專利名稱：作為預(yù)后和治療靶標(biāo)的乳腺癌中表達(dá)的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌癥的監(jiān)測，預(yù)后和治療方法。具體地，本發(fā)明涉及基因表達(dá)分析的用途，用于檢測乳腺癌對內(nèi)分泌治療的應(yīng)答性和幫助選擇乳腺癌療法或監(jiān)測各種乳腺癌療法的效力。
背景技術(shù)：
乳腺癌是影響美國婦女的最常見的癌癥。僅在美國，每年就診斷約200,000例新的乳腺癌病例，并且大約44,000名婦女將死于該疾病。在婦女的一生期間，乳腺癌將以12.5％(每8名婦女中有1名)的概率發(fā)生，占婦女癌癥病例的32％。它是繼肺癌之后女性癌癥死亡的第二主要原因。男性乳腺癌占所有新病例的約1％，同女性乳腺癌有類似的自然史。盡管現(xiàn)在乳腺癌的發(fā)病率正在緩慢地降低，但是過去幾十年的死亡率卻保持恒定。全世界，每年診斷約1百萬新的乳腺癌病例。一般地，較富裕的西方國家有最高的發(fā)病率，而發(fā)展中國家有最低的發(fā)病率。
盡管乳腺癌的病因仍舊是未知的，但是已經(jīng)鑒定了大量的危險因素。例如隨著年齡的增加，乳腺癌的發(fā)病率顯著地增加；在美國，50％以上患乳腺癌的婦女是60歲以上。其它危險因素是在月經(jīng)初潮時的較小年齡和在絕經(jīng)期時的較大年齡。
最近，發(fā)現(xiàn)推測的腫瘤抑制基因，BRCA-1和BRCA-2中的突變可能是大部分乳腺癌的病因。具有這些突變的婦女常常有陽性家族史，并且在所有乳腺癌患者中有5％觀察到了常染色體顯性遺傳的清晰模式(參見，Cecil，“Textbook of Medicine”，Goldman and Bennett，編輯，Saunders Co.，Philadelphia，PA)。
乳腺癌的治療和最終結(jié)果取決于腫瘤病理學(xué)和治療時癌癥的分期。最常用的分期系統(tǒng)是TNM系統(tǒng)。該系統(tǒng)根據(jù)腫瘤大小、淋巴結(jié)累及程度和轉(zhuǎn)移的存在確定癌癥的狀態(tài)和階段(參見，美國癌癥聯(lián)合委員會AJCCCancer Staging Handbook，Lippincott-Raven，Philadelphia，PA(1998))。檢測時的癌癥階段決定了10年不復(fù)發(fā)的百分率測定結(jié)果。這是通過乳房切除術(shù)或腫塊切除術(shù)除去原始腫瘤后，10年中沒有經(jīng)歷原始癌癥復(fù)發(fā)的患者的百分?jǐn)?shù)。
乳腺癌的癥狀變化很大，并且取決于原發(fā)腫瘤的位置和大小及轉(zhuǎn)移的存在、位置和范圍。然而，可以包括下面的一種或多種癥狀一側(cè)或兩側(cè)可觸知的乳腺腫塊、乳頭溢液、乳房皮膚改變、乳房疼痛。這可能具有也可能不具有天然周期(即伴隨著月經(jīng)期)，血樣或水樣的乳頭溢液、可觸知的腋下腫塊或其它淋巴結(jié)累及跡象。
如果原發(fā)腫瘤已經(jīng)轉(zhuǎn)移，那么可以在身體任何器官系統(tǒng)中出現(xiàn)癥狀。最常見的轉(zhuǎn)移位點(diǎn)是局部區(qū)域的，即胸壁和/或局部淋巴結(jié)(20-40％)、骨(60％)、肺(即惡性滲出液和/或?qū)嵸|(zhì)損害)(15-25)和肝(10-20％)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)、脊髓或其它骨骼轉(zhuǎn)移和柔腦脊膜轉(zhuǎn)移可以引起局部或擴(kuò)散性疼痛，特別是背疼和神經(jīng)學(xué)上的癥狀或功能障礙包括麻木(parathesias)，截癱，感覺弱化或喪失和高鈣血癥。伴隨CNS累及最常見的是癲癇發(fā)作，頭痛，精神狀態(tài)的改變或者甚至是麻痹或中風(fēng)。肝轉(zhuǎn)移可以引起肝功能衰竭，伴有升高的肝功能測定，黃疸和/或其它肝功能障礙跡象。肺的累及可以引起呼吸困難、肺炎或其它呼吸癥狀。因?yàn)槟[瘤細(xì)胞可以在身體的任何組織中侵襲和擴(kuò)增，所以上述癥狀在有或無轉(zhuǎn)移的乳腺癌中均是常見的，但也可能在患乳腺癌的患者中出現(xiàn)差不多所有的癥候群。
在乳腺癌患者中已經(jīng)鑒定了大量預(yù)后因素，包括腫瘤局部侵襲的程度、累及的腋下淋巴結(jié)數(shù)量和腫瘤的大小，并且這些因素包含在上述分期系統(tǒng)中。
然而，乳腺癌中一個重要的預(yù)示性因素是雌激素受體α(ESR1)在腫瘤細(xì)胞表面上的表達(dá)。雌激素受體(ER)是配體驅(qū)使的轉(zhuǎn)錄因子，其調(diào)節(jié)對乳腺癌生長重要的多種基因(包括生長因子、激素和癌基因)的表達(dá)(參見，Gronemeyer，Ann.Rev.Genetics，25卷，89-123頁(1991)；Dickson &Lippman，“The Molecular Basis of Cancer”，Mendelsohn編輯；Howley，Israel & Liotta編輯，358-384頁，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，PA(1994))。ER的表達(dá)在乳腺癌的發(fā)病和維持中起重要作用。乳腺癌患者中約三分之二的腫瘤是ESR1陽性(參見，Lippman等，Cancer，第46卷，2838-2841頁(1980))。大約50％的這些ER陽性腫瘤是雌激素依賴性的，并且對內(nèi)分泌治療產(chǎn)生應(yīng)答(參見，Manni等，Cancer，第46卷，2838-2841頁，(1980)；Jensen，Cancer，47卷，2319-2326頁，(1981))。在絕經(jīng)后婦女中出現(xiàn)的乳腺癌常常是ER陽性的(參見，Iglehart，“Textbook of Surgery”第14版，Sabiston編輯，510-550頁，W.B.Saunders，Philadelphia，PA(1991)。這些腫瘤中的許多腫瘤表達(dá)比正常乳房上皮顯著更多的ER(參見，Ricketts等，Cancer Res.，51卷，1817-1822頁(1991))。
ESR1基因橫跨140Kb，由剪接產(chǎn)生6.3Kb RNA的8個外顯子組成，該RNA編碼分子量為66千道爾頓有595個氨基酸的蛋白質(zhì)(參見，Walter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第82卷，7889-7893頁；和Ponglikitmongkoli等，EMBO J.，7卷，3385-3388頁)。
與原發(fā)損害沒有表達(dá)ER的患者比較，原發(fā)損害表達(dá)ESR1的患者的存活率至少提高5-10％。
此外，十分重要地，原發(fā)損害中ESR1的存在傾向于預(yù)示對內(nèi)分泌治療形式的輔助治療的陽性應(yīng)答。內(nèi)分泌治療的目的是阻止腫瘤細(xì)胞上ER的活化，由此使腫瘤細(xì)胞塊的生長和增生降低或停止。
已經(jīng)利用多種方法阻止乳腺癌患者中ER的活化。最廣泛使用的藥劑是抗雌激素劑如它莫西芬(tamoxifen)，其在惡性細(xì)胞水平抑制雌激素作用。盡管它莫西芬對ER有激動劑和拮抗劑的作用，但是它作為抗雌激素藥物起作用。傳統(tǒng)上，此藥物是晚期乳腺癌患者的首要治療方法。
然而，不幸地，對于晚期ER陽性乳腺癌的患者而言，對它莫西芬的應(yīng)答率僅僅是約50％(參見，Clark等，Semin.Oncol.，15卷，2期，增補(bǔ)1，20-25頁，(1988))。在許多不存在對它莫西芬的應(yīng)答的情況下，看起來腫瘤的生長變得不受雌激素的控制，并且抗雌激素藥物的應(yīng)用將不起作用。然而，意外地，約三分之一它莫西芬抗藥性患者將對內(nèi)源雌激素水平的降低產(chǎn)生應(yīng)答(參見，Dombernowsky等，J.Clin.Oncol.，16920卷，453-461頁，(1998)；和Crump等，Breast Cancer Res.Treat.，44卷，3期，201-210頁，(1997))。在絕經(jīng)后的患者中，用選擇性非類固醇芳香酶抑制劑來曲唑(letrozole)(FemaraTM)可達(dá)到該目的(參見Dombernowsky等，上文)。Femara是一種芳香酶抑制劑，其通過結(jié)合芳香酶并且抑制它將腎上腺雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素起作用。
此外，也利用了通過降低可到達(dá)靶細(xì)胞的雌激素濃度而起臨床作用的其它藥劑。這些藥劑包括孕酮，如甲地孕酮和乙酸甲羥孕酮，LHRH，雄激素和其它芳香酶抑制劑，如阿納托唑(Anastrozole)(參見，Litherland等，Cancer Treatment Reviews，15卷，183-194頁(1988))。
因此，一般地，腫瘤為ER陽性的患者是內(nèi)分泌治療的好的候選者。然而，如上述所討論的，僅僅30-70％ESR1陽性的惡性腫瘤將對內(nèi)分泌治療，例如抗雌激素或雌激素剝奪治療產(chǎn)生應(yīng)答(參見，Clark等，Semin.Oncol.，15卷，20-25頁(1988)；和Lutherland等，Cancer Treatment Reviews，15卷，183-194頁，(1988))?？箖?nèi)分泌治療的ESR1陽性惡性腫瘤的分子基礎(chǔ)還不是很了解。
通過測定雌激素調(diào)節(jié)的基因孕酮受體(PGR)和三葉草因子1(TFF1)，(也稱為PS2)的表達(dá)，已經(jīng)進(jìn)行了增加生物標(biāo)志物對乳腺癌內(nèi)分泌治療的預(yù)示能力的嘗試。這些蛋白質(zhì)之一的存在指示功能性和活化ER的存在，并且這兩種蛋白質(zhì)都是乳腺癌內(nèi)分泌治療的預(yù)示性生物標(biāo)志物。盡管PGR表達(dá)的應(yīng)用提高了單獨(dú)ESR1的預(yù)示性價值，但是在轉(zhuǎn)移情況下，20％的表達(dá)ER和PGR的腫瘤仍舊不能對內(nèi)分泌治療產(chǎn)生應(yīng)答。同樣地，盡管TFF1與好的預(yù)后有關(guān)，并且預(yù)示對激素治療的陽性應(yīng)答，但是還沒有證明其足以作為乳腺癌常規(guī)評估的預(yù)示性生物標(biāo)志物(參見，Ribieras等，Biochem.Biophys.Acta.，F(xiàn)-61-F77卷，1378頁，(1998))。
盡管評估乳腺癌腫瘤細(xì)胞中ER的存在及PGR和TFF1的狀態(tài)的方法，如基于胞質(zhì)的配體結(jié)合測定法或免疫組織化學(xué)(IHC)的應(yīng)用在預(yù)測內(nèi)分泌治療應(yīng)答中是有價值的，但是即使這些蛋白質(zhì)存在，仍有相當(dāng)數(shù)量的患者對內(nèi)分泌治療顯示出原發(fā)或獲得性抗性，并且預(yù)測特定的患者腫瘤是否將對內(nèi)分泌治療產(chǎn)生應(yīng)答的能力仍是薄弱的。
在乳腺癌活檢組織中具有與ESR1類似的表達(dá)模式的基因的鑒定提供了增加ESR1預(yù)示性價值的方法。而且，乳腺癌中涉及的關(guān)鍵分子機(jī)理大部分是未知的。對于用于乳腺癌的激素應(yīng)答的生物標(biāo)志物的開發(fā)、乳腺癌的分子機(jī)理的闡明及可以用于治療乳腺癌患者或者有乳腺癌發(fā)生危險的患者的新治療靶標(biāo)的開發(fā)而言，鑒定乳腺癌細(xì)胞中受ER調(diào)節(jié)或與ER共表達(dá)的基因是極為重要的。
此外，目前鑒定乳腺癌存在的主要方式是對致密腫瘤組織存在的檢測?？梢酝ㄟ^乳房外部的直接檢查或者通過乳房造影術(shù)或其它X射線成像方法完成該檢測，該檢測具有不同的成功程度(參見，Jatoi，Am.J.Surg.，177卷，518-524頁，(1999))。為了確定特定腫瘤是不是ESR1陽性的，有必要獲得用于IHC分析的腫瘤活檢組織樣品。該方法昂貴而且具有侵入性，并且將使患者暴露于并發(fā)癥如感染。非常期望可以在血液上進(jìn)行較少侵入性的診斷分析，因?yàn)椴豢偸强梢缘玫接糜诜治龅哪[瘤組織。
因此，需要更特異和更少侵入性的方法用于檢測患者的腫瘤是否為ESR1陽性的。此外，更需要提供確定特定患者的腫瘤——無論是否存在ER——對內(nèi)分泌治療將如何應(yīng)答的方法。這將使得醫(yī)師能夠作出更明智的有關(guān)治療選擇方案的決定，并且能夠給患者更準(zhǔn)確的預(yù)后。此外，需要用于鑒定如下化合物的方法，該化合物將提高乳腺癌腫瘤對內(nèi)分泌治療的應(yīng)答率。
發(fā)明概述如此后所述，本發(fā)明通過鑒定人乳腺癌細(xì)胞中受ER調(diào)節(jié)或與ER共表達(dá)的大量基因，克服了目前檢測ER陽性乳腺癌的激素應(yīng)答性的可用方法中的缺陷。相應(yīng)于這些基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)有例如作為激素應(yīng)答性的替代標(biāo)志物和作為乳腺癌特異性潛在治療靶標(biāo)的用途。
而且，本發(fā)明鑒定了在對內(nèi)分泌治療(包括用芳香酶抑制劑來曲唑(FemaraTM)治療)產(chǎn)生應(yīng)答和不產(chǎn)生應(yīng)答的乳腺癌腫瘤中差異表達(dá)的基因。
本發(fā)明鑒定了與ESR1表達(dá)相關(guān)的編碼分泌性蛋白質(zhì)的幾種基因，這些分泌性蛋白質(zhì)包括TFF1；三葉草因子3(TFF3)；絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制劑進(jìn)化枝A成員3(SERPINA3)；催乳素誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)(PIP)，基質(zhì)Gla蛋白質(zhì)(MGP)；轉(zhuǎn)化生長因子β的III型受體(TGFRB3)；和含鋅α-2-糖蛋白1(AZGP1)。這些蛋白質(zhì)可以形成基于血清的預(yù)示性生物標(biāo)志物的基礎(chǔ)。表6中列出了在本發(fā)明各種實(shí)施方案中鑒定的所有基因及它們的單基因簇號、基因符號和它們的表達(dá)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)登錄號。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及基因的鑒定，所述基因在乳腺癌細(xì)胞中受ER調(diào)節(jié)或與ER共表達(dá)。原發(fā)性乳腺癌中ESR1的表達(dá)確定了與內(nèi)分泌應(yīng)答、較長的無疾病間隔期和較長的整體存活期有關(guān)的腫瘤表型。在大的乳腺癌樣品中發(fā)現(xiàn)了ESR1基因表達(dá)和18種其它基因表達(dá)之間存在高度的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著相關(guān)性。鑒于乳腺癌細(xì)胞中這些基因與ER基因的共表達(dá)，這些基因和它們的表達(dá)產(chǎn)物可以用于乳腺癌復(fù)發(fā)患者或處在乳腺癌發(fā)病危險中的患者或乳腺癌患者的處理、預(yù)后和治療。表1中顯示了這些基因。用表6中所示的單基因簇登錄號可以得到本申請中公開的這18種基因和所有其它基因的完整序列。
檢測mRNA表達(dá)水平的方法是本領(lǐng)域熟知的，包括但不限于Northern印跡法，反轉(zhuǎn)錄PCR，實(shí)時定量PCR和其它雜交方法。
對于檢測獲自大量公開基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的水平，一個特別有用的方法涉及用標(biāo)記mRNA與寡核苷酸有序陣列雜交。這種方法允許同時檢測這多種基因的轉(zhuǎn)錄水平以產(chǎn)生基因表達(dá)譜或模式。在另一個實(shí)施方案中，來源于對象的樣品的基因表達(dá)譜可以與來源于無該疾病的個體的樣品的基因表達(dá)譜比較，由此確定是否所述對象患有或有危險患有乳腺癌。
ER基因調(diào)節(jié)和這18種基因調(diào)節(jié)間的強(qiáng)相關(guān)性支持了這些基因與ER基因共調(diào)節(jié)且因此是功能性ER轉(zhuǎn)錄體(transcriptosome)的生物標(biāo)志物的這一假說。表1中列出的基因中有10種基因(基因號8-17)已經(jīng)被證實(shí)與ER基因相關(guān)或被雌激素直接調(diào)節(jié)。表1中所示的前7種基因(基因號1-7，即非電壓門控鈉通道1α(SCNN1A)；SERPINA3；N-?；拾贝减０匪饷?ASAH)；lipocalin 1(LCN1)；TGFBR3；谷氨酸受體前體2(GRIA2)和細(xì)胞色素P450的IIB亞族(苯巴比妥誘導(dǎo)的CYP2B))以前從沒有被證實(shí)與乳腺癌中ER的表達(dá)相關(guān)。
因此，本發(fā)明提供了在大乳腺癌樣品中多種與ER一起調(diào)節(jié)的基因?？梢匀我膺x擇這些基因中的至少一個作為替代ER的標(biāo)志物。在特別有用的實(shí)施方案中，可以選擇這些基因中的多種，并且同時監(jiān)測它們的mRNA表達(dá)以提供用在各個方面中的表達(dá)譜。
在另一實(shí)施方案中，可以在各種體液，包括但不限于血液、血漿、血清、淋巴、CSF、膽囊液體、腹水、尿、糞便和膽汁中監(jiān)測基因表達(dá)產(chǎn)物(蛋白質(zhì))的水平。該表達(dá)產(chǎn)物水平可以用作腫瘤細(xì)胞上存在ER的代替標(biāo)志物，并且可以提供患者腫瘤的內(nèi)分泌治療應(yīng)答的指數(shù)。
此外，這些基因中一種或多種基因的表達(dá)譜可以提供有價值的分子工具，用于檢測乳腺癌中內(nèi)分泌應(yīng)答的分子基礎(chǔ)和用于評估藥物的乳腺癌治療效力。當(dāng)細(xì)胞暴露于各種修飾條件，如與藥物或其它活性分子接觸時，表達(dá)譜相對于基線譜的改變可以用于指示這些效果。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明鑒定在對內(nèi)分泌治療產(chǎn)生和不產(chǎn)生應(yīng)答的乳腺癌腫瘤中以不同水平表達(dá)的基因。由于這些基因的差異表達(dá)，可以利用這些基因和/或它們的表達(dá)產(chǎn)物以增加有關(guān)特定患者乳腺腫瘤是否將對內(nèi)分泌治療作出有利應(yīng)答的預(yù)測的確定性。這些基因是神經(jīng)腫瘤腹側(cè)抗原1(neuro-oncological ventral antigenl，NOVA1)和免疫球蛋白重鏈γ3恒定區(qū)(IGHG3)，在表2中列出了這些基因。通過測定基因表達(dá)所對應(yīng)的mRNA或基因編碼的蛋白質(zhì)可以檢測這些公開基因的表達(dá)水平?？梢栽谌魏畏奖愕捏w液，包括但不限于血液、血漿、血清、淋巴、CSF、膽囊液體、腹水、尿、糞便和膽汁中測定蛋白質(zhì)。
因此，本發(fā)明提供了用于確定特定乳腺癌樣品的細(xì)胞是否有內(nèi)分泌應(yīng)答表型的方法。此處所用術(shù)語“內(nèi)分泌應(yīng)答的”意指通過如下治療可以減緩或阻止乳腺腫瘤或癌的生長或增生，該治療在腫瘤細(xì)胞上引起改變的，即增加的或降低的ER活化作用。
此處所用術(shù)語“內(nèi)分泌治療”意指作為其臨床效果的主要方面可以直接或間接地造成腫瘤細(xì)胞上ER活化的增加或降低的任何類型的治療。因此，術(shù)語內(nèi)分泌治療包括但不限于封閉ER的藥物和作為ER的混合激動劑-拮抗劑的藥物及降低內(nèi)源雌激素濃度的治療，包括但不限于，例如芳香酶抑制劑、孕酮和LHRH。
因此，本發(fā)明提供了篩選乳腺癌患者以確定患者乳腺腫瘤對內(nèi)分泌治療產(chǎn)生應(yīng)答的可能性的方法、在治療乳腺癌患者中有用的藥劑的鑒定方法、監(jiān)測特定藥物的乳腺癌治療效力的方法和在乳腺癌腫瘤細(xì)胞中特異復(fù)制的載體。
用在來曲唑(FEMARATM)對它莫西芬比較研究中的客觀應(yīng)答的定義可測量的疾病1.完全應(yīng)答(CR)通過不少于4周間隔的2次觀察確定的所有已知疾病的消失。
2.部分應(yīng)答(PR)為確定治療的效力，通過不少于4周間隔的2次觀察測量到的50％或以上總腫瘤損傷尺寸的減小。此外，不能出現(xiàn)新的損傷或任何損傷進(jìn)展。
3.沒有變化(NC)既不能確定為50％總腫瘤尺寸的減小，也沒有顯示一個或多個可測量損傷的尺寸有25％的增加。
4.進(jìn)行性疾病(PD)一個或多個可測量損傷的尺寸有25％或以上的增加或出現(xiàn)新的損傷。
臨床應(yīng)答評估主要的療效變量是利用世界衛(wèi)生組織(WHO)標(biāo)準(zhǔn)(參見，報(bào)道癌癥治療結(jié)果的WHO手冊(WHO Handbook for Reporting Results of CancerTreatment))，通過臨床檢查評估的腫瘤應(yīng)答。將其定義為每個治療組中具有CR或PR的患者的百分率，其中在4個月時通過胸部觸診臨床確定CR和PR?？赡艿膽?yīng)答是CR，PR，NC，PD或不可評估/不可估測(NA/NE)?？捎|知的同側(cè)腋下淋巴結(jié)累及降低臨床CR的腫瘤等級。此外，還考慮了其它因素，如經(jīng)歷乳房保存手術(shù)(象限切除術(shù)/腫塊切除術(shù))而不是乳房切除術(shù)的患者的百分率。把變得不能手術(shù)的患者或者在4個月時依然不能手術(shù)的患者算作治療失敗。
用于檢測乳腺癌中與ESR1共調(diào)節(jié)的基因的方法材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)在加有0.03mg/mL內(nèi)皮細(xì)胞生長補(bǔ)料(ECGS)，0.1mg/mL肝素和1xPen/Strep的DMEM/F-12中生長U373細(xì)胞(ATCC，Rockville，MD)。細(xì)胞生長到約40％鋪滿，然后用培養(yǎng)液洗一次。然后用培養(yǎng)基或培養(yǎng)基+PDGF20ng/mL培養(yǎng)細(xì)胞48小時。在具有5％FBS，0.03mg/mLECGS，0.1mg/mL肝素和1x Pen/Strep的F-12培養(yǎng)基中生長人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC(ATCC，Rockville，MD)到約40％鋪滿，然后用培養(yǎng)液洗一次。在培養(yǎng)基或培養(yǎng)基+VEGF 50ng/mL中生長細(xì)胞48小時。在MEM+2mM L-谷氨酰胺，0.1mM NEAA，1mM丙酮酸鈉，0.1mM牛胰島素，10％BSA中生長乳腺癌細(xì)胞系MCF7(ATCC，Rockville，MD)到80％鋪滿。用冰冷卻的PBS洗所有的細(xì)胞培養(yǎng)物2次，然后從培養(yǎng)皿刮下，在冷卻的PBS中沉淀，在液氮中快速冷凍。
樣品制備從14號針芯活檢組織提取21個RNA樣品，其中在新的輔助內(nèi)分泌治療開始前，從參加隨機(jī)III期來曲唑(FEMARATM，Novartis Pharma，BasalSwitzerland)對它莫西芬試驗(yàn)的患者收集所述活檢組織，其中所述試驗(yàn)針對患有不適于乳房保存手術(shù)的原發(fā)侵襲性乳腺癌的絕經(jīng)后婦女。
利用Trizol(Life Technologies，Gaithersburg，MD)從另外30個瑞典收集的原發(fā)性乳腺癌、1個另外的ESR1+乳腺腫瘤外科手術(shù)活檢組織、2個HUVEC樣品、2個來自成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系U373-MG的樣品和一個MCF7樣品中提取RNA。根據(jù)當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會批準(zhǔn)的協(xié)議獲得知情同意后，收集臨床樣品。購買2個RNA樣品，一個為浸潤III期導(dǎo)管癌(Ambion，Austin，TX)，另一個為2個正常乳腺組織的混和物(Clontech，Palo Alto，CA)。制備的樣品總數(shù)是59個，包括53個乳腺癌活檢組織和1個混合的正常乳腺樣品。如Lockhart等，Nat.Biotechnol.，14卷，1675-1680頁(1996)所述，總RNA用QIAGEN RNEASYTM柱(Qiagen，Valencia，CA)純化，處理后與HUGENETMFL 6800陣列(Affymetrix，Santa Clara，CA)雜交。
層級聚類由于計(jì)算限制，將HuGeneFL 6800陣列的1,156個基因的子集輸入用于聚類。該子集由GENECHIP軟件(Affymetrix，Santa Clara，CA)認(rèn)可(call)存在的基因組成，這些基因存在于59個樣品之至少一個中并且有20倍的表達(dá)差異，即在正常的混合乳腺組織樣品和這59個樣品之至少一個之間的平均差異(AvDif)。該基因子集在理想情況下代表了在正常和腫瘤間有一些差異水平的那些基因。該子集排除了那些在任何樣品中均無表達(dá)或未在至少一個樣品中有顯著變化的基因。利用GENESPRINGTM3.2.8(Silicon Genetics，Redwood City，CA)，用基因表達(dá)值對基因和樣品進(jìn)行聚類，其中跨樣品對每個基因的平均差異測量值進(jìn)行歸一化以使中值為一。通過標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)性測定基因表達(dá)相似性，最小距離為0.001且分離率為0.5。從所獲含有ESR1基因的樹形圖的分枝匯編了與ESR1共聚類的基因的列表。
結(jié)果實(shí)驗(yàn)樣品樹沒有或具有很低ESR1表達(dá)的樣品主要簇集在樹形圖近一端，具有高ESR1表達(dá)的樣品簇集在另一端，但沒有描繪這兩個樣品類的清晰分枝(圖2)。ESR1的AvDif值的范圍從-24.08到3501.6，正常乳腺顯示值為124。正常乳腺樣品簇集在對于本文報(bào)道的18種基因而言通常具有低表達(dá)的樣品和具有高表達(dá)的樣品的邊界上。圖2中，簇集在正常乳腺上的所有樣品的ESR1 AvDif的平均值是66.37，標(biāo)準(zhǔn)差是163.54。簇集在正常乳腺樣品以下的所有樣品的ESR1 AvDif的平均值是1440，標(biāo)準(zhǔn)差是936。
內(nèi)皮和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞培養(yǎng)樣品與它們各自的細(xì)胞類型簇集在不同于腫瘤活檢組織的分枝中。內(nèi)皮和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤分枝位于具有低ESR1表達(dá)的樹形圖的末端。在聚類分析中包含細(xì)胞系，以便通過提供可以存在于乳腺腫瘤中的細(xì)胞類型如內(nèi)皮和上皮細(xì)胞以及明顯不同的細(xì)胞類型如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤以提高基因的聚類。
與ESR1共聚類的基因18種基因與ESR1共聚類(表1)。這些基因具有在ESR1陽性樣品中高表達(dá)而在ESR1陰性樣品中低表達(dá)的獨(dú)特模式(圖2)。與ESR1共聚類的7種基因，即SCNN1A、SERPINA3、ASAH、LCN1、TGFBR3、GRIA2和CYP2B(表1)，以前從未曾與雌激素刺激或乳腺癌聯(lián)系在一起。
與ESR1共聚類的6種基因以前被認(rèn)為是雌激素調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)，作為乳腺癌的預(yù)測或預(yù)后生物標(biāo)志物，這6種基因即癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞粘附分子5(CEACAM5)、LIV-1蛋白質(zhì)(LIV-1)、PIP、MGP、TFF3和TFF1(也稱為PS2)(參見表1)。
CEACAM5是被報(bào)道在10-95％乳腺癌中表達(dá)的免疫反應(yīng)性糖蛋白。在對298例乳房組織樣品的研究中，發(fā)現(xiàn)ESR1陽性/PGR-陽性腫瘤中CEACAM5蛋白質(zhì)水平最高(參見，Molina等，Anticancer Res.，19卷，2557-2562頁(1999))。除了與ESR1表達(dá)相關(guān)外，在Zach等，J.Clin Oncol，17卷，2015-2019頁(1999)的報(bào)道中指出CEACAM5與乳腺珠蛋白(mammaglobin)1(MGB1)表達(dá)相關(guān)。同一報(bào)告中還指出MGB1水平與ER水平相關(guān)，這支持了基因聚類結(jié)果。
LIV-1是文獻(xiàn)詳細(xì)記載的ER基因。通過ESR1依賴性機(jī)制，表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子α(TGFα)和胰島素生長因子1(IGF1)誘導(dǎo)LIV-1(參見，EI-Tanani等，J.Steroid Biochem.Mol.Biol.，60卷，269-276頁，(1997))。
PIP，或者稱為總囊性疾病液體蛋白質(zhì)15(gross cystic disease fluidprotein 15)，其被催乳素和雄激素誘導(dǎo)。PIP表達(dá)水平與ESR-1和PGR-陽性狀態(tài)相關(guān)(參見，Clark等，Br.J.Cancer，81卷，1002-1008頁(1999))。
MGP屬于骨鈣蛋白/基質(zhì)gla蛋白質(zhì)家族，與骨骼和軟骨的有機(jī)基質(zhì)有關(guān)，并被認(rèn)為作為骨骼形成的抑制劑起作用。雌激素是MGP基因表達(dá)的強(qiáng)誘導(dǎo)物。
雌激素也強(qiáng)烈地誘導(dǎo)TTF1和TTF3。三葉草因子是在胃腸粘膜中表達(dá)的穩(wěn)定分泌性蛋白質(zhì)。它們可以起到保護(hù)粘膜上皮免受損害和幫助治愈的作用。TFF3可以是乳腺癌內(nèi)分泌治療的預(yù)測性生物標(biāo)志物。它在雌激素應(yīng)答的而不在雌激素不應(yīng)答的乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)，并且其可以通過控制APC和E-鈣粘著蛋白—連環(huán)蛋白復(fù)合物的表達(dá)而起到促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用(參見，Efstathiou等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95卷，3122-3127頁(1998))。如前面所討論的，TFF1是建立良好的內(nèi)分泌治療應(yīng)答的預(yù)測性生物標(biāo)志物，并且據(jù)報(bào)道，通過雌二醇而不是孕酮、地塞米松或雙氫睪酮可以增加TFF1 mRNA的水平(參見，Prud′homme等，DNA，4卷，11-21頁(1985))。而且，據(jù)報(bào)道，它莫西芬抑制TFF1的雌二醇誘導(dǎo)(參見，Prud′homme，上述引文)。
與ESR1共聚類的另一個基因，即肝細(xì)胞核因子3α(HNF3A)活化TFF1(參見，Beck等，DNA Cell Biol.，18卷，157-164頁(1999))。以前證明在65個乳腺腫瘤的表達(dá)譜中HNF3A與ESR1共聚類(Perou等，Nature，406卷，747-752頁(2000))。在上文Perou等的報(bào)道中，表1列出的3個另外基因也與ESR1共聚類LIV-1；hepsin(HPN)跨膜蛋白酶，其在細(xì)胞生長和細(xì)胞形態(tài)學(xué)維持中有根本作用；X盒子結(jié)合蛋白質(zhì)1(XBP1)，其結(jié)合HLA-DR-α啟動子，并且可以在B細(xì)胞中作為轉(zhuǎn)錄因子(參見，Liou等，Science，247卷，1581-1584頁(1990))。
AZGP1在與ESR1共聚類的基因中是獨(dú)特的，因?yàn)樗郧拔丛c內(nèi)分泌應(yīng)答有聯(lián)系而被認(rèn)為是乳腺癌分化的生物化學(xué)標(biāo)志物(參見，Diez-ltza等，Eur.J.Cancer，29A卷，1256-1260頁(1993))。AZGP1是刺激脂肪細(xì)胞中脂質(zhì)降解的分泌性蛋白質(zhì)，其可以促使晚期癌癥患者中脂肪大量的損失。其與I類MHC抗原α鏈的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域有高度相似性。
在mRNA水平上對基因表達(dá)的整體分析是研究復(fù)雜生物學(xué)問題如乳腺癌的強(qiáng)有力工具。這里，利用標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)性算法對表達(dá)陣列數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，從而能夠鑒定到與ESR1共調(diào)節(jié)的基因。發(fā)現(xiàn)了18種基因，包括已知的受ESR1調(diào)節(jié)或與乳腺癌腫瘤發(fā)生相關(guān)的11種基因。有趣地，這里描述的ESR1分枝中存在的4種基因，即LIV1、HPN、XBP1和HNF3A被鑒定腔上皮ESR1基因簇的成員，參見Perou等(Nature，406卷，747-752頁(2000))所述。在Bertucci等(Hum.Mol.Genet.，9卷，2981-2991頁，(2000))的第三份乳腺腫瘤基因表達(dá)譜的報(bào)道中XBP1也與ESR1狀態(tài)有關(guān)。HPN、HNF3A和XBP1與ESR1的共聚類表明這些基因象LIV1一樣被雌激素調(diào)節(jié)，并且應(yīng)該被認(rèn)為是完整ER信號途徑的可能標(biāo)志物。
這是ER和下面7種基因間相關(guān)性的首次報(bào)道SCNN1A、SERPINA3、ASAH、LCN1、TGFBR3、GRIA2和CYP2B?；騎GFBR3和LCN1參與細(xì)胞分化和增生，并且它們在特定細(xì)胞系——起源上亦是ESR1樣性的細(xì)胞系——中的下調(diào)能引起腫瘤發(fā)生和ESR1與這些基因的共聚類(參見，Bratt，Biochim.Biophys.Acta.，1482卷，318-326頁(2000))。
表1顯示在53個乳腺腫瘤活檢組織、1個正常乳腺和5個細(xì)胞系樣品中1126個基因的層級聚類中與ESR1共聚類的基因。針對每個基因所顯示的GenBank登錄號是序列的登錄號，從此序列可獲得用在Affymetrix基因芯片上的25mer探針用于該基因的檢測。用+表示以前已證實(shí)具有與ER陽性相關(guān)的表達(dá)的基因。
表1與ESR1共聚類的基因基因 GenBank登錄號 已知的與ESR1的相關(guān)性1. SCNN1A X76180-2. SERPINA3 X68733-3. ASAH U70063-4. LCN1 L14927-5. TGFBR3 L07594-6. GRIA2L20814-7. CYP2BM29874-8. CEACAM5 M29540+9. MGB1 U33147+10. LIV1 U41060+11. PIP HG1763+12. MGP X53331+13. TFF3 L08044+14. TFF1 X52003+15. HNF3AU39840+16. HPN X07732+17. XBP1 M31627+18. AZGP1X59766-19. ESR1 X03635+治療前活檢組織中內(nèi)分泌應(yīng)答的預(yù)測性標(biāo)志物在本發(fā)明另一個方面中，從53例患者獲得了136個乳腺活檢組織。從116個活檢組織提取RNA。對來自35例患者的43個活檢組織制備了表達(dá)譜。鑒定了乳腺腫瘤中內(nèi)分泌治療應(yīng)答的預(yù)測性標(biāo)志物。將來源于來曲唑(FEMARATM)治療前的制備了表達(dá)譜的活檢組織和患者的臨床結(jié)果細(xì)分如下4例患者有CR，9例患者有PR，4例患者有NC及4位患者有PD。
對于用它莫西芬治療的組，沒有患者在CR分類中，10例患者有PR，7例患者有NC，4例患者有PD。
具有CR或PR的患者歸類為“應(yīng)答者”，具有NC或PD的患者歸類為“非應(yīng)答者”。在來自接受來曲唑(FEMARATM)給藥的患者的治療前活檢組織中比較8,000個基因在這兩組間的表達(dá)。數(shù)值(AvDiff)表示在特定樣品中基因的表達(dá)水平。因?yàn)橛?jì)算的原因，相對于所有應(yīng)答者，計(jì)算陣列上每個基因的AvDiff值的平均值。然后，將這些平均值和非應(yīng)答者組中每個單獨(dú)樣品的每個基因作比較。鑒定到兩個在應(yīng)答者的平均值和每個非應(yīng)答者樣品間有3倍或更高的表達(dá)差異的基因，即NOVA1和IGHG3，它們在表2和6中列出。表2也包括僅供參考的V5活檢組織(治療后)數(shù)據(jù)。
與FEMARATM治療期間有NC或PD的婦女的活檢組織比較，發(fā)現(xiàn)這兩個基因IGHG3和NOVA1在隨后最終對FEMARATM治療呈陽性應(yīng)答的婦女的治療前腫瘤中以較高水平表達(dá)。使用Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)，對于基因NOVA1，兩組(包括V5樣品)間中值的差異比由概率(P＝0.012)所預(yù)期的值大。對于IGHG3基因，該數(shù)據(jù)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性。這些基因(IGHG3和NOVA1)在來自它莫西芬治療患者的活檢組織中沒有差異表達(dá)，因此不能提供標(biāo)志物以指示是否可對它莫西芬產(chǎn)生有利應(yīng)答。
為了唯一地確定NOVA1基因，可以利用下面的標(biāo)志NOVA1(單基因ID Hs.214)位于染色體14q上，由mRNA登錄號NM_002515及蛋白質(zhì)登錄號NP_002506標(biāo)識。
對于IGHG3基因(Hs.300697)，該基因也位于染色體14q上，由mRNA登錄號BC016381標(biāo)識。沒有蛋白質(zhì)登錄號。
基因IGHG3和NOVA1存在幾種生物學(xué)特征，這些生物學(xué)特征使得這些基因適于用作診斷標(biāo)志物和/或治療靶標(biāo)。IGHG3與重鏈疾病(HCD)有關(guān)。HCD是天然發(fā)生的淋巴增生性疾病，其中在血清或尿中存在單克隆Ig重鏈(H)可變片段。NOVA1是具有嚴(yán)格調(diào)節(jié)的表達(dá)的核RNA結(jié)合蛋白質(zhì)，在發(fā)育的小鼠中，該蛋白質(zhì)限于CNS的神經(jīng)元中。在具腫瘤形成征兆的視性眼陣攣-共濟(jì)失調(diào)(POA)患者中觀察到了抗該抗原的抗體。POA是自身免疫疾病，在該病中患乳腺癌或小細(xì)胞肺癌的婦女發(fā)生眼睛、軀干和四肢的異常運(yùn)動控制。在該疾病中乳腺腫瘤異常地表達(dá)NOVA1基因。這引起攻擊天然表達(dá)NOVA1的CNS的免疫應(yīng)答。與NOVA1融合蛋白質(zhì)的血清反應(yīng)被用于POA的診斷，并且表明存在隱性乳腺、婦科或肺腫瘤。
表2與非應(yīng)答者比較，應(yīng)答患者治療前(FEMARATM)乳腺活檢組織中具有可變表達(dá)的基因

PG樣品號＝獨(dú)特的患者標(biāo)識符V0＝第一次調(diào)查取樣的活檢組織(治療前)V5＝第五次調(diào)查(治療后)▲＝基于基因表達(dá)譜和ICH發(fā)現(xiàn)存在ER數(shù)值(AvDiff)＝特定樣品中該基因的表達(dá)水平絕對認(rèn)可(AbsCall)＝由Affymetrix軟件確定樣品中基因是否表達(dá)，并用A(缺乏)；M(臨界)；或P(存在)表示。
來自治療后活檢組織的預(yù)測性標(biāo)志物在本發(fā)明的另一方面，鑒定了來自治療后患者的應(yīng)答標(biāo)志。為此目的，將來自來曲唑(FEMARATM)治療患者的活檢組織，來自V5的樣品，即治療后的活檢組織分為兩個種類——應(yīng)答者和非應(yīng)答者。來自具有CR或PR的患者的活檢組織被作為應(yīng)答者，來自具有NC或PD的患者的活檢組織被劃為非應(yīng)答者。因?yàn)橛?jì)算的原因，針對V5應(yīng)答者，計(jì)算陣列上每個基因的AvgDiff值的平均值。然后，將這些平均值和非應(yīng)答者組中每個單獨(dú)樣品的每個基因作比較。鑒定到由8組探針代表的7種基因在應(yīng)答者的平均值和非應(yīng)答者組的每個樣品間有多于3倍的表達(dá)差異(表3)。表3也包括僅供參考的來自治療前活檢組織V0的數(shù)據(jù)。用于β-血紅蛋白的兩組不同探針表明，對FEMARATM應(yīng)答的患者的活檢組織與非應(yīng)答者的活檢組織比較有較高的該基因表達(dá)。有趣地，鑒定的2個基因，即HPN和PIP在通過基因表達(dá)進(jìn)行的ER陽性和ER陰性活檢組織的2維層級聚類中與ESR1共聚類。使用Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)，對于HPN(P＝0.046)和乳運(yùn)鐵蛋白(P＝＜0.001)，在應(yīng)答者和非應(yīng)答者間中值有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。為了進(jìn)行Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)，利用了所有活檢組織數(shù)據(jù)，包括V0和V5活檢組織。
標(biāo)志物列表包括HPN和PIP。在層級聚類分析中也發(fā)現(xiàn)這些基因與ESR1共聚類。根據(jù)兩個獨(dú)立的分析，應(yīng)該認(rèn)為HPN和PIP是可以用于預(yù)測對來曲唑(FEMARATM)的應(yīng)答性的功能ER轉(zhuǎn)錄體的生物標(biāo)志物。
如Kazama(J.Biol.Chem.，270卷，66-72頁，(1995))所述，HPN是II類膜相關(guān)絲氨酸蛋白酶，已證實(shí)其激活人因子VII，并且在細(xì)胞表面上啟動血液凝固途徑而導(dǎo)致形成凝血酶。如Torres-Rosada等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90卷，7181-7185頁(1993))所述，據(jù)認(rèn)為大量贅生性細(xì)胞可以通過這個和其它途徑激活血液凝固系統(tǒng)，引起血凝過快和血管內(nèi)血栓形成，并且hepsin在它們的細(xì)胞生長中起作用。如Tsuji等，J.Biol.Chem.，266卷，16948-16953頁(1991)所述，HPN基因的表達(dá)是高度受限的；即該基因除了在肝中高水平表達(dá)和在腎中中等水平表達(dá)外，在大多數(shù)身體組織中為低水平表達(dá)。
已經(jīng)報(bào)道在幾種癌細(xì)胞系和卵巢癌(最近報(bào)道的，參見例如Tanimoto等，Cancer Res.，57卷，2884-2887頁(1997))中高水平表達(dá)HPN。此外，盡管在肝中HPN高表達(dá)，但是HPN基因的兩個拷貝都被破壞的敲除小鼠沒有顯示肝異常和功能障礙。例如WU等，J.Clin.Invest.，101卷，321-6頁(1998)中所述，實(shí)際上，這些小鼠并未顯示任何可辨別的表現(xiàn)型。例如上述引文Torres-Rosada等所述，已證實(shí)靶向HPN細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的抗體可阻滯過度表達(dá)HPN的肝癌細(xì)胞的生長。
鑒定到兩個用于β血紅蛋白的探針。這表明在治療后(V5)腫瘤中β血紅蛋白在應(yīng)答者中比在非應(yīng)答者中表達(dá)水平更高。與血管形成較差的腫瘤比較，來曲唑(FEMARATM)可能更成功地靶向血管形成良好的乳腺腫瘤，并且β血紅蛋白表達(dá)水平與這些活檢組織中血管形成的程度相關(guān)。乳運(yùn)鐵蛋白(LTF)也包括在潛在標(biāo)志物列表中。LTF是在奶中表達(dá)的鐵結(jié)合蛋白質(zhì)，其也在嗜中性粒細(xì)胞的次級顆粒中表達(dá)。LTF參與鐵的運(yùn)輸貯藏和螯合以及宿主防御機(jī)制。據(jù)報(bào)道，在測定的約50％乳腺腫瘤中缺乏LTF(參見，Perou等，Nature，406卷，747-752頁，(2000))。
表3與對FEMARATM治療產(chǎn)生陰性應(yīng)答的患者相比，在腫瘤對FEMARATM陽性應(yīng)答的患者中發(fā)現(xiàn)的以較高水平表達(dá)的基因

表4與對FEMARATM治療產(chǎn)生陰性應(yīng)答的患者相比，在腫瘤對FEMARATM陽性應(yīng)答的患者中發(fā)現(xiàn)的以較低水平表達(dá)的基因

因此，可以通過任何可靠的方法，包括但不限于這里公開的方法，在應(yīng)答Femara的患者中和對Femara不產(chǎn)生應(yīng)答的患者中測定這些基因或它們的基因產(chǎn)物的絕對表達(dá)水平，然后對該結(jié)果和在未知個體中同樣基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)水平進(jìn)行比較以確定未知腫瘤是否將對內(nèi)分泌治療(包括來曲唑(FEMARATM)治療)產(chǎn)生應(yīng)答。
表5與非應(yīng)答者比較，在FEMARATM應(yīng)答者的乳腺活檢組織中有可變表達(dá)的基因

表6除了IGHG3和PIP之外(只得到Mrna序列)，針對本申請中公開的所有基因的完整基因組序列的單基因簇號該表也有HUGO基因符號和該基因表達(dá)的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)登錄號GenBanK登錄號 蛋白質(zhì)基因 (用于設(shè)計(jì) 單基因簇號 基因符號Affymetrix探針) 登錄號非電壓門控鈉通道1α X76180Hs.2794 SCNN1A prf2015190A絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制劑成員3X68733Hs.234726SERPINANA3N-?；拾贝减０?U70063Hs.75811 ASAH spQ13510水解酶(酸性神經(jīng)酰胺酶)Lipocalinl L14927Hs.2099 LCN1 prf1908211A轉(zhuǎn)化生長因子β的III型受體L07594Hs.79059 TGFBR3 spQ03167谷氨酸受體前體2 L20814Hs.89582 GRIA2 pir158181苯巴比妥誘導(dǎo)的細(xì)胞色素P450-IIB M29874Hs.1360 CYP2B pirA32969癌胚抗原mRNA M29540Hs.220529CEACAM5pirA36319乳腺珠蛋白1 U33147Hs.46452 MGB1 spQ13296-雌激素調(diào)節(jié)的LIV-1蛋白質(zhì) U41060Hs.79136 LIV-1 pirG02273催乳素誘導(dǎo)的蛋白質(zhì) HG1763Hs.99949 PIPpirSQHUAC基質(zhì)Gla蛋白質(zhì)X53331Hs.279009MGPpirGEHUM三葉草因子3 L08044Hs.82961 TFF3 spQ07654三葉草因子1 X52003Hs.1406 TFF1 pirA26667肝細(xì)胞核因子3α U39840Hs.299867HNF3A pirS70357絲氨酸蛋白酶hepsin X07732Hs.823 HPNpirS00845X盒結(jié)合蛋白質(zhì)1 M31627Hs.149923XBP1 spP17861Zn-α2-糖蛋白X59766Hs.71AZGP1 pdb1ZAG雌激素受體αX03635Hs.1657 ESR1 pirS64737X盒結(jié)合蛋白質(zhì)1 M31627Hs.149923XBP1 spP17861神經(jīng)-腫瘤腹側(cè)抗原1 U04840Hs.214 NOVA1 pir138489免疫球蛋白γ3重鏈恒定區(qū)(G3m標(biāo)志物) M87789Hs.300697IGHG3 NAβ血紅蛋白 M25079Hs.155376HBBprf1701384A離子型谷氨酸受體 L20814Hs.89582 GRIA2 pir158181乳運(yùn)鐵蛋白 X53961Hs.105938LTFpirTFHUL山梨醇脫氫酶 L29008Hs.878 SORD spQ00796腫瘤差異表達(dá)的d1 U49188Hs.272168TDE1 NA
藥物基因組學(xué)藥物遺傳學(xué)/基因組學(xué)確定參與對外來化合物或藥物的個體應(yīng)答的遺傳/基因組因子。可以將對本發(fā)明標(biāo)志物表達(dá)有刺激或抑制作用的藥劑或調(diào)節(jié)劑給予個體以預(yù)防或治療患者乳腺癌。必須將這種治療和個體的藥物基因組學(xué)一起考慮。治療劑的新陳代謝差異通過改變藥理活性藥物的劑量和血液濃度間的關(guān)系可能引起嚴(yán)重毒性和治療失敗。因此，了解個體的藥物基因組學(xué)有助于有效的篩選預(yù)防性或治療性藥劑(例如藥物)。進(jìn)一步可以利用這種藥物基因組學(xué)確定適合的劑量和治療方案。因此，可以測定個體中本發(fā)明標(biāo)志物的表達(dá)水平以篩選用于個體治療或預(yù)防的適合的藥劑。
藥物基因組學(xué)研究由于個體中藥物處置和作用的不同而造成的藥物效力或毒性的臨床顯著變化(參見，例如.Linder，Clin.Chem.，43卷，2號，254-266頁(1997))。一般地，可以分為兩種類型的藥物遺傳條件。改變藥物對身體的作用方式的、作為單因子遺傳的遺傳條件稱為“改變的藥物作用”。改變身體對藥物的作用方式的、作為單因子遺傳的遺傳條件稱為“改變的藥物代謝”。這些藥物遺傳條件可以作為罕見的缺陷或者常見的多態(tài)性出現(xiàn)。例如，6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PD)缺陷是常見的遺傳性酶病，其中主要的臨床并發(fā)癥是攝入氧化劑藥物(抗瘧疾藥，磺胺，止痛藥，硝基呋喃)后和食用蠶豆后出現(xiàn)溶血。
作為一個示例性實(shí)施方案，藥物代謝酶的活性是藥物作用強(qiáng)度和持繼時間的主要決定因素。藥物代謝酶(例如，N-乙酰轉(zhuǎn)移酶2(NAT2)和細(xì)胞色素P450酶CYP2D6和CYP2C19)的遺傳多態(tài)性的發(fā)現(xiàn)解釋了為什么一些患者在服用標(biāo)準(zhǔn)安全劑量的藥物后沒有獲得期望的藥物效果或顯示過大的藥物反應(yīng)和嚴(yán)重中毒。
這些多態(tài)性在人群中以兩種表現(xiàn)型表達(dá)強(qiáng)代謝者(EM)和弱代謝者(PM)。不同種群中PM的流行程度不同。例如，編碼CYP2D6的基因是高度多態(tài)性的，并且在PM中已經(jīng)鑒定了幾種突變，所有的這些突變都導(dǎo)致了功能性CYP2D6的缺乏。當(dāng)CYP2D6和CYP2C19的弱代謝者接受標(biāo)準(zhǔn)劑量時，他們經(jīng)常經(jīng)受過大的藥物反應(yīng)和副作用。正如由CYP2D6形成的可待因代謝物嗎啡介導(dǎo)的止痛作用所證明的，如果代謝物是活性治療部分，PM將顯示沒有治療應(yīng)答。其它的極端情況是不對標(biāo)準(zhǔn)劑量應(yīng)答的所謂超快速代謝者。最近，鑒定了超快速代謝的分子基礎(chǔ)由于CYP2D6基因擴(kuò)增所致。
因此，可以測定個體中本發(fā)明標(biāo)志物的表達(dá)水平或功能水平以選擇用于個體治療或預(yù)防的適合的藥劑。此外，藥物遺傳學(xué)研究可以用于對編碼藥物代謝酶或藥物靶的多態(tài)等位基因進(jìn)行基因分型以預(yù)測個體的藥物應(yīng)答表現(xiàn)型。當(dāng)這種知識應(yīng)用于給藥和藥物篩選時，用本發(fā)明標(biāo)志物的表達(dá)調(diào)節(jié)劑治療患者可以避免不良反應(yīng)或治療失敗，由此增強(qiáng)治療或預(yù)防的效率。
蛋白質(zhì)組學(xué)可以分析培養(yǎng)的正常細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)以鑒定可能由癌細(xì)胞分泌進(jìn)入體液的并且在本發(fā)明方法中可能有價值的蛋白質(zhì)?？梢苑蛛x上清液，并且可以用MWT-CO過濾器簡化蛋白質(zhì)混合物。然后用胰蛋白酶消化蛋白質(zhì)。然后可以在毛細(xì)管HPLC柱上加載胰蛋白酶消化產(chǎn)生的肽，在毛細(xì)管HPLC柱中這些肽將被分離，之后通過專門定制的電噴霧電離源直接洗脫到離子阱質(zhì)譜儀中。在整個梯度上，通過對柱上洗脫的4種最強(qiáng)離子(肽)進(jìn)行片段化，并同時動態(tài)地排除那些之前已經(jīng)片段化的離子，可以獲得序列數(shù)據(jù)。在這種方法中，可以獲得多次掃描的序列數(shù)據(jù)，對應(yīng)于樣品中約50-200種不同蛋白質(zhì)。利用相關(guān)性分析工具，如MS-Tag，相對于數(shù)據(jù)庫檢索這些數(shù)據(jù)可以鑒定上清液中的蛋白質(zhì)。
測量方法本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)方法取決于細(xì)胞組分的測量。所測量的細(xì)胞組分可以來自細(xì)胞生物學(xué)狀態(tài)的任何方面。它們可以來自轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，其中測定RNA豐度；來自翻譯狀態(tài)，其中測定蛋白質(zhì)的豐度；來自活性狀態(tài)，其中測定蛋白質(zhì)的活性。細(xì)胞特征也可以來自混合方面，例如測定一種或多種蛋白質(zhì)活性連同其它細(xì)胞組分的RNA豐度(基因表達(dá))。這部分描述了用于測量藥物應(yīng)答或途徑應(yīng)答中細(xì)胞組分的示例性方法。本發(fā)明亦適用進(jìn)行這種測量的其它方法。
優(yōu)選地，在本發(fā)明中測定其它細(xì)胞組分的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)?？梢酝ㄟ^對核酸或核酸模擬探針陣列的雜交技術(shù)(如下一小部分所述)或通過其它基因表達(dá)技術(shù)(隨后小部分所述)測定轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。不管如何測量，結(jié)果是包括代表mRNA豐度和/或比率的值的數(shù)據(jù)，(在RNA降解速率相同的情況下)其通常反映DNA表達(dá)率。
在本發(fā)明各種備選的實(shí)施方案中，可以測定非轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的生物學(xué)狀態(tài)(如翻譯狀態(tài)、活性狀態(tài))的方面或混合方面。
在本發(fā)明的一個方面，可以隨著時間的推移，即在乳腺疾病的各個階段，在獲自患者的體液或乳腺組織樣品中，測量對應(yīng)于表1，2，3或4中鑒定的至少一種基因的mRNA或編碼蛋白的表達(dá)水平，以監(jiān)測患者中乳腺癌的存在、進(jìn)展或預(yù)后。對應(yīng)于鑒定為與整體預(yù)后相關(guān)的基因的mRNA或編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)水平可以提供關(guān)于乳腺癌治療或進(jìn)展的有價值的信息?？梢酝ㄟ^如下所述的標(biāo)準(zhǔn)方法檢測與該基因?qū)?yīng)的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。
在一個特別有用的實(shí)施方案中，可以同時檢測各個乳腺疾病階段下患者中多種公開基因的mRNA表達(dá)水平以產(chǎn)生隨著時間推移乳腺疾病的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)譜。例如，可以在不同時間從患者乳腺細(xì)胞獲得對應(yīng)于這些基因大多數(shù)的mRNA轉(zhuǎn)錄物，并且與含有寡核苷酸探針的芯片進(jìn)行雜交物(其中所述寡核苷酸探針與期望基因的轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ))，以比較大量基因在乳腺癌各個階段的表達(dá)。
在另一方面，基于公開基因的細(xì)胞分析可以用于鑒定能用在乳腺癌治療中的藥劑。該方法包括a)用候選藥劑接觸獲自懷疑患有乳腺疾病的患者的體液或乳腺組織樣品；b)檢測表1、2、3或4中鑒定的至少一種基因的表達(dá)水平；和c)與在缺乏候選藥劑情況下樣品中基因的表達(dá)水平進(jìn)行比較，其中相對于藥劑缺乏情況下的表達(dá)水平，藥劑存在情況下樣品中表達(dá)水平的改變將指示該藥劑在乳腺癌治療中是有用的。如下所述，可以通過測量對應(yīng)于該基因的mRNA水平或該基因編碼的蛋白質(zhì)水平以檢測基因表達(dá)水平。
當(dāng)用于比較兩個或多個值時，這里所用術(shù)語“相似的”意指這些值相互間相差在10％以內(nèi)。
這里所用術(shù)語“候選藥劑”指能改變或降低對應(yīng)于至少一個公開基因的mRNA水平或該基因編碼的蛋白質(zhì)水平的任何分子。候選藥劑可以是天然或合成的分子，如蛋白質(zhì)或其片段、抗體、小分子抑制劑、核酸分子，例如反義核苷酸、核酶、雙鏈RNA、有機(jī)和無機(jī)化合物等等。
無細(xì)胞測定法也可以用于鑒定能與一種公開基因編碼的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)合伴侶相互作用以改變蛋白質(zhì)或其結(jié)合伴侶的活性的化合物。無細(xì)胞測定也可以用于鑒定能調(diào)節(jié)編碼蛋白質(zhì)和其結(jié)合伴侶(如靶肽)間相互作用的化合物。
在一個實(shí)施方案中，用于鑒定這種化合物的無細(xì)胞測定法包含反應(yīng)混合物，該反應(yīng)混合物含有一種公開基因編碼的蛋白質(zhì)和試驗(yàn)化合物或試驗(yàn)化合物庫，并且還含有或沒有結(jié)合伴侶，例如生物學(xué)失活的靶肽或小分子。因此，本發(fā)明提供了用于鑒定在乳腺癌治療中有用的藥劑的無細(xì)胞方法的一個例子，該方法包括將蛋白質(zhì)或其功能性片段或蛋白質(zhì)結(jié)合伴侶和試驗(yàn)化合物或試驗(yàn)化合物庫接觸，并檢測復(fù)合物的形成。為了檢測，可以用特定的標(biāo)志物標(biāo)記蛋白質(zhì)，并且用不同的標(biāo)志物標(biāo)記試驗(yàn)化合物或試驗(yàn)化合物庫。然后，通過測量在溫育和沖洗步驟后兩種標(biāo)志物的水平可以檢測試驗(yàn)化合物和蛋白質(zhì)或其片段或蛋白質(zhì)結(jié)合伴侶的相互作用。兩種標(biāo)志物都存在表示有相互作用。
通過檢測表面等離子共振—一種光學(xué)現(xiàn)象—的即時BIA(生物分子相互作用分析，Pharmacia Biosensor(AB))也可以估測分子間的相互作用。該檢測取決于在生物特異界面上質(zhì)量大分子的質(zhì)量濃度的改變而不需要標(biāo)記分子。在一個有用的實(shí)施方案中，可以在傳感器表面，例如微流室(micro-flow cell)壁上固定試驗(yàn)化合物庫。然后，使含有蛋白質(zhì)、其功能性片段或蛋白質(zhì)結(jié)合伴侶的溶液在傳感器表面連續(xù)循環(huán)流動。信號記錄上指示的共振角度的改變表明發(fā)生了相互作用。在Pharmacia的BIA技術(shù)指南中詳細(xì)描述了該技術(shù)。
無細(xì)胞測定法的另一個實(shí)施方案包括a)混合至少一種基因編碼的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)合伴侶和試驗(yàn)化合物以形成反應(yīng)混合物；和b)在試驗(yàn)化合物存在或缺乏情況下檢測蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)合伴侶的相互作用。與不存在試驗(yàn)化合物情況下的相互作用比較，試驗(yàn)化合物存在情況下的蛋白質(zhì)和結(jié)合伴侶相互作用的相當(dāng)大的變化(增強(qiáng)作用或抑制作用)表明試驗(yàn)化合物是蛋白質(zhì)活性的潛在的激動劑(模擬物或增強(qiáng)劑)或拮抗劑(抑制劑)。測定成分可以同時混合或者用試驗(yàn)化合物接觸蛋白質(zhì)一段時間后向反應(yīng)混合物添加結(jié)合伴侶。通過利用各種濃度的化合物產(chǎn)生劑量應(yīng)答曲線可以估測化合物的效力。也可以在不存在試驗(yàn)化合物的情況下，通過定量蛋白質(zhì)和其結(jié)合伴侶間復(fù)合物的形成進(jìn)行對照測定。
用可檢測地標(biāo)記的蛋白質(zhì)如放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記或酶標(biāo)記的蛋白質(zhì)或其結(jié)合伴侶，通過免疫測定法或通過色譜檢測法可以檢測蛋白質(zhì)和其結(jié)合伴侶間復(fù)合物的形成。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以固定蛋白質(zhì)或其結(jié)合伴侶以有利于從蛋白質(zhì)和其結(jié)合伴侶的未復(fù)合形式中分離復(fù)合物和利于測定的自動化?？梢栽谌魏晤愋偷娜萜鳎缥⒘康味ò?，微離心管和試管中完成蛋白質(zhì)與其結(jié)合伴侶的復(fù)合。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)可以與另一種蛋白質(zhì)，例如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合以形成融合蛋白質(zhì)，該融合蛋白質(zhì)可以吸附在基質(zhì)，例如谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠上(Sigma Chemical，St.Louis，MO)，然后與標(biāo)記的，例如用35S標(biāo)記的蛋白質(zhì)伴侶和試驗(yàn)化合物混合，并且在足以形成復(fù)合物的條件下孵育。隨后，洗滌珠以除去未結(jié)合的標(biāo)記，并將基質(zhì)固定化，測定放射性標(biāo)記。
另一個在基質(zhì)上固定蛋白質(zhì)的方法包括利用生物素和鏈霉抗生物素蛋白。例如，可以利用公知的技術(shù)用生物素NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)生物素化蛋白質(zhì)，并且將其固定在鏈霉抗生物素蛋白包被的板的孔中。
無細(xì)胞測定法也可以用于鑒定能夠與至少一種基因編碼的蛋白質(zhì)相互作用并且調(diào)節(jié)該基因編碼的蛋白質(zhì)的活性的藥劑。在一個實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)與試驗(yàn)化合物孵育并測定蛋白質(zhì)的催化活性。在另一個實(shí)施方案中，通過本領(lǐng)域已知的方法測定蛋白質(zhì)對靶分子的結(jié)合親和性。
本發(fā)明也提供了對患有或有危險患有乳腺疾病的個體進(jìn)行預(yù)防和治療的方法。預(yù)防性藥劑的給藥可以發(fā)生在乳腺疾病的特征癥狀顯現(xiàn)之前，這樣可以預(yù)防乳腺疾病的發(fā)展或延緩它的進(jìn)程。在乳腺疾病的治療方面，并不要求殺死乳腺細(xì)胞(例如癌細(xì)胞)或誘導(dǎo)其發(fā)生細(xì)胞死亡。相反實(shí)現(xiàn)乳腺疾病治療所需要的僅是在一定程度上減緩腫瘤生長或使得一些異常細(xì)胞恢復(fù)正常。適合的治療藥劑的例子包括，但不限于反義核苷酸、核酶、雙鏈RNA和拮抗劑，如下文詳述。
這里所用的術(shù)語“反義”指與至少一種公開基因的RNA表達(dá)產(chǎn)物的一部分互補(bǔ)的核苷酸序列?！盎パa(bǔ)的”核苷酸序列指根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)Watson-Crick互補(bǔ)規(guī)則能進(jìn)行堿基配對的核苷酸序列。即，嘌呤將和嘧啶配對以形成鳥嘌呤胞嘧啶和腺嘌呤胸腺嘧啶(在DNA中)或腺嘌呤尿嘧啶(在RNA中)的聯(lián)合體。其它不常見的堿基，例如次黃苷，5-甲基胞嘧啶，6-甲基腺嘌呤，次黃嘌呤和其它堿基可以包含在雜交序列中，并且它們不干擾配對。
在所有實(shí)施方案中，細(xì)胞組分的測定應(yīng)該以相對獨(dú)立于測量時間的方式進(jìn)行。
轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的測定優(yōu)選地，通過核酸和寡核苷酸陣列雜交進(jìn)行轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的測定，見本小節(jié)描述。在本小節(jié)中稍后描述了一些其它的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)測定方法。
轉(zhuǎn)錄物陣列概述在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明利用了“寡核苷酸陣列”(這里也稱為“微陣列”)?？梢岳梦㈥嚵蟹治黾?xì)胞中的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，特別是測定癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。
在一個實(shí)施方案中，通過將代表細(xì)胞中存在的mRNA轉(zhuǎn)錄物的可檢測標(biāo)記的多核苷酸(例如，從總細(xì)胞mRNA合成的熒光標(biāo)記的cDNA或標(biāo)記的cRNA)與微陣列雜交產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物陣列。微陣列是具有一系列有序排列的位點(diǎn)的表面，所述位點(diǎn)用于與細(xì)胞或生物體基因組中許多基因(優(yōu)選大多數(shù)或幾乎所有基因)的產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)合(例如雜交)?？梢杂迷S多方法制備微陣列，下文描述了其中幾種方法。無論如何制造，產(chǎn)生的微陣列有一些共同特征。陣列是可復(fù)制的，允許產(chǎn)生特定陣列的多個拷貝，并且這些拷貝之間易于相互比較。優(yōu)選地，微陣列較小，通常小于5cm2，并且它們由在結(jié)合(例如，核酸雜交)條件下穩(wěn)定的材料制成。微陣列中特定的結(jié)合位點(diǎn)或獨(dú)特的一組結(jié)合位點(diǎn)將特異結(jié)合細(xì)胞的單個基因的產(chǎn)物。盡管每種特定mRNA可能有一個以上的物理結(jié)合位點(diǎn)(此后稱為“位點(diǎn)”)，但是為了清楚的原因，下述的討論將假定只有單個位點(diǎn)。在特定實(shí)施方案中，利用在每個位置含有固定的已知序列核酸的位置可尋址陣列。
可以理解，當(dāng)制備與細(xì)胞RNA互補(bǔ)的cDNA，并且在適合的雜交條件下將其與微陣列雜交時，與對應(yīng)于任何特定基因的陣列位點(diǎn)的雜交水平將反映細(xì)胞中該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的豐度。例如，當(dāng)與總細(xì)胞mRNA互補(bǔ)的可檢測標(biāo)記的(例如用熒光團(tuán))cDNA或cRNA與微陣列雜交時，對應(yīng)于細(xì)胞中未轉(zhuǎn)錄基因的陣列位點(diǎn)(所述“對應(yīng)于”即能特異結(jié)合基因產(chǎn)物)將沒有或幾乎沒有信號(例如，熒光信號)，而對應(yīng)于編碼的mRNA占優(yōu)勢的基因的位點(diǎn)將有相對強(qiáng)的信號。
微陣列的制備微陣列是本領(lǐng)域已知的，由一個表面組成，在該表面上在序列上相應(yīng)于基因產(chǎn)物的探針(例如cDNA、Mrna、cRNA、多肽及其片段)可以特異地在已知位置發(fā)生雜交或結(jié)合。在一個實(shí)施方案中，微陣列是陣列(即矩陣)，在其中每個位置是基因編碼產(chǎn)物(例如蛋白質(zhì)或RNA)的一個離散結(jié)合位點(diǎn)，并且存在針對生物體基因組中大多數(shù)或幾乎所有基因產(chǎn)物的結(jié)合位點(diǎn)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，“結(jié)合位點(diǎn)”(此后稱“位點(diǎn)”)是特定關(guān)連cDNA或cRNA可以特異雜交的核酸或核酸類似物。結(jié)合位點(diǎn)的核酸或類似物可以是例如合成的寡聚體、全長cDNA、小于全長的cDNA或基因片段。
盡管在優(yōu)選的實(shí)施方案中，微陣列含有靶生物體基因組中所有或幾乎所有基因產(chǎn)物的結(jié)合位點(diǎn)，但是這種全面性不一定是必需的。微陣列可以僅有部分靶生物體基因的結(jié)合位點(diǎn)。然而，一般地，微陣列有對應(yīng)于至少約50％，常常至少約75％，更常見至少約85％，甚至更常見多于約90％和最常見至少約99％的基因組基因的結(jié)合位點(diǎn)。優(yōu)選地，微陣列具有如下基因的結(jié)合位點(diǎn)，所述基因與測試和驗(yàn)證目的生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)模型相關(guān)。“基因”被定義為優(yōu)選具有至少50，75或99個氨基酸的開放閱讀框(ORF)，在生物體(例如，如果是單細(xì)胞)中或在多細(xì)胞生物體的一些細(xì)胞中將從該開放閱讀框轉(zhuǎn)錄信使RNA。可從生物體表達(dá)的mRNA數(shù)或通過從基因組的詳細(xì)表征部分外推估測基因組中的基因數(shù)目。對感興趣生物體的基因組測序后，通過DNA序列分析可以確定ORF數(shù)目并鑒定mRNA編碼區(qū)。例如已經(jīng)完整測序了釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因組，據(jù)報(bào)道其有約6275個長于99個氨基酸的ORF。對這些ORF的分析表明有5885個可能規(guī)定蛋白質(zhì)產(chǎn)物的ORF(參見，例如Goffeau等，“具有6000個基因的生命體”，Science，274卷，546-567頁，(1996)，為了所有目的，整體并入該篇文獻(xiàn)為參考文獻(xiàn))。相比較，估測人類基因組含有約25,000-35,000個基因。
制備用于微陣列的核酸如上所述，與特定關(guān)連cDNA特異雜交的“結(jié)合位點(diǎn)”通常是附著在該位點(diǎn)的核酸或核酸類似物。在一個實(shí)施方案中，微陣列的結(jié)合位點(diǎn)是對應(yīng)于生物體基因組的每種基因的至少一個部分的DNA多核苷酸。可以通過例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增來自基因組DNA、cDNA(例如，通過RT-PCR)或克隆序列的基因片段獲得這些DNA，或者可以在芯片表面利用例如照相平板印刷技術(shù)從頭合成序列，例如Affymetrix利用這種不同技術(shù)直接在芯片上合成了它們的寡聚體?？梢愿鶕?jù)基因或cDNA的已知序列選擇PCR引物，以便擴(kuò)增獨(dú)特的片段(即，該片段與微陣列上任何其它片段不共有10個以上堿基的連續(xù)相同序列)。計(jì)算機(jī)程序在具有所需特異性和最適擴(kuò)增特性的引物的設(shè)計(jì)中很有用(參見，例如Oligo pl 5.0版本(National Biosciences))。在結(jié)合位點(diǎn)對應(yīng)于很長的基因的情況下，有時期望擴(kuò)增基因3’末端附近的片段，這樣當(dāng)寡聚-dT引發(fā)的cDNA探針與微陣列雜交時，小于全長的探針可以有效地結(jié)合。通常，微陣列上每個基因片段的長度在約20bp和約2000bp間，更通常地在約100bp和約1000bp間，通常約300bp至約800bp。PCR方法是公知的，例如在Innis等編輯，″PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications″，AcademicPress Inc.，San Diego，CA(1990)中描述了該方法，為了所有的目的，整體并入該篇文獻(xiàn)為參考文獻(xiàn)。很明顯，計(jì)算機(jī)控制的機(jī)器人系統(tǒng)對于分離和擴(kuò)增核酸是有用的。
產(chǎn)生用于微陣列的核酸的備選方法是例如利用N-磷酸酯或亞磷酰胺化學(xué)合成多核苷酸或寡核苷酸(Froehler等，Nucleic Acid Res.，14卷，5399-5407頁，(1986)；McBride等，Tetrahedron Lett.，24卷，245-248頁，(1983))。合成序列長度在約15到約500個堿基之間，更通常地在約20到約50個堿基之間。在一些實(shí)施方案中，合成的核酸包括非天然的堿基，例如次黃苷。如上所述，核酸類似物可以用作雜交的結(jié)合位點(diǎn)。一個適宜的核酸類似物的例子是肽核酸(參見，例如Egholm等，“PNA遵循Watson-Crick氫鍵鍵合規(guī)則與互補(bǔ)寡核苷酸雜交”，Nature，365卷，566-568頁(1993)；也參見美國專利號5,539,083)。
在備選的實(shí)施方案中，結(jié)合(雜交)位點(diǎn)從基因、cDNA(例如已表達(dá)序列標(biāo)志)的質(zhì)粒或噬菌體克隆或來自其中的插入物制備(Nguyen等，“通過與cDNA克隆陣列定量雜交分析小鼠胸腺中的差異基因表達(dá)”，Genomics，29卷，207-209頁，(1995))。在再一個實(shí)施方案中，結(jié)合位點(diǎn)的多核苷酸是RNA。
將核酸結(jié)合到固相表面核酸或類似物被結(jié)合到固相支持體上，該固相支持體可以由玻璃、塑料(例如聚丙烯、尼龍)、聚丙烯酰胺、硝化纖維或其它材料制成。優(yōu)選的將核酸結(jié)合到表面的方法是在玻璃板上印刷，一般地可參見Schena等，“用互補(bǔ)DNA微陣列定量監(jiān)測基因表達(dá)模式”，Science，270卷，467-470頁，(1995)。該方法特別可用于制備cDNA微陣列。也參見DeRisi等，“使用cDNA微陣列分析人類癌癥中的基因表達(dá)模式”，Nature Genetics，14卷，457-460頁，(1996)；Shalon等，“使用雙色熒光探針雜交分析復(fù)雜DNA樣品的DNA微陣列系統(tǒng)”，Genome Res.，6卷，639-645頁，(1996)；和Schena等，“平行人類基因組分析；1000個基因的基于微陣列的表達(dá)”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93卷，10539-11286頁，(1995))。為了所有的目的，整體并入每篇前述的文章作為參考文獻(xiàn)。
第二種優(yōu)選的制備微陣列的方法是制備高密度的寡核苷酸陣列。利用用于原位合成的照相平板印刷技術(shù)生產(chǎn)含有數(shù)千寡核苷酸的陣列的技術(shù)是已知的，其中所述寡核苷酸位于表面規(guī)定位置并與規(guī)定序列互補(bǔ)(參見Fodor等，“光指導(dǎo)的空間可尋址平行化學(xué)合成”，Science，251卷，767-773頁(1991)；Pease等，“用于快速DNA序列分析的光導(dǎo)寡核苷酸陣列”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91卷，5022-5026頁，(1994)；Lockhart等，“通過與高密度寡核苷酸陣列雜交監(jiān)測表達(dá)”，Nature Biotech.，14卷，1675頁(1996)；美國專利號5,578,832；5,556,752和5,510,270，為了所有的目的，整體并入每篇文獻(xiàn)為參考文獻(xiàn))；用于快速合成和沉淀規(guī)定寡核苷酸的其它方法的技術(shù)也是已知的(Blanchard等，“高密度寡核苷酸陣列”，Biosensors& Bioelectronics，11卷，687-690頁，(1996))。當(dāng)利用這些方法時，直接在表面如衍生的載玻片上合成已知序列的寡核苷酸(例如25聚體)。通常，產(chǎn)生的陣列是冗余的，每個RNA對應(yīng)于幾個寡核苷酸分子?？梢赃x擇寡核苷酸探針以檢測可變剪接的mRNA。
也可以利用其它制備微陣列的方法，例如掩蔽法(參見，Maskos和Southern，Nuc.Acids Res.，20卷，1679-1684頁，(1992))。盡管如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)識到的，優(yōu)選非常小的陣列，因?yàn)檫@樣雜交體積較小，但是原則上，可以利用任何類型的陣列，例如尼龍雜交膜上的點(diǎn)印跡(參見，Sambrook等，″Molecular Cloning--A Laboratory Manual(第二版)″，1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)，為了所有目的，整體并入這篇文獻(xiàn)為參考文獻(xiàn))。
產(chǎn)生標(biāo)記探針制備總的和poly(A)+RNA的方法是公知的，在Sambrook等上述引文中概述了該方法。在一個實(shí)施方案中，在本發(fā)明中利用硫氰酸胍裂解各種類型目的細(xì)胞，接著通過CsCl離心提取RNA(Chirgwin等，Biochemistry，18卷，5294-5299頁，(1979))。通過用寡聚-dT纖維素選擇poly(A)+RNA(參見，Sambrook等，上引文)。目的細(xì)胞包括野生型細(xì)胞，暴露于藥物的野生型細(xì)胞、具有修飾的/干擾的細(xì)胞組分的細(xì)胞和具有修飾的/干擾的細(xì)胞組分的暴露于藥物的細(xì)胞。
通過寡聚dT引物或隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄從mRNA或備選地直接從RNA制備標(biāo)記的cDNA，所述兩種技術(shù)均是本領(lǐng)域已知的(參見，例如Klug和Berger，Methods Enzymol.，152卷，316-325頁，(1987))。可以在綴合可檢測標(biāo)記的dNTP，最優(yōu)選熒光標(biāo)記的dNTP存在的情況下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。備選地，可以在標(biāo)記的dNTP存在的情況下，通過雙鏈cDNA的體外轉(zhuǎn)錄合成將分離的mRNA轉(zhuǎn)化為標(biāo)記的反義RNA(參見，Lockhart等，“通過與高密度寡核苷酸陣列雜交監(jiān)測表達(dá)”，Nature Biotech.，14卷；1675頁，(1996)，為了所有目的，整體并入該篇文獻(xiàn)為參考文獻(xiàn))。在可替代的實(shí)施方案中，在缺乏可檢測標(biāo)記的情況下合成cDNA或RNA探針，并隨后通過例如引入生物素化的dNTP或rNTP或一些類似方法(例如使生物素的補(bǔ)骨脂素衍生物光交聯(lián)到RNA上)及接著添加標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白(例如綴合藻紅蛋白的鏈霉抗生物素蛋白)或等同物來標(biāo)記該cDNA或RNA探針。
當(dāng)使用熒光標(biāo)記的探針時，已知有許多適合的熒光團(tuán)，包括熒光素、麗絲胺、藻紅蛋白、羅丹明(Perkin Elmer Cetus)、Cy2、Cy3、CY3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、FluorX(Amersham)和其它熒光團(tuán)(參見，例如Kricka，“非同位素DNA探針技術(shù)”，Academic Press，San Diego，CA(1992))?？梢岳斫獾氖牵瑧?yīng)選擇有不同發(fā)射光譜的成對熒光團(tuán)以便于容易地區(qū)分它們。
在另一個實(shí)施方案中，利用了非熒光標(biāo)記的標(biāo)記物。例如，可以利用放射性標(biāo)記或有不同發(fā)射光譜的成對放射性標(biāo)記(參見，Zhao等，“高密度cDNA濾膜分析大規(guī)模定量分析基因表達(dá)的新方法”，Gene，156卷，207頁(1995)；Pietu等，“通過與高密度cDNA陣列定量雜交揭示的在人類肌肉中優(yōu)先表達(dá)的新基因轉(zhuǎn)錄物”，Genome Res.，6卷，492頁，(1996))。然而，因?yàn)榉派湫粤Ｗ拥纳⑸浜鸵虼诵枰獙掗g隔的結(jié)合位點(diǎn)，放射性同位素的使用是不太優(yōu)選的實(shí)施方案。
在一個實(shí)施方案中，通過在42℃，與反轉(zhuǎn)錄酶(如，TMII，LTI Inc.)一起孵育含有0.5mM dGTP，dATP和dCTP以及0.1mM dTTP和熒光脫氧核糖核苷酸(例如，0.1mM羅丹明110 UTP(Perken Elmer Cetus)或0.1mM Cy3 dUTP(Amersham))的混合物60分鐘以合成標(biāo)記的cDNA。
雜交到微陣列選擇核酸雜交和洗滌條件，以便探針“特異地結(jié)合”或“特異地雜交”到特定陣列位點(diǎn)，即，使探針與具有互補(bǔ)核酸序列的序列陣列位點(diǎn)雜交、形成雙鏈體或結(jié)合但是不與具有非互補(bǔ)核酸序列的位點(diǎn)雜交。如這里所用的，如果兩個多核苷酸序列的短者少于或等于25個堿基且利用標(biāo)準(zhǔn)堿基配對規(guī)則兩者沒有錯配，或者如果兩個多核苷酸序列的短者長于25個堿基且兩者之間的錯配不超過5％，那么認(rèn)為其中一個多核苷酸序列與另一個多核苷酸序列互補(bǔ)。優(yōu)選地，多核苷酸完全地互補(bǔ)(沒有錯配)。通過進(jìn)行包括陰性對照的雜交分析，可以很容易證明是否特定雜交條件將導(dǎo)致特異雜交(參見，例如Shalon等，上引文和Chee等，上引文)。
最適雜交條件取決于標(biāo)記探針和固定的多核苷酸或寡核苷酸的長度(例如寡聚體相對于具有200個以上堿基的多核苷酸)和類型(例如，RNA，DNA，PNA)。在Sambrook等以上引文和在Ausubei等，″Current Protocolsin Molecular Biology″，Greene Publishing and Wiley-interscience，NY(1987)中描述了核酸特異(即嚴(yán)緊)雜交條件的一般參數(shù)，為了所有目的，整體并入這些文獻(xiàn)為參考文獻(xiàn)。當(dāng)利用Schena等的cDNA微陣列時，典型的雜交條件是在65℃、5xSSC加0.2％SDS中雜交4小時，隨后在25℃、低嚴(yán)緊性的洗滌緩沖液(1xSSC加0.2％SDS)中洗滌，接著在25℃、高嚴(yán)緊性的洗滌緩沖液(0.1xSSC加0.2％SDS)中洗滌10分鐘(參見，Shena等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93卷，10614頁，(1996))。
在例如Tijessen，″Hybridization With Nucleic Acid Probes″，ElsevierScience Publishers B.V.(1993)和Kricka，″Nonisotopic DNA ProbeTechniques″，Academic Press，San Diego，CA(1992)中也提供了有用的雜交條件。
信號檢測和數(shù)據(jù)分析當(dāng)利用熒光標(biāo)記的探針時，優(yōu)選地，通過掃描共聚焦激光顯微術(shù)來檢測轉(zhuǎn)錄物陣列上每個位點(diǎn)的熒光發(fā)射。在一個實(shí)施方案中，利用適合的激發(fā)線對所用兩個熒光團(tuán)中的每個熒光團(tuán)進(jìn)行單獨(dú)掃描?？商娲?，可以利用激光以特異于所用熒光團(tuán)的波長照射樣品，然后分析熒光團(tuán)的發(fā)射光。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用具有計(jì)算機(jī)控制的X-Y階(stage)和顯微鏡物鏡的激光熒光掃描儀掃描陣列?？梢杂枚嗑€混合氣體激光實(shí)現(xiàn)熒光團(tuán)的相繼激發(fā)，并按波長分開發(fā)射光后用光電倍增管進(jìn)行檢測。在Schena等，GenomeRes.，6卷，639-645頁，(1996)和這里引用的其它參考文獻(xiàn)中描述了熒光激光掃描裝置?？商娲?，F(xiàn)erguson等，Nature Biotech.，14卷，1681-1684頁，(1996)描述的光纖束可以用于同時監(jiān)測許多位點(diǎn)上的mRNA豐度水平。
記錄信號并在優(yōu)選實(shí)施方案中通過計(jì)算機(jī)，例如利用12位模數(shù)板對信號實(shí)施分析。在一個實(shí)施方案中，用圖形程序(例如，Hijaak Graphics Suite)除去掃描圖像的光斑，然后用圖像網(wǎng)格程序分析圖像，該程序?qū)a(chǎn)生記錄了每個位點(diǎn)每個波長下的平均雜交的電子表格。
Agilent Technologies GENEARRAYTM掃描儀是臺式488nM氬離子激光分析儀。該激光可以聚焦到小于4微米大小的點(diǎn)。這種精確度允許對具有小至20微米的探針單元的探針陣列進(jìn)行掃描。激光束聚焦在探針陣列上，激發(fā)熒光標(biāo)記的核苷酸。然后利用針對分析中所用的染料而選定的濾光器執(zhí)行掃描。通過移動探針陣列完成正交坐標(biāo)的掃描。結(jié)合在雜交樣品中的染料分子將吸收激光輻射而發(fā)射熒光。通過透鏡校準(zhǔn)熒光，使其穿過濾光器以選擇波長。然后通過第二透鏡聚焦光線在用于強(qiáng)度鑒別的孔上方。然后通過高敏光電倍增管(PMT)檢測。PMT輸出電流被模數(shù)轉(zhuǎn)換器(ADC)轉(zhuǎn)換成電壓讀數(shù)，處理后的數(shù)據(jù)以樣品點(diǎn)的熒光強(qiáng)度水平或當(dāng)前掃描的圖像元素(象素)的形式返回計(jì)算機(jī)。隨著掃描的進(jìn)行計(jì)算機(jī)將數(shù)據(jù)顯示為圖像。此外，表示樣品表達(dá)譜的所有樣品的熒光強(qiáng)度水平以計(jì)算機(jī)可讀格式記錄。
如果必要，可以實(shí)驗(yàn)確定以校正兩種熒光通道間的“串話”(或重疊)。對于轉(zhuǎn)錄物陣列上任何特定的雜交位點(diǎn)，可以計(jì)算兩種熒光的發(fā)射比率。該比率獨(dú)立于關(guān)聯(lián)基因的絕對表達(dá)水平，但是可能對于表達(dá)受到藥物施用、基因缺失或任何其它檢測事件顯著調(diào)節(jié)的基因是有用的。
優(yōu)選地，除了鑒定干擾為陽性或陰性外，測定干擾的幅度也是有利的。這可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的方法進(jìn)行。
當(dāng)用于比較兩個或多個值時，如這里所用術(shù)語“類似的”，指當(dāng)用相同單位時，兩個值在數(shù)值上相差在20％以內(nèi)，或更優(yōu)選地10％以內(nèi)。
其它的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)測量方法可以通過本領(lǐng)域已知的其它基因表達(dá)技術(shù)測定細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。幾種這樣的技術(shù)產(chǎn)生用于電泳分析的具有有限復(fù)雜性的限制性片段庫，如結(jié)合雙限制酶消化和定相引物(phasing primer)的方法(參見，例如Zabeau等1992年9月24日提交的歐洲專利0 534858 A1)，或用最接近規(guī)定mRNA末端的位點(diǎn)篩選限制性片段的方法(參見，例如Prashar等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93卷，659-663頁，(1996))。其它方法統(tǒng)計(jì)地采樣cDNA庫，如通過測序多個cDNA之每一個的足夠堿基(例如20-50堿基)以鑒定每個cDNA，或通過測序在相對于規(guī)定的mRNA末端的已知位置上產(chǎn)生的短標(biāo)簽(例如9-10堿基)(參見，例如Velculescu，Science，270卷，484-487頁，(1995))以鑒定途徑模式。
其它方面的測量在本發(fā)明各種實(shí)施方案中，可以測定除了轉(zhuǎn)錄狀態(tài)外的生物學(xué)狀態(tài)方面，如翻譯狀態(tài)，活性狀態(tài)或混合方面以獲得藥物和途徑應(yīng)答。在本部分描述了這些實(shí)施方案的細(xì)節(jié)。
翻譯狀態(tài)的測量可以通過可檢測地標(biāo)記的或可隨后標(biāo)記的探針檢測基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)。一般地，該探針是識別所表達(dá)蛋白質(zhì)的抗體。
如這里所用的術(shù)語“抗體”包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、人源化或嵌合抗體和足以結(jié)合抗體片段到蛋白質(zhì)的生物功能性抗體片段。
為了產(chǎn)生一種公開基因編碼的蛋白質(zhì)的抗體，可以通過注射多肽或其片段免疫各種宿主動物。這些宿主動物可以包括，但不限于家兔、小鼠和大鼠等。根據(jù)宿主物種，可以用各種佐劑增強(qiáng)免疫應(yīng)答，這些佐劑包括但不限于弗氏佐劑(完全和不完全)、礦物凝膠如氫氧化鋁，表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、多聚醇、聚陰離子、肽、油乳化佐劑、鑰孔蝛血藍(lán)蛋白、二硝基苯酚和潛在有用的人用佐劑如BCG(bacille Camette-Guerin)和小棒桿菌(Corynebacterium parvum)。
多克隆抗體為來自利用抗原免疫的動物血清的異質(zhì)抗體分子群，上述抗原例如靶基因產(chǎn)物或其抗原性功能衍生物。為生產(chǎn)多克隆抗體，可以通過利用添加了上述佐劑的編碼蛋白或其部分注射來免疫例如以上所述的宿主動物。
單克隆抗體(mAb)是針對特定抗原的同質(zhì)抗體群，其可以通過利用任何可允許培養(yǎng)的連續(xù)細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子的技術(shù)獲得。這些技術(shù)包括但并不限于Kohler和Milstein的雜交瘤技術(shù)(1975，自然(Nature)256495-497；以及美國專利號4,376,110)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等人，1983，今日免疫學(xué)(Immunology Today)472；Cole等人，1983，美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)802026-2030)以及EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等人，1985，單克隆抗體與癌癥治療(MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy)，Alan R.Liss公司，77-96)。這些抗體可以為任何免疫球蛋白種類，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD以及它們的任何亞類。產(chǎn)生本發(fā)明mAb的雜交瘤可以在體外或體內(nèi)培養(yǎng)。體內(nèi)產(chǎn)生高效價mAb的方法為目前優(yōu)選的生產(chǎn)方法。
另外，也可以使用生產(chǎn)“嵌合抗體”的技術(shù)(Morrison等人，1984，美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)816851-6855；Neuberger等人，1984，自然(Nature)312604-608；Takeda等人，1985，自然(Nature)314452-454)，其通過將具適當(dāng)抗原特異性的小鼠抗體分子的基因與具有適當(dāng)生物學(xué)活性的人抗體分子的基因拼接在一起而進(jìn)行。嵌合抗體是其中不同的部分來自不同的動物種類的分子，例如那些具有來自小鼠mAb的可變或高變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體。
備選地，可以采用產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(美國專利號4,946,778；Bird，1988，科學(xué)(Science)242423-426；Huston等人，1988，美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)855879-5883；以及Ward等人，1989，自然(Nature)334544-546)來生產(chǎn)差異表達(dá)基因的單鏈抗體。單鏈抗體可通過使重鏈和輕鏈的Fv區(qū)片斷借助氨基酸橋相連產(chǎn)生單鏈多肽而形成。
更優(yōu)選地，采用用于生產(chǎn)“人源化抗體”的技術(shù)來生產(chǎn)蛋白質(zhì)、其片斷或衍生物的抗體。這些技術(shù)公開在美國專利號5,932,488、5,693,762、5,693,761、5,585,089、5,530,101、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,661,016和5,770,429中。
識別特異表位的抗體片斷可以通過公知的技術(shù)產(chǎn)生。例如，這些片斷包括但并不限于通過胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生的F(ab’)2片斷和通過還原F(ab’)2片斷的二硫鍵而生成的Fab片斷。另外，可以構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(Huse等人，1989，科學(xué)(Science)，2461275-1281)以進(jìn)行具有期望特異性的單克隆Fab片斷的快速而容易的鑒定。
然后可以通過利用上述抗體的免疫測定法檢測樣品中已知蛋白質(zhì)的表達(dá)程度。這種免疫測定法包括但不限于點(diǎn)印跡，western印跡，競爭性和非競爭性蛋白質(zhì)結(jié)合測定法，酶連免疫吸附測定法(ELISA)，免疫組織化學(xué)，熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)和其它在科學(xué)和專利文獻(xiàn)中常用和廣泛描述的方法及許多商用的方法。
為便于檢測，特別優(yōu)選使用三明治ELISA，該測定法存在多種變異方式。所有方式均包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。例如，在一般的正向測定中，將未標(biāo)記抗體固定于固體基質(zhì)上，并將測試樣品與結(jié)合的分子接觸。經(jīng)過適當(dāng)?shù)姆跤龝r間，該時間將足夠抗體抗原二元復(fù)合體形成。這時，再加入用能夠誘導(dǎo)可檢測信號的報(bào)告分子標(biāo)記的第二抗體并孵育，孵育時間應(yīng)足夠抗體-抗原-標(biāo)記抗體三元復(fù)合體的形成。將任何未反應(yīng)物質(zhì)洗去，并通過觀察信號確定抗原的存在或者通過與含有已知量抗原的對照樣品比較來定量。正向測定的變異方式包括同時測定和反向測定，其中在同時測定中樣品和抗體同時加至結(jié)合的抗體中；而在反向測定中標(biāo)記的抗體與待測試樣品首先混合、孵育然后加至未標(biāo)記的表面結(jié)合抗體中。這些技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，并且顯而易見可以進(jìn)行小的改動。于此使用的“三明治測定法”意味著包括基于此基本的兩位點(diǎn)技術(shù)的所有變異方案。對本發(fā)明的免疫測定而言，僅有的限制因素是標(biāo)記的抗體必須是目的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)的特異性抗體。
在這種測定中最常使用的報(bào)告分子為酶或者含熒光團(tuán)或放射性核素的分子。在酶免疫測定的案例中，將酶偶聯(lián)至第二抗體，這通常通過戊二醛或過碘酸實(shí)現(xiàn)。然而，正如易于意識到的，存在相當(dāng)大量不同的連接技術(shù)，它們?yōu)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員所公知。通常使用的酶包括辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶等等。對于與特定酶一起使用的底物，一般選擇在相應(yīng)酶的水解作用后可以產(chǎn)生可檢測的顏色改變的底物。例如對硝基苯磷酸適合與堿性磷酸酶綴合物一起使用；對過氧化物酶綴合物而言，通常使用1，2-苯二胺或甲苯胺。也可以使用熒光底物，其生成熒光產(chǎn)物而不是上文提及的生色底物。然后將含有適當(dāng)?shù)孜锏娜芤杭又寥獜?fù)合體中。底物與連接至第二抗體的酶反應(yīng)，產(chǎn)生定性的可見信號，該信號可以進(jìn)一步通過通常地分光光度計(jì)定量以評價血清樣品中存在的蛋白量。
備選地，可以將熒光化合物(例如熒光素和羅丹明)在不改變抗體的結(jié)合能力的條件下化學(xué)偶聯(lián)至抗體。當(dāng)利用特定波長的光照射激活后，熒光色素標(biāo)記的抗體吸收光能，誘導(dǎo)分子進(jìn)入激發(fā)狀態(tài)，并隨后發(fā)射出特征長波長的光。該發(fā)射光在光學(xué)顯微鏡下表現(xiàn)為可觀測的特征顏色。免疫熒光和EIA技術(shù)在本領(lǐng)域均是極為成熟的技術(shù)并且為本方法所特別優(yōu)選。然而，本發(fā)明也可以使用其它報(bào)告分子，例如放射性同位素、化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光分子。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，如何改變方法以適應(yīng)所需用途是顯而易見的。
根據(jù)幾種其它方法也可以進(jìn)行翻譯狀態(tài)的測定。例如，通過構(gòu)建微陣列可以進(jìn)行整個基因組的蛋白質(zhì)監(jiān)測(即“蛋白質(zhì)組學(xué)”，Goffeau等，以上引文)，其中該微陣列的結(jié)合位點(diǎn)包含固定化的、對細(xì)胞基因組編碼的大量蛋白質(zhì)種類具特異性的抗體，優(yōu)選單克隆抗體。優(yōu)選地，存在針對相當(dāng)大部分的編碼蛋白質(zhì)的抗體，或至少存在與測試或驗(yàn)證目的生物網(wǎng)絡(luò)模型相關(guān)的那些蛋白質(zhì)的抗體。制備單克隆抗體的方法是公知的(參見，例如Harlow和Lane，″AntibodiesA Laboratory Manual″，Cold SpringHarbor，NY(1988)，為了所有的目的，整體并入該篇文獻(xiàn)為參考文獻(xiàn))。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，產(chǎn)生抗合成的肽片斷的單克隆抗體，所述合成肽片段是基于細(xì)胞基因組序列設(shè)計(jì)的。使用這種抗體陣列時，使來自細(xì)胞的蛋白質(zhì)接觸陣列，并且用本領(lǐng)域已知的測定法檢測它們的結(jié)合。
可替代地，可以通過二維凝膠電泳系統(tǒng)分離蛋白質(zhì)。二維凝膠電泳是本領(lǐng)域公知的，通常包括沿著第一維的等電聚焦，隨后沿著第二維的SDS-PAGE電泳(參見，例如Hames等，″Gel Electrophoresis of ProteinsAPractical Approach″，IRL Press，NY(1990)；Shevchenko等，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA，93卷，1440-1445頁(1996)；Sagliocco等，Yeast，12卷，1519-1533頁(1996)；Lander，Science，274卷，536-539頁(1996)))?？梢酝ㄟ^許多技術(shù)，包括質(zhì)譜技術(shù)，western印跡和利用多克隆和單克隆抗體的免疫印跡分析法及內(nèi)部和N-末端微測序方法分析所得到的電泳圖譜。利用這些技術(shù)，可以鑒定在給定生理?xiàng)l件下(包括暴露于藥物的細(xì)胞中(例如，酵母中)，或通過例如缺失或過表達(dá)特定基因而修飾的細(xì)胞中)產(chǎn)生的所有蛋白質(zhì)的相當(dāng)大部分。
基于生物學(xué)狀態(tài)的其它方面的實(shí)施方案盡管監(jiān)測mRNA豐度以外的細(xì)胞組分目前存在一些在監(jiān)測mRNA時沒有遇到的技術(shù)困難，但是對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，使用本發(fā)明方法時，可以測量與細(xì)胞功能特征有關(guān)的蛋白質(zhì)活性，而且本發(fā)明的實(shí)施方案可以基于此測量。可以通過適于待表征的特定活性的任何功能性的、生物化學(xué)的或物理的方法進(jìn)行活性測定。當(dāng)活性涉及化學(xué)轉(zhuǎn)化時，可以將細(xì)胞蛋白質(zhì)與天然底物接觸，并且測定轉(zhuǎn)化速率。當(dāng)活性涉及多聚體單元中的聯(lián)系，例如活化的DNA的結(jié)合復(fù)合物與DNA的結(jié)合時，可以測定相關(guān)蛋白質(zhì)的量或此聯(lián)系的次級結(jié)果，如轉(zhuǎn)錄的mRNA量。而且，當(dāng)僅知道功能活性，例如細(xì)胞周期控制中的功能活性時，可以觀察功能的實(shí)現(xiàn)。然而，不論是如何已知和測量的，蛋白質(zhì)活性的變化都可以形成本發(fā)明上述方法所分析的應(yīng)答數(shù)據(jù)。
在可替代的非限制性實(shí)施方案中，應(yīng)答數(shù)據(jù)可以由細(xì)胞生物狀態(tài)的混合方面組成。可以從例如某些mRNA豐度的變化、某些蛋白質(zhì)豐度的變化和某些蛋白質(zhì)活性的變化來構(gòu)建應(yīng)答數(shù)據(jù)。
計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)在優(yōu)選實(shí)施方案中，為了提供用于形成和檢測生物系統(tǒng)模型的強(qiáng)大的和方便的工具，在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)上或一個或多個聯(lián)網(wǎng)的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)上執(zhí)行前述方法的計(jì)算步驟。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)可以是包括內(nèi)部元件并與外部元件連接的單一硬件平臺。該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的內(nèi)部元件包括與主存儲器互相連接的處理器元件。例如計(jì)算機(jī)系統(tǒng)可以具有200Mhz或更大時鐘頻率的基于IntelPentium的處理器及32MB或更大的主存儲器。
外部元件包括大容量數(shù)據(jù)存儲器。該大容量存儲器可以是一個或多個硬盤(其通常與處理器和存儲器裝在一起)。通常，這種硬盤提供至少1GB的存儲。其它外部元件包括用戶界面設(shè)備，這可以是顯示器和鍵盤及點(diǎn)擊設(shè)備(這可以是“鼠標(biāo)”)或其它圖形輸入設(shè)備。通常，此計(jì)算機(jī)系統(tǒng)還與其它本地計(jì)算機(jī)系統(tǒng)、遠(yuǎn)程計(jì)算機(jī)系統(tǒng)或廣域的通訊網(wǎng)絡(luò)，如互聯(lián)網(wǎng)連接。這種網(wǎng)絡(luò)連接允許此計(jì)算機(jī)系統(tǒng)與其它計(jì)算機(jī)系統(tǒng)共享數(shù)據(jù)和處理任務(wù)。
在該系統(tǒng)運(yùn)行期間幾個軟件被下載到存儲器，它們在本領(lǐng)域是標(biāo)準(zhǔn)的并且對本發(fā)明是特定的。根據(jù)本發(fā)明的方法，這些軟件組件共同地使計(jì)算機(jī)系統(tǒng)起作用。這些軟件組件通常存儲在大容量存儲器上?？蛇x地，可以在可移動介質(zhì)如軟盤或CD-ROM(未示出)上存儲軟件組件。這些軟件組件代表操作系統(tǒng)，該操作系統(tǒng)負(fù)責(zé)管理計(jì)算機(jī)系統(tǒng)和其網(wǎng)絡(luò)互連。該操作系統(tǒng)可以是，例如Microsoft Windows家族，如Windows95，Windows98或Windows NT，或Unix操作系統(tǒng)，如Sun Solaris。軟件包括適于存在于該系統(tǒng)上的常用語言和函數(shù)以幫助程序?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明特定的方法?？梢杂糜诰幊瘫景l(fā)明的分析方法的語言包括C、C++或不太優(yōu)選地JAVA。最優(yōu)選地，用數(shù)學(xué)軟件包編程本發(fā)明方法，該數(shù)學(xué)軟件包允許符號輸入方程式以及處理的高級別說明，其包括所要用的算法，因此用戶不需要程序化地編程單個的方程或算法。這種軟件包包括例如Mathworks(Natick MA)的MATLABTM、Wolfram Research(Champaign，IL)的MATHEMATICATM和Mathsoft(Cambridge，MA)的MATHCADTM。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，分析軟件組件實(shí)際上包括相互作用的單獨(dú)軟件組件。分析軟件代表包含系統(tǒng)運(yùn)行所有必需的數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫。這種數(shù)據(jù)一般包括，但不是必須限于以前試驗(yàn)的結(jié)果、基因組數(shù)據(jù)、實(shí)驗(yàn)步驟和費(fèi)用及其它信息，這些對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。分析軟件包括數(shù)據(jù)簡化和計(jì)算成分，該計(jì)算成分包括一個或多個執(zhí)行本發(fā)明分析方法的程序。分析軟件也包括用戶界面(UI)，該界面使得計(jì)算機(jī)系統(tǒng)用戶可以控制和輸入測試網(wǎng)絡(luò)模型，并且可選地，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。用戶界面可以包括用于說明系統(tǒng)假設(shè)的拖放界面。用戶界面也可以包括用于從大容量存儲組件(例如，硬驅(qū)動)、從可移動介質(zhì)(例如軟盤或CD-ROM)或通過網(wǎng)絡(luò)(例如，局域網(wǎng)或廣域通訊網(wǎng)絡(luò)如互聯(lián)網(wǎng))從與本系統(tǒng)通訊的不同計(jì)算機(jī)系統(tǒng)載入試驗(yàn)數(shù)據(jù)的方法。
本發(fā)明還提供了構(gòu)建包含至少一個本發(fā)明所述標(biāo)志物，例如mRNA或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的數(shù)據(jù)庫的方法。例如，多核苷酸或氨基酸序列可以被存儲在數(shù)字存儲介質(zhì)中以便可以編譯處理系統(tǒng)以標(biāo)準(zhǔn)化的表現(xiàn)可鑒定乳腺癌細(xì)胞的基因。該數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對分析兩個細(xì)胞間的基因表達(dá)有用，其中首先選出一個被懷疑為具有腫瘤表現(xiàn)型或基因型的細(xì)胞，然后從該細(xì)胞中分離多核苷酸。測序分離的多核苷酸。用同源性檢索技術(shù)比較樣品序列和數(shù)據(jù)庫中存在的序列。試驗(yàn)序列和本發(fā)明多核苷酸序列間大于90％，更優(yōu)選地，大于95％，更優(yōu)選地，大于或等于97％的序列同一性從正面表明該多核苷酸已經(jīng)從上面所定義的乳腺癌細(xì)胞中分離出來。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明分析方法的備選計(jì)算機(jī)系統(tǒng)和方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見，并且包括在所附權(quán)利要求中。具體地，所附權(quán)利要求旨在包括實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的備選程序結(jié)構(gòu)，這些程序結(jié)構(gòu)對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
修飾mRNA的豐度或活性的方法在本發(fā)明各種實(shí)施方案中，通過改變或修飾表達(dá)mRNA的豐度或活性來產(chǎn)生臨床上有益的效果。目前，修飾RNA豐度和活性的方法包括4類核酶、反義物、雙鏈RNA和RNA適體(aptamer)(Good等，Gene Therapy，4卷，45-54頁(1997))。將細(xì)胞可控性應(yīng)用或暴露于這些實(shí)體允許可控地干擾RNA的豐度，包括mRNA豐度和活性，所述活性包括mRNA向活性或可檢測的基因表達(dá)產(chǎn)物(即蛋白質(zhì))的翻譯。
核酶核酶是以與DNA限制性內(nèi)切核酸酶相似的方式特異切割其它單鏈RNA的RNA分子。核酶具有催化RNA切割反應(yīng)的能力(Cech，Science，236卷，1532-1539頁(1987)；1990年10月4日公開的PCT國際公布WO90/11364；Sarver等，Science，247卷，1222-1225頁(1990))。如Cech，Amer.Med.Assn.，260卷，3030頁(1988)所述，通過修飾編碼RNA的核苷酸序列，可以合成核酶以識別分子中特異核苷酸序列并將其切割。因此，僅具有特定序列的mRNA被切割和失活。
兩種基本類型的核酶包括“錘頭”型(如，Rossie等，Pharmac.Ther.，50卷，245-254頁(1991)中所述)和“發(fā)夾”型核酶(如Hampel等，Nucl.Acids Res.，18卷，299-304頁(1999)和美國專利號5,254,678中所述)?？梢栽O(shè)計(jì)發(fā)夾和錘頭RNA核酶以特異切割特定的靶mRNA。已經(jīng)確立了設(shè)計(jì)具有核酶活性的短RNA分子的規(guī)則，該RNA分子能以高度序列特異性方式切割其它RNA分子，并且能靶向?qū)嶋H上所有種類的RNA(Haseloff等，Nature，334卷，585-591頁(1988)；Koizumi等，F(xiàn)EBS Lett.，228卷，228-230頁(1988)；Koizumi等，F(xiàn)EBS Lett.，239卷，285-288頁(1988))。
核酶方法涉及使細(xì)胞暴露于這種小RNA核酶分子以誘導(dǎo)細(xì)胞中的表達(dá)，等(Grassi和Marini，Annals of Medicine，28卷，499-510頁(1996)；Gibson，Cancer and Metastasis Reviews，15卷，287-299頁(1996))?？梢酝ㄟ^靶向?qū)?yīng)于至少一種公開基因的mRNA的錘頭和發(fā)夾核酶在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)以抑制該基因編碼的蛋白質(zhì)。
可以用包含核酶序列的RNA寡核苷酸形式直接向細(xì)胞遞送核酶，或者以編碼期望核酶RNA的表達(dá)載體形式向細(xì)胞引入核酶。核酶可以在體內(nèi)以足夠有效催化切割mRNA的數(shù)量常規(guī)地表達(dá)，因此修飾細(xì)胞中mRNA豐度(參見，Cotton等，“核酸介導(dǎo)的體內(nèi)RNA破壞”，The EMBO J.，8卷，3861-3866頁(1989))。特別地，可以將根據(jù)以前規(guī)則設(shè)計(jì)，并且例如通過標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)法合成的核酶編碼DNA序列連接到編碼tRNA的基因的反密碼子莖和環(huán)的限制性酶位點(diǎn)中，然后通過本領(lǐng)域常規(guī)方法轉(zhuǎn)化其進(jìn)入目的細(xì)胞并在細(xì)胞中表達(dá)。優(yōu)選地，還向該構(gòu)建體引入誘導(dǎo)型啟動子(例如，糖皮質(zhì)激素或四環(huán)素效應(yīng)元件)，這樣可以選擇地控制核酶表達(dá)。對于飽和應(yīng)用，可以利用具有組成型高活性的啟動子。因?yàn)閠DNA基因(即，編碼tRNA的基因)的小尺寸和在不同種類組織中的高轉(zhuǎn)錄速率及普遍表達(dá)，所以在本申請中是有用的。
因此，可以常規(guī)地設(shè)計(jì)核酶以切割實(shí)際上任何mRNA序列，并且可以用編碼這種核酶序列的DNA常規(guī)地轉(zhuǎn)化細(xì)胞以可控表達(dá)催化有效量的核酶。因此，可以修飾或干擾細(xì)胞中實(shí)際上任何RNA物類的豐度。
可以用與就反義核苷酸所述的方式基本相同的方式修飾核酶序列，例如核酶序列可以含有修飾的堿基部分。
反義分子在另一個實(shí)施方案中，可以通過反義核酸的可控應(yīng)用可控地抑制靶RNA(優(yōu)選mRNA)種類的活性，特別是其翻譯速率。高水平應(yīng)用引起飽和抑制。這里所用的“反義”核酸指能夠借助于與編碼和/或非編碼區(qū)域的一定序列互補(bǔ)性而與靶RNA的序列特異(例如非polyA)部分(例如其翻譯起始區(qū))雜交的核酸。本發(fā)明的反義核酸可以是雙鏈或單鏈寡核苷酸，可以是RNA或DNA或其修飾物或衍生物，并且可以以可控方式給細(xì)胞直接施用，或者可以通過外源引入序列的轉(zhuǎn)錄-以足夠干擾靶RNA翻譯的可控量在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生。
優(yōu)選地，反義核酸至少具有6個核苷酸，優(yōu)選是寡核苷酸(范圍從6到約200個寡核苷酸)。在特定方面，寡核苷酸具有至少10個核苷酸，至少15個核苷酸，至少100個核苷酸，或至少200個核苷酸。寡核苷酸可以是DNA或RNA或它們的嵌合混合物或衍生物或修飾形式，并可以是單鏈或雙鏈?？梢栽趬A基部分，糖部分或磷酸骨架修飾寡核苷酸。寡核苷酸可以包含其它附加基團(tuán)，如肽或有利于跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的因子(參見，例如Letsinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86卷，6553-6556頁(1989)；Lemaitre等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84卷，648-652頁(1987)；1998年12月15日公開的PCT公開號.WO 88/09810)、雜交觸發(fā)的切割劑(參見，例如Krol等，BioTechniques，6卷，958-976頁(1988))或嵌入劑(參見，例如Zon，Pharm.Res.，5卷，539-549頁(1988))。
在本發(fā)明優(yōu)選方面，提供優(yōu)選為單鏈DNA的反義寡核苷酸。可以用本領(lǐng)域公知的組分在寡核苷酸結(jié)構(gòu)的任何位置上修飾它。
典型的反義方法包括與基因編碼的mRNA互補(bǔ)的寡核苷酸(DNA或RNA)的制備。反義寡核苷酸將與該基因編碼的mRNA雜交，并且阻止翻譯。反義核苷酸序列與期望基因雜交的能力將取決于反義核苷酸序列的互補(bǔ)程度和長度。通常，隨雜交核酸長度增加，它可以含有更多與RNA錯配的堿基而仍舊形成穩(wěn)定的雙螺旋或三股螺旋。通過利用常規(guī)方法測定雜交復(fù)合物熔點(diǎn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定錯配的耐受程度。
優(yōu)選地，設(shè)計(jì)與mRNA 5’末端，例如，非翻譯序列直到并且包含mRNA起始位點(diǎn)，即AUG的區(qū)域互補(bǔ)的反義核苷酸。然而，正如Wagner，Nature，372卷，333頁(1994)所述，與mRNA 3’非翻譯序列互補(bǔ)的寡核苷酸序列也被證實(shí)可以有效地抑制mRNA翻譯。盡管可以設(shè)計(jì)與mRNA編碼區(qū)互補(bǔ)的反義寡核苷酸，但是這種寡核苷酸是不太有效的翻譯抑制劑。
反義寡核苷酸可以包含至少一個修飾的堿基部分，所述修飾的堿基部分選自包括但不限于5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黃嘌呤，黃嘌呤，4-乙酰胞嘧啶，5-(羧基羥甲基)尿嘧啶，5-羧基甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶，5-羧基甲基氨甲基尿嘧啶，二氫尿嘧啶，β-D-半乳糖queosine，次黃苷，N6-異戊烯腺嘌呤，1-甲基鳥嘌呤，1-甲基次黃苷，2，2-二甲基鳥嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鳥嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基鳥嘌呤，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶，β-D-甘露糖queosine，5′-甲氧基羧基甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲硫基-N6-異戊烯腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)，wybutoxosine，假尿苷，queosine，2-硫代胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)，5-甲基-2-硫尿嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2羧基丙基)尿嘧啶，(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。
在另一個實(shí)施方案中，寡核苷酸包含至少一個修飾的糖部分，所述修飾的糖部分選自但不限于阿拉伯糖，2-氟代阿拉伯糖，木酮糖和己糖。
在再一個實(shí)施方案中，寡核苷酸包含至少一個修飾的磷酸骨架，所述修飾的磷酸骨架選自硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，硫代氨基磷酸酯，氨基磷酸酯，二氨基磷酸酯，甲基膦酸酯，烷基磷酸三酯和formacetal或其類似物。
在再一個實(shí)施方案中，寡核苷酸是2-a-端基異構(gòu)寡核苷酸。a-端基異構(gòu)寡核苷酸與互補(bǔ)RNA形成特殊的雙鏈雜合體，其中與常見的B-單元相反，鏈的走向互相平行(Gautier等，Nucl.Acids Res.，15卷，6625-6641頁(1987))。
寡核苷酸可以與另外的分子，例如肽、雜交觸發(fā)的交聯(lián)劑、轉(zhuǎn)運(yùn)劑、雜交觸發(fā)的切割劑等綴合。
本發(fā)明的反義核酸包含與靶RNA物的至少一部分互補(bǔ)的序列。然而，盡管優(yōu)選完全互補(bǔ)，但是這不是必需的。如這里所提到的“與RNA至少一部分互補(bǔ)”的序列意指有足夠能與RNA雜交形成穩(wěn)定雙螺旋的互補(bǔ)性的序列；在雙鏈反義核酸的情況下，可以檢測雙螺旋DNA的單鏈，或可以測定三股螺旋的形成。雜交能力將取決于互補(bǔ)性程度和反義核酸長度。一般地，雜交核酸越長，它可以包含越多與靶RNA錯配的堿基而仍舊形成穩(wěn)定雙螺旋(或可能情況下，三股螺旋)。通過利用標(biāo)準(zhǔn)程序測定雜交復(fù)合物的熔點(diǎn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定錯配的耐受程度?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)測定技術(shù)確定有效抑制靶RNA翻譯的反義核酸量。
可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如通過應(yīng)用(如從Biosearch，Applied Biosystems等商購的)自動DNA合成儀合成本發(fā)明寡核苷酸。例如，可以通過Stein等，Nucl.Acids Res.，16卷，3209頁(1988)的方法合成硫代磷酸酯寡核苷酸，可以通過可控有孔玻璃聚合物載體的應(yīng)用制備甲基膦酸酯寡核苷酸(參見，Sarin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85卷，7448-7451頁(1988))等)。在另一個實(shí)施方案中，寡核苷酸是2’-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等，Nucl.Acids Res.，15卷，6131-6148頁(1987))，或嵌合RNA-DNA類似物(Inoue等，F(xiàn)EBS Lett.，215卷，327-330頁(1987))。
然后可以以可控或飽和方式給細(xì)胞施用合成的反義寡核苷酸。例如，可以在細(xì)胞生長環(huán)境中以可控水平放置反義寡核苷酸，從該環(huán)境中細(xì)胞可以攝取所述反義寡核苷酸。通過本領(lǐng)域公知方法的應(yīng)用可以幫助反義寡核苷酸的攝取。
當(dāng)反義寡核苷酸被引入宿主細(xì)胞時，其特異地與相應(yīng)于基因的細(xì)胞mRNA和/或基因組DNA雜交以例如，通過抑制細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯抑制編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)。
可以例如，以表達(dá)載體的形式遞送包含反義核苷酸序列的分離的核酸分子，當(dāng)在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄時，其將產(chǎn)生與基因編碼的mRNA的至少一個獨(dú)特部分互補(bǔ)的RNA?？商娲兀戳x核苷酸序列的分離的核酸分子是離體制備的寡核苷酸探針，并且當(dāng)將它引入細(xì)胞時，通過它與該基因的mRNA和/或基因組序列雜交將引起編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)受抑。
優(yōu)選地，寡核苷酸含有人工核苷酸間鍵，其使得反義分子具有對外切核酸酶和內(nèi)切核酸酶的抗性，因此在細(xì)胞中穩(wěn)定。例如，如在美國專利號5,176,996；5,264,564；和5,256,775所述，修飾的核酸分子用作反義核苷酸序列的例子是DNA的氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和甲基膦酸酯類似物。例如，在Van der Krol.，BioTechniques，6卷，958-976頁(1988)；和Stein等，Cancer Res.，48卷，2659-2668頁(1988)中描述了制備用于反義治療中的寡聚體的一般方法。
細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的反義分子如上所述，可以通過各種技術(shù)向表達(dá)所述基因的細(xì)胞體內(nèi)遞送反義核苷酸，所述技術(shù)包括例如直接注射反義核苷酸進(jìn)入乳腺組織位點(diǎn)，在脂質(zhì)體中包載反義核苷酸，通過連接反義核苷酸和特異性結(jié)合細(xì)胞表面表達(dá)的受體或抗原的肽或抗體而施用靶向乳腺細(xì)胞的修飾的反義核苷酸。
然而，利用上述遞送方法獲得足夠抑制內(nèi)源mRNA翻譯的細(xì)胞內(nèi)濃度可能是困難的。因此，在可替代的實(shí)施方案中，將包含反義核苷酸序列的核酸置于啟動子(即，起始特定基因轉(zhuǎn)錄所需的DNA序列)的轉(zhuǎn)錄控制之下以形成表達(dá)構(gòu)建體。通過從外源序列轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞內(nèi)可控地表達(dá)本發(fā)明的反義核酸。如果控制高水平的表達(dá)，那么就會出現(xiàn)飽和干擾和修飾結(jié)果。例如，可以體內(nèi)引入載體，這樣細(xì)胞將攝取該載體，在細(xì)胞內(nèi)載體或其部分轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生本發(fā)明反義核酸(RNA)。這種載體將含有編碼反義核酸的序列。只要載體可以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生期望的反義RNA，該載體可以保持游離型或在染色體上整合?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)方法構(gòu)建這種載體。載體可以是質(zhì)粒，病毒或本領(lǐng)域已知的其它可以用于哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制和表達(dá)的載體?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何啟動子起動目的細(xì)胞中編碼反義RNA的序列的表達(dá)。這種啟動子可以是誘導(dǎo)型或組成型的。最優(yōu)選地，啟動子可以通過外源部分的施用而控制或誘導(dǎo)，以實(shí)現(xiàn)反義寡核苷酸的可控表達(dá)。這種可控啟動子包括Tet啟動子。其它可用于哺乳動物細(xì)胞的啟動子包括但不限于SV40早期啟動子區(qū)域(參見，Bernoist和Chambon，Nature，290卷，304-310頁(1981))，勞氏肉瘤病毒3’長末端重復(fù)含有的啟動子(Yamamoto等，Cell，22卷，787-797頁(1980))，皰疹病毒胸苷激酶啟動子(Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78卷，1441-1445頁(1981))，金屬硫蛋白基因調(diào)節(jié)序列(Brinster等，Nature，296卷，39-42頁(1982))等。
因此，可以常規(guī)設(shè)計(jì)反義核酸以實(shí)際上靶向任何mRNA序列，可以用編碼這種反義序列的核酸常規(guī)地轉(zhuǎn)化細(xì)胞，或?qū)⒓?xì)胞暴露于編碼這種反義序列的核酸，這樣可以表達(dá)有效和可控或飽和量的反義核酸。因此，可以修飾或干擾細(xì)胞中實(shí)際上任何RNA種類的翻譯。
雙鏈RNA也可以利用對應(yīng)于至少一種公開基因的雙鏈RNA，即有義-反義RNA干擾至少一種公開基因的表達(dá)。已經(jīng)證明了在各種生物體，如秀麗隱桿線蟲(C.elegans)中通過雙鏈RNA可以干擾內(nèi)源基因的功能和表達(dá)，參見如Fire等，Nature，391卷，806-811頁(1998)中所述。
RNA適體最后，在再一實(shí)施方案中，可以在細(xì)胞中引入或表達(dá)RNA適體。RNA適體是蛋白質(zhì)的特異RNA配體，如針對Tat和Rev的RNA(Good等，GeneTherapy，4卷，45-54頁(1997))，其能特異地抑制它們的翻譯。
修飾表達(dá)蛋白質(zhì)的豐度或活性的方法修飾蛋白質(zhì)豐度的方法尤其包括改變蛋白質(zhì)降解速率的方法和利用抗體的方法(抗體結(jié)合蛋白質(zhì)從而影響天然靶蛋白質(zhì)物的活性或豐度)。直接修飾蛋白質(zhì)活性的方法尤其包括抗體、顯性負(fù)突變、特異性藥物或化學(xué)部分的應(yīng)用。
增加(或降低)一種蛋白質(zhì)的降解速率可以降低(或增加)該種蛋白質(zhì)的豐度。通過應(yīng)答升高的溫度和/或暴露于特定的藥物而增加靶蛋白質(zhì)降解速率的方法是本領(lǐng)域已知的，可以在本發(fā)明中利用該方法。例如，一種方法利用了熱誘導(dǎo)或藥物誘導(dǎo)的N-端degron，其是N-端蛋白質(zhì)片段，在較高溫度(例如37℃)該片段暴露降解信號促進(jìn)快速蛋白質(zhì)降解，在較低溫度(例如23℃)該片段被隱藏起來以阻止快速降解(參見，Dohmen，Science，263卷，1273-1276頁(1994))。這種degron的一個例子是Arg-DHFRts—鼠科二氫葉酸還原酶的變異體，其中在N-末端Arg置換Val并且Leu置換位置66的Pro。根據(jù)該方法，可以例如，通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)基因靶向方法(Lodish等，″Molecular Biology of the cell″，W.H.Freeman和Co.，NY(1995)，特別是第8章)，用編碼融合蛋白質(zhì)Ub-Arg-DHFRts-P(“Ub”代表遍在蛋白，“P”代表靶蛋白)的基因置換靶蛋白質(zhì)P的基因。N-末端的遍在蛋白在翻譯后被快速切割從而暴露出N-末端degron。在較低溫度時，不暴露Arg-DHFRts內(nèi)部的賴氨酸，沒有出現(xiàn)融合蛋白質(zhì)的遍在蛋白化，降解慢，并且活性靶蛋白質(zhì)水平高。在較高溫度(在氨甲喋呤不存在的情況下)，暴露Arg-DHFRts內(nèi)部的賴氨酸，融合蛋白質(zhì)出現(xiàn)遍在蛋白化，降解快速，并且活性靶蛋白質(zhì)水平低。
因?yàn)榻到獾臒峄罨梢酝ㄟ^暴露氨甲喋呤可控地阻斷，所以該技術(shù)也允許降解速率的可控修飾。該方法適用于對其它誘導(dǎo)因素，如藥物和溫度變化產(chǎn)生應(yīng)答的其它N-末端degron。而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可以利用結(jié)合和抑制靶蛋白質(zhì)的抗體的表達(dá)作為另一個顯性負(fù)策略。
用小分子藥物或配體修飾表達(dá)的蛋白質(zhì)活性此外，可以通過暴露于外源藥物或配體，以可控或飽和方式修飾或干擾一些靶蛋白質(zhì)的活性。因?yàn)楸景l(fā)明方法常常應(yīng)用于試驗(yàn)或證明各種藥物對治療癌癥的有用性，所以藥物暴露是修飾/干擾細(xì)胞組分-mRNA和表達(dá)的蛋白質(zhì)的重要方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過藥物暴露或基因操作(如基因缺失或剔除)干擾輸入細(xì)胞組分，并通過基因表達(dá)技術(shù)(如下述對基因轉(zhuǎn)錄物陣列的雜交)測定系統(tǒng)應(yīng)答。
在一種優(yōu)選的情況下，已知藥物與細(xì)胞中僅僅一種靶蛋白質(zhì)相互作用，并且改變僅僅該一種靶蛋白質(zhì)的活性，即或者增加活性或者降低該活性。因此，細(xì)胞與變化量的該藥物的梯度接觸將引起對其中該靶蛋白質(zhì)作為輸入物的網(wǎng)絡(luò)模型的梯度干擾。飽和暴露引起飽和修飾/干擾。例如，環(huán)孢菌素A是非常特異的鈣調(diào)磷酸酶蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)劑，其通過親環(huán)蛋白復(fù)合起作用。因此可以利用一系列滴度的環(huán)孢菌素A產(chǎn)生任何期望強(qiáng)度的鈣調(diào)磷酸酶蛋白質(zhì)抑制作用?？商娲兀柡捅┞队诃h(huán)孢菌素A將最大程度地抑制鈣調(diào)磷酸酶蛋白質(zhì)。
用抗體和拮抗劑修飾蛋白質(zhì)活性術(shù)語“拮抗劑”指當(dāng)與基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)合時可抑制其活性的分子。拮抗劑包括但不限于肽、蛋白質(zhì)、碳水化合物和小分子。
在特別有用的實(shí)施方案中，拮抗劑是對至少一種基因表達(dá)的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)特異的抗體。用作治療劑的抗體包括上述抗體?？贵w單獨(dú)可以作為治療的效應(yīng)物起作用，或它可以征募其它細(xì)胞以實(shí)際上實(shí)現(xiàn)細(xì)胞殺傷。抗體也可以與試劑，如化療藥物，放射性核素，蓖麻毒蛋白A鏈，霍亂毒素，百日咳毒素等綴合，并且用作定向藥劑?？商娲?，效應(yīng)物可以是帶有直接或間接與腫瘤靶相互作用的表面分子的淋巴細(xì)胞。各種效應(yīng)細(xì)胞包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞和NK細(xì)胞。
用在治療中的抗體-治療劑綴合物的例子包括，但不限于1)與放射性核素如125I，131I，123I，111In，105Rh，153Sm，67Cu，67Ga，166HO′，177LU，186Re和188Re偶聯(lián)的抗體，并且可參見如，Goldenberg等，Cancer Res.，41卷，4354-4360頁(1981)；Carrasquillo等，Cancer Treat.Rep.，68卷，317-328頁(1984)；Zalcberg等，J.Natl.Cancer Inst.，72卷，697-704頁(1984)；Jones等，Int.J.Cancer，35卷，715-720頁(1985)；Lange等，Surgery，98卷，143-150頁(1985)；Kaltovich等，J.Nucl.Med.，27卷，897頁(1986)；Order等，Int.J.Radiother.Oncol.Biol.Phys.，8卷，259-261頁(1982)；Courtenay-Luck等，Lancet，1卷，1441-1443頁(1984)；和Ettinger等，Cancer Treat.Rep.，66卷，289-297頁(1982)中所述；2)與藥物或生物應(yīng)答修飾劑，如氨甲喋呤，阿霉素和淋巴因子，如干擾素偶聯(lián)的抗體，參見例如Chabner等，″Cancer，Principles and Practice of Oncology″，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia，PA，1卷，290-328頁(1985)；Oldham等，″Principles and Practice of Oncology″，Cancer，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia，PA，2卷，2223-2245頁(1985)；Deguchi等，Cancer Res.，46卷，43751-43755頁(1986)；Deguchi等，F(xiàn)ed.Proc.，44卷，1684頁(1985)；Embleton等，Br.J.Cancer，49卷，559-565頁(1984)；和Pimm等，CancerImmunol.Immunother.，12卷，125-134頁(1982)中所述；3)與毒素偶聯(lián)的抗體，參見例如Uhr等，″Monoclonal Antibodiesand Cancer″，Academic Press，Inc.，85-98頁(1983)；Vitetta等，″Biotechnology and Bio.Frontiers″，P.H.Abelson編輯，73-85頁(1984)；和Vitetta等，Science，219卷，pp.644-650頁(1983)中所述；4)異功能抗體，例如與另一個抗體偶聯(lián)或結(jié)合的抗體，這樣復(fù)合物既結(jié)合癌也結(jié)合效應(yīng)細(xì)胞，例如殺傷細(xì)胞如T細(xì)胞，參見例如Perez等，J.Exper.Med.，163卷，166-178頁(1986)；和Lau等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82卷，8648-8652頁(1985)中所述；和5)天然的，即非綴合或非復(fù)合的抗體，參見例如，Herlyn等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79卷，4761-4765頁(1982)；Schulz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80卷，5407-5411頁(1983)；Capone等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80卷，7328-7332頁(1983)；Sears等，Cancer Res.，45卷，5910-5913頁(1985)；Nepom等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81卷，2864-2867頁(1984)；Koprowski等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，81卷，216-219頁(1984)；和Houghton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82卷，1242-1246頁(1985)中所述。
偶聯(lián)抗體或其片段與如上所述治療劑的方法是本領(lǐng)域公知的，并且在上述參考文獻(xiàn)中提供的方法中描述了這些方法。
拮抗劑作為治療劑的用途在再一個實(shí)施方案中，作為治療乳腺癌治療劑的拮抗劑可以是一種公開基因編碼的蛋白質(zhì)的抑制劑。例如，通過利用特異的絲氨酸蛋白酶抑制劑可以抑制膜結(jié)合的絲氨酸蛋白酶hepsin的活性，而這將以最小的系統(tǒng)毒性阻斷惡性乳腺細(xì)胞的生長。這種絲氨酸蛋白酶抑制劑是本領(lǐng)域已知的。例如，arotinin是已批準(zhǔn)用于降低心肺旁路手術(shù)中的血液損失和輸血需要的絲氨酸蛋白酶抑制劑，其抑制激肽釋放酶和血纖蛋白溶酶，引起參與炎癥反應(yīng)的多系統(tǒng)的抑制(參見，Ann.Thorac.Surg.，71卷，2期，745-754頁(2001))。
Maspin(乳房Serpin)是具有抑制乳腺癌腫瘤功能的、與serpin家族有關(guān)的新絲氨酸蛋白酶抑制劑(參見Acta.Oncol.，39卷，8期，931-934頁(2000))。
凝血酶和因子Xa(fXa)是唯一開發(fā)出的小的、有效的、選擇性非共價抑制劑的絲氨酸蛋白酶，這些抑制劑最終計(jì)劃用作藥物開發(fā)的候選者(在這種情況下，作為抗凝血劑)(參見，Med.Res.Rev.，19卷，2期，179-197頁(1999)).。
通過(中和)抗體也可以降低靶蛋白質(zhì)活性。通過提供對這種抗體的可控或飽和暴露，可以以可控或飽和方式修飾或干擾蛋白質(zhì)豐度/活性。例如，針對蛋白質(zhì)表面上適合抗原表位的抗體可以通過聚集靶蛋白質(zhì)活性形式成為與未聚集野生型形式的野生型比較具有較少或最少活性的復(fù)合物而降低靶蛋白質(zhì)野生型活性形式的豐度，由此間接地降低活性。可替代地，抗體可以通過，例如直接與活性位點(diǎn)相互作用或通過阻斷底物接近活性位點(diǎn)，直接降低蛋白質(zhì)活性。相反地，在一些情況下，(激活)抗體也可以與蛋白質(zhì)和它們的活性位點(diǎn)相互作用以增加所產(chǎn)生的活性。在任何情況下，均可以(通過將要描述的方法)產(chǎn)生抗特異蛋白質(zhì)種類的(將要描述的各種類型的)抗體并對它們的效果進(jìn)行篩選。例如可以測定抗體的效果，選擇提高或降低靶蛋白質(zhì)種類的濃度和/或活性的適合抗體。這種測定包括向細(xì)胞引入抗體(參見下文)，并通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法(如免疫測定法)測定野生型靶蛋白質(zhì)濃度或活性。通過適于靶蛋白質(zhì)已知活性的測定方法可以測定野生型形式的凈活性。
向細(xì)胞中引入抗體可以用許多方式將抗體引入細(xì)胞，包括，例如顯微注射抗體進(jìn)入細(xì)胞(參見，Morgan等，Immunology Today，9卷，84-86頁(1988))或轉(zhuǎn)化編碼期望抗體的雜交瘤mRNA進(jìn)入細(xì)胞(參見，Burke等，Cell，36卷，847-858頁(1984))。在另一技術(shù)中，可以人工構(gòu)建重組抗體并在廣泛多種的非淋巴細(xì)胞類型中異位地表達(dá)以結(jié)合靶蛋白質(zhì)及阻斷靶蛋白質(zhì)活性(Biocca等，Trends in Cell Biology，5卷，248-252頁(1995))。優(yōu)選地，抗體表達(dá)受可控啟動子如Tet啟動子或組成活性啟動子(用于產(chǎn)生飽和干擾)控制。第一步是篩選對靶蛋白質(zhì)具有適當(dāng)特異性的特定單克隆抗體(參見下文)。然后，將編碼選定抗體可變區(qū)的序列克隆入各種基因工程化抗體形式，包括，例如完整抗體、Fab片段、Fv片段、單鏈Fv片段(通過肽接頭連接的VH和VL區(qū)域)(”ScFv”片段)、diabodies(兩個結(jié)合在一起的具有不同特異性的ScFv片段)等等(Hayden等，Current Opinion in Immunology，9卷，210-212頁(1997))。通過使細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的各種形式抗體表達(dá)為與各種已知細(xì)胞內(nèi)前導(dǎo)序列融合的蛋白質(zhì)，可以使它們定向進(jìn)入細(xì)胞區(qū)室(例如，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和線粒體等)(Bradbury等，Antibody Engineerinq，2卷，Borrebaeck編輯，295-361頁，IRL Press(1995))。特別地，ScFv形式看似特別適合于細(xì)胞質(zhì)靶向。
各種有用的抗體類型抗體類型包括但不限于多克隆、單克隆、嵌合、單鏈抗體及Fab片段和Fab表達(dá)文庫。本領(lǐng)域已知的各種方法可以用于產(chǎn)生靶蛋白質(zhì)的多克隆抗體。為了產(chǎn)生抗體，可以用靶蛋白質(zhì)注射免疫各種宿主動物，這種宿主動物包括但不限于家兔、小鼠和大鼠等?？梢愿鶕?jù)宿主物種，利用各種佐劑增加免疫應(yīng)答，所述佐劑包括但不限于弗氏(完全和不完全)佐劑、礦物凝膠如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、多聚醇、聚陰離子、肽、油乳劑、二硝基苯酚和潛在有用的人用佐劑如卡介菌(BCG)和小型棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。
單克隆抗體為了制備指向靶蛋白質(zhì)的單克隆抗體，可以利用任何可允許培養(yǎng)的連續(xù)細(xì)胞系生產(chǎn)抗體分子的技術(shù)。這種技術(shù)包括但不限于Kohler和Milstein，Nature，256卷，495-497頁(1975)最初研究開發(fā)的雜交瘤技術(shù)，trioma技術(shù)和人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(參見，Kozbor等，Immunology Today，4卷，72頁(1983))，和產(chǎn)生人單克隆抗體的EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等，″MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy″，Alan R.Liss，Inc.，77-96頁(1985))。在本發(fā)明其它實(shí)施方案中，可以利用最近的技術(shù)在無菌動物中產(chǎn)生單克隆抗體(PCT/US90/02545)。根據(jù)本發(fā)明，可以利用人抗體，并且可以通過利用人雜交瘤(參見，Cote等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80卷，2026-2030頁(1983))或通過用EBV病毒體外轉(zhuǎn)化人B細(xì)胞(參見，Cole等，″MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy″，Alan R.Liss，Inc.，77-96頁(1985))獲得人抗體。實(shí)際上，根據(jù)本發(fā)明，可以利用開發(fā)的“嵌合抗體”產(chǎn)生技術(shù)，該技術(shù)通過將對靶蛋白質(zhì)特異的小鼠抗體分子的基因和具適當(dāng)生物學(xué)活性的人抗體分子的基因拼接在一起實(shí)施(參見Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81卷，6851-6855頁(1984)；Neuberger等，Nature，312卷，604-608頁(1984)；Takeda等，Nature，314卷，452-454頁(1985))；這種抗體在本發(fā)明范圍內(nèi)。
此外，當(dāng)單克隆抗體是有利的時，備選地可以用噬菌體展示技術(shù)從大抗體文庫選擇它們(參見，Marks等，J.Biol.Chem.，267卷，16007-16010頁(1992))。利用該技術(shù)，已在fd絲狀噬菌體表面表達(dá)了多達(dá)1012個不同抗體的文庫，產(chǎn)生可用于單克隆抗體篩選的“單罐”體外抗體免疫系統(tǒng)(參見，Griffiths等，EMBO J.，13卷，3245-3260頁(1994))?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的技術(shù)，包括讓噬菌體接觸固定的靶蛋白質(zhì)、篩選和克隆結(jié)合靶的噬菌體并將編碼抗體可變區(qū)的序列亞克隆入表達(dá)期望抗體形式的適合載體中，從這種文庫中篩選抗體。
根據(jù)本發(fā)明，可以適應(yīng)性修改美國專利號4,946,778所述的單鏈抗體產(chǎn)生技術(shù)以產(chǎn)生對靶蛋白質(zhì)特異的單鏈抗體。本發(fā)明的其它實(shí)施方案利用了Fab表達(dá)文庫構(gòu)建技術(shù)(參見，Huse等，Science，246卷，1275-1281頁(1989))以允許快速和簡便地鑒定對靶蛋白質(zhì)具有期望特異性的單克隆Fab片段。
可以通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)產(chǎn)生包含獨(dú)特型的靶蛋白質(zhì)的抗體片段。例如，這種片段包括但不限于可以通過胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生的F(ab’)2片段；可以通過還原F(ab’)2片段的二硫橋產(chǎn)生的Fab’片段；可以通過用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子產(chǎn)生的Fab片段和Fv片段。
在抗體產(chǎn)生中，可以通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)，例如ELISA完成期望抗體的篩選。為了篩選對靶蛋白質(zhì)特異的抗體，可以測定產(chǎn)生的雜交瘤或噬菌體展示抗體庫以尋找能結(jié)合靶蛋白質(zhì)的抗體。
修飾蛋白質(zhì)活性的其它方法顯性負(fù)突變是當(dāng)在細(xì)胞中表達(dá)時可破壞靶蛋白質(zhì)物活性的內(nèi)源基因突變或外源基因突變體。根據(jù)靶蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性，存在選擇構(gòu)建顯性負(fù)突變適當(dāng)策略的一般指導(dǎo)原則，所述顯性負(fù)突變將破壞靶活性(參見，Hershkowitz，Nature，329卷，219-222頁(1987))。在活性單體形式的情況下，失活形式的超表達(dá)可以引起足以顯著地降低靶蛋白質(zhì)凈活性的對天然底物或配體的競爭。通過，例如連接具有增加活性的啟動子，優(yōu)選可控或誘導(dǎo)型啟動子，或組成型表達(dá)啟動子和突變體基因可以實(shí)現(xiàn)這種超表達(dá)。可替代地，可以進(jìn)行對活性位點(diǎn)殘基的改變，從而造成與靶配體實(shí)際上不可逆轉(zhuǎn)的連接。這可以通過小心置換活性位點(diǎn)的絲氨酸殘基，用某些酪氨酸激酶實(shí)現(xiàn)(參見，Perlmutter等，Current Opinion in Immunology，8卷，285-290頁(1996))。
在活性多亞基形式的情況下，有幾種策略可以指導(dǎo)對顯性負(fù)突變體的選擇。通過表達(dá)編碼外源蛋白質(zhì)片段的基因可以以可控或飽和方式降低多亞基的活性，所述外源蛋白質(zhì)片段能結(jié)合多亞基關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域并且阻止多聚體形成。可替代地，特定類型失活蛋白質(zhì)單元的可控或飽和超表達(dá)可以將野生型活性單元束縛在失活多聚體中，因此降低多聚體活性(參見，Nocka等，EMBO J.，9卷，1805-1813頁(1990))。例如，在二聚體DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的情況下，可以從DNA結(jié)合單元中缺失DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或者從活化單元中缺失活化結(jié)構(gòu)域。而且，在這種情況下，可以表達(dá)這樣的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域單元，該結(jié)構(gòu)域單元沒有引起與活化單元結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。因此，占用DNA結(jié)合位點(diǎn)，而沒有任何可能激活表達(dá)。
對于在活性期間特定類型的單元正常將進(jìn)行構(gòu)象變化的情況，剛性單元的表達(dá)可以失活由此得到的復(fù)合物。再例如，參與細(xì)胞機(jī)制，如細(xì)胞運(yùn)動、有絲分裂過程、細(xì)胞構(gòu)建等的蛋白質(zhì)通常是由許多屬于幾種類型的亞基相結(jié)合而組成。這些結(jié)構(gòu)對將幾種具有結(jié)構(gòu)缺陷的單體單元包括在內(nèi)的破壞常常高度敏感。這種突變單體將破壞相關(guān)蛋白質(zhì)活性，可以在細(xì)胞內(nèi)以可控或飽和方式表達(dá)。
除了顯性負(fù)突變外，通過本領(lǐng)域公知的誘變和篩選方法可以發(fā)現(xiàn)對溫度(或其它外源因子)敏感的突變靶蛋白質(zhì)。
治療形式在用反義核苷酸治療的情況下，該方法包括給予治療有效量的分離的核酸分子，該分離的核酸分子包含來源于表1，2，3或4中鑒定的至少一種基因的反義核苷酸序列，其中該反義核苷酸有改變所述至少一種基因的轉(zhuǎn)錄/翻譯的能力。術(shù)語“分離的”核酸分子意指從其原始環(huán)境中(例如，當(dāng)核酸分子為天然的，則為天然環(huán)境)移出的核酸分子。例如，天然存在的核酸分子不是分離的，但是對于從天然系統(tǒng)中的一些或所有共存物質(zhì)中分離出的相同核酸分子，即使其隨后再將被引入該天然系統(tǒng)，其也是分離的。這種核酸分子可以是載體的一部分或組合物的一部分，并且仍舊是分離的，因?yàn)檫@種載體或組合物不是核酸分子的天然環(huán)境的一部分。
在用核酶或雙鏈RNA分子治療的方面，該方法包括給予治療有效量的編碼核酶的核苷酸序列或雙鏈RNA分子，其中編碼核酶的核苷酸序列/雙鏈RNA分子有改變所述至少一種基因的轉(zhuǎn)錄/翻譯的能力。
在用拮抗劑治療的情況下，該方法包括給予患者治療有效量的拮抗劑，該拮抗劑能抑制或激活表1，2，3或4中鑒定的至少一種基因所編碼的蛋白質(zhì)。
包含反義核苷酸的分離核酸分子、編碼核酶的核苷酸序列、雙鏈RNA或拮抗劑的“治療有效量”是指這些治療劑之一足以治療乳腺癌(例如限制乳腺癌生長或延緩或阻止腫瘤轉(zhuǎn)移)的量。治療有效量的確定在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。對于任何治療而言，可以在例如贅生性細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物中或者在動物模型，通常是小鼠、兔，狗或豬中最初測估治療有效劑量。也可以用動物模型確定給藥的適合濃度范圍和途徑。然后可以利用這些信息確定人類給藥時的有用劑量和途徑。
可以通過標(biāo)準(zhǔn)藥理學(xué)方法，在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動物中測定治療效力和毒性，例如ED50(在50％群體中治療有效的劑量)和LD50(造成群體50％致死的劑量)。毒性作用和治療作用間的劑量比率是治療指數(shù)，并且其可以表示為比率LD50/ED50。優(yōu)選顯示大治療指數(shù)的反義核苷酸、核酶、雙鏈RNA和拮抗劑。在制定人用劑量范圍時可以利用從細(xì)胞培養(yǎng)物測定和動物研究獲得的數(shù)據(jù)。在這種組合物中含有的劑量優(yōu)選在如下循環(huán)濃度范圍內(nèi)，該循環(huán)濃度范圍包括幾乎沒有或完全沒有毒性的ED50。根據(jù)所用的劑量形式、患者的敏感性和給藥途徑，劑量可在該范圍內(nèi)變化。
根據(jù)與需要治療的患者相關(guān)的因素，醫(yī)師可以確定確切的劑量?？梢哉{(diào)整劑量和給藥方案以提供足夠水平的活性部分或維持期望的效果。可能考慮的因素包括患者疾病狀態(tài)的嚴(yán)重性、總的健康、患者的年齡、體重和性別、飲食、給藥時間和頻率、藥物聯(lián)合、反應(yīng)敏感性和對治療的耐受性/應(yīng)答。
根據(jù)給藥途徑，正常的劑量可以從0.1到100,000微克，直到約1g的總劑量。在文獻(xiàn)中提供了關(guān)于特定劑量和遞送方法的指導(dǎo)，并且本領(lǐng)域的從業(yè)者一般可以獲得該指導(dǎo)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將對核苷酸和拮抗劑使用不同的制劑。
對于治療應(yīng)用，優(yōu)選反義核苷酸、編碼核酶的核苷酸序列、雙鏈RNA(無論在脂質(zhì)體中包載還是包含在病毒載體中)和抗體作為藥物組合物給藥，該藥物組合物將含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體以及所述治療劑?？梢詥为?dú)給予該組合物或與至少一種其它藥劑，如穩(wěn)定化合物聯(lián)合給藥；可以在任何無菌、生物相容的藥物載體，包括但不限于鹽水，緩沖鹽水，葡萄糖和水中施用該組合物。可以單獨(dú)給予患者該組合物，或者還給予患者其它藥劑、藥物或激素。
可以通過多種途徑，包括但不限于口服，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，關(guān)節(jié)內(nèi)，動脈內(nèi)，髓內(nèi)，鞘內(nèi)，心室內(nèi)，透皮，皮下，腹膜內(nèi)，鼻內(nèi)，腸道，局部，舌下或直腸方式給予藥物組合物。除了活性組分外，這些藥物組合物可以含有適宜的藥學(xué)上可接受的載體，包括有利于將活性化合物加工為藥學(xué)上可利用的制劑的賦形劑和助劑?？梢栽谧罱姹镜摹癛emington’sPharmaceutical Sciences”，Maack Publishing Co.，Easton，PA.中發(fā)現(xiàn)關(guān)于制劑和給藥技術(shù)的更多細(xì)節(jié)。
利用本領(lǐng)域公知的適于口服給藥的藥學(xué)上可接受的載體，可以配制備口服給藥的藥物組合物。這種載體使得藥物組合物可以配制成可被患者消化的片劑，丸劑，糖衣丸，膠囊，液體，凝膠，糖漿，漿液，懸浮液等。
通過如下方式可以獲得口服用的藥物制劑混合活性化合物和固體賦形劑，可選地，研磨由此得到的混合物，并加工顆粒混合物(如果期望，在添加適宜助劑后)，獲得片劑或糖衣丸芯。適宜的賦形劑是碳水化合物或蛋白質(zhì)填充劑，如糖，包括乳糖，蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；來源于玉米、小麥、水稻、馬鈴薯或其它植物的淀粉；纖維素，如甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素或者羧甲基纖維素鈉；樹膠如阿拉伯膠和黃蓍膠；和蛋白質(zhì)如明膠和膠原蛋白。如果期望，可以添加崩解劑或穩(wěn)定劑，如交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮，瓊脂，海藻酸或其鹽，如海藻酸鈉。
糖衣丸芯可以與適合的包衣，如濃縮的糖溶液聯(lián)合使用，其也可以含有阿拉伯膠，滑石，聚乙烯吡咯烷酮，聚羰乙烯凝膠，聚乙二醇和/或二氧化鈦，紫膠漆溶液和適合的有機(jī)溶劑或溶劑混合物?？梢韵蚱瑒┗蛱且峦璋轮刑砑又珓┗蛏赜糜诋a(chǎn)品鑒定或表征活性化合物的量，如劑量。
可以口服使用的藥物制劑包括明膠制成的推入填充(push-fit)膠囊及由明膠和包衣如甘油或山梨醇制成的軟密封膠囊。推入填充(push-fit)契合膠囊可以含有與填充劑或粘合劑如乳糖或淀粉，潤滑劑如滑石或硬脂酸鎂和可選地穩(wěn)定劑混合的活性組分。在軟膠囊中，可以在有或無穩(wěn)定劑的適合液體，如脂肪油、液體或液體聚乙二醇中溶解或懸浮活性化合物。
可以在水溶液中，優(yōu)選生理學(xué)上相容的緩沖液，如Hank’s溶液、Ringer’s溶液或生理緩沖鹽水中制備適于腸胃外給藥的藥物制劑。水性注射懸浮液可以含有增加懸浮液粘度的物質(zhì)，如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。此外，可以將活性化合物的懸浮液制備為適合的油性注射懸浮液。適合的親脂性溶劑或載體包括脂肪油如芝麻油、或合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯、或脂質(zhì)體。非脂質(zhì)多聚陽離子(polycatonic)氨基聚合物也可以用于遞送?？蛇x地，懸浮液也可以包含適合的穩(wěn)定劑或增加化合物溶解性的試劑以允許高濃縮溶液的制備。
對于局部或鼻給藥，可在制劑中利用適于待滲透的特定屏障的滲透劑。這種滲透劑通常在本領(lǐng)域是已知的。
可以用本領(lǐng)域已知的方法制造本發(fā)明的藥物組合物，例如傳統(tǒng)的混合，溶解，?；?，制成糖衣丸，研磨，乳化，包封，截留(entrap)或凍干過程。
藥物組合物可以作為鹽提供，可以用許多酸，包括但不限于鹽酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸和琥珀酸等來成鹽。鹽在水性或其它質(zhì)子溶劑中比相應(yīng)的游離堿形式傾向于更容易溶解。在其它情況下，優(yōu)選的制劑可以是凍干粉末，該凍干粉末可以含有下列任一項(xiàng)或所有1-50mM組氨酸、0.1-2％蔗糖和2-7％甘露醇，pH4.5-5.5，使用前將粉末和緩沖液混合。
制備藥物組合物后，可以將它們放置在適合容器中并標(biāo)記上其用于治療的適應(yīng)癥。對于反義核苷酸或拮抗劑的施用，這種標(biāo)記將包括用量、頻率和給藥方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員將對反義核苷酸和拮抗劑，例如抗體或抑制劑使用不同制劑。例如，在美國專利號5,008,114；5,505,962；5,641,515；5,681,811；5,700,486；5,766,633；5,792,451；5,853,748；5,972,387；5,976,569；和6,051,561中描述了適于蛋白質(zhì)口服給藥的藥物制劑。
在另一方面，可以通過檢測至少一種公開基因編碼的mRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，或至少一種公開基因編碼的蛋白質(zhì)的活性，監(jiān)測用如上所述治療劑進(jìn)行的患者治療。這些測定將表明是否治療是有效的或是否應(yīng)該調(diào)整或優(yōu)化該治療。因此，在臨床試驗(yàn)期間，這里描述的一種或多種基因可以用作藥物效力的標(biāo)志物。
在特別有用的實(shí)施方案中，提供了監(jiān)測藥劑(如拮抗劑、蛋白質(zhì)、核酸、小分子或其它治療劑或通過本文所述篩選方法鑒定的候選藥劑)對患乳腺癌或有患乳腺癌危險的患者的治療效力的方法，包括a)在藥劑施用前從患者獲得給藥前的樣品；b)檢測給藥前樣品中由至少一種所述基因編碼的mRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平或由至少一種所述基因編碼的蛋白質(zhì)的活性；c)從患者獲得一個或多個給藥后的樣品；d)檢測給藥后樣品中由所述至少一種基因編碼的mRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平或由所述至少一種基因編碼的蛋白質(zhì)的活性；e)將給藥前樣品中由所述至少一種基因編碼的mRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平或由所述至少一種基因編碼的蛋白質(zhì)的活性和一個或多個給藥后樣品中由該至少一種基因編碼的mRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平或由該至少一種基因編碼的蛋白質(zhì)的活性作比較；和f)相應(yīng)地調(diào)整藥劑的給藥。
例如，可能期望增加藥劑給藥以改變所述至少一種基因的表達(dá)水平或活性使之比檢測到的水平高或低，即增加藥劑的有效性?？商娲兀赡芷谕麥p少藥劑給藥以改變所述至少一種基因的表達(dá)使之比檢測到的水平高或低，即降低藥劑的有效性。
在另一方面，提供了抑制患者中乳腺癌組織增生的方法，該方法利用了上述治療劑，例如反義核苷酸、核酶、雙鏈RNA和拮抗劑如抗體。在利用反義核苷酸抑制乳腺癌組織增生的方面，該方法包括給患者施用治療有效量的分離的核酸分子，該核酸分子包含來源于表1，2，3或4中鑒定的至少一種基因的反義核苷酸序列，其中該反義核苷酸有改變所述至少一種基因的轉(zhuǎn)錄/翻譯的能力。
在利用核酶抑制乳腺癌組織增生的方面，該方法包括給患者施用治療有效量的編碼核酶的核苷酸序列，該編碼核酶的核苷酸序列有改變表1，2，3或4中鑒定的至少一種基因的轉(zhuǎn)錄/翻譯的能力。
在利用雙鏈RNA抑制乳腺癌組織增生的方面，該方法包括給患者施用治療有效量的對應(yīng)于表1，2，3或4中鑒定的至少一種基因的雙鏈RNA，其中雙鏈RNA有改變所述至少一種基因的轉(zhuǎn)錄/翻譯的能力。
在利用拮抗劑抑制乳腺癌組織增生的方面，該方法包括給患者施用治療有效量的拮抗劑，該拮抗劑可以引起表1，2，3或4中鑒定的至少一種基因所編碼的蛋白質(zhì)的抑制或活化。
在抑制乳腺癌組織增生的情況下，包含反義核苷酸的分離的核酸分子、編碼核酶的核苷酸序列、雙鏈RNA或拮抗劑的“治療有效量”指這些治療藥劑之一足以抑制乳腺癌組織增生(例如，抑制或穩(wěn)定乳腺癌組織的細(xì)胞生長)的量，并且可以如上所述測定。
病毒載體的用途在另一個方面，提供了包含如下基因啟動子的病毒載體，該基因選自表1，2，3或4中鑒定的至少一種基因，其中所述啟動子可操作地連接載體復(fù)制所必需的基因編碼區(qū)，其中該載體適應(yīng)于在轉(zhuǎn)染進(jìn)入乳腺細(xì)胞后進(jìn)行復(fù)制。
這種載體能在乳腺組織中而不在非乳腺組織中選擇性復(fù)制。復(fù)制是以乳腺組織中存在陽性轉(zhuǎn)錄因子而非乳腺組織中不存在該陽性轉(zhuǎn)錄因子為條件的，該陽性轉(zhuǎn)錄因子將激活公開基因的啟動子。由于缺乏正常地出現(xiàn)在非乳腺組織中阻止啟動子轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄抑制因子，也可以出現(xiàn)復(fù)制。因此，當(dāng)轉(zhuǎn)錄發(fā)生時，它繼續(xù)進(jìn)入復(fù)制必需的基因，因此，在乳腺組織中而不在非乳腺組織中出現(xiàn)載體的復(fù)制和其伴隨的功能。利用該載體可以選擇性治療患病的乳腺組織，例如乳腺腫瘤，而具有最小的系統(tǒng)毒性。
在一個實(shí)施方案中，病毒載體是腺病毒載體，其包含載體復(fù)制所必需的基因編碼區(qū)，其中編碼區(qū)選自E1a，E1b，E2和E4編碼區(qū)。制備這種載體的方法對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是公知的，參見例如，Sambrook等，″Molecular CloningA Laboratory Manual″，Cold Spring Harbor，NY(1989)所述。
在再一實(shí)施方案中，載體編碼異源基因產(chǎn)物，該異源基因產(chǎn)物將在乳腺細(xì)胞中從該載體表達(dá)。異源基因產(chǎn)物提供了對患病乳腺組織，例如乳腺腫瘤生長的抑制、阻止或破壞作用。
基因產(chǎn)物可以是RNA，例如反義RNA或核酶，或蛋白質(zhì)，如細(xì)胞因子，例如白細(xì)胞介素，干擾素或毒素如白喉毒素、假單胞菌毒素等。異源基因產(chǎn)物也可以是負(fù)選擇性標(biāo)志物如胞嘧啶脫氨酶。這種負(fù)選擇性標(biāo)志物可以與其它藥劑相互作用以阻止、抑制或破壞患病乳腺細(xì)胞的生長。
可以將本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入用于病毒復(fù)制和產(chǎn)生感染性病毒顆粒的輔助細(xì)胞系?？商娲?，可以通過電穿孔、磷酸鈣沉淀，顯微注射或通過蛋白脂質(zhì)體(Proteoliposome)將載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入乳腺細(xì)胞。在例如美國專利號5,998,205中詳細(xì)描述了制備組織特異性復(fù)制載體的方法和它們在腫瘤細(xì)胞和其它類型異常細(xì)胞治療中的用途，所述腫瘤細(xì)胞和其它類型異常細(xì)胞在患者體內(nèi)是有害的或者是不希望的。
作為標(biāo)志物的核酸和蛋白質(zhì)的檢測在特別實(shí)施方案中，利用本領(lǐng)域已知的方法，通過在生物樣品中以原位和體外的方式檢測對應(yīng)于標(biāo)志物的mRNA的水平。術(shù)語“生物樣品”意指包括從患者分離的組織、細(xì)胞、生物液體和其分離物以及患者體內(nèi)存在的組織、細(xì)胞和液體。許多表達(dá)檢測方法利用分離的RNA。對于體外方法，任何不會選擇性地抵抗mRNA分離的RNA分離技術(shù)都可以用于乳腺細(xì)胞RNA的純化(參見，例如Ausubel等編輯，″Current Protocols in MolecularBiology″，John Wiley & Sons，NY(1987-1999))。此外，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)，如，Chomczynski，美國專利號4,843,155(1989)的單步RNA分離方法可以容易地處理大量的組織樣品。
分離的mRNA可以用在雜交或擴(kuò)增測定中，所述測定包括但不限于Southern或Northern分析，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分析和探針測定。一種優(yōu)選的用于mRNA水平檢測的診斷方法包括使分離的mRNA和核酸分子(探針)接觸，該核酸分子能與待檢測基因編碼的mRNA雜交。核酸探針可以是，例如全長cDNA或其部分，如長至少7，15，30，50，100，250或500個核苷酸并且在嚴(yán)格條件下足以特異性地與編碼本發(fā)明標(biāo)志物的mRNA或基因組DNA雜交的寡核苷酸。這里還描述了其它適用在本發(fā)明診斷測定中的適合探針。mRNA與探針的雜交表明正在表達(dá)所述標(biāo)志物。
在一種形式中，通過例如在瓊脂糖凝膠上電泳分離的mRNA，然后從凝膠轉(zhuǎn)移mRNA到膜，如硝酸纖維素膜上，固定mRNA在固相載體上并與探針接觸。在可替代形式中，例如在Affymetrix基因芯片陣列中，固定探針在固相載體上，并使mRNA與探針接觸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地修改已知的mRNA檢測方法以用在檢測本發(fā)明標(biāo)志物編碼的mRNA的水平中。
用于檢測樣品中對應(yīng)于本發(fā)明標(biāo)志物的mRNA水平的可替代方法涉及核酸擴(kuò)增過程，例如，通過rtPCR(見Mullis，美國專利號4,683,202(1987)中所述的實(shí)驗(yàn)實(shí)施方案)；連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Barany，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88卷，189-193頁(1991))；自動維持序列復(fù)制(Guatelli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87卷，1874-1878頁(1990))；轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增系統(tǒng)(Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86卷，1173-1177頁(1989))；Q-β復(fù)制酶(Lizardi等，Bio/Technology，6卷，1197頁(1988))；滾環(huán)復(fù)制(Lizardi等，美國專利號5,854,033(1988))；或任何其它核酸擴(kuò)增方法進(jìn)行的核酸擴(kuò)增過程，接著利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)檢測擴(kuò)增的分子。如果核酸分子以非常低的數(shù)量出現(xiàn)，這些檢測方案對于這種核酸分子的檢測特別有用。如這里所用，擴(kuò)增引物定義為能與基因(分別是正和負(fù)鏈，或反之亦然)5’或3’區(qū)域退火的一對核酸分子，在兩者間含有短區(qū)域。一般地，擴(kuò)增引物約是10-30個核苷酸長度，并且側(cè)翼為約50-200個核苷酸長度的區(qū)域。在適合的條件和具有適合試劑的情況下，這種引物允許包含引物所包圍的核苷酸序列的核酸分子擴(kuò)增。
對于原位方法，檢測前不需要從乳腺細(xì)胞分離mRNA。在這種方法中，用已知的組織學(xué)方法制備/處理細(xì)胞或組織樣品。然后在載體，通常是載玻片上固定樣品，然后與探針接觸，該探針可以與編碼標(biāo)志物的mRNA雜交。
作為基于標(biāo)志物的絕對表達(dá)水平進(jìn)行檢測的替代方案，可以基于標(biāo)志物的標(biāo)化表達(dá)水平進(jìn)行檢測。通過比較標(biāo)志物的表達(dá)和不是標(biāo)志物的基因，例如組成表達(dá)的持家基因的表達(dá)修正標(biāo)志物的絕對表達(dá)水平來標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)水平。用于標(biāo)準(zhǔn)化的適合基因包括持家基因如肌動蛋白基因或上皮細(xì)胞特異的基因。該標(biāo)準(zhǔn)化允許一個樣品，例如患者樣品中的表達(dá)水平與另一個樣品，例如非乳腺癌樣品中的表達(dá)水平進(jìn)行比較，或允許在不同來源的樣品間進(jìn)行比較。
可替代地，可以以相對表達(dá)水平的形式提供表達(dá)水平。為了確定標(biāo)志物的相對表達(dá)水平，在檢測所述樣品的表達(dá)水平前，檢測10個或更多，優(yōu)選50個或更多個正常的和癌細(xì)胞的分離物樣品的標(biāo)志物表達(dá)水平。確定在大量樣品中測定的每個基因的平均表達(dá)水平，并且用這個作為標(biāo)志物的基線表達(dá)水平。然后用測定的試驗(yàn)樣品的標(biāo)志物表達(dá)水平(絕對表達(dá)水平)除以針對該標(biāo)志物獲得的平均表達(dá)值。這提供了相對表達(dá)水平。
優(yōu)選地，用在基線測定中的樣品將來源于乳腺癌或者來源于乳腺組織的非乳腺癌細(xì)胞。細(xì)胞來源的選擇取決于相對表達(dá)水平的應(yīng)用。利用正常組織中的表達(dá)作為平均表達(dá)分?jǐn)?shù)可以有助于驗(yàn)證是否測定的標(biāo)志物是乳腺特異的(相對于正常細(xì)胞)。此外，隨著更多數(shù)據(jù)的積累，可以修正平均表達(dá)值，根據(jù)積累的數(shù)據(jù)提供改進(jìn)的相對表達(dá)值。來自乳腺細(xì)胞的表達(dá)數(shù)據(jù)提供了分級乳腺癌狀態(tài)嚴(yán)重性的手段。
在本發(fā)明另一個實(shí)施方案中，檢測對應(yīng)于標(biāo)志物的多肽。檢測本發(fā)明多肽的優(yōu)選試劑是能結(jié)合本發(fā)明標(biāo)志物對應(yīng)的多肽的抗體，優(yōu)選具有可檢測標(biāo)記的抗體?？贵w可以是多克隆，或更優(yōu)選地單克隆抗體。可以利用完整的抗體，或其片段(例如Fab或F(ab’)2)。涉及探針或抗體的術(shù)語“標(biāo)記的”意在包括通過偶聯(lián)(即，物理結(jié)合)可檢測的物質(zhì)到探針或抗體上對探針或抗體直接標(biāo)記，及通過與直接標(biāo)記的另一種試劑反應(yīng)對探針或抗體間接標(biāo)記。間接標(biāo)記的例子包括利用熒光標(biāo)記的第二抗體檢測第一抗體，和用熒光標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白檢測生物素末端標(biāo)記的DNA探針。
利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)可以從乳腺細(xì)胞分離蛋白質(zhì)?？梢允褂?，例如，在Harlow和Lane，″AntibodiesA Laboratory Manual″，Harlow和Lane，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1988)中所述的蛋白質(zhì)分離方法。
可以利用各種形式檢測是否樣品含有結(jié)合給定抗體的蛋白質(zhì)。這些形式的例子包括但不限于酶免疫測定法(EIA)；放射性免疫測定法(RIA)，Western印跡分析和ELISA。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地修改已知的蛋白質(zhì)/抗體檢測方法以用在檢測是否乳腺細(xì)胞表達(dá)本發(fā)明標(biāo)志物的方法中。
在一種形式中，抗體或抗體片段可以用在方法，如Western印跡或免疫熒光技術(shù)中以檢測表達(dá)的蛋白質(zhì)。在這種應(yīng)用中，一般優(yōu)選在固相支持體上固定抗體或蛋白質(zhì)。適合的固相支持體或載體包括能結(jié)合抗原或抗體的任何支持體。公知的支持體或載體包括玻璃，聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、直鏈淀粉、天然和改性的纖維素、聚丙烯酰胺、輝長巖和磁鐵礦。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道許多其它的用于結(jié)合抗體或抗原的適合載體，并且可以適應(yīng)性修改這種支持體以與本發(fā)明一起使用。例如，從乳腺細(xì)胞分離的蛋白質(zhì)可以在聚丙烯酰胺凝膠上電泳，并且固定在固相支持體如硝酸纖維素上。然后用適合的緩沖液洗支持體，接著用可檢測標(biāo)記的抗體處理。然后可以用緩沖液二次洗滌固相支持以除去未結(jié)合的抗體。然后可以通過常規(guī)方法檢測固相支持體上結(jié)合的標(biāo)記量。
本發(fā)明也包括用于檢測生物樣品(例如，乳腺相關(guān)體液、血清、血漿、淋巴、膽囊液體、尿、糞便、CSF、腹水或血液)中對應(yīng)于本發(fā)明標(biāo)志物的多肽或核酸存在的試劑盒。這種試劑盒可以用于檢測是否患者患有乳腺癌，或者處在患有乳腺癌的增加危險中。例如，該試劑盒可以包含能夠檢測生物樣品中對應(yīng)于本發(fā)明標(biāo)志物的多肽或編碼多肽的mRNA的標(biāo)記化合物或試劑，和測定樣品中多肽或mRNA量的手段(例如，結(jié)合多肽的抗體或結(jié)合編碼多肽的DNA或mRNA的寡核苷酸探針)。試劑盒也可以包含解釋用該試劑盒所得結(jié)果的說明書。
對于基于抗體的試劑盒，試劑盒可以包括，例如1)能結(jié)合對應(yīng)于本發(fā)明標(biāo)志物的多肽的第一抗體(例如，與固相支持體連接)，和可選地2)第二不同的抗體，該第二抗體可以結(jié)合多肽或第一抗體并且與可檢測標(biāo)記綴合。
對于基于寡核苷酸的試劑盒，該試劑盒可以包含，例如1)可與編碼對應(yīng)于本發(fā)明標(biāo)志物的多肽的核酸序列雜交的寡核苷酸，例如可檢測標(biāo)記的寡核苷酸；或者2)一對可用于擴(kuò)增對應(yīng)于本發(fā)明標(biāo)志物的核酸分子的引物。該試劑盒也可以包含，例如緩沖劑、防腐劑或蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。試劑盒可以進(jìn)一步包含檢測可檢測標(biāo)記所必需的組分(例如酶或底物)。試劑盒也可以包含對照樣品或系列對照樣品，可以測定這些對照樣品并且與試驗(yàn)樣品比較。
試劑盒的每種組分可以裝在單獨(dú)的容器中，并且所有的這各種容器可以與解釋該試劑盒的測定結(jié)果的說明書一起包在單個包裝中。
監(jiān)測臨床試驗(yàn)監(jiān)測試劑(例如藥物組合物)對本發(fā)明標(biāo)志物表達(dá)水平的影響不僅可以應(yīng)用在基本藥物篩選中，也可以應(yīng)用在臨床試驗(yàn)中。例如，可以在接受乳腺癌治療的患者的臨床試驗(yàn)中監(jiān)測試劑影響標(biāo)志物表達(dá)的有效性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了監(jiān)測用藥劑(例如激動劑、拮抗劑和多肽模擬、蛋白質(zhì)、肽、核酸、小分子或者其它藥物候選物)治療患者的有效性的方法，包括下面步驟(i)在施用藥劑前，從患者獲得給藥前樣品；(ii)檢測給藥前樣品中一種或多種選定的本發(fā)明標(biāo)志物的表達(dá)水平；(iii)從患者獲得一個或多個給藥后樣品；(iv)檢測給藥后樣品中該標(biāo)志物的表達(dá)水平；(v)將給藥前樣品中的標(biāo)志物表達(dá)水平和一個或多個給藥后樣品中的標(biāo)志物表達(dá)水平進(jìn)行比較；和(vi)相應(yīng)地改變患者的藥劑施用方案；例如，可能期望增加藥劑給藥以增加標(biāo)志物的表達(dá)使其高于檢測到的水平，即增加藥劑的有效性?？商娲?，可能期望減少藥試劑給藥以降低藥劑的有效性。
實(shí)驗(yàn)方案扣除文庫和制作轉(zhuǎn)錄物譜利用基于PCR的方法產(chǎn)生扣除文庫，該方法允許分離出在一個mRNA群(測試者)中比在另一個群(驅(qū)動者)中以較高水平表達(dá)的克隆。通過反轉(zhuǎn)錄將測試者和驅(qū)動者mRNA群轉(zhuǎn)換為cDNA，然后用Clontech的SMARTTMPCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后用Clontech的PCR-選擇cDNA扣除試劑盒使測試者和驅(qū)動者的cDNA雜交。該技術(shù)導(dǎo)致扣除和標(biāo)準(zhǔn)化，即，使低豐度和高豐度序列的拷貝數(shù)均衡化?？鄢膸飚a(chǎn)生后，用反相Southern雜交檢測每個文庫的一組96個或更多個克隆以證實(shí)差異表達(dá)。
對于通過上述扣除文庫雜交技術(shù)鑒定的本發(fā)明標(biāo)志物，扣除文庫的“測試者”來源由從3種乳腺癌(從人患者獲得的)組織樣品或者從乳腺癌細(xì)胞系產(chǎn)生的cDNA組成。扣除文庫的“驅(qū)動者”來源由從非癌性乳腺組織細(xì)胞產(chǎn)生的cDNA組成。
對于轉(zhuǎn)錄物譜，利用與樣品數(shù)據(jù)庫連接的機(jī)器人網(wǎng)格系統(tǒng)，通過在尼龍膜上點(diǎn)上純化的PCR產(chǎn)物制備尼龍陣列。在每個尼龍濾膜上可以點(diǎn)上幾千個克隆。
利用來自(腫瘤和正常的)臨床樣品和細(xì)胞系的RNA或DNA雜交尼龍陣列。該RNA或DNA利用體外反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)標(biāo)記，該體外反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)包含可以在反應(yīng)期間摻入的放射性標(biāo)記核苷酸?？商娲?，通過反轉(zhuǎn)錄將mRNA轉(zhuǎn)化為cDNA，然后利用Clontech的SMART PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過在雜交室中將標(biāo)記的RNA或DNA樣品與尼龍濾膜混合進(jìn)行雜交試驗(yàn)。進(jìn)行兩份重復(fù)的獨(dú)立雜交試驗(yàn)以產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄譜數(shù)據(jù)(參見，NatureGenetics，21卷(1999))。
引用的參考文獻(xiàn)在這里為了所有目的整體并入本文引用的所有文獻(xiàn)為參考文獻(xiàn)，并且這種并入就等同于詳細(xì)和單獨(dú)地指明為所有目的整體并入每篇出版物或?qū)＠驅(qū)＠暾垶閰⒖嘉墨I(xiàn)一樣，此外，為了所有目的這里整體并入本文中引用的所有GenBank登錄號、單基因簇號和蛋白質(zhì)登錄號作為參考，并且這種并入等同于為所有目的詳細(xì)和單獨(dú)地指明整體并入每個這種編號作為參考一樣。
本發(fā)明不限于本申請描述的特定實(shí)施方案，這些特定實(shí)施方案旨在作為本發(fā)明各方面的單個舉例說明?？梢詫Ρ景l(fā)明進(jìn)行許多修改和變動，而不背離本發(fā)明的精神和范圍，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。除了這里列舉的方法和儀器外，從前述描述和附圖
中，本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了功能性等同方法和儀器亦在本發(fā)明范圍內(nèi)。這種修改和變動旨在落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本發(fā)明僅受限于所附的權(quán)利要求及該權(quán)利要求所涵蓋的等同物的全部范圍。
權(quán)利要求
1.一種篩選乳腺癌患病對象以預(yù)測所述乳腺癌對內(nèi)分泌治療的應(yīng)答的方法，包括a)檢測獲自對象的乳腺腫瘤活檢組織中對應(yīng)于基因NOVA1的mRNA表達(dá)水平，以獲得第一值；b)檢測獲自其腫瘤對內(nèi)分泌治療產(chǎn)生應(yīng)答的患者的乳腺腫瘤活檢組織中對應(yīng)于基因NOVA1的mRNA表達(dá)水平，以獲得第二值；c)檢測獲自其腫瘤對內(nèi)分泌治療不產(chǎn)生應(yīng)答的患者的乳腺腫瘤活檢組織中對應(yīng)于基因NOVA1的mRNA表達(dá)水平，以獲得第三值；和d)比較第一值與第二和第三值，其中第一值與第二值相似并且比第三值高預(yù)示對象的腫瘤將對內(nèi)分泌治療產(chǎn)生應(yīng)答；而其中第一值比第二值小并且與第三值相似表明對象對內(nèi)分泌治療將不產(chǎn)生應(yīng)答。
2.一種篩選乳腺癌患病對象以預(yù)測所述乳腺癌對內(nèi)分泌治療的應(yīng)答的方法，包括a)檢測獲自對象的乳腺腫瘤活檢組織中對應(yīng)于基因IGHG3的mRNA表達(dá)水平，以獲得第一值；b)檢測獲自其腫瘤對內(nèi)分泌治療產(chǎn)生應(yīng)答的患者的乳腺腫瘤活檢組織中對應(yīng)于基因IGHG3的mRNA表達(dá)水平，以獲得第二值；c)檢測獲自其腫瘤對內(nèi)分泌治療不產(chǎn)生應(yīng)答的患者的乳腺腫瘤活檢組織中對應(yīng)于基因IGHG3的mRNA表達(dá)水平，以獲得第三值；d)比較第一值與第二和第三值，其中第一值與第二值相似并且比第三值高預(yù)示對象的腫瘤將對內(nèi)分泌治療產(chǎn)生應(yīng)答；而其中第一值比第二值小并且與第三值相似表明對象對內(nèi)分泌治療將不產(chǎn)生應(yīng)答。
3.一種篩選乳腺癌患病對象以預(yù)測所述乳腺癌對內(nèi)分泌治療的應(yīng)答的方法，包括a)檢測獲自對象的乳腺腫瘤活檢組織中對應(yīng)于至少一種表3中鑒定的基因的mRNA表達(dá)水平，以獲得第一值；b)檢測獲自其腫瘤對內(nèi)分泌治療產(chǎn)生應(yīng)答的患者的乳腺腫瘤活檢組織中對應(yīng)于a)中所述至少一種鑒定的基因的mRNA表達(dá)水平，以獲得第二值；c)檢測獲自其腫瘤對內(nèi)分泌治療不產(chǎn)生應(yīng)答的患者的乳腺腫瘤活檢組織中對應(yīng)于a)中所述至少一種鑒定的基因的mRNA表達(dá)水平，以獲得第三值；d)比較第一值與第二和第三值，其中第一值與第二值相似并且比第三值高預(yù)示對象的腫瘤將對內(nèi)分泌治療產(chǎn)生應(yīng)答；而其中第一值比第二值小并且與第三值相似表明對象對內(nèi)分泌治療將不產(chǎn)生應(yīng)答。
4.一種篩選乳腺癌患病對象以預(yù)測所述乳腺癌對內(nèi)分泌治療的應(yīng)答的方法，包括a)檢測獲自對象的乳腺腫瘤活檢組織中對應(yīng)于至少一種表4中鑒定的基因的mRNA表達(dá)水平，以獲得第一值；b)檢測獲自其腫瘤對內(nèi)分泌治療產(chǎn)生應(yīng)答的患者的乳腺腫瘤活檢組織中對應(yīng)于a)中所述至少一種鑒定的基因的mRNA表達(dá)水平，以獲得第二值；c)檢測獲自其腫瘤對內(nèi)分泌治療不產(chǎn)生應(yīng)答的患者的乳腺腫瘤活檢組織中對應(yīng)于a)中所述至少一種鑒定的基因的mRNA表達(dá)水平，以獲得第三值；d)比較第一值與第二和第三值，其中第一值與第二值相似并且比第三值低預(yù)示對象的腫瘤將對內(nèi)分泌治療產(chǎn)生應(yīng)答；而其中第一值與第三值相似并且比第二值高預(yù)示對象的腫瘤對內(nèi)分泌治療將不產(chǎn)生應(yīng)答。
5.一種治療乳腺癌的方法，包括給需要這種治療的患者施用可以調(diào)節(jié)表1、2、3或4中所示的一種或多種基因或這些基因的基因產(chǎn)物的合成、表達(dá)或活性的化合物，以改善至少一種乳腺癌癥狀。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述基因選自非電壓門控鈉通道1α(SCNN1A)；絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制劑進(jìn)化枝A成員3(SERPINA3)；N-?；拾贝减０匪饷?ASAH)；lipocalin 1(LCN1)；轉(zhuǎn)化生長因子-β的III型受體(TGFBR3)；谷氨酸受體前體2(GRIA2)和苯巴比妥誘導(dǎo)的細(xì)胞色素P450的IIB亞族(CYP2B)、AZGP1、NOVA1和IGHG3。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述基因產(chǎn)物選自如下基因表達(dá)的蛋白質(zhì)非電壓門控鈉通道1α(SCNN1A)；絲氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制劑；進(jìn)化枝A成員3(SERPINA3)；N-?；拾贝减０匪饷?ASAH)；Lipocalin 1(LCN1)；轉(zhuǎn)化生長因子-β的III型受體(TGFBR3)；谷氨酸受體前體2(GRIA2)和苯巴比妥誘導(dǎo)的細(xì)胞色素P450的IIB亞族(CYP2B)、AZGP1、NOVA1和IGHG3。
8.一種確定乳腺腫瘤對基于內(nèi)分泌的治療是否將產(chǎn)生應(yīng)答的方法，包括a)檢驗(yàn)乳腺腫瘤組織樣品中對應(yīng)于至少一種表1、2、3或4中鑒定的基因的mRNA表達(dá)水平，以提供第一值；b)檢測獲自非患病個體的乳腺組織樣品中對應(yīng)于至少一種表1、2、3或4中鑒定的基因的mRNA表達(dá)水平，以提供第二值；和c)比較第一值與第二值，其中第一值比第二值高表明患有乳腺腫瘤的個體對基于內(nèi)分泌的治療將產(chǎn)生應(yīng)答。
9.一種確定對象的乳腺癌是否將對基于內(nèi)分泌的治療產(chǎn)生應(yīng)答的方法，包括a)檢測獲自對象的患病樣品中NOVA1基因的基因表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平，以獲得第一值；b)檢測獲自其腫瘤對內(nèi)分泌治療產(chǎn)生應(yīng)答的患者的患病樣品中NOVA1基因的基因表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平，以獲得第二值；c)檢測獲自其腫瘤對內(nèi)分泌治療不產(chǎn)生應(yīng)答的患者的患病樣品中NOVA1基因的基因表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平，以獲得第三值；和d)比較第一值與第二和第三值，其中第一值與第二值相似并且比第三值高表明對象的腫瘤將對內(nèi)分泌治療產(chǎn)生應(yīng)答；而其中第一值比第二值低并且與第三值相似表明對象的腫瘤對內(nèi)分泌治療將不產(chǎn)生應(yīng)答。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中代替NOVA1基因，檢測IGHG3基因的基因產(chǎn)物的表達(dá)水平。
11.如權(quán)利要求9或10所述的方法，其中患病樣品是乳腺相關(guān)身體樣品，選自乳腺活檢組織、血液、血清、血漿、淋巴、腹水、膽囊液體、尿、CSF、乳腺滲出液或乳頭吸出物。
12.如權(quán)利要求9，10或11所述的方法，其中基因表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平通過檢測對應(yīng)于該基因表達(dá)產(chǎn)物的蛋白質(zhì)的存在來評估。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中利用特異結(jié)合蛋白質(zhì)的試劑檢測蛋白質(zhì)的存在。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中試劑選自抗體、抗體衍生物和抗體片段。
15.一種用于檢測是否患者的乳腺癌將對基于內(nèi)分泌的治療產(chǎn)生應(yīng)答的試劑盒，其包括在適于接觸乳腺相關(guān)體液的容器中的權(quán)利要求13或14的試劑。
16.如權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中所述試劑包括抗體，其中所述抗體特異地結(jié)合權(quán)利要求12的對應(yīng)于基因表達(dá)產(chǎn)物的蛋白質(zhì)。
17.一種治療患者乳腺癌的方法，包括給所述患者施用可以調(diào)節(jié)一群基因中的一種或多種基因或基因表達(dá)產(chǎn)物的合成、表達(dá)或活性的化合物，以改善至少一種乳腺癌癥狀，其中所述的基因群包含表1、2、3或4中鑒定的那些基因。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中化合物選自反義分子、雙鏈RNA、核酶、小分子化合物、抗體或抗體片段。
19.監(jiān)測患有或有危險患有乳腺癌的患者中乳腺癌進(jìn)展的方法，包括隨著時間的推移，測量獲自患者的體液或乳腺組織樣品中對應(yīng)于一群基因中的至少一種基因的mRNA表達(dá)水平，其中所述的基因群包含表1、2、3或4中鑒定的那些基因，其中隨著時間的推移，所述至少一種基因的mRNA表達(dá)水平的增加表明患者中乳腺癌的進(jìn)展。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述至少一種表1、2、3或4中鑒定的基因選自TFF1，TFF3，SERPINA3，PIP，MGP，TGFRB3和AZGP1。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中通過選自Northern印跡分析、反轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時定量PCR的技術(shù)檢測mRNA的表達(dá)水平。
22.監(jiān)測患有或有危險患有乳腺癌的患者中乳腺癌進(jìn)展的方法，包括隨著時間的推移，測量獲自患者的體液或乳腺組織樣品中由至少一種表1、2、3或4中鑒定的基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，其中隨著時間的推移，所述至少一種基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平的增加表明患者中乳腺癌的進(jìn)展。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述至少一種表1、2、3或4中鑒定的基因選自TFF1，TFF3，SERPINA3，PIP，MGP，TGFRB3和AZGP1。
24.監(jiān)測患有或有危險患有乳腺癌的患者中乳腺癌進(jìn)展的方法，包括隨著時間的推移，測量獲自患者的體液或乳腺組織樣品中對應(yīng)于選自表1、2、3或4中鑒定的那些基因的至少一種基因的mRNA表達(dá)水平，其中隨著時間的推移，所述至少一種基因的mRNA表達(dá)水平的改變表明患者中乳腺癌的進(jìn)展。
25.監(jiān)測患有或有危險患有乳腺癌的患者中乳腺癌進(jìn)展的方法，包括隨著時間的推移，測量獲自患者的體液或乳腺組織樣品中選自表1、2、3或4中鑒定的那些基因的至少一種基因所編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，其中隨著時間的推移，所述至少一種基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平的改變表明患者中乳腺癌的進(jìn)展。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述至少一種基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平利用對該蛋白質(zhì)特異的標(biāo)記探針通過Western印跡檢測。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中標(biāo)記探針是抗體。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中抗體是單克隆抗體。
29.一種鑒定可以用于乳腺癌治療中的藥劑的方法，其由如下步驟組成a)用候選藥劑接觸獲自乳腺癌疑似患者的乳腺組織樣品；b)檢測樣品中至少一種基因的mRNA表達(dá)水平，其中所述至少一種基因選自包括表1、2、3或4中鑒定的那些基因的基因群；和c)將在候選藥劑存在的情況下樣品中所述至少一種基因的mRNA表達(dá)水平與在候選藥劑缺乏的情況下樣品中所述至少一種基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行比較，其中相對于在候選藥劑缺乏的情況下樣品中該至少一種基因的mRNA表達(dá)水平，在候選藥劑存在的情況下樣品中該至少一種基因的mRNA表達(dá)水平的降低或增加表明藥劑在乳腺癌治療中是有用的。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述至少一種表1、2、3或4中鑒定的基因選自TFF1，TFF3，SERPINA3，PIP，MGP，TGFRB3和AZGP1。
31.如權(quán)利要求29所述的方法，其中通過選自Northern印跡分析、反轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時定量PCR的技術(shù)檢測mRNA的表達(dá)水平。
32.如權(quán)利要求29所述的方法，其中藥劑選自小分子和反義多核苷酸。
33.一種鑒定可以用于乳腺癌治療中的藥劑的方法，其由如下步驟組成a)用候選藥劑接觸獲自乳腺癌疑似患者的體液或乳腺組織樣品；b)檢測樣品中至少一種基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，其中所述至少一種基因選自包含表1、2、3或4中鑒定的那些基因的基因群；c)將在候選藥劑存在的情況下樣品中所述至少一種基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平與在候選藥劑缺乏的情況下樣品中所述至少一種基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平進(jìn)行比較，其中相對于在候選藥劑缺乏的情況下樣品中該至少一種基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，在候選藥劑存在的情況下樣品中該至少一種基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平的降低或增加表明藥劑在乳腺癌治療中是有用的。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述選自包含表1、2、3或4中鑒定的那些基因的基因群的至少一種基因是TFF1，TFF3，SERPINA3，PIP，MGP，TGFRB3和AZGP1。
35.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述至少一種基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平利用對該蛋白質(zhì)特異的標(biāo)記探針通過Western印跡檢測。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中標(biāo)記探針是抗體。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中抗體是單克隆抗體。
38.一種鑒定可以用于乳腺癌治療中的藥劑的方法，包括a)用候選藥劑接觸獲自乳腺癌疑似患者的乳腺組織樣品；b)檢測樣品中至少一種基因的mRNA表達(dá)水平，其中所述基因選自表1、2、3或4中鑒定的那些基因；和c)將在候選藥劑存在的情況下樣品中所述至少一種基因的mRNA表達(dá)水平與在候選藥劑缺乏的情況下樣品中所述至少一種基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行比較，其中相對于在候選藥劑缺乏的情況下樣品中該至少一種基因的mRNA表達(dá)水平，在候選藥劑存在的情況下樣品中該至少一種基因的mRNA表達(dá)水平的改變表明藥劑在乳腺癌治療中是有用的。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中通過選自Northern印跡分析、反轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時定量PCR的技術(shù)檢測mRNA的表達(dá)水平。
40.如權(quán)利要求41所述的方法，其中藥劑選自小分子和反義多核苷酸。
41.一種鑒定可以用于乳腺癌治療中的藥劑的方法，包括a)用候選藥劑接觸獲自乳腺疾病疑似患者的體液或乳腺組織樣品；b)檢測樣品中至少一種基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，其中所述基因選自表1、2、3或4中鑒定的那些基因；和c)將在候選藥劑存在的情況下樣品中所述至少一種基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平與在候選藥劑缺乏的情況下樣品中所述至少一種基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平進(jìn)行比較，其中相對于在候選藥劑缺乏的情況下樣品中該至少一種基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，在候選藥劑存在的情況下樣品中該至少一種基因的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平的改變表明藥劑在乳腺癌治療中是有用的。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中所述至少一種基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平利用對該蛋白質(zhì)特異的標(biāo)記探針通過Western印跡檢測。
43.如權(quán)利要求41所述的方法，其中標(biāo)記探針是抗體。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其中抗體是單克隆抗體。
45.如權(quán)利要求41所述的方法，其中藥劑選自小分子和反義多核苷酸。
46.一種治療患有或有危險患有乳腺癌的患者的方法，包括給患者施用治療有效量的分離的核酸分子，該分離的核酸分子由來源于選自表1、2、3或4中鑒定的那些基因的至少一種基因的反義核苷酸序列組成，并能夠改變所述至少一種基因的轉(zhuǎn)錄/翻譯。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其中所述至少一種基因選自TFF1，TFF3，SERPINA3，PIP，MGP，TGFRB3和AZGP1。
48.一種治療患有或有危險患有乳腺癌的患者的方法，包括給患者施用治療有效量的拮抗劑，該拮抗劑可以抑制/激活由選自表1、2、3或4中鑒定的那些基因的至少一種基因編碼的蛋白質(zhì)。
49.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述至少一種基因選自TFF1，TFF3，SERPINA3，PIP，MGP，TGFRB3和AZGP1。
50.如權(quán)利要求48所述的方法，其中拮抗劑是對所述蛋白質(zhì)特異的抗體。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其中抗體是單克隆抗體。
52.如權(quán)利要求51所述的方法，其中單克隆抗體與毒性劑綴合。
53.一種治療患有或有危險患有乳腺癌的患者的方法，其由如下步驟組成給患者施用治療有效量的分離的核酸分子，該分離的核酸分子由來源于選自表1、2、3或4中鑒定的那些基因的至少一種基因的反義核苷酸序列組成，并能夠降低/增加所述至少一種基因的轉(zhuǎn)錄/翻譯。
54.一種治療患有或有危險患有乳腺癌的患者的方法，其包括給患者施用治療有效量的拮抗劑，該拮抗劑可以抑制/激活由選自表1、2、3或4中鑒定的那些基因的至少一種基因編碼的蛋白質(zhì)。
55.如權(quán)利要求54所述的方法，其中拮抗劑是對所述蛋白質(zhì)特異的抗體。
56.如權(quán)利要求55所述的方法，其中抗體是單克隆抗體。
57.如權(quán)利要求56所述的方法，其中單克隆抗體與毒性劑綴合。
58.一種治療患有或有危險患有乳腺癌的患者的方法，包括給患者施用治療有效量的編碼核酶的核苷酸序列，該核苷酸序列能夠降低/增加選自表1、2、3或4中鑒定的那些基因的至少一種基因的轉(zhuǎn)錄/翻譯。
59.一種治療患有或有危險患有乳腺癌的患者的方法，包括給患者施用治療有效量的對應(yīng)于權(quán)利要求58中定義的至少一種基因的雙鏈RNA，該雙鏈RNA能夠降低該至少一種基因的轉(zhuǎn)錄/翻譯。
60.一種治療患有或有危險患有乳腺癌的患者的方法，包括給患者施用治療有效量的編碼核酶的核苷酸序列，該核苷酸序列能夠改變選自表1、2、3或4中鑒定的那些基因的至少一種基因的轉(zhuǎn)錄/翻譯。
61.一種治療患有或有危險患有乳腺癌的患者的方法，包括給患者施用治療有效量的對應(yīng)于選自表1、2、3或4中鑒定的那些基因的至少一種基因的雙鏈RNA，該雙鏈RNA有改變該至少一種基因的轉(zhuǎn)錄/翻譯的能力。
62.一種用于監(jiān)測藥劑對患有或有危險患有乳腺癌的患者的治療效力的方法，該方法包括a)在給與藥劑前從患者獲得給藥前樣品；b)檢測對應(yīng)于選自表1、2、3或4中鑒定的那些基因的基因的mRNA表達(dá)水平；c)從患者獲得一個或多個給藥后樣品；d)檢測此一個或多個給藥后樣品中對應(yīng)于所述至少一種基因的mRNA表達(dá)水平；e)將給藥前樣品中對應(yīng)于該至少一種基因的mRNA表達(dá)水平與給藥后樣品中對應(yīng)于該至少一種基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行比較；f)相應(yīng)地調(diào)整藥劑的給藥方案。
63.一種用于監(jiān)測藥劑對患有或有危險患有乳腺癌的患者的治療效力的方法，該方法包括a)在給與藥劑前從患者獲得給藥前樣品；b)檢測選自表1、2、3或4中鑒定的那些基因的至少一種基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平；c)從患者獲得一個或多個給藥后樣品；d)檢測此一個或多個給藥后樣品中所述至少一種基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平；e)將給藥前樣品中該至少一種基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平與給藥后樣品中該至少一種基因編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平進(jìn)行比較；f)相應(yīng)地調(diào)整藥劑的給藥方案。
64.一種抑制患者乳腺癌組織增生的方法，該方法包括給患者施用治療有效量的分離的核酸分子，該分離的核酸分子由來源于選自表1、2、3或4中鑒定的那些基因的至少一種基因的反義核苷酸序列組成，并能夠改變所述至少一種基因的轉(zhuǎn)錄/翻譯。
65.一種抑制患者乳腺癌組織增生的方法，該方法包括給患者施用治療有效量的分離的核酸分子，該分離的核酸分子由來源于選自表1、2、3或4中鑒定的那些基因的至少一種基因的反義核苷酸序列組成，并能夠改變所述至少一種基因的轉(zhuǎn)錄/翻譯。
66.一種抑制患者乳腺癌組織增生的方法，該方法包括給患者施用治療有效量的編碼核酶的核苷酸序列，該核苷酸序列能夠改變選自表1、2、3或4中鑒定的那些基因的至少一種基因的轉(zhuǎn)錄/翻譯。
67.一種抑制患者乳腺癌組織增生的方法，該方法包括給患者施用治療有效量的編碼核酶的核苷酸序列，該核苷酸序列能夠改變選自表1、2、3或4中鑒定的那些基因的至少一種基因的轉(zhuǎn)錄/翻譯。
68.一種抑制患者乳腺癌組織增生的方法，該方法包括給患者施用治療有效量的對應(yīng)于選自表1、2、3或4中鑒定的那些基因的至少一種基因的雙鏈RNA，該雙鏈RNA有改變該至少一種基因的轉(zhuǎn)錄/翻譯的能力。
69.一種抑制患者乳腺癌組織增生的方法，該方法包括給患者施用治療有效量的對應(yīng)于選自表1、2、3或4中鑒定的那些基因的至少一種基因的雙鏈RNA，該雙鏈RNA有改變該至少一種基因的轉(zhuǎn)錄/翻譯的能力。
70.一種抑制患者乳腺癌組織增生的方法，該方法包括給患者施用治療有效量的拮抗劑，該拮抗劑可以抑制/激活由選自表1、2、3或4中鑒定的那些基因的至少一種基因編碼的蛋白質(zhì)。
71.如權(quán)利要求70所述的方法，其中拮抗劑是對所述蛋白質(zhì)特異的抗體。
72.如權(quán)利要求71所述的方法，其中抗體是單克隆抗體。
73.如權(quán)利要求72所述的方法，其中單克隆抗體與毒性劑綴合。
74.一種抑制患者乳腺癌組織增生的方法，該方法包括給患者施用治療有效量的拮抗劑，該拮抗劑可以抑制由選自表1、2、3或4中鑒定的那些基因的至少一種基因編碼的蛋白質(zhì)。
75.如權(quán)利要求74所述的方法，其中拮抗劑是對所述蛋白質(zhì)特異的抗體。
76.如權(quán)利要求75所述的方法，其中抗體是單克隆抗體。
77.如權(quán)利要求76所述的方法，其中單克隆抗體與毒性劑綴合。
78.一種病毒載體，其包含選自表1、2、3或4中鑒定的那些基因的至少一種基因的啟動子，此啟動子可操作地與載體復(fù)制所必需的基因編碼區(qū)連接，其中所述載體適應(yīng)于在轉(zhuǎn)染進(jìn)入乳腺細(xì)胞中后進(jìn)行復(fù)制。
79.如權(quán)利要求78所述的載體，其中病毒載體是腺病毒載體。
80.如權(quán)利要求78所述載體，其中載體復(fù)制所必需的基因編碼區(qū)選自E1a、E1b、E2和E4編碼區(qū)。
81.如權(quán)利要求78，79或80所述的載體，其還包含編碼異源基因產(chǎn)物的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于確定乳腺癌內(nèi)分泌應(yīng)答及治療和監(jiān)測乳腺癌進(jìn)展的方法，該方法以乳腺腫瘤中差異表達(dá)的基因?yàn)榛A(chǔ)。本發(fā)明也公開了用于鑒定乳腺癌治療中有用的藥劑的方法、監(jiān)測乳腺癌治療效力的方法、抑制乳腺癌增生的方法和包含公開基因的啟動子的乳腺特異載體。
文檔編號A61K48/00GK1526025SQ02809997
公開日2004年9月1日 申請日期2002年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月16日
發(fā)明者M·M·德雷斯曼, M M 德雷斯曼, C·N·拉韋丹, 拉韋丹, M·波利默羅普羅斯, 奩章匏 申請人:諾瓦提斯公司