治療后的乳腺癌預(yù)后的制作方法
【專利摘要】本公開內(nèi)容包括與患者的延長治療和無癌存活有臨床相關(guān)性的基因表達概況或模式的鑒定和用途。具體而言，本公開內(nèi)容包括與在用于治療患者的內(nèi)分泌療法的變化中的益處有關(guān)而表達的基因的身份?；虮磉_的水平被公開為用于預(yù)測患者的臨床結(jié)果和因此預(yù)后的分子指數(shù)。本公開內(nèi)容還包括用于在用抗雌激素劑起始治療后預(yù)測癌癥復發(fā)和/或預(yù)測轉(zhuǎn)移性癌癥發(fā)生的方法。本公開內(nèi)容還包括用于根據(jù)壽命預(yù)期、癌癥復發(fā)和/或癌癥轉(zhuǎn)移的可能性確定或選擇受試者治療的方法。
【專利說明】治療后的乳腺癌預(yù)后
[0001]相關(guān)申請
本申請要求提交于2010年12月9日的美國臨時專利申請61/421，627的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，其通過引用其整體而結(jié)合于本文中，如同在本文中完整闡明。
[0002]本申請涉及提交于2008年9月6日且指定美國的國際申請?zhí)朠CT/US2008/075528(公布為WO 2009/108215 Al)，并且涉及提交于2010年3月6日的美國專利申請?zhí)?2/718,973。兩個申請通過引用結(jié)合于本文，如同在本文中完整闡明。
發(fā)明領(lǐng)域
[0003]本公開內(nèi)容涉及與乳腺癌具有臨床相關(guān)性的基因表達概況或模式的鑒定和用途。具體而言，本公開內(nèi)容部分地基于與在用芳香酶抑制劑或其他內(nèi)分泌療法的起始治療后癌癥復發(fā)的可能性有關(guān)的表達的基因的身份?；虮磉_的水平形成能對用芳香酶抑制劑或其他內(nèi)分泌療法的起始治療后的患者預(yù)測臨床結(jié)果以及因此預(yù)后的分子指數(shù)。
[0004]基因表達概況，無論其具體化為核酸表達、蛋白質(zhì)表達或其他表達形式，可用于預(yù)測患有乳腺癌的受試者治療后的臨床結(jié)果、預(yù)測癌癥復發(fā)和/或預(yù)測轉(zhuǎn)移性癌癥的發(fā)生。所述概況還可用于研究受試者的預(yù)后。當用于預(yù)后時，所述概況用來根據(jù)壽命預(yù)期、癌癥復發(fā)和/或癌癥轉(zhuǎn)移的可能性確定癌癥的治療。
[0005]發(fā)明背景
乳腺癌的治療已為極受關(guān)注和廣泛研究的領(lǐng)域。通過分析來自受試者的乳腺癌細胞樣品初步診斷為乳腺癌后，治療方法經(jīng)常始于腫瘤細胞的手術(shù)去除。在激素依賴的乳腺癌(例如雌激素受體陽性(ER+)的乳腺癌)的情況下，手術(shù)后通過拮抗雌激素以減少腫瘤生長或再生長。在許多病例中，使用用抗雌激素他莫昔芬(tamoxifen)的治療達5年以降低疾病復發(fā)的風險和因此乳腺癌介導的死亡率。
[0006]不幸地是,現(xiàn)場數(shù)據(jù)(data from the field)表明所有乳腺癌復發(fā)中超過一半在用輔藥他莫昔芬治療的5年后發(fā)生。
[0007]Goss 等(J.Clin.0ncol., 26 (12): 1948-1955，2008)報道了檢查使用來曲唑的試驗結(jié)果，該試驗在具有原發(fā)性ER+乳腺癌的受試者中用輔藥他莫昔芬5年后的3個月內(nèi)開始。結(jié)果表明他莫昔芬后，用來曲唑的治療提高無乳腺癌的存活率和無遠處乳腺癌(distant breast cancer-free)的存活率。
[0008]但Goss等沒有提供預(yù)測哪些用他莫昔芬治療5年的受試者將從隨后的來曲唑治療中受益的方法。因此，沒有方法將來曲唑治療僅針對期望得到益處的受試者。因此，對沒有期望獲得益處的受試者施用來曲唑治療，導致用他莫昔芬治療5年的無乳腺癌受試者群體的治療過度。
[0009]本文中文獻的引用不應(yīng)解釋為反映對任何文獻是相關(guān)現(xiàn)有技術(shù)的承認。此外，其引用并不表示是對相關(guān)公開內(nèi)容的檢索。關(guān)于文獻的日期或內(nèi)容的所有陳述基于可得到的信息，并不承認關(guān)于其準確性或正確性。
[0010]發(fā)明簡述本公開內(nèi)容部分地基于乳腺癌腫瘤細胞中基因表達水平的發(fā)現(xiàn)和測定，其與抗乳腺癌化學療法中的受益改變相關(guān)。在某些情況下，所述改變從一種形式的內(nèi)分泌治療到另一種。表達水平可用于提供預(yù)后信息(例如癌癥復發(fā))和預(yù)測信息(例如對某些療法的反應(yīng)性)。
[0011]第一方面，本公開內(nèi)容包括將起始用抗雌激素或抗芳香酶療法治療的受試者群鑒定或分類成至少兩個亞群的方法。第一亞群預(yù)期從療法改變中受益，例如改變成另一種抗雌激素或抗芳香酶療法。第二亞群預(yù)期不受益。在某些情況下，起始治療用他莫昔芬，例如輔藥他莫昔芬療法達約5年或更少的一段時期。任選地，所述改變是改變?yōu)閬砬虔煼ɑ蚱渌狗枷忝腐煼ā１竟_內(nèi)容包括用于將以該方式治療的受試者群和治療期間無乳腺癌的受試者群分類為第一和/或第二亞群的方法。
[0012]本公開內(nèi)容的方法基于在受試者的乳腺癌細胞中某些基因的表達水平，包括HoxB13的表達水平。在一些實施方案中，可使用HoxB13表達對IL17BR表達的雙基因比率(或 HoxB13:1L17BR 比率)(參見 Ma 等，7； Clin.0ncol., 24:4611-9 (2006))。在備選的實施方案中，可使用HoxB13表達對CHDH表達的雙基因比率。
[0013]HoxB13:1L17BR(H:1)比率基于預(yù)測超出標準預(yù)后因素的臨床結(jié)果的新生物標記物的研究而發(fā)現(xiàn)。關(guān)于腫瘤的階段和等級，發(fā)展為癌癥復發(fā)的患者與未發(fā)展為癌癥復發(fā)的患者一致。發(fā)現(xiàn)單一的H:1比率適于在接受輔藥他莫昔芬治療的雌激素受體陽性(ER+)的乳腺癌患者中預(yù)測癌癥復發(fā)。后續(xù)的研究(Goetz等，Clin Cancer Res.12:2080-7 (2006);Jerevall 等，Rreast Grnicer Res.Treat (2007) ; Jansen 等，J.Clin.0ncol.25:662-8(2007))進一步顯示該比率既是預(yù)后性的(例如通過作為腫瘤侵占性的指示劑)而且是預(yù)測性的(在可追溯的臨床試驗和隨機化的臨床試驗兩者中預(yù)測他莫昔芬的益處)。
[0014]在其他實施方案中，本公開內(nèi)容包括與HoxB13表達組合的一個或多個其他的基因。組合可以是與下文 另外公開的基因中的任何I個、2個、3個、4個或所有的5個。
[0015]本公開內(nèi)容其他的基因編碼BublB (不受苯并咪唑抑制的出芽1β)或p21蛋白激活激酶6 (PAK6) ,CENPA (著絲粒蛋白A、同種型a)、NEK2 (NIMA相關(guān)激酶2或“永離有絲分裂基因a”相關(guān)激酶2)、RACGAP1 (Rac GTP酶激活蛋白I)和RRM2 (核糖核苷酸還原酶M2)。這5個基因的單獨使用被稱為分子級別指數(shù)(MolecularGrade Index, MGI)。本公開內(nèi)容的方面包括組合物和方法，其被描述用于與上文5個所研究的基因的一個或多個的表達水平組合的BoxB13表達(與或不與IL17BR)，以提供預(yù)后信息和/或提供臨床反應(yīng)性的預(yù)測。
[0016]因此，本公開內(nèi)容部分地基于以下發(fā)現(xiàn):基因表達水平可用于給受試者提供預(yù)后性確定(例如乳腺癌局部或遠處復發(fā)形式或轉(zhuǎn)移形式中的癌癥復發(fā)的可能性)和預(yù)測性確定(例如對治療過程的反應(yīng)性)。所有7個公開的基因的使用被稱為乳腺癌指數(shù)(BCI)。
[0017]當使用實時反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)分析BCI的表達水平時，發(fā)現(xiàn)該組合提供在用5年的他莫昔芬療法治療的受試者中復發(fā)風險的優(yōu)良分層(superiorstratification)。這反映意想不到的發(fā)現(xiàn)，因為這是第一次確定了乳腺癌療法的有益改變的預(yù)測物。
[0018]在其他方面，HoxB13表達和/或BCI可用于預(yù)測在乳腺癌患者中的癌癥的后期復發(fā)。后期復發(fā)的非限制性實例包括用他莫昔芬治療的5年后，而且還包括用他莫昔芬治療的4年、3年或2年或更少的時間后。同樣地，HoxB13表達和/或BCI可用于預(yù)測在上文的時間期間后對來曲唑或其他抗雌激素治療或抗芳香酶療法(以抑制后期復發(fā))的反應(yīng)性。[0019]本公開內(nèi)容的實施方案包括用預(yù)后值和預(yù)測值的測定方法，其用于將具有原發(fā)性ER+乳腺癌和隨后的無乳腺癌治療的受試者分層。作為預(yù)后，分層可基于與乳腺癌療法的改變相關(guān)的差異表達水平，并因此表明需要改變?nèi)橄侔┋煼?作為非限制性實例)。作為非限制性實例，分層(基于表達水平)可用于預(yù)測內(nèi)分泌敏感性(例如對來曲唑的敏感性作為非限制性實例)和/或預(yù)測自抗雌激素和/或抗芳香酶抑制劑的益處。當然可在任何合適的本文所述含有細胞的樣品中進行基因表達的檢測。用于本公開內(nèi)容的細胞的非限制性實例包括從受試者新鮮分離的細胞、分離后冷凍的細胞和固定和/或包埋(例如福爾馬林固定、石蠟包埋(FFPE))的細胞。在大多數(shù)實施方案中，細胞為乳腺細胞，例如乳腺癌細胞。
[0020]在一些實施方案中，基于表達水平的方法有利地用于來自受試者的含有乳腺癌細胞的樣品，例如DCIS樣品。作為非限制性實例，細胞可以是來自用于診斷受試者中的癌癥的手術(shù)前的組織學樣品的細胞。對于這樣的受試者，護理的標準是手術(shù)(相對于根治性乳房切除術(shù)，優(yōu)選乳房保留手術(shù)(breast conserving surgery))去除DCIS。往往隨后進行手術(shù)后的放射療法，任選使用內(nèi)分泌療法，例如用他莫昔芬、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)、選擇性雌激素受體下調(diào)劑(SERD)或芳香酶抑制劑(Al)例如來曲唑治療。在其他手術(shù)后的病例中，給予無放射的內(nèi)分泌療法，并任選使用化學療法。
[0021]本公開內(nèi)容涉及預(yù)期在起始的內(nèi)分泌療法過程期間無乳腺癌存活后從內(nèi)分泌療法改變(例如從一種類型的內(nèi)分泌療法到另一種)中受益的受試者的鑒定。在其他實施方案中，所述改變可在5年、4年、3年或2年的起始的內(nèi)分泌療法過程后進行。
[0022]本公開內(nèi)容還包括檢測基因表達，其中高HoxB13表達為起始的內(nèi)分泌療法(例如輔藥他莫昔芬療法)后受試者中癌癥復發(fā)的可能性增加的指示劑。因此，方法可包括鑒定受試者為可能或不可能經(jīng)歷局部癌癥復發(fā)，并且還包括改變受試者的治療形式以得到預(yù)期的結(jié)果。作為非限制性實例，在不存在延長的起始治療后的療法的情況下，復發(fā)可能性的確定可用于證實延長療法的合適性或選擇延長療法，所述延長療法具有所用的抗-雌激素和/或抗芳香酶形式的改變。
[0023]在某些情況下，所公開的方法可用于給絕經(jīng)前的女性或絕經(jīng)后的女性選擇或消除療法，所述女性經(jīng)歷了內(nèi)分泌療法的治療并且在該時間期間保持無癌癥。絕經(jīng)前的女性包括年齡低于約35歲的那些女性。所述方法可包括測定來自受試者的含有乳腺癌細胞的樣品中所公開基因的表達。作為非限制性實例，細胞可以是用于診斷受試者的癌癥的來自手術(shù)前組織學樣品的細胞。
[0024]內(nèi)分泌療法的非限制性實例包括用SERM例如他莫昔芬、或SERD、或芳香酶抑制劑(Al)治療。Al的非限制性實例包括非留族抑制劑(例如來曲唑和阿那曲唑)和不可逆甾族抑制劑(例如依西美坦)。
[0025]本發(fā)明實施方式的詳述 本文使用的術(shù)語定義:
基因表達“模式”或“概況”或“特征”指在兩個或更多個臨床結(jié)果、癌癥結(jié)果、癌癥復發(fā)和/或存活結(jié)果之間的一個或多個基因的相對表達，其中所述表達與能夠區(qū)別所述結(jié)果相關(guān)。在某些情況下，所述結(jié)果為乳腺癌結(jié)果。
[0026] “基因”是編碼離散的產(chǎn)物(無論本質(zhì)上是RNA還是蛋白質(zhì)性質(zhì)的)的多核苷酸。應(yīng)理解超過一個多核苷酸可能能夠編碼離散的產(chǎn)物。該術(shù)語包括編碼相同產(chǎn)物或其功能上相關(guān)(包括功能的獲得、喪失或調(diào)節(jié))的類似物的基因的等位基因和多態(tài)性，其基于染色體的位置和在正常有絲分裂期間重組的能力。
[0027]術(shù)語“相關(guān)”或“相關(guān)性”或其等同物是指一個或多個基因的表達與細胞的生理狀態(tài)之間的關(guān)聯(lián)，以排除通過用本文所述的方法鑒定的一種或多種其他狀態(tài)?；蚩梢暂^高或較低水平表達，并還與一種或多種癌癥狀態(tài)或結(jié)果相關(guān)。
[0028]“多核苷酸”是任何長度的核苷酸(核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸)的多聚形式。該術(shù)語僅指分子的一級結(jié)構(gòu)。因此，該術(shù)語包括雙鏈和單鏈DNA和RNA。其還包括已知類型的修飾，包括本領(lǐng)域已知的標記、甲基化、“帽”、一個或多個天然存在的核苷酸用類似物的取代和核苷酸間的修飾例如不帶電荷的鍵合(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)，以及未修飾形式的多核苷酸。
[0029]術(shù)語“擴增”廣義用于指通過DNA或RNA聚合酶酶促產(chǎn)生擴增產(chǎn)物。本文所用的“擴增”通常指產(chǎn)生所需序列的多拷貝(尤其是樣品的多拷貝)的過程?！岸嗫截悺敝钢辽?拷貝?！翱截悺辈⒉槐厝恢概c模板序列的完全序列互補性或同一性。
[0030]所謂一致性(corresponding)是指一個核酸分子與另一個核酸分子共有基本數(shù)量的序列同一性。基本數(shù)量意指至少95%、通常至少98%和更通常至少99%，并且使用BLAST算法確定序列同一性,如在Altschul等，J.MoL Biol.215:403-410 (1990)中所述(使用公布的默認設(shè)置，即參數(shù)w=4、t=17)。擴增mRNA的方法通常為本領(lǐng)域已知，并包括反轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)和在美國專利申請10/062,857 (提交于2001年10月25日)以及美國臨時專利申請60/298，847 (提交于2001年6月15日)和60/257，801 (提交于2000年12月22日)中所述的方法，上述所有文獻通過引用以其整體結(jié)合于本文中，如同完全闡明?？墒褂玫牧硪环椒槎縋CR (或Q-PCR)?；蛘?，可通過本領(lǐng)域已知的方法將RNA直接標記為相應(yīng)的cDNA。
[0031]“微陣列”是優(yōu)選不連續(xù)區(qū)域的線性或二維陣列，每個區(qū)域具有確定的面積，其在固體支持物(例如但不限于玻璃、塑料或合成膜)的表面上形成。在微陣列上的不連續(xù)區(qū)域的密度由在單一固相支持物的表面上待檢測的固定的多核苷酸的總量決定，優(yōu)選至少約50/cm2,更優(yōu)選至少約100/cm2,更優(yōu)選至少約500/cm2,但優(yōu)選低于約1，000/cm2。優(yōu)選地是，陣列總共含有少于約500、約1000、約1500、約2000、約2500或約3000種固定的多核苷酸。本文所用的DNA微陣列為置于芯片或其他表面上的寡核苷酸或多核苷酸陣列，所述芯片或其他表面用來與從樣品中擴增或克隆的多核苷酸雜交。由于在陣列中各具體組的引物的位置是已知的，樣品多核苷酸的身份可基于其與微陣列中具體位置的結(jié)合而確定。
[0032]由于本公開內(nèi)容依賴于過表達或表達不足的基因的鑒定，因此本公開內(nèi)容的一個實施方案涉及通過樣品細胞的mRNA或其擴增或克隆形式與對具體的基因序列獨特的多核苷酸的雜交來測定表達。優(yōu)選該類型的多核苷酸含有在其他基因序列中不存在的基因序列的至少約20、至少約22、至少約24、至少約26、至少約28、至少約30或至少約32個連續(xù)的堿基對。在前述語句中使用的術(shù)語“約”意指從所述數(shù)值增加或減少I。甚至更優(yōu)選在其他基因序列中不存在的基因序列的至少或約50、至少或約100、至少或約150、至少或約200、至少或約250、至少或約300、至少或約350、或至少或約400個堿基對的多核苷酸。在前述語句中使用的術(shù)語“約”意指從所述數(shù)值增加或減少10%。所述多核苷酸還可稱為多核苷酸探針，其能夠與本文所述的基因或其獨特部分的序列雜交。優(yōu)選地是，序列為由基因編碼的mRNA序列、與所述mRNA對應(yīng)的cDNA序列和/或所述序列的擴增形式的序列。在本公開內(nèi)容優(yōu)選的實施方案中，多核苷酸探針固定在陣列上、其他裝置上或使探針定位的單獨的點上。
[0033]在本公開內(nèi)容的另一實施方案中，可擴增所公開序列的全部或部分，并通過例如聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)和其變化(例如但不限于定量PCR (Q-PCR)、反轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)和實時PCR，任選實時RT-PCR)等方法進行檢測。這類方法使用與所公開序列的部分互補的一個或兩個引物，其中所述引物用于引導核酸的合成。新合成的核酸任選被標記并可被直接檢測或通過與本公開內(nèi)容的多核苷酸雜交來檢測。新合成的核酸可與本公開內(nèi)容的多核苷酸(含有序列)在允許其雜交的條件下接觸。
[0034]或者，在本公開內(nèi)容的另一實施方案中，可通過分析目的細胞樣品中表達的蛋白質(zhì)測定基因表達，所述分析使用一種或多種特異針對所述細胞樣品中的單獨基因產(chǎn)物(蛋白質(zhì))的一個或多個表位的抗體。這類抗體優(yōu)選被標記以使其在與基因產(chǎn)物結(jié)合后容易檢測。
[0035]術(shù)語“標記”指能夠產(chǎn)生指示所標記分子存在的可檢測信號的組合物。合適的標記包括放射性同位素、核苷酸發(fā)色團、酶、底物、熒光分子、化學發(fā)光部分、磁性粒子、生物發(fā)光部分等。照此，標記為通過光譜學、光化學、生物化學、免疫化學、電學、光學或化學方法可檢測的任何組合物。
[0036]術(shù)語“支持物”指常規(guī)的支持物例如珠粒、顆粒、浸潰片(dipsticks)、纖維、濾紙、膜和硅烷或硅酸鹽支持物例如玻片。
[0037]本文所用的“癌癥組織樣品”或“癌癥細胞樣品”指分離自患有相應(yīng)癌癥的個體的含有細胞的組織樣品。所述樣品可來自經(jīng)手術(shù)程序(例如活組織檢查)去除的材料。這類樣品為初步分離物(與培養(yǎng)的細胞形成對比)并且可通過本領(lǐng)域公認的任何合適方法收集。在一些實施方案中，可通過非侵入式的方法收集“樣品”，所述方法包括但不限于擦破、細針抽吸。
[0038]“乳腺組織樣品”或“乳腺細胞樣品”指自懷疑患有乳腺癌或具有發(fā)展為乳腺癌的風險的個體分離的乳腺組織或流體的樣品。這類樣品為初步分離物(與培養(yǎng)的細胞形成對比)，并可通過任何非侵入式方法收集，所述方法包括但不限于導管灌洗、細針抽吸、針吸活組織檢查、在美國專利號6，328，709中描述的裝置和方法或本領(lǐng)域已知的任何其他合適的方法?；蛘撸赏ㄟ^侵入式方法收集“樣品”，所述方法包括但不限于手術(shù)活組織檢查。
[0039]“表達”和“基因表達”包括核酸材料的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。當然該術(shù)語亦可限于僅指核酸的轉(zhuǎn)錄，如果如此說明的話。
[0040]本文所用的術(shù)語“包含”和其相關(guān)詞在其包括的意義內(nèi)使用；即，等同于術(shù)語“包括”和其相應(yīng)的相關(guān)詞。
[0041 ] “允許”事件發(fā)生的條件或“適于”事件發(fā)生的條件，例如雜交、鏈延伸等，或“適當?shù)摹睏l件為不阻止所述事件發(fā)生的條件。因此，這些條件允許、增強、促進和/或有益于事件。本領(lǐng)域已知的和本文所述的這類條件取決于例如核苷酸序列的性質(zhì)、溫度和緩沖液條件。這些條件還取決于所需要的事件，例如雜交、裂解、鏈延伸或轉(zhuǎn)錄。
[0042] 本文所用的序列“突變”指與參照序列比較，在本文公開的目的基因序列內(nèi)的任何序列改變。序列突變包括在序列中單一核苷酸的改變或者超過一個核苷酸的改變，所述改變歸因于例如取代、缺失或插入等機制。單核苷酸多態(tài)性(SNP)也是本文所用的序列突變。因為本公開內(nèi)容基于基因表達的相對水平，所以本文公開的基因的非編碼區(qū)的突變也可在本公開內(nèi)容的實施中進行測定。
[0043]“檢測”包括任何檢測方法，其包括基因表達和其中的變化的直接檢測和間接檢測。例如，“可檢測地更少”產(chǎn)物可直接或間接地觀察到，并且該術(shù)語表示任何的減少(包括可檢測信號的缺失)。同樣地，“可檢測地更多”產(chǎn)物指任何的增加，無論直接還是間接地觀察到。
[0044]所公開序列表達的增加或減少以下列術(shù)語進行定義，其基于相對于正常細胞中表達的百分比或倍數(shù)變化。相對于正常細胞的表達水平，增加可以是10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180或200%?；蛘?，倍數(shù)增加可以是相對于正常細胞中表達水平的 1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5 或 10 倍。相對于正常細胞的表達水平，減少可以是 10、20、30、40、50、55、60、65、70、75、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、99 或 100%ο
[0045]除非另外說明，本文使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有與本公開內(nèi)容所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員的通常理解相同的含義。
[0046]概述 本文公開的基因表達模式是內(nèi)分泌療法改變中的治療益處的預(yù)測因子。在某些情況下，作為非限制性實例，預(yù)測是在結(jié)陰性(node-negative)乳腺癌患者例如ER+結(jié)陰性患者中。
[0047]為在本公開內(nèi)容的實施中測定基因的表達水平，可利用本領(lǐng)域已知的任何方法。在一些實施方案中，使用基于RNA檢測的表達，所述RNA與本文鑒定和公開的基因雜交。這通過本領(lǐng)域已知的或公認等同的任何RNA檢測或擴增+檢測的方法容易地進行，所述方法例如但不限于反轉(zhuǎn)錄PCR、在美國專利申請序列號10/062，857 (提交于2001年10月25日)以及美國臨時專利申請60/298，847 (提交于2001年6月15日)和60/257，801 (提交于2000年12月22日)中公開的方法、和檢測RNA穩(wěn)定化或脫穩(wěn)定化序列的存在和不存在的方法。
[0048]或者，可使用基于DNA狀態(tài)檢測的表達。經(jīng)鑒定為甲基化或缺失的基因的DNA檢測可用于表達減少的基因。這可通過本領(lǐng)域已知的基于PCR的方法容易地進行，所述方法包括但不限于Q-PCR。相反地，經(jīng)鑒定為擴增的基因的DNA檢測可用于與具體的乳腺癌結(jié)果相關(guān)的表達增加的基因。這可通過本領(lǐng)域已知的基于PCR的熒光原位雜交(FISH)和染色體原位雜交(CISH)方法容易地進行。
[0049]還可使用基于蛋白質(zhì)水平或活性的存在、增加或減少的檢測的表達?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的或公認適合于蛋白檢測的任何基于免疫組織化學(IHC)、基于血液(尤其對分泌蛋白)、基于抗體(包括針對蛋白的自身抗體)、基于片狀剝落細胞(exfoliate cell)(來自癌)、基于質(zhì)譜和基于成像(包括標記配體的使用)的方法進行檢測?；诳贵w和成像的方法還可用于在癌癥測定后通過使用非侵入程序(例如導管灌洗或細針抽吸)獲得的細胞進行腫瘤的定位，其中癌細胞的來源是未知的?？墒褂脴擞浀目贵w或配體來定位患者體內(nèi)的癌。
[0050]使用基于核酸的測定來檢測表達的一個實施方案為通過將一個或多個本文鑒定的基因序列固定到固體支持物上，所述固體支持物包括但不限于固體基質(zhì)(例如陣列)或本領(lǐng)域已知的基于一種或多種珠粒的技術(shù)?；蛘?，還可使用本領(lǐng)域已知的基于溶液的表達測定。
[0051]固定的基因可以是對該基因獨特或在其他方面特異的多核苷酸形式，以使該多核苷酸能與對應(yīng)于該基因的DNA或RNA雜交。這些多核苷酸可以是基因的全長或者是基因的短序列(通過從序列的5’或3’末端缺失，比本領(lǐng)域已知的全長序列縮短達一個核苷酸)，其任選最低限度地被間斷(例如通過錯配或插入非互補堿基對)以使與對應(yīng)于該基因的DNA或RNA的雜交不受影響。在某些情況下，使用的多核苷酸為來自基因的3’末端，例如自基因或所表達序列的多腺苷酸化信號或多腺苷酸化位點的約350個、約300個、約250個、約200個、約150個、約100個或約50個以內(nèi)的核苷酸。還可使用含有相對于公開的基因序列的突變的多核苷酸，只要該突變的存在仍允許雜交產(chǎn)生可檢測信號。
[0052]固定的基因可用于測定從樣品的癌或乳腺、細胞中制備的核酸樣品的狀態(tài)，對此樣品的受試者(例如從其中獲得樣品的患者)的結(jié)果是未知的，或用于證實已指定給樣品的受試者的結(jié)果。不限制本公開內(nèi)容，所述細胞可來自ER+乳腺癌的患者。固定的多核苷酸僅需要足以與源自樣品的相應(yīng)的核酸分子在合適的條件下特異地雜交。
[0053]如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，上述相應(yīng)的序列中的一些包括3’多聚A (或在互補鏈上的多聚T)延伸，其并不促成所公開序列的獨特性。因此可用缺少3’多聚A(或多聚T)延伸的序列實施本公開內(nèi)容。所公開序列的獨特性指僅在所公開的基因的核酸中存在的序列的部分或整體，包括在基因的3’非翻譯部分存在的獨特序列。用于實施本公開內(nèi)容的優(yōu)選獨特序列是其對三組中的各序列的共有序列有貢獻的那些序列，以使所述獨特序列可用于檢測在各種個體中的表達，而不是特異地針對存在于一些個體中的多態(tài)性?；蛘?，可使用對個體或亞群獨特的序列。優(yōu)選的獨特序列優(yōu)選具有如本文所述的本公開內(nèi)容的多核苷酸長度。
[0054]為在本公開內(nèi)容的實施中測定上文所述序列的表達水平(增加或減少)，可使用本領(lǐng)域已知的任何方法。在本公開內(nèi)容的一個實施方案中，使用基于RNA檢測的表達，所述RNA與含有上文所述序列的多核苷酸雜交。這通過本領(lǐng)域已知的或公認等同的任何RNA檢測或擴增+檢測的方法容易地進行，所述方法例如但不限于反轉(zhuǎn)錄PCR (任選實時PCR)、在美國專利申請序列號10/062,857 (題目為“核酸擴增”，提交于2001年10月25日)以及美國臨時專利申請60/298，847 (提交于2001年6月15日)和60/257，801 (提交于2000年12月22日)中公開的方法、在美國專利號6，291，170中公開的方法和定量PCR。還可使用鑒定增加的RNA穩(wěn)定性(導致觀察到表達增加)或降低的RNA穩(wěn)定性(導致觀察到表達減少)的方法。這些方法包括增加或降低含有基因序列的mRNA的穩(wěn)定性的序列的檢測。這些方法還包括增加的mRNA降解的檢測。
[0055]在本公開內(nèi)容的一些實施方案中，使用具有在上文公開的序列的3’非翻譯和/或非編碼區(qū)存在的序列的多核苷酸，以檢測在癌、或乳腺、細胞中基因序列的表達水平。這類多核苷酸可任選含有在上文公開的序列的編碼區(qū)的3’部分存在的序列。含有來自編碼區(qū)和3’非編碼區(qū)的序列的組合的多核苷酸優(yōu)選具有鄰接排列的序列，不具有插入的異源序列。
[0056]或者，可用具有在癌、或乳腺、細胞中的基因序列的5’非翻譯區(qū)和/或非編碼區(qū)存在的序列的多核苷酸實施本公開內(nèi)容，以檢測其表達水平。這類多核苷酸可任選含有在編碼區(qū)的5’部分存在的序列。含有來自編碼區(qū)和5’非編碼區(qū)的序列的組合的多核苷酸優(yōu)選具有鄰接排列的序列，不具有插入的異源序列。還可用在所公開的基因序列的編碼區(qū)中存在的序列實施本公開內(nèi)容。
[0057]非限制性的多核苷酸含有來自3’或5’非翻譯區(qū)和/或非編碼區(qū)的至少約20個、至少約22個、至少約24個、至少約26個、至少約28個、至少約30個、至少約32個、至少約34個、至少約36個、至少約38個、至少約40個、至少約42個、至少約44個或至少約46個連續(xù)核苷酸的序列。前述語句中使用的術(shù)語“約”是指從所述數(shù)值增加或減少I。甚至更優(yōu)選含有至少或約50個、至少或約100個、至少或約150個、至少或約200個、至少或約250個、至少或約300個、至少或約350個、或者至少或約400個連續(xù)核苷酸的序列的多核苷酸。前述語句中使用的術(shù)語“約”是指從所述數(shù)值增加或減少10%。
[0058]來自在本公開內(nèi)容的多核苷酸中存在的上述編碼區(qū)的3’或5’末端的序列具有與上述的那些序列相同的長度，除它們當然受到編碼區(qū)長度的限制之外。編碼區(qū)的3’末端可包括直到編碼區(qū)的3’ 一半的序列。相反地，編碼區(qū)的5’末端可包括直到編碼區(qū)的5’ 一半的序列。當然可以其整體使用上述序列或編碼區(qū)和含有其部分的多核苷酸。
[0059]組合了來自3’非翻譯區(qū)和/或非編碼區(qū)的序列和編碼區(qū)的締合3’末端的多核苷酸可以是至少或約100個、至少或約150個、至少或約200個、至少或約250個、至少或約300個、至少或約350個、或者至少或約400個連續(xù)的核苷酸。優(yōu)選地是，使用的多核苷酸來自基因的3’末端，例如自基因或所表達序列的多腺苷酸化信號或多腺苷酸化位點的約350個、約300個、約250個、約200個、約150個、約100個、或約50個以內(nèi)的核苷酸。還可使用含有突變(相對于公開的基因序列)的多核苷酸，只要突變的存在仍允許雜交產(chǎn)生可檢測的信號。
[0060]在本公開內(nèi)容的另一實施方案中，可使用含有自上文公開的序列的5’和/或3’末端的核苷酸缺失的多核苷酸。優(yōu)選從5’和/或3’末端缺失1-5個、5-10個、10-15個、15-20 個、20-25 個、25-30 個、30-35 個、35-40 個、40-45 個、45-50 個、50-60 個、60-70 個、70-80 個、80-90 個、90-100 個、100-125 個、125-150 個、150-175 個或 175-200 個核苷酸，盡管缺失的程度當然受限于所公開序列的長度和能夠使用多核苷酸來檢測表達水平的需要。
[0061]來自上文公開序列的3’末端的本公開內(nèi)容的其他多核苷酸包括用于定量PCR的引物和任選探針的那些多核苷酸。在一些實施方案中，引物和探針為其擴增自基因或所表達序列的多腺苷酸化信號或多腺苷酸化位點的少于約350個、少于約300個、少于約250個、少于約200個、少于約150個、少于約100個、或少于約50個核苷酸的區(qū)域的那些。
[0062]在本公開內(nèi)容的其他實施方案中，可使用含有上文公開的序列(包括3’末端)的部分的多核苷酸。這類多核苷酸含有自所公開序列的3’末端的至少或約50個、至少或約100個、至少或約150個、至少或約200個、至少或約250個、至少或約300個、至少或約350個、或至少或約400個連續(xù)的核苷酸。
[0063]本公開內(nèi)容還包括用于檢測乳腺細胞中基因表達的多核苷酸。所述多核苷酸可包含較短的多核苷酸，其由在上述基因中存在的序列與異源序列的組合組成，所述異源序列非天然存在于與所述序列的組合中。非限制性實例包括來自克隆載體或存在于限制性片段中的較短序列，其用于制備本文所述的標記探針或引物。[0064]HoxB 13 和 Η/Ι
本公開內(nèi)容的方法(基于受試者的乳腺癌細胞中的ΗοχΒ13的表達水平)可用作在起始內(nèi)分泌療法過程后在改變內(nèi)分泌療法中受益的預(yù)測。在一些實施方案中，可以Ma等{J.Clin.0ncol., 24:4611-9 (2006))報道的方式使用HoxB13表達對IL17BR表達的兩基因比率(或HoxB13:1L17BR比率)。在備選的實施方案中，可使用HoxB13表達對CHDH表達的兩基因比率。
[0065]在單獨使用HoxB13表達或使用HoxB13:1L17BR (H:1)比率的情況下，可使用截止值來定義乳腺癌細胞為具有相應(yīng)于表達的“高”和“低”值。在一些實施方案中，可使用截止值來定義乳腺癌細胞為具有“高H/Ι”和“低H/Ι”值。作為非限制性實例，可以Ma等的方式使用值0.06。在其他實施方案中，截止值可以是患病受試者的乳腺癌細胞中的HoxB13的平均表達。在其他可能的實施方案中，截止值可以是患病受試者的乳腺癌細胞中的Η/I的平均值，其通過平均HoxB13表達/平均IL17BR表達確定。
【權(quán)利要求】
1.一種方法，其包括: 從來自患有乳腺癌的受試者的ER+乳腺癌細胞樣品的核酸中制備cDNA， 自所述cDNA測定價基因的表達水平， 確定所述受試者為已經(jīng)歷乳腺癌去除并且為已用第一內(nèi)分泌療法治療一段時間且無癌癥復發(fā)，和 將所述受試者分類為預(yù)期從第一內(nèi)分泌療法結(jié)束后用不同的第二內(nèi)分泌療法的治療中受益，其中所述分類基于提高的HoxB13表達水平。
2.—種方法，其包括: 從來自患有乳腺癌的受試者的ER+乳腺癌細胞樣品的核酸中制備cDNA， 自所述cDNA測定在公開的乳腺癌指數(shù)(BCI)中的7個基因的表達水平以確定BCI值，其中所述基因為價?又 IL17BR、BublB, CENPA, ΝΕΚ2、RACGAPI 和 RRM2, 確定所述受試者為已經(jīng)歷乳腺癌去除并且為已用內(nèi)分泌療法治療一段時間且無癌癥復發(fā)，和 由于高風險的BCI值，將所述癌癥分類為可能復發(fā)。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述核酸為來自所述樣品的mRNA。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述RNA用于PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))。
5.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述測定包括使用陣列。
6.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述樣品分割自從所述受試者去除的組織。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述PCR為RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄-PCR)，任選為實時RT-PCR。
8.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述樣品為福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)的樣品。
9.權(quán)利要求1或2的方法，所述方法還包括在他莫昔芬治療結(jié)束后用來曲唑治療所述受試者。
10.權(quán)利要求1或2的方法，所述方法還包括測定所述樣品中的H:1比率并且其中所述比率用于表明提高的價表達水平。
11.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述癌癥為原位管癌(DCIS)并且所述癌癥復發(fā)包括局部復發(fā)。
12.前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述第一內(nèi)分泌療法為用他莫昔芬治療并且所述第二內(nèi)分泌療法為用來曲唑治療。
13.一種治療癌癥患者的方法，所述方法包括 從來自患有乳腺癌的受試者的ER+乳腺癌細胞樣品的核酸中制備cDNA， 自所述cDNA測定價基因的表達水平， 確定所述受試者為已經(jīng)歷乳腺癌去除并且為已用第一內(nèi)分泌療法治療一段時間且無癌癥復發(fā)， 將所述受試者分類為預(yù)期從在第一內(nèi)分泌療法結(jié)束后用不同的第二內(nèi)分泌療法的治療中受益，其中所述分類基于提高的HoxB13表達水平，和 在用第一內(nèi)分泌療法治療結(jié)束后用第二內(nèi)分泌療法治療患者。
14.權(quán)利要求13的方法，所述方法還包括測定所述樣品中的H:1比率，其中所述比率用于表明提高的HoxB13表達水平。
15.權(quán)利要求13或14的方法，其中所述第一內(nèi)分泌療法為用他莫昔芬治療并且所述第二內(nèi) 分泌療法為用來曲唑治療。
【文檔編號】A61K31/7105GK103998064SQ201180067193
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2011年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2010年12月9日
【發(fā)明者】D.斯格羅瓦, M.G.埃爾蘭德, Y.張, C.A.施納貝爾 申請人:生物診斷治療公司, 綜合醫(yī)院公司