的用途。
16.一種如權(quán)利要求10至13中任一項(xiàng)所述重組體內(nèi)切核酸酶制品的用途，用于通過Ecotilling鑒別自然群體中DNA的多態(tài)性。
17.一種如權(quán)利要求10至13中任一項(xiàng)所述重組體內(nèi)切核酸酶制品作為錯(cuò)配檢測(cè)試劑的用途。
18.一種如權(quán)利要求10至13中任一項(xiàng)所述重組體內(nèi)切核酸酶制品在錯(cuò)配篩選方法中的用途。
19.一種如權(quán)利要求10至13中任一項(xiàng)所述重組體內(nèi)切核酸酶制品的用途，用于在任何有機(jī)體種群或由此衍生的細(xì)胞系中的靶基因中同時(shí)篩選一個(gè)或多個(gè)突變，其通過下列步驟進(jìn)行a)對(duì)所述種群中每一個(gè)體的所述靶基因或其部分進(jìn)行擴(kuò)增，b)將所述擴(kuò)增產(chǎn)品在2維或3維矩陣中進(jìn)行排序，包括行、列(2維矩陣)和柱(3維矩陣)，c)將所述擴(kuò)增產(chǎn)品集中，以此獲得不同的庫，每一個(gè)庫代表所述矩陣的一列、一行或一柱，d)向每一個(gè)庫添加從非突變基因獲得的參照擴(kuò)增產(chǎn)品，并在允許形成異源雙鏈的環(huán)境下對(duì)這些庫進(jìn)行培養(yǎng)，以及e)用所述內(nèi)切核酸酶制品對(duì)每一個(gè)庫進(jìn)行培養(yǎng)，以及f)在所述培養(yǎng)的庫中檢測(cè)異源雙鏈的存在。
20.一種如權(quán)利要求10至13中任一項(xiàng)所述重組體內(nèi)切核酸酶制品的用途，用于在任何有機(jī)體種群中或由其衍生的細(xì)胞系中對(duì)一個(gè)靶基因中的一個(gè)或多個(gè)突變同時(shí)進(jìn)行篩選，其中進(jìn)行以下步驟a)在包括行、列(2維矩陣)和柱(3維矩陣)的2維或3維矩陣中對(duì)所述種群的每一個(gè)體進(jìn)行排序，b)將每一列、行和柱集中以此獲得不同的庫，從而使每一個(gè)庫代表所述矩陣的一列、一行或一柱，c)向每一個(gè)庫中添加從非突變基因獲得的參照基因產(chǎn)品，d)在每一個(gè)庫內(nèi)對(duì)所述靶基因或其部分進(jìn)行擴(kuò)增，以此獲得擴(kuò)增產(chǎn)品的庫，e)在允許形成異源雙鏈的環(huán)境下對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)品的庫進(jìn)行培養(yǎng)，f)用所述內(nèi)切核酸酶制品對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)品的庫進(jìn)行培養(yǎng)，以及g)在所述培養(yǎng)的庫中檢測(cè)異源雙鏈的存在。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)具有高敏感性的重組體內(nèi)切核酸酶的方法，并且涉及用所述方法獲得的內(nèi)切核酸酶制品，以及其用途，特別是用于檢測(cè)錯(cuò)配。
文檔編號(hào)C12N9/22GK101044238SQ200580031302
公開日2007年9月26日 申請(qǐng)日期2005年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月30日
發(fā)明者阿卜杜勒菲德·本達(dá)馬內(nèi), 貝內(nèi)迪克特·斯圖勒保耶斯, 卡利內(nèi)·特里凱斯, 米歇爾·卡博什 申請(qǐng)人:法國(guó)植物基因組研究計(jì)劃-華萊, 法國(guó)國(guó)家農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院