專利名稱：一種利用外切核酸酶活性的無痕克隆及重組方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用外切核酸酶活性的無痕克隆及重組方法。
背景技術(shù)：
經(jīng)典的基因克隆以及重組實(shí)驗(yàn)是以II型限制性內(nèi)切酶以及T4DNA連接酶為基礎(chǔ)的。利用限制性內(nèi)切酶特異性地識別并酶切DNA，然后用T4DNA連接酶將不同DNA片段連接在一起，從而達(dá)到基因克隆和重組的目的。這種方法存在著一些問題首先，并不是所有的基因都存在合適的酶切位點(diǎn)，尤其是有些載體的克隆位點(diǎn)只有少數(shù)幾個(gè)內(nèi)切酶可供選擇的情況下；其次，用限制性內(nèi)切酶克隆或重組后，會留下不必要限制性內(nèi)切酶序列痕跡，多數(shù)情況下這些限制性內(nèi)切酶的識別序列隨后也會導(dǎo)致我們目的蛋白上多出一些氨基酸序列， 這些多余的氨基酸可能會改變目的蛋白的結(jié)構(gòu)以及活性，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種不依賴酶切位點(diǎn)和連接酶的克隆及重組DNA的方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種利用外切核酸酶活性的無痕克隆及重組方法，所述方法是在待插入的目的基因兩端分別加上與克隆載體插入位點(diǎn)兩端序列相同的長度為10 30bp(15bp左右為宜) 的DNA片段后與載體DNA在外切核酸酶作用下進(jìn)行重組，即在制備目的基因片段時(shí)，在擴(kuò)增引物的5’端分別加上與克隆載體插入位點(diǎn)兩端序列相同的長度為10 30bp(15bp左右為宜)的DNA片段。所述方法包括(I)載體DNA制備以目的基因插入位點(diǎn)對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對純化的克隆載體質(zhì)粒進(jìn)行酶切；或者以稀釋的克隆載體質(zhì)粒為模板，以目的基因插入位點(diǎn)兩端的序列為結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，上游引物記為primerl (約15bp),下游引物記為primer2 (約15bp),進(jìn)行 PCR擴(kuò)增；(2)目的基因制備在目的基因原始擴(kuò)增引物的5’端分別加上primerl和 primer2的反向互補(bǔ)序列，所得引物以含有目的基因的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的
基因;(3)基因重組將步驟(I)載體DNA和步驟⑵目的基因混合，加入Pfu DNA聚合酶、T4DNA聚合酶或λ Exonuclease，進(jìn)行反應(yīng)獲得重組DNA。(4)轉(zhuǎn)化將步驟(3)所得的重組DNA轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選獲得含有目的基因質(zhì)粒的大腸桿菌克隆。優(yōu)選的,步驟(3)所用聚合酶為T4DNA聚合酶。具體的，以所述目的基因?yàn)镾GK2 (serum/glucocorticoid regulated kinase 2) 基因的0RF，所述克隆載體為pBlueScript II KS (-)，插入位點(diǎn)為EcoR V酶切位點(diǎn)為例，所述方法如下
(I)載體DNA制備以稀釋的克隆載體質(zhì)粒為模板，以引物primerl. I和 primer2. I進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到載體DNA ；引物primerl. I 序列如下5’ -ATCGAATTCCTGCAGCC-3’ ；引物primer2. I 序列如下5’ -AATCAAGCTTATCGATACCG-3’ ；(2)目的基因制備以小鼠脊髓cDNA為模板，用引物SGK2F和SGK2R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的基因；弓丨物SGK2F序列如下5’ -GGCTGCAGGAATTCGATGGCCTCCAGCCCAGTTG-3’弓丨物SGK2R序列如下5’ -CGGTATCGATAAGCTTGATCAAGAGTCCAAAATGTCATCATC-3，(3)基因重組將步驟(I)載體DNA和步驟⑵目的基因混合，加入T4DNA聚合酶， 在20°C進(jìn)行2min，然后70°C IOmin使酶失活，再50°C溫浴30min進(jìn)行退火；或加入Pfu DNA 聚合酶，在50°C溫浴30min進(jìn)行酶切及退火；或加入λ Exonuclease,在37°C進(jìn)行5min,然后70°C IOmin使酶失活，再在50°C溫浴30min進(jìn)行退火；即得重組DNA。(4)轉(zhuǎn)化將步驟(3)所得的重組DNA轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選獲得含有目的基因質(zhì)粒的大腸桿菌克隆。本發(fā)明原理示意圖見圖I。T4、Pfu DNA聚合酶等酶具有3’ 一 5’外切核酸酶活性(3，—5，Exonuclease activity,圖 1A)，而 λ Exonuclease (Lambda exonuclease)具有5’一 3’外切核酸酶活性(圖1B)。在這些外切核酸酶活性作用下，雙鏈DNA的末端會形成單鏈區(qū)，當(dāng)不同DNA片段間的末端具有相同序列時(shí)(圖I中分別用紅色及藍(lán)色表示)，單鏈區(qū)域就能夠按照堿基互補(bǔ)配對的原則特異性退火，轉(zhuǎn)化到細(xì)菌后就能達(dá)到無痕重組的目的。這種克隆方法要求設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)，在引物的5’末端要分別增加與載體上的克隆位點(diǎn)兩端序列相同的一段DNA堿基(圖IC中SGK2F和SGK2R)。載體可以用酶切(如EcoR V) 獲得，此外也可以用PCR方法擴(kuò)增載體獲得。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(I)目的基因或DNA片段不需要酶切，不必考慮其內(nèi)部的酶切位點(diǎn)，也不受載體上限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的限制；(2)目的片段連接到載體時(shí)避免了引入不必要的序列，即無痕克隆。


圖I為利用外切核酸酶活性的無痕克隆方法的原理及引物設(shè)計(jì)示意圖；圖2 為 Pfu polymerase、T4DNA polymerase 和 AExonuclease 的外切酶活性；M, 500bp Marker ；C, Control,未加酶；Pfu DNA polymerase 的反應(yīng)溫度為 50 °C， T4DNApolymerase 和 AExonuclease 的反應(yīng)溫度為 37°C。圖3為插入片段檢測結(jié)果；M為marker ;泳道I 8為8個(gè)隨機(jī)挑選的白斑用PCR 檢測插入片段；挑選泳道2 4及6 8所代表的細(xì)菌克隆做測序鑒定，其中泳道2、4、6及 8所代表的細(xì)菌克隆均包含目的基因SGK2的完整0RF，而泳道3的克隆則包含了 SGK2基因的不同轉(zhuǎn)錄本(variant transcript),只有泳道7的克隆為非目的基因片段。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例I :利用外切核酸酶活性無痕克隆SGK(serum/glucocorticoid regulated kinase 2)基因的編碼區(qū)(open reading frame, ORF) 7· I、檢測 Pfu、T4DNA 聚合酶和 λ Exonuclease的外切酶活性在10 μ I反應(yīng)體系中將IOOng DNA片段分別用IU的Pfu DNA聚合酶、T4DNA聚合酶以及 λ Exonuclease (表 I)反應(yīng) 5min, IOmin 和 30min 后，加 2 μ I 50mM EDTA 終止反應(yīng)， 進(jìn)行電泳。表I :外切核酸酶活性檢測
權(quán)利要求
1.一種利用外切核酸酶活性的無痕克隆及重組方法，其特征在于所述方法是在目的基因兩端分別加上與克隆載體插入位點(diǎn)兩端序列相同的長度為10 30bp的DNA片段后與載體DNA在外切核酸酶活性作用下進(jìn)行重組，即在制備目的基因片段時(shí)，在擴(kuò)增引物的5’端分別加上與克隆載體插入位點(diǎn)兩端序列相同的長度為10 30bp的DNA片段。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述方法包括 (1)載體DNA制備以目的基因插入位點(diǎn)對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對純化的克隆載體質(zhì)粒進(jìn)行酶切；或者以稀釋的克隆載體質(zhì)粒為模板，以目的基因插入位點(diǎn)兩端的序列為結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，上游引物記為primer I,下游引物記為primer2,進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(2)目的基因制備在目的基因原始擴(kuò)增引物的5’端分別加上primerl和primer2的反向互補(bǔ)序列，所得引物以含有目的基因的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的基因；(3)基因重組將步驟(I)載體DNA和步驟⑵目的基因混合，加入PfuDNA聚合酶、 T4DNA聚合酶或λ Exonuclease，進(jìn)行反應(yīng)獲得重組DNA。(4)轉(zhuǎn)化將步驟(3)所得的重組DNA轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞之后，即可篩選獲得含有目的基因質(zhì)粒的大腸桿菌克隆。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(3)所用酶為T4DNA聚合酶。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述目的基因?yàn)镾GK2(serUm/ glucocorticoid regulated kinase 2)基因的 ORF,所述克隆載體為 pBlueScript II KS(-)，插入位點(diǎn)為EcoR V酶切位點(diǎn)，所述方法如下(1)載體DNA制備以稀釋的克隆載體質(zhì)粒為模板，以引物primerl.I和primer2. I進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到載體DNA ；引物 primerl. I 序列如下5’ -ATCGAATTCCTGCAGCC-3’ ；引物 primer2. I 序列如下5’ -AATCAAGCTTATCGATACCG-3’ ；(2)目的基因制備以小鼠脊髓cDNA為模板，用引物SGK2F和SGK2R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的基因；引物SGK2F序列如下、5，-GGCTGCAGGAATTCGATGGCCTCCAGCCCAGTTG-3，引物SGK2R序列如下、5，-CGGTATCGATAAGCTTGATCAAGAGTCCAAAATGTCATCATC-3，(3)基因重組將步驟(I)載體DNA和步驟(2)目的基因混合，加入T4DNA聚合酶，在 20°C進(jìn)行2min，然后70°C IOmin使酶失活，再50°C溫浴30min進(jìn)行退火；或加入Pfu DNA聚合酶，在50°C溫浴30min進(jìn)行酶切及退火；或加入λ Exonuclease,在37°C進(jìn)行5min,然后 70°C IOmin使酶失活，再在50°C溫浴30min進(jìn)行退火；即得重組DNA ；(4)轉(zhuǎn)化將步驟(3)所得的重組DNA轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選獲得含有目的基因質(zhì)粒的大腸桿菌克隆。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用外切核酸酶活性的無痕克隆及重組方法，所述方法是在目的基因兩端分別加上與克隆載體插入位點(diǎn)兩端序列相同的長度為10～30bp的DNA片段后與載體DNA在外切核酸酶作用下進(jìn)行重組，即在制備目的基因片段時(shí)，在擴(kuò)增引物的5’端分別加上與克隆載體插入位點(diǎn)兩端序列相同的長度為10～30bp的DNA片段。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(1)目的基因或DNA片段不需要酶切，不必考慮其內(nèi)部的酶切位點(diǎn)，也不受載體上限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的限制；(2)目的片段連接到載體時(shí)避免了引入不必要的序列，即無痕克隆。
文檔編號C12R1/19GK102604982SQ201210070600
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月16日
發(fā)明者孫淑慧, 戴忠敏, 邱猛生, 黃浩 申請人:杭州師范大學(xué)