專利名稱：一種用于結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌診斷和預(yù)后的標(biāo)志物的制作方法
—種用于結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌診斷和預(yù)后的標(biāo)志物所屬領(lǐng)域本發(fā)明屬于生物醫(yī)療技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種新的結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌標(biāo)志物， 其本質(zhì)為人源電壓門控質(zhì)子通道Hvl。這項(xiàng)發(fā)明可在結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌的診斷和預(yù)后中得到廣泛的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
癌癥是一大類惡性腫瘤的統(tǒng)稱，由控制細(xì)胞生長(zhǎng)增殖機(jī)制失常而引起的疾病。癌細(xì)胞除了生長(zhǎng)失控外，還會(huì)局部侵入周遭正常組織甚至經(jīng)由體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到身體其他部分。由于各種癌的發(fā)生部位不同，病理形態(tài)不同，以及發(fā)展階段不同，因此會(huì)產(chǎn)生各種各樣的臨床表現(xiàn)。但癌癥的早期往往癥狀很少，待發(fā)展到一定階段后才漸漸表現(xiàn)出一系列癥狀和體征。一般將癌癥的臨床表現(xiàn)分為局療表現(xiàn)和全身性癥狀兩個(gè)方面。癌細(xì)胞的特點(diǎn)是無(wú)限制、無(wú)止境地增生，使患者體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗；癌細(xì)胞釋放出多種毒素，使人體產(chǎn)生一系列癥狀；癌細(xì)胞還可轉(zhuǎn)移到全身各處生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致人體消瘦、無(wú)力、 貧血、食欲不振、發(fā)熱以及嚴(yán)重的臟器功能受損等等。我國(guó)目前已經(jīng)成為惡性腫瘤多發(fā)國(guó)之一。惡性腫瘤包括癌和肉瘤，由上皮組織細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤稱為癌；由間葉組織來(lái)源的惡性腫瘤稱為肉瘤。惡性腫瘤可以發(fā)生在各個(gè)年齡段。隨著年齡的增加，癌的發(fā)病率會(huì)逐漸增加，尤其40歲以上的中老年人其發(fā)病率顯著增加；肉瘤在兒童和青年人的發(fā)病率較高。惡性腫瘤對(duì)人類的危害不僅是威脅患者的生命，還給患者帶來(lái)軀體的痛苦、精神壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前常用的癌癥診斷方式有以下幾種影像檢查，身體內(nèi)某個(gè)部位的影像檢查可幫助醫(yī)生判斷是否有腫瘤存在。X線檢查是醫(yī)生的最常用的方式，如胸片、X線檢查骨骼等。 還有一些特殊的X線檢查，如CT掃描用一臺(tái)計(jì)算機(jī)與X-射線機(jī)連接，可得出一系列身體內(nèi)的詳細(xì)的圖象。核磁共震(MRI)，將一塊強(qiáng)有力的電磁鐵與計(jì)算機(jī)連接，可得出與CT掃描類似但作用不同的圖像。放射性核素掃描，患者口服或注射一種有輕度放射性的物質(zhì)，由掃描器測(cè)量某些器官的放射線水平，然后由醫(yī)生分析某器官內(nèi)有無(wú)放射線濃聚的異常區(qū)域。 超聲波，是檢查身體內(nèi)部結(jié)構(gòu)的另外一種方法。這種不能被人聽見(jiàn)的高頻率聲波進(jìn)入身體， 然后反彈回來(lái)，這就形成一張超聲圖像。這些圖片可顯示在一臺(tái)象電視機(jī)一樣的屏幕上，也可在紙上打印出來(lái)。內(nèi)窺鏡檢查，內(nèi)窺鏡檢查時(shí)，醫(yī)生將一根很細(xì)的管子通過(guò)咽喉、氣管、食道、腸腔、陰道或子宮直接進(jìn)行觀察，同時(shí)可采集異常的組織或細(xì)胞進(jìn)行病理分析。實(shí)驗(yàn)室檢查，血液和尿檢等的實(shí)驗(yàn)室檢查可為醫(yī)生提供重要信息。如果身體內(nèi)有癌癥，人體內(nèi)某些物質(zhì)的水平也會(huì)變得異常。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)血液、腦脊液、大小便及痰等，可提示某些腫瘤的存在。病理切片檢查，體檢、影像檢查、內(nèi)窺鏡和實(shí)驗(yàn)室檢查可顯示身體內(nèi)有異常情況存在，但只有病理切片檢查能最后確診是否是癌癥。在切片檢查中，醫(yī)生從異常地方取一小塊組織樣品或切除整個(gè)腫瘤。病理醫(yī)生在顯微鏡下進(jìn)行觀察。如果確定癌癥存在，病理醫(yī)生通常能分出是什么種類的癌癥，并能判斷該腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)快慢。因此，尋找惡性腫瘤的生物標(biāo)志物，對(duì)于診斷癌癥，尤其是早期診斷癌癥和判斷預(yù)后有極大幫助。這個(gè)標(biāo)志物必須在正常組織中極少表達(dá)，而在癌組織中大量特異表達(dá)，不僅僅可用來(lái)診斷癌癥或判斷預(yù)后、協(xié)助分期等，同時(shí)還可以被用作免疫導(dǎo)向治療的靶位點(diǎn)?？梢哉f(shuō)，癌癥的生物標(biāo)志物在惡性腫瘤的診斷、預(yù)防、治療、判斷預(yù)后等方面均起著重要的作用。結(jié)直腸癌為結(jié)腸癌和直腸癌的總稱，結(jié)直腸癌是指大腸粘膜上皮在環(huán)境或遺傳等多種致癌因素作用下發(fā)生的惡性病變預(yù)后不良，死亡率較高。結(jié)直腸癌是大腸粘膜上皮起源的惡性腫瘤，是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)生率僅次于胃癌和食道癌。結(jié)直腸癌在不同地區(qū)，其發(fā)病率有明顯區(qū)別。據(jù)世界腫瘤流行病學(xué)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)的國(guó)家發(fā)病率較高，不同國(guó)家的發(fā)病率相差60倍。結(jié)直腸癌在北美、西歐、澳大利亞、 新西蘭等地的發(fā)病率最高，日本、智利、非洲等地則低。在西方發(fā)達(dá)國(guó)家，結(jié)直腸癌是僅次于肺癌的第二位惡性腫瘤。根據(jù)有關(guān)資料顯示，非洲結(jié)直腸癌的發(fā)病率似乎非常低。一般來(lái)說(shuō)，在世界范圍內(nèi)我國(guó)屬于低發(fā)區(qū)。近年來(lái)結(jié)直腸癌同肺癌一樣有上升趨勢(shì)，我國(guó)亦不例外。該病在國(guó)內(nèi)的發(fā)病率亦有地區(qū)差異，以上海、浙江、福建為高發(fā)區(qū)。在我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤死亡中，結(jié)直腸癌患者在男性占第五位，女性占第六位。男性結(jié)直腸癌的發(fā)病率明顯高于女性，約為1.6 I。近二十年來(lái)結(jié)直腸癌的發(fā)病率在逐漸增加，同時(shí)，其發(fā)病年齡趨向老齡化。好發(fā)部位為直腸及直腸與乙狀結(jié)腸交界處，占60%。發(fā)病率年齡方面資料，據(jù)國(guó)內(nèi)統(tǒng)計(jì)，以40 50歲為多，年齡組中位數(shù)為45左右，40歲以下者全部病例的1/3左右，30歲以下者占10%左右。高發(fā)國(guó)家大腸癌高發(fā)年齡為60 70歲， 30歲以下者占6%左右。我國(guó)結(jié)直腸癌好發(fā)年齡比國(guó)外提早10 15歲，30歲以下者占 11% 13%，這是我國(guó)結(jié)直腸癌的一個(gè)主要特點(diǎn)。尋找結(jié)直腸癌的生物標(biāo)志物，對(duì)于診斷結(jié)直腸癌，尤其是早期診斷結(jié)直腸癌和判斷預(yù)后有極大幫助。這個(gè)標(biāo)志物必須在正常組織中極少表達(dá)，而在結(jié)直腸癌組織中大量特異表達(dá)，不僅僅可用來(lái)診斷結(jié)直腸癌或判斷預(yù)后、協(xié)助分期等，同時(shí)還可以被用作免疫導(dǎo)向治療的靶位點(diǎn)?？梢哉f(shuō)，結(jié)直腸癌的生物標(biāo)志物在結(jié)直腸癌的診斷、預(yù)防、治療、判斷預(yù)后等方面均起著重要的作用。目前常用于檢測(cè)結(jié)直腸癌的生物標(biāo)志物主要由以下幾種(1)血清癌胚抗原 (CEA)測(cè)定在結(jié)直腸癌患者血清中，可以檢測(cè)到癌胚抗原(CEA)，這是一種糖蛋白，常出現(xiàn)于惡性腫瘤患者血清中，并非結(jié)直腸癌的特異相關(guān)抗原，故血清CEA測(cè)定對(duì)本病的診斷不具有特異性。但用放射免疫法檢測(cè)CEA，作定量動(dòng)態(tài)觀察，對(duì)判斷結(jié)直腸癌的手術(shù)效果與監(jiān)測(cè)術(shù)后復(fù)發(fā)有一定意義。如結(jié)直腸癌經(jīng)手術(shù)將腫瘤完全切除后，血清CEA則逐漸下降；若復(fù)發(fā)，又可再度升高。(2)CA19-9是一種糖蛋白類的腫瘤標(biāo)志物，在消化道腫瘤患者的血清中含量明顯升高。血清CA19-9濃度與Duke分期呈正相關(guān)，隨著分期的升級(jí)濃度升高，因此濃度的大小對(duì)于判斷結(jié)直腸癌的預(yù)后有臨床應(yīng)用價(jià)值。但血清檢測(cè)CA19-9的陽(yáng)性率較低，僅有22. 39%，在各Duke分期中，血清與組織中CA19-9的陽(yáng)性率差異情況與CEA相同。Duke A Duke C期中，通過(guò)血清檢測(cè)CA19-9的陽(yáng)性率均明顯低于術(shù)后組織，尤其是在Duke A期患者，檢測(cè)血清CA19-9的結(jié)果為陰性。CA19-9對(duì)結(jié)直腸癌的早期診斷價(jià)值不高，但對(duì)結(jié)直腸癌的療效觀察和復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)具有重要臨床意義。(3)CA50以脂或脂蛋白結(jié)合的形式存在于細(xì)胞膜，屬于鞘糖脂類標(biāo)記物，是胰腺和結(jié)直腸癌的標(biāo)志物。結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中伴隨一系列分子生物學(xué)的改變，理想的腫瘤標(biāo)記物應(yīng)具有較高的敏感性和特異性，并能反應(yīng)腫瘤的進(jìn)展及治療效果。然而至今尚沒(méi)有一種腫瘤標(biāo)志物能滿足上述條件，因此尋找一種敏感性、特異性都比較理想的標(biāo)志物，尤其在結(jié)直腸癌早期診斷方面具有重要作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率占女性惡性腫瘤的 6. 7% -14. 9%，僅次于子宮癌。經(jīng)手術(shù)治療后約50%病例可治愈，其余50%的病例可能復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。乳腺癌是乳房腺上皮細(xì)胞在多種致癌因子作用下，發(fā)生了基因突變，致使細(xì)胞增生失控。因?yàn)榘┘?xì)胞的生物行為發(fā)生了改變，而導(dǎo)致細(xì)胞呈現(xiàn)出無(wú)序、無(wú)限制的惡性增生。 它的組織學(xué)表現(xiàn)形式是大量的幼稚化的癌細(xì)胞無(wú)限增殖和無(wú)序狀地?fù)頂D成團(tuán)，擠壓并侵蝕破壞周圍的正常乳房組織結(jié)構(gòu)。由于乳腺癌細(xì)胞很容易脫落游離，隨血液或淋巴液等播散全身，形成早期的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致其臨床治愈困難。全身重要臟器的轉(zhuǎn)移如肺轉(zhuǎn)移、腦轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移等都將直接威脅人的生命，因此乳腺癌是嚴(yán)重危及人體生命的惡性疾病。乳腺癌細(xì)胞存在的一些特異性抗原性物質(zhì)，對(duì)于乳腺癌的檢測(cè)有極大幫助。通過(guò)對(duì)于這些標(biāo)志物的檢測(cè)，便可得到活檢或手術(shù)標(biāo)本是否是乳腺癌。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的乳腺癌標(biāo)志物有十幾種，它們或與人源乳腺癌內(nèi)分泌直接相關(guān)，或可輔助乳腺癌診斷，或與乳腺癌預(yù)后相關(guān)。這些抗原包括雌激素受體(estrogen receptor ER)、孕激素受體(progesterone receptor PR),雄激素受體(androgen receptor AR), PS2 基因又稱乳腺癌雌激素誘導(dǎo)基因(breast cancer estrogen induced, BCEI), CA15 抗原，癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA),泌乳素(prolactin, PRL),腫瘤易感基因(BreastPovarian cancer susceptibility gene, BRCA1), p53 抑癌基因，增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA), C-erbB-2 (HER-2/ neu)基因，組織蛋白酶D(Cath印sin-D，Cath-D)，p27抑癌基因，p21抑癌基因，轉(zhuǎn)移抑癌基因nm23等。常規(guī)臨床分期對(duì)乳腺癌的遠(yuǎn)期判斷不理想，需要建立新的對(duì)臨床有指導(dǎo)意義的方法，研究表明，反映腫瘤生物行為的一些標(biāo)志物能更準(zhǔn)確地判斷乳腺癌的預(yù)后。所以，我們可以說(shuō)，乳腺癌的標(biāo)志物在乳腺癌的診斷和判斷預(yù)后等方面起著重要的作用。當(dāng)然，這些標(biāo)志物在乳腺癌組織或細(xì)胞表面的表達(dá)的越特異，它在診斷和預(yù)后中的作用就越準(zhǔn)確和明顯。綜上所述，尋找一種特異性高、在乳腺癌中表達(dá)陽(yáng)性率高、位于乳腺癌細(xì)胞表面、 對(duì)人具有抗原性的乳腺癌的生物標(biāo)志物對(duì)于人乳腺癌的診斷和預(yù)后具有十分重要的意義。胰腺癌是消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是惡性腫瘤中最常見(jiàn)的，多發(fā)生于胰頭部。 腹痛及無(wú)痛性黃疸為胰頭癌的常見(jiàn)癥狀。糖尿病患者長(zhǎng)期大量吸煙，高脂肪高動(dòng)物蛋白飲食者，發(fā)病率相對(duì)增高，本病多發(fā)于中老年人，男性患者遠(yuǎn)較絕經(jīng)前的婦女多，絕經(jīng)后婦女發(fā)病率與男性相仿。發(fā)病原因尚不清楚，發(fā)現(xiàn)些環(huán)境因素與胰腺癌的發(fā)生有關(guān)。已定的首要危險(xiǎn)因素為吸煙，糖尿病膽石病飲酒(包括啤酒)以及慢性胰腺炎等進(jìn)食高脂肪高蛋白飲食和精制的面粉食品，胃切除術(shù)也是發(fā)生胰腺癌的危險(xiǎn)因素，其死亡率極高。1943年，Rockeg首先實(shí)行了全胰切除術(shù)。國(guó)內(nèi)余文光于1954年首先報(bào)告胰頭十二指腸切除的病例。近年來(lái)，胰腺癌的發(fā)病率逐年上升，在美國(guó)1988年發(fā)病率為9. 0/10萬(wàn)， 男女為I. 3 I。多見(jiàn)于45歲以上者。瑞典發(fā)病率較高，為125/10萬(wàn)，并且在過(guò)去20年里保持不變。英國(guó)和挪威各增加了 I倍。70年代與60年代相比，加拿大、丹麥和波蘭的標(biāo)化發(fā)病率增加了 50%以上。在中國(guó)，胰腺癌已成為人口死亡的十大惡性腫瘤之一。北京協(xié)和醫(yī)院近年來(lái)收住院的胰腺癌病人比50年代增加了 5 6倍。而且據(jù)北京地區(qū)7家醫(yī)院 354例病例分析，病人中41 70歲者占80%，近年來(lái)，年輕的胰腺癌病人也較10年前有明顯增加的趨勢(shì)，而且惡性度更高，預(yù)后更差。就胰腺癌的發(fā)生部位而言，仍以胰頭部位最多見(jiàn)，約占70%左右，胰體次之，胰尾部更次之，有的頭體尾部均有，屬于彌漫性病變或多中心性病變。目前發(fā)現(xiàn)與胰腺癌相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物有10多種，臨床常用的除CA19-9外，還有 CA50、Span-1、Dupan_2、POA, CEA等。目前國(guó)內(nèi)所用的試劑多為進(jìn)口的，較昂貴，多數(shù)醫(yī)院尚未能普及。但腫瘤標(biāo)記的檢測(cè)對(duì)胰腺癌的篩選、診斷術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的監(jiān)測(cè)，以及胰腺良惡性腫瘤的鑒別都有著重要作用。若用兩種或兩種以上的腫瘤標(biāo)記物檢查可提高其陽(yáng)性率。l、CA19-9是胰腺癌的相關(guān)抗原，其表達(dá)依賴于lewis血型抗原的表達(dá)，lewis陰性者， CA 19-9的檢查也為陰性。CA19-9診斷胰腺癌的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性分別為83. I %、 73%、75%，而小胰腺癌病人CA19-9的水平不高，小于2cm的胰腺癌陽(yáng)性率僅60. 7%，而腫瘤較大的病人CA19-9的水平較高，陽(yáng)性率達(dá)80%以上，分界值定為120kU/L，高于此值者高度懷疑胰腺癌。同時(shí)還可以判斷預(yù)后，腫瘤切除后CA19-9降至正常值，血清臨界值為30kU/ L者預(yù)后較好，如果腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或病情惡化可見(jiàn)CA19-9的再度明顯升高。故CA19-9是胰腺癌的有效標(biāo)記物。2、CA50也是lewis系統(tǒng)的一個(gè)抗原，與CA19-9有很好的相關(guān)性，不必同時(shí)將這兩個(gè)抗原一起測(cè)定。但若將CA50和CA242聯(lián)合檢測(cè)可提高對(duì)胰腺癌診斷的敏感性。3、Span-l胰腺癌病人可高達(dá)1446KU/L。其敏感性為81%，特異性為68%，但對(duì)于小胰腺癌的診斷不理想，小于2cm的腫瘤陽(yáng)性率僅為56%。4、Dupan-2其臨界值為400KU/L， 對(duì)胰腺癌的敏感性為50 % 70 %，與CA19-9聯(lián)合檢測(cè)可使陽(yáng)性率提高到95 %，膽受肝功能的影響，與GOT有密切相關(guān)。5、CEA(癌胚抗原)陽(yáng)性率78. 9%，對(duì)于低分化胰腺癌> 3cm 腫瘤以及臨床IV期的胰腺癌陽(yáng)性率明顯提高，CEA陰性者平均生存期為38. 6個(gè)月，比陽(yáng)性者明顯延長(zhǎng)，可以用來(lái)判斷預(yù)后。上述這些胰腺癌的生物標(biāo)志物，尚不能廣泛開展，特異性偏低，對(duì)早期癌和小胰腺癌(<2cm的腫瘤)陽(yáng)性率更低，尚存在一定的假陽(yáng)性和其他腫瘤的交叉反應(yīng)。因此，尋找一種特異性強(qiáng)，陽(yáng)性率高的生物標(biāo)志物對(duì)胰腺癌的早期診斷和預(yù)后具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是為了解決結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌缺乏敏感性、特異性標(biāo)志物的問(wèn)題，提供一種以電壓門控質(zhì)子通道Hvl作為結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌診斷和預(yù)后的標(biāo)志物。本發(fā)明涉及一種新的人源結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌診斷和預(yù)后的標(biāo)志物電壓門控質(zhì)子通道Hvl。Hvl在結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌組織中高表達(dá)，在正常組織和良性瘤中不表達(dá)；Hvl在結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌組織中的表達(dá)水平和癌癥的臨床分期及病人的存活率有關(guān)，因此Hvl可作為結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌診斷和預(yù)后的標(biāo)志物。本發(fā)明提供的用于結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌診斷和預(yù)后的標(biāo)志物，為人源電壓門控質(zhì)子通道Hvl，其基因是序列表SEQ ID No. I所示的序列；其基因編碼的標(biāo)志物人源電壓門控質(zhì)子通道Hvl是序列表SEQ ID No. 2所示的氨基酸殘基序列。所述標(biāo)志物人源電壓門控質(zhì)子通道Hvl蛋白全長(zhǎng)為273個(gè)氨基酸殘基，依據(jù)該通道各氨基酸殘基的疏水特性，可將Hvl蛋白全長(zhǎng)劃分為3個(gè)結(jié)構(gòu)域N-端胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和C-端胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域；Hvl對(duì)質(zhì)子具有特異的高選擇性，能夠高效地跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)子。本發(fā)明提供了結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌抗原Hvl相應(yīng)的多克隆和單克隆抗體、 抗體片段及衍生物。所設(shè)計(jì)的人源結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌抗原Hvl的C端引物如序列表 SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 所示。我們的研究表明人源電壓門控質(zhì)子通道Hvl在人的結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌組織中高表達(dá)，而在正常和良性瘤組織中基本不表達(dá)。Hvl在結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌組織中的表達(dá)水平和腫瘤的惡性化程度有關(guān)，Hvl在惡性化程度高的腫瘤中表達(dá)量高、在惡性化程度低的腫瘤中表達(dá)量低。同時(shí)，Hvl在結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌組織中表達(dá)水平和病人的存活率有關(guān)，Hvl表達(dá)量高的病人預(yù)后不好，死亡率高。因此利用電壓門控質(zhì)子通道Hvl 作為結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌診斷和預(yù)后的標(biāo)志物，可以用于結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌的診斷和預(yù)后。由于結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌缺乏特異性標(biāo)志物用于診斷和預(yù)后，因此該標(biāo)志物具有十分廣闊的應(yīng)用前景和潛在的巨大的社會(huì)效益。我們的研究表明Hvl對(duì)結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌的生長(zhǎng)、侵襲和遷移起關(guān)鍵性作用。抑制Hvl在結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌中的表達(dá)明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和遷移能力。其機(jī)理是因?yàn)镠vl參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的pH值，維持腫瘤細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的pH值。 在本發(fā)明中我們提供人源電壓門控質(zhì)子通道HvI作為結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌診斷和預(yù)后的標(biāo)志物。運(yùn)用Hvl的多克隆和單克隆抗體，用免疫組織化學(xué)等方法來(lái)檢測(cè)Hvl 在結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌組織中的表達(dá)水平，從而來(lái)診斷和預(yù)后。本發(fā)明提供了以Hvl來(lái)診斷和預(yù)后結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌的方法；結(jié)直腸癌、 乳腺癌和胰腺癌抗原Hvl相應(yīng)的多克隆和單克隆抗體、抗體片段及衍生物。本發(fā)明可在結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌的診斷和預(yù)后中得到廣泛的應(yīng)用，具有潛在的巨大的社會(huì)效益。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果本發(fā)明提供的作為結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌診斷和預(yù)后的標(biāo)志物，即電壓門控質(zhì)子通道Hvl是一種在人的結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌組織中高表達(dá)，而在正常和良性瘤組織中不表達(dá)。Hvl在結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌組織中的表達(dá)水平和腫瘤的惡性化程度有關(guān)，Hvl在惡性化程度高的腫瘤中表達(dá)量高、在惡性化程度低的腫瘤中不表達(dá)。同時(shí)，Hvl 在結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌組織中表達(dá)水平和病人的存活率有關(guān)，Hvl表達(dá)量高的病人預(yù)后不好，死亡率高。因此利用電壓門控質(zhì)子通道Hvl作為結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌診斷和預(yù)后的標(biāo)志物，可以用于結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌的診斷和預(yù)后。由于結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌缺乏特異性標(biāo)志物用于診斷和預(yù)后，因此該標(biāo)志物具有十分廣闊的應(yīng)用前景和潛在的巨大的社會(huì)效益。


圖I是Hvl在結(jié)直腸癌中的表達(dá)A(IOOX)，B(500X)，C(IOOX)和D(500X)，為正常結(jié)直腸組織;E(100X)和F(500X)腺瘤組織；G(100X)，H(500X)，I (100X)，J(500X)， K(IOOX)和L(500X)為結(jié)直腸癌組織。正常組織包括增生和腺瘤，染色為陰性和弱陽(yáng)性。在癌組織中，Hvl顯示強(qiáng)陽(yáng)性。Hvl染成棕色，細(xì)胞核為藍(lán)色。圖2是Hvl在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)SW620，HT29，LS174T，Colo205和SW480 細(xì)胞，分別用免疫細(xì)胞化學(xué)(A)和實(shí)時(shí)定量PCR(B)檢測(cè)。A.HT29(a，200X)，LS174T(b， 200X)，Colo205(c，200X)，SW480 (d, 200X), SW620 (e, 200X)和 SW620 (f, 500X)用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。B.用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Hvl在SW620, HT29, LS174T, Colo205和SW480細(xì)胞中mRNA表達(dá)水平。所有細(xì)胞與SW620比較。圖3是Hvl表達(dá)量和存活率的關(guān)系高低表達(dá)Hvl的結(jié)直腸癌病人總生存曲線和無(wú)病復(fù)發(fā)生存曲線。低表達(dá)病人比高表達(dá)病人總生存期和無(wú)病復(fù)發(fā)生存期長(zhǎng)。A.總生存曲線，B.無(wú)病復(fù)發(fā)生存曲線圖4是Hvl在乳腺癌中的表達(dá)病人的乳腺癌組織樣品用anti-Hvl抗體染色。在正常乳腺組織(A)和乳腺增生組織(B和C)Hvl染色成陰性或弱陽(yáng)性，但在乳腺癌組織中成中染色和強(qiáng)染色(D-I)。Hvl染色區(qū)成褐色，細(xì)胞核成藍(lán)色。A，B，D，F(xiàn)和H為200倍；C，E， G和I為500倍。陰性對(duì)照用小鼠非免疫血清代替免疫血清。圖5 是Hvl 在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá) MCF-7，MDA-MB-231，T-47D，SK-BR-3， MDA-MB-468和MDA-MB-453細(xì)胞，分別用免疫細(xì)胞化學(xué)(A)和實(shí)時(shí)定量PCR(B)檢測(cè)。A. MCF-7(a，200X)，MDA-MB-231 (b，200X)，T-47D (c，200X)，SK-BR-3 (d，200X)， MDA-MB-468 (e, 200X)和MDA-MB-453 (f，200X)用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。B.用實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè) Hvl 在 MCF-7，MDA-MB-231, T-47D，SK-BR-3, MDA-MB-468 和 MDA-MB-453 細(xì)胞中 mRNA 表達(dá)水平。所有細(xì)胞與MDA-MB-231比較。圖6是Hvl表達(dá)量和存活率的關(guān)系Hvl表達(dá)量和存活率的關(guān)系高低表達(dá)Hvl的乳腺癌癌病人總生存曲線和無(wú)病復(fù)發(fā)生存曲線。低表達(dá)病人比高表達(dá)病人總生存期和無(wú)病復(fù)發(fā)生存期長(zhǎng)。A.總生存曲線，B.無(wú)病復(fù)發(fā)生存曲線 圖7是Hvl在胰腺癌中的表達(dá)。A (100 X)和B (500 X)，胰腺癌組織陰性對(duì)照(用 Balb/c鼠非免疫血清代替Hvl抗體)；C(100X)和D(500X)，為#379689胰腺癌組織； E(IOOX)和 F(500X)為 #380190 胰腺癌組織；G(IOOX)，H(500X)為 #380333 胰腺癌組織。Hvl在不同惡性程度的胰腺癌組織中染色強(qiáng)弱不同，惡性程度高的胰腺癌組織中Hvl顯示強(qiáng)陽(yáng)性，在惡性程度低的胰腺癌組織中染色為弱陽(yáng)性。Hvl染成棕色，細(xì)胞核為藍(lán)色。
具體實(shí)施例方式病人和組織樣本結(jié)直腸癌組織樣本是從通化中心醫(yī)院外科手術(shù)得到的，為2001年到2007年的組織樣本。這些病人未經(jīng)過(guò)放化療治療。139例結(jié)直腸癌組織及相應(yīng)的癌旁組織用10%福爾馬林固定，石蠟包埋。這些病人的病歷資料在表一中給出。另外，為了證實(shí)Hvl表達(dá)的特異性，我們也選了未癌變的組織，10例正常結(jié)直腸組織，18例增生組織，以及20例腺瘤組織。 每個(gè)病人的病理資料都根據(jù)腫瘤分期，腫瘤大小，淋巴節(jié)狀態(tài)分類。腫瘤分化程度根據(jù)埃德蒙森分級(jí)法。乳腺癌組織樣本是從通化中心醫(yī)院外科手術(shù)得到的，為2001年到2007年的組織樣本。這些病人未經(jīng)過(guò)放化療治療。105例乳腺癌組織及相應(yīng)的癌旁組織用10%福爾馬林固定，石蠟包埋。這些病人的病歷資料在表二中給出。另外，為了證實(shí)Hvl表達(dá)的特異性，
8我們也選了未癌變的組織，8例正常乳腺組織，20例乳腺增生組織。每個(gè)病人的病理資料都根據(jù)腫瘤分期，腫瘤大小，淋巴節(jié)狀態(tài)分類。腫瘤分化程度根據(jù)埃德蒙森分級(jí)法。胰腺癌組織樣本是從天津市腫瘤醫(yī)院外科手術(shù)得到的，為2004年到2008年的組織樣本。這些病人未經(jīng)過(guò)放化療治療。152例胰腺癌組織及相應(yīng)的癌旁組織用10%福爾馬林固定，石蠟包埋。另外，為了證實(shí)Hvl表達(dá)的特異性，我們也選了 10例正常胰腺組織。每個(gè)病人的病理資料都根據(jù)腫瘤分期，腫瘤大小，淋巴節(jié)狀態(tài)分類。腫瘤分化程度根據(jù)埃德蒙森分級(jí)法。實(shí)施例I電壓門控質(zhì)子通道Hvl (人源結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌重組蛋白抗原)的制備之一首先設(shè)計(jì)出新的人源結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌抗原Hvl的C端引物，序列如下C-Hvl BamH I-F :5，CGCGGATCCAAGACACGTTCAGAACGGC(序列 3)EcoR I-R :5，CGGAATTCCTAGTTCACTTCACCAAGAAG(序列 4)通過(guò)PCR擴(kuò)增，雙酶切PCR產(chǎn)物和載體pGEX6p_l并回收，連接，得到重組質(zhì)粒。這個(gè)克隆就是含有本發(fā)明提到的電壓門控質(zhì)子通道Hvl (人源結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌抗原)DNA序列的重組表達(dá)質(zhì)粒的克隆，它命名為pGEX6p-l-c-Hvl。將pGEX6p-l-c_Hvl轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E. coli BL21(DE3)大腸桿菌，使用O. 5mM IPTG誘導(dǎo)劑，進(jìn)行蛋白表達(dá)。通過(guò)離子交換柱純化得到電壓門控質(zhì)子通道Hvl蛋白(人源結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌重組蛋白抗原)，基因序列如序列表序列I所示、氨基酸序列如序列2所示。電壓門控質(zhì)子通道Hvl (人源結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌抗原)的制備之二人工合成多肽，序列為CSEKEQEIERLNKL，然后把該多肽和血藍(lán)蛋白(或牛血清白蛋白按質(zhì)量I比I連接，得到人源結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌抗原(keyhole limpet haemocyanin (KLH)-conjugated Hvl peptide CSEKEQEIERLNKL)(序列 5)。實(shí)施例2 (一 )抗人源結(jié)直腸癌抗原Hvl兔多克隆抗體的制備采用4mg/每只實(shí)施例I獲得的人源結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌抗原Hvl的重組蛋白抗原混合完全福氏佐劑多點(diǎn)皮下免疫新西蘭大耳白兔，10天后采用4mg/每只人源結(jié)直腸癌抗原Hvl的重組蛋白抗原混合不完全福氏佐劑多點(diǎn)皮下第二次免疫新西蘭大耳白兔。第二次免疫后，間隔一周進(jìn)行第三次免疫。第三次免疫后10天采血測(cè)效價(jià)，當(dāng)效價(jià)> I 106，處死動(dòng)物采血，采用凝結(jié)法收集血清，低速離心去沉淀。用生理鹽水I : 2稀釋， 上ProteinA親和層析柱純化，pH2. 8的O. IM甘氨酸緩沖液洗脫，IM Tris中和后對(duì)PBS透析3次，檢測(cè)0D280定抗體含量，獲得抗人源結(jié)直腸癌抗原Hvl的兔多克隆抗體。如果效價(jià) < I 106，則繼續(xù)免疫至效價(jià)> I : 106。( 二)抗人源結(jié)直腸癌抗原Hvl小鼠單克隆抗體采用IOOug/每只實(shí)施例I獲得的新的人源結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌重組蛋白抗原混合完全福氏佐劑皮下免疫Balb/c小鼠,4周后采用50ug/每只重組蛋白抗原混合完全福氏佐劑腹腔加強(qiáng)免疫，4周后再次采用50ug/每只重組蛋白抗原混合完全福氏佐劑腹腔加強(qiáng)免疫，總共3次加強(qiáng)免疫，10天后采血測(cè)效價(jià)，當(dāng)效價(jià)> I : 106，處死動(dòng)物，收集脾組織，使其通過(guò)100目的篩網(wǎng)分離為單細(xì)胞。采用50%的PEG促融合法將500萬(wàn)脾細(xì)胞與100 萬(wàn)SP2/0細(xì)胞融合，融合后采用HAT培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)。培養(yǎng)I周后采用人源乳腺癌重組蛋白抗原包被的ELISA進(jìn)行篩選，陽(yáng)性克隆連續(xù)進(jìn)行亞克隆，篩選穩(wěn)定分泌特異抗體的克隆，獲得抗人源乳腺癌抗原Hvl的鼠單克隆抗體。實(shí)施例3 用電壓門控質(zhì)子通道Hvl的抗體檢測(cè)結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌采用常規(guī)免疫組化方法，石蠟切片，以山羊血清封閉，一抗采用小鼠抗人結(jié)直腸癌抗原Hvl多克隆抗體，二抗采用山羊抗小鼠IgG-HRP，DAB顯色，蘇木精染細(xì)胞核。結(jié)果如圖1，圖4和圖7所示，在癌組織上著色密集，同時(shí)在正常的組織未被染色。 證明電壓門控質(zhì)子通道Hvl在結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌細(xì)胞中高表達(dá)。結(jié)直腸癌染色結(jié)果根據(jù)IRS方法，分別由兩個(gè)不同的病理醫(yī)生打分，0-3分為Hvl 低表達(dá)，4-12分為Hvl高表達(dá)。使用SPSS17. O統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，如表三所示，Hvl的表達(dá)情況與腫瘤大小，腫瘤分級(jí)，淋巴結(jié)狀態(tài)和臨床分期有關(guān)，與其他因素?zé)o關(guān)。乳腺癌染色結(jié)果根據(jù)IRS方法，分別由兩個(gè)不同的病理醫(yī)生打分，0-3分為Hvl低表達(dá)，4-12分為Hvl高表達(dá)。使用SPSS17. O統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，如表四所示，Hvl的表達(dá)情況與腫瘤大小，腫瘤分級(jí)，淋巴結(jié)狀態(tài)和臨床分期有關(guān)，與其他因素?zé)o關(guān)。實(shí)施例4 電壓門控質(zhì)子通道Hvl與結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌病人生存和復(fù)發(fā)的關(guān)系通過(guò)電話回訪的方式，得到每個(gè)病人目前存活和有無(wú)復(fù)發(fā)的情況，使用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，如表五，表六和表七，表八所示，病人的存活率和復(fù)發(fā)情況與Hvl表達(dá)水平有直接關(guān)系。實(shí)施例5 結(jié)直腸癌中p53，Ki-67，TopoII, GST- 和P_gp表達(dá)水平與病理參數(shù)之間的關(guān)系用已知的p53，Ki-67, TopoII, GST- Ji和P_gp抗體分別對(duì)結(jié)直腸癌組織進(jìn)行免疫染色，結(jié)果統(tǒng)計(jì)入表九所示。P53與腫瘤分級(jí)有關(guān)(P = O. Oil)，Ki-67與分化有關(guān)(P = O. 010)，TopoII與分化有關(guān)(P = O. 010)，GST- π與腫瘤大小有關(guān)(P = O. 007)，與分化有關(guān)(P = O. 000)。乳腺癌中ER，PR，Her-2，Ki-67, TopoII, GST- Ji和P_gp表達(dá)水平與病理參數(shù)之間的關(guān)系用已知的ER，PR，Her-2, Ki-67, TopoII, GST- 和P_gp抗體分別對(duì)乳腺癌組織進(jìn)行免疫染色，結(jié)果統(tǒng)計(jì)入表十所示。Her-2表達(dá)與腫瘤分級(jí)有關(guān)(P = O. 015)，與淋巴結(jié)狀態(tài)有關(guān)(P = O. 058)，與臨床分期有關(guān)(P = O. 029)。與腫瘤分級(jí)有關(guān)(P = O. 012)。TopoII 與腫瘤大小有關(guān)(P = O. 005)。表一結(jié)直腸癌臨床病理資料
權(quán)利要求
1.一種用于結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌診斷和預(yù)后的標(biāo)志物，其特征在于所述的標(biāo)志物為人源電壓門控質(zhì)子通道Hvl，其基因是序列表SEQ ID No. I所示的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用于結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌診斷和預(yù)后的標(biāo)志物，其特征在于所述的標(biāo)志物人源電壓門控質(zhì)子通道Hvl是序列表SEQ ID No.2所示的氨基酸殘基序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌診斷和預(yù)后的標(biāo)志物，其特征在于所述標(biāo)志物人源電壓門控質(zhì)子通道Hvl蛋白全長(zhǎng)為273個(gè)氨基酸殘基，依據(jù)該通道各氨基酸殘基的疏水特性，可將Hvl蛋白全長(zhǎng)劃分為3個(gè)結(jié)構(gòu)域N-端胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和C-端胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域；Hvl對(duì)質(zhì)子具有特異的選擇性，能夠高效地跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的用于結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌診斷和預(yù)后的標(biāo)志物， 其特征在于所設(shè)計(jì)的人源結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌抗原Hvl的C端引物如序列表SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4 所示。
全文摘要
一種用于結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌診斷和預(yù)后的標(biāo)志物。本發(fā)明以人源電壓門控質(zhì)子通道Hv1作為標(biāo)志物，運(yùn)用免疫組織化學(xué)等方法來(lái)診斷結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌，并以Hv1作為判斷預(yù)后的指標(biāo)。Hv1的基因序列和氨基酸序列如序列表SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。Hv1在結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌組織中高表達(dá)，而在正常和良性瘤組織中不表達(dá)。Hv1結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌組織中的表達(dá)水平和腫瘤的惡性化程度有關(guān)，在惡性化程度高的腫瘤中表達(dá)量高。同時(shí)，Hv1結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌組織中表達(dá)水平和病人的存活率有關(guān)，Hv1表達(dá)量高的病人預(yù)后不好，死亡率高。因此利用Hv1作為結(jié)直腸癌、乳腺癌和胰腺癌診斷和預(yù)后的標(biāo)志物，具有廣闊的應(yīng)用前景和潛在的社會(huì)效益。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102584978SQ20121007074
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月16日
發(fā)明者李樹杰, 王一凡 申請(qǐng)人:李樹杰