專利名稱：用于乳腺癌的診斷/預(yù)后的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于乳腺癌的診斷/預(yù)后的方法。本發(fā)明也涉及用于該方法的擴(kuò)增引物和雜交探針，以及用于乳腺癌的診斷/預(yù)后的試劑盒。
乳腺癌是種普遍發(fā)生的疾病11個(gè)婦女中有1個(gè)在其一生中會(huì)發(fā)生乳腺癌。然而，因?yàn)榇嬖诟鞣N類型乳腺癌和不同的乳腺癌預(yù)后，因此受其影響的婦女不會(huì)都采用相同的治療為了獲得最大的治愈可能性，醫(yī)生給每個(gè)患者提供適合于其狀況的療法。
因此，作為乳腺癌的系統(tǒng)性療法的激素療法被用于激素依賴性乳腺癌，即在其細(xì)胞表面表達(dá)激素受體的腫瘤的情況下使用。手術(shù)后，可單獨(dú)地使用激素治法或與輔助化學(xué)治法交替地使用。在疾病的復(fù)發(fā)中，可開出單獨(dú)的、或與化學(xué)療法組合的或與化學(xué)療法交替使用的激素療法。
化學(xué)療法本身是種系統(tǒng)性癌癥療法，因?yàn)橥ㄟ^血液循環(huán)運(yùn)載的藥物能夠在身體中各處起作用。化學(xué)療法在治療法中占有重要的位置，特別是最近十年左右，隨著新的分子的出現(xiàn)更是如此。藥物最普遍通過靜脈內(nèi)、皮下或肌內(nèi)輸注來施用。
因此，治療可以傾向或不傾向激素療法，其依賴于激素分泌細(xì)胞表面的激素受體的表達(dá)。
特別是我們可提到雌激素受體ESR1和ESR2以及孕酮受體(PGR)，其是預(yù)測乳腺癌中對激素療法的反應(yīng)的最著名的參數(shù)。因此，ESR1的含量用作預(yù)后指標(biāo)，和用于預(yù)測患者對使用抗雌激素例如Tamoxifen(Osborne C等人，Breast Cancer Res treat 51227-238，1998；Goldhirsch等人，J Clin Oncol 193817-3827，2001)的療法的反應(yīng)。PGR受體的存在也用于監(jiān)控激素療法和用作預(yù)后標(biāo)記(Horwitz等人，Recent Prog Horm Res 41249-316，1995)。我們也會(huì)提到HER2受體，據(jù)說其在大約1/4的侵襲性乳腺癌中過量表達(dá)(Slamon等人，Science，1987，235177-182)。
為了給患者提供合適的療法，因此有必要了解編碼激素受體，例如ESR1、ESR2、HER2和PGR的基因的表達(dá)。通常在原發(fā)性腫瘤中和通常使用免疫組織化學(xué)法來研究該表達(dá)。在不確定的情況下，通過原位雜交法(FISH)檢查基因的擴(kuò)增是種參考方法，特別是在HER2的情況下。近些年來，已可能檢測小腫瘤，使得能夠進(jìn)行乳腺癌的早期診斷，但從少量腫瘤組織中對該癌癥進(jìn)行預(yù)后仍然困難，少量腫量組織使前述激素受體的蛋白定量變得十分困難。因此分子生物學(xué)技術(shù)成為激素受體定量的必不可少的技術(shù)，因?yàn)槠湫枰倭康哪[瘤組織(Fuqua等人，Natl Cancer Inst 82859-861，1997；Fasco等人，Anal Biochem，245167-178，1997；Poola等人，Anal Biochem，258209-215，1998)。
本發(fā)明提出了用于乳腺癌的診斷/預(yù)后的新方法。該方法特別地使用了能夠用作擴(kuò)增引物或用作雜交探針的新的核苷酸序列。特別是本發(fā)明的方法可能確定最適合用于治療患有乳腺癌的患者的療法。
因此，本發(fā)明涉及用于乳腺癌的診斷/預(yù)后的方法，其包括下列階段A-從生物樣品中提取核物質(zhì)(nuclear material)，B-使用至少一對擴(kuò)增引物獲得核物質(zhì)中的至少一個(gè)靶序列的擴(kuò)增子，C-使用至少一種檢測探針檢測所述擴(kuò)增子的存在，其特征在于，在B階段，所述引物對包含至少一個(gè)這樣的擴(kuò)增引物，該擴(kuò)增引物含有選自SEQ ID No.1至SEQ ID No.24的核苷酸序列的至少10個(gè)核苷酸殘基，和/或在C階段，所述檢測探針包含選自SEQID No.1至SEQ ID No.20的核苷酸序列的至少10個(gè)核苷酸殘基。
令人吃驚的是，本發(fā)明者由此發(fā)現(xiàn)在乳腺癌的診斷/預(yù)后的方法中，包含選自SEQ ID No.1至SEQ ID No.20的核苷酸序列的至少10個(gè)核苷酸殘基的核苷酸序列非常適合用作擴(kuò)增靶序列例如編碼ESR1、ESR2、PGR或HER2的基因的擴(kuò)增引物。本發(fā)明者也發(fā)現(xiàn)將包含選自SEQ ID No.1至SEQ ID No.20的核苷酸序列的至少10個(gè)核苷酸殘基的核苷酸序列用作雜交探針非常適合用于對靶序列(例如編碼ESR1、ESR2、PGR或HER2的基因)的特異性雜交。
在本發(fā)明的含義中，生物學(xué)樣品是指任何可含有如此后定義的核物質(zhì)的樣品。該生物學(xué)樣品可采自患者和可以特別是獲自患者的組織、血液、血清、唾液或循環(huán)細(xì)胞的樣品。優(yōu)選地，該生物學(xué)樣品采自腫瘤。以任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式獲得該生物學(xué)樣品。
在本發(fā)明的含義中，核物質(zhì)b包含核酸序列例如脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的序列。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案，所述核物質(zhì)包含脫氧核糖核酸的序列。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案，從采自患者的生物學(xué)樣品中提取所述核物質(zhì)。
核苷酸序列(或核酸序列或核苷酸片段或寡核苷酸、或多核苷酸)是指通過磷酯鍵連接起來的核苷酸殘基的鏈，其特征在于能夠和另一核酸序列雜交的天然核酸的信息序列，其中所述鏈可含有不同結(jié)構(gòu)的單體和可從天然核酸分子和/或通過基因重組和/或通過化學(xué)合成獲得。
核苷酸殘基是指單體的衍生物，其可以是核酸的天然核苷酸，其組成成分是糖、磷酸基團(tuán)和含氮堿基，在DNA中所述糖為脫氧-2-核糖，在RNA中所述糖為核糖；依賴于其是否是DNA或RNA物質(zhì)，所述含氮堿基選自腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶或胸腺嘧啶；或可選擇地所述單體是在所述三個(gè)組成成分中的至少一個(gè)上經(jīng)修飾的核苷酸；作為例子，修飾可以發(fā)生在堿基水平上，經(jīng)修飾的堿基例如為肌苷、甲基-5-脫氧胞苷、脫氧尿苷、二甲氨基-5-脫氧尿苷、二氨基-2，6-嘌呤、溴-5-脫氧腺苷或任何能夠雜交的其他經(jīng)修飾的堿基，或者修飾可以發(fā)生在糖的水平上，例如至少一個(gè)脫氧核糖被聚酰胺取代(P.E.Nielsen等人，Science，254，1497-1500(1991))，或者修飾可發(fā)生在磷酸基團(tuán)的水平上，例如其被酯特別是選自二磷酸酯、烷基和芳基膦酸酯和硫代磷酸酯取代。該核物質(zhì)包含至少一個(gè)靶序列。至于靶序列，我們是指這樣的序列，即其中核苷酸殘基的鏈特異于靶基因，例如優(yōu)選地是編碼ESR1、ESR2、PGR或HER2的基因。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案，所述靶序列包含于選自ESR1、ESR2、PGR或HER2的編碼基因的基因中。此后，我們將使用術(shù)語靶序列，無論其是單鏈的還是雙鏈的。
在步驟A中，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的實(shí)驗(yàn)方案從生物學(xué)樣品中提取核物質(zhì)。作為示例，可通過裂解存在于生物學(xué)樣品的細(xì)胞的步驟進(jìn)行核酸的提取，以使細(xì)胞的蛋白和/或脂包膜(如干擾隨后反應(yīng)的細(xì)胞碎片)中包含的核酸釋放出來。作為例子，可能使用如專利申請WO00/05338中描述的使用磁力和機(jī)械力組合的裂解、WO99/53304中的使用電裂解和WO99/15321中使用機(jī)械裂解的裂解方法。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使用其他熟知的裂解方法例如熱或滲透休克(thermal or osmotic shock)、或通過離液劑例如胍鹽的化學(xué)裂解(US 5,234,809)。該裂解步驟之后也可進(jìn)行純化步驟，使核酸和在裂解步驟中鹽析的其他細(xì)胞成分之間產(chǎn)生分離。該步驟通常使核酸被濃縮，并可適于DNA或RNA的純化。作為例子，可能使用任選地通過吸附或共價(jià)結(jié)合(cf.專利US 4,672,040和US 5,750,338)包被了寡核苷酸的磁粒，從而在洗滌步驟中將附著在這些磁粒上的核酸純化出來。如果想要進(jìn)一步擴(kuò)增所述核酸，用于純化核酸的該步驟是特別有吸引力的。在專利申請WO97/45202和WO99/35500中描述了這些磁粒的特別有吸引力的實(shí)施方案。核酸純化的方法的另一個(gè)有吸引力的例子是使用二氧化硅，其以柱子形式存在、或以惰性顆粒(Boom R.等人，J.Clin.Microbiol.，1990，No.28(3)，p.495-503)或磁粒(MerckMagPrepSilica，PromegaMagneSilTMParamagneticparticles)形式存在。廣泛使用的其他方法基于柱子中的或以順磁性顆粒(WhatmanDEAE-Magarose)形式存在的離子交換樹脂(LevisonPR等人，J.Chromatography，1998，p.337-344)。另一個(gè)非常合適本發(fā)明但并不專用于本發(fā)明的方法是金屬氧化物支持物上吸附法(company XtranaXtra-BindTMmatrix)。
如果我們希望從生物樣品中專一地提取DNA，特別地可用酚、氯仿和乙醇除去蛋白并用100％乙醇沉淀DNA來進(jìn)行提取。然后可通過離心沉淀DNA、洗滌DNA和重懸浮DNA。
在步驟B中，使用至少一對擴(kuò)增引物以獲得核物質(zhì)中的至少一個(gè)靶序列的擴(kuò)增子。
在本發(fā)明的含義中，擴(kuò)增引物是指包含10至100個(gè)核苷酸殘基，優(yōu)選地15至25個(gè)核苷酸殘基的核酸序列。該擴(kuò)增引物包含選自SEQ IDNo.1至20的序列的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基。在本發(fā)明的含義中，包含下面序列的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和甚至更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的引物，并具有和本發(fā)明的擴(kuò)增引物功能(即用于擴(kuò)增完整的或部分的編碼ESR1、ESR2、PGR或HER2的基因)相同的引物，被認(rèn)為是本發(fā)明的擴(kuò)增引物的等同物●與SEQ ID No.1至SEQ ID No.20同源的序列，即○與SEQ ID No.1至SEQ ID No.20互補(bǔ)或充分互補(bǔ)的序列○顯示足以與SEQ ID No.1至SEQ ID No.20或與SEQ IDNo.1至SEQ ID No.20的互補(bǔ)序列雜交的同源性的序列，●包含來自SEQ ID No.1至SEQ ID No.20的序列(或如前面定義的，與SEQ ID No.1至SEQ ID No.20同源的序列)的序列，在所述序列中尿嘧啶堿基替代了胸腺嘧啶堿基。
擴(kuò)增引物對使得可以起始酶促聚合作用，特別是例如酶促擴(kuò)增反應(yīng)。
酶促擴(kuò)增反應(yīng)是指通過至少一種酶的作用產(chǎn)生核酸序列的多拷貝(或擴(kuò)增子)的過程。在本發(fā)明的含義中，擴(kuò)增子是指在酶促擴(kuò)增反應(yīng)中獲得的靶序列的拷貝。這些擴(kuò)增反應(yīng)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟悉的，特別地我們可提到在專利US-A-4,683,195、US-A-4,683,202和US-A-4,800,159中描述的PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))；在例如專利申請EP-A-0 201 184中公開的LCR(連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))；在專利申請WO-A-90/01069中公開的RCR(修復(fù)鏈?zhǔn)椒磻?yīng))；專利申請WO-A-90/06995中的3SR法(自動(dòng)維持序列擴(kuò)增)；專利申請WO-A-91/02818中的NASBA(基于核酸序列的擴(kuò)增)，或?qū)＠鸘S-A-5,399,491中的TMA(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增)。一般地，這些酶促擴(kuò)增反應(yīng)通常使用包含下列步驟的連續(xù)循環(huán)○靶序列的變性(如果靶序列是雙鏈的)，以獲得兩個(gè)互補(bǔ)性靶鏈，○這些在前面的變性步驟中獲得的靶鏈中的每一條鏈與至少一個(gè)擴(kuò)增引物的雜交，○在聚合酶和核苷三磷酸(核糖核苷三磷酸和/或脫氧核糖核苷三磷酸，依賴于所用的技術(shù))存在的情況下，在擴(kuò)增引物的基礎(chǔ)上，形成和與之雜交的鏈互補(bǔ)的鏈，重復(fù)進(jìn)行確定次數(shù)的該循環(huán)以獲得足以使其被檢測到的份量的靶序列。
雜交是指這樣的過程，即在其中，在合適的條件下，兩個(gè)核酸序列特別是例如擴(kuò)增引物和靶序列或雜交探針和靶序列，通過穩(wěn)定和特異的氫鍵連接起來形成雙鏈。在互補(bǔ)性堿基腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)(或尿嘧啶(U))(稱作A-T鍵)之間或在互補(bǔ)性堿基鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)(稱作G-C鍵)之間形成這些氫鍵。兩個(gè)核酸序列的雜交可以是完全的(此時(shí)稱其為互補(bǔ)序列)，即在該雜交中獲得的雙鏈只包含A-T鍵和C-G鍵。該雜交也可以是部分的(此時(shí)稱其為充分互補(bǔ)的序列)，即獲得的雙鏈包含允許雙鏈形成的A-T鍵和C-G鍵，同時(shí)還包括未和互補(bǔ)性堿基結(jié)合的堿基。兩個(gè)互補(bǔ)序列或充分互補(bǔ)的序列之間的雜交依賴于使用的工作條件，特別是嚴(yán)緊性。嚴(yán)緊性的確定與兩個(gè)核酸序列之間的堿基組成以及這兩個(gè)核酸序列之間的錯(cuò)配程度緊密相關(guān)。嚴(yán)緊性也可以是反應(yīng)參數(shù)例如存在于雜交溶液中的離子種類的濃度和類型、變性劑的性質(zhì)和濃度和/或雜交溫度的函數(shù)。所有這些因素都是熟知的并且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定合適的條件。
更準(zhǔn)確地，NASBA是基于三種酶(逆轉(zhuǎn)錄酶AMV、RNA酶-H和RNA聚合酶T7)的組合作用的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。和對于靶序列特異性的擴(kuò)增引物結(jié)合，其在90分鐘內(nèi)擴(kuò)增超過10億倍的RNA靶序列。擴(kuò)增反應(yīng)在41℃發(fā)生并以單鏈RNA分子為終產(chǎn)物。NASBA需要這樣的引物對，即其中至少有一個(gè)引物包含允許通過噬菌體T7聚合酶啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。這樣的引物優(yōu)選地選自SEQ ID No.21至24。根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施方案，所述引物對包含至少一個(gè)這樣的擴(kuò)增引物，即其含有允許通過噬菌體T7聚合酶啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。
根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施方案，所述用于步驟B的引物對選自下列的引物對□包含核苷酸序列SEQ ID No.1的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ IDNo.2的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；例如，當(dāng)?shù)谝灰镆許EQ ID No.1作為其序列，第二引物以SEQ ID No.2作為其序列時(shí)，獲得對編碼ESR1的基因特異性的、具有202個(gè)堿基對大小的擴(kuò)增子，該擴(kuò)增子對應(yīng)于編碼ESR1的參照基因的序列(Genbank X03635)上的序列1427-1629。
□包含核苷酸序列SEQ ID No.3的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ IDNo.4的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；例如，當(dāng)?shù)谝灰镆許EQ ID No.3作為其序列，第二引物以SEQ ID No.4作為其序列時(shí)，于是獲得對編碼PGR的基因特異性的、具有184個(gè)堿基對大小的擴(kuò)增子，該擴(kuò)增子對應(yīng)于編碼PGR的參照序列(Genbank NM_000926)上的序列2761-2945。
□包含核苷酸序列SEQ ID No.5的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ IDNo.6的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；例如，當(dāng)?shù)谝灰镆許EQ ID No.5作為其序列，第二引物以SEQ ID No.6作為其序列時(shí)，獲得對編碼ESR2的基因特異性的、具有210個(gè)堿基對大小的擴(kuò)增子，該擴(kuò)增子對應(yīng)于編碼ESR2的參照序列(Genbank MN_001437)上的序列1640-1850。
□包含核苷酸序列SEQ ID No.7的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.8的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；例如，當(dāng)?shù)谝灰镆許EQ ID No.7作為其序列，第二引物以SEQ ID No.8作為其序列時(shí)，于是獲得對編碼HER2的基因特異性的、具有185個(gè)堿基對大小的擴(kuò)增子，該擴(kuò)增子對應(yīng)于編碼HER2的參照序列(Genbank NM_00448)上的序列2567-2752。
□包含核苷酸序列SEQ ID No.13的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ IDNo.14的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；例如，當(dāng)?shù)谝灰镆許EQ ID No.13作為其序列，第二引物以SEQ ID No.14作為其序列時(shí)，此時(shí)獲得對編碼ESR1的基因特異性的、具有858個(gè)堿基大小的擴(kuò)增子，該擴(kuò)增子對應(yīng)于編碼ESR1的參照序列(Genbank X03635)上的序列808-1666。
□包含核苷酸序列SEQ ID No.15的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ IDNo.16的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；例如，當(dāng)?shù)谝灰镆許EQ ID No.15作為其序列，第二引物以SEQ ID No.16作為其序列時(shí)，此時(shí)獲得對編碼PGR的基因特異性的、具有658個(gè)堿基對大小的擴(kuò)增子，該擴(kuò)增子對應(yīng)于編碼PGR的參照序列(Genbank NM_000926)上的序列2319-2977。
□包含核苷酸序列SEQ ID No.17的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ IDNo.18的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；例如，當(dāng)?shù)谝灰镆許EQ ID No.17作為其序列，第二引物以SEQ ID No.18作為其序列時(shí)，此時(shí)獲得對編碼ESR2的基因特異性的、具有702個(gè)堿基對大小的擴(kuò)增子，該擴(kuò)增子對應(yīng)于編碼ESR2的參照序列(Genbank MN_001437)上的序列1246-1948。
□包含核苷酸序列SEQ ID No.19的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ IDNo.20的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；例如，當(dāng)?shù)谝灰镆許EQ ID No.19作為其序列，第二引物以SEQ ID No.20作為其序列時(shí)，此時(shí)獲得對編碼HER2的基因特異性的、具有928個(gè)堿基對大小的擴(kuò)增子，該擴(kuò)增子對應(yīng)于編碼HER2的參照序列(Genbank NM_004448)上的序列2123-3051。
根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施方案，所述用于步驟B的引物對，包括含有允許通過噬菌體T7聚合酶啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的第一引物，并選自下列的引物對□第一擴(kuò)增引物SEQ ID No.21和包含核苷酸序列SEQ ID No.2的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；□第一擴(kuò)增引物SEQ ID No.22和包含核苷酸序列SEQ ID No.4的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；□第一擴(kuò)增引物SEQ ID No.23和包含核苷酸序列SEQ ID No.6的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；□第一擴(kuò)增引物SEQ ID No.24和包含核苷酸序列SEQ ID No.8的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物。
考慮到可在擴(kuò)增反應(yīng)的各步驟中觀察到的酶促效率的可變性，可通過同時(shí)確定所謂的管家基因的表達(dá)(在不同患者群體中，其表達(dá)相似)來標(biāo)準(zhǔn)化靶基因的表達(dá)。通過保持靶基因的表達(dá)對管家基因的表達(dá)的比例，可校正不同實(shí)驗(yàn)間的任何可變性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可特別地參考下列出版物Bustin SA Journal of molecular endocrinology，2002，2923-39；Giulietti A Methods，2001，25386-401。根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施方案，為獲得對于管家基因特異性的擴(kuò)增子，在步驟B中，另外使用至少一對擴(kuò)增引物。至于管家基因，我們是指無論在怎樣的生理學(xué)狀況下，在給定的組織中，其表達(dá)穩(wěn)定的基因。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案，所述管家基因是編碼親環(huán)蛋白B的PPIB基因。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案，所述用于獲得對于管家基因特異性的擴(kuò)增子的擴(kuò)增引物包含選自SEQ ID No.25至29的序列的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基。
根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施方案，所述用于獲得對于管家基因特異性的擴(kuò)增子的擴(kuò)增引物對選下列引物對□包含核苷酸序列SEQ ID No.27的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ IDNo.28的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；例如，當(dāng)?shù)谝灰镆許EQ ID No.27作為其序列，第二引物以SEQ ID No.28作為其序列時(shí)，獲得對PPIB基因特異性的、具有239個(gè)堿基對大小的擴(kuò)增子，該擴(kuò)增子對應(yīng)于PPIB參照序列(GenbankM60857)上的序列231-470；□包含核苷酸序列SEQ ID No.25的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ IDNo.26的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；例如，當(dāng)?shù)谝灰镆許EQ ID No.25作為其序列，第二引物以SEQ ID No.26作為其序列時(shí)，獲得對PPIB基因特異性的、具有639個(gè)堿基對大小的擴(kuò)增子，該擴(kuò)增子對應(yīng)于PPIB參照序列(GenbankM60857)上的序列11-650。
根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施方案，所述用于獲得對于管家基因特異性的擴(kuò)增子的擴(kuò)增引物對包括含有允許通過噬菌體T7聚合酶啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的第一擴(kuò)增引物。所述第一擴(kuò)增引物優(yōu)選地是SEQ ID No.30，所述第二擴(kuò)增引物優(yōu)選地包含核苷酸序列SEQ ID No.28的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基。
在步驟C中，使用至少一種檢測探針檢測所述擴(kuò)增子的存在?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的涉及核酸檢測的所有實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行該檢測步驟。
在本發(fā)明的意思中，雜交探針是指10至100個(gè)核苷酸殘基，特別是15至35個(gè)核苷酸殘基的核酸序列，所述核酸序列在特定的條件下具有和靶核酸序列形成雜交復(fù)合物的雜交特異性。雜交探針可包括使其能夠被檢測的標(biāo)記物。因此稱其為檢測探針。檢測是指通過物理方法直接檢測，或通過使用標(biāo)記物檢測的方法間接檢測。存在許多用于核酸檢測的檢測方法。[參見例如Kricka等人，ClinicalChemistry，1999，No.45(4)，p.453-458或Keller G.H.等人，DNAProbes，第2版，Stockton Press，1993，sections 5 and 6，p.173-249]。標(biāo)記物是指能夠產(chǎn)生可被檢測的信號的示蹤物。這些示蹤物的非限制性名錄包括產(chǎn)生可通過例如比色、熒光或發(fā)光檢測的信號的酶，例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；發(fā)色團(tuán)例如熒光、發(fā)光或顯色化合物；可通過電子顯微鏡或通過其與電有關(guān)的性質(zhì)例如導(dǎo)電性、通過電流測定法或電壓測定法、或通過阻抗的測量來檢測的具有電子密度的基團(tuán)；可通過光學(xué)方法例如衍射、表面等離子共振、接觸角的變化或通過物理方法例如原子力光譜學(xué)、隧道效應(yīng)等來檢測的基團(tuán)；放射性分子例如32P、35S或125I。
在本發(fā)明的含義中，雜交探針可以是所謂的檢測探針。在該情況下，用前面所定義的標(biāo)記物標(biāo)記所謂的檢測探針。由于該標(biāo)記物的存在，因此可能檢測到給定的檢測探針和對于給定的物種特異性的靶序列之間的雜交反應(yīng)的存在。
特別地檢測探針可以是如Tyagi & Kramer(Nature biotech，1996，14303-308)描述的“分子信標(biāo)(molecular beacon)”檢測探針。這些“分子信標(biāo)”在雜交時(shí)產(chǎn)生熒光。其具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)并且包含熒光團(tuán)和“淬滅”基團(tuán)。特異性的環(huán)序列和其互補(bǔ)序列靶核酸的固定導(dǎo)致莖的解旋并在合適的波長激發(fā)下發(fā)射熒光信號。
雜交探針也可以是所謂的捕獲探針。在該情況下，通過任何合適的方法，即例如通過共價(jià)鍵合或通過吸附，直接或間接地將或可將所謂的捕獲探針固定在固體支持物上。然后檢測給定的捕獲探針和靶序列之間的雜交反應(yīng)。
為檢測雜交反應(yīng)，可能直接地(特別是通過將標(biāo)記整合入靶序列內(nèi))使用經(jīng)標(biāo)記的靶序列，或間接地(特別是通過使用如前面定義的檢測探針)使用靶序列。特別地，在雜交步驟之前，可能進(jìn)行靶序列的標(biāo)記和/或切割步驟，例如通過在酶促擴(kuò)增反應(yīng)中使用經(jīng)標(biāo)記的脫氧核糖核苷三磷酸來進(jìn)行。特別是可通過咪唑和氯化錳的作用進(jìn)行切割。也可以在擴(kuò)增步驟后標(biāo)記靶序列，例如根據(jù)資料WO 91/19812中所描述的三明治雜交技術(shù)，通過和檢測探針進(jìn)行雜交來標(biāo)記。另一個(gè)特別優(yōu)選的標(biāo)記核酸的方法描述于申請F(tuán)R2 780 059。
作為固體支持物，可能使用合成材料或天然材料，任選地經(jīng)化學(xué)修飾的材料，特別是多糖例如基于纖維素的材料，例如紙、纖維素衍生物例如乙酸纖維素和硝酸纖維素或葡聚糖、多聚體、共聚物(特別是基于苯乙烯型的單體的)、天然纖維例如棉花和合成的纖維例如尼龍；礦物例如硅石、石英、玻璃、陶瓷；膠乳；磁粒；金屬衍生物、凝膠等。固體支持物可以微量滴定板、如申請WO 94/12670中描述的膜或顆粒的形式存在。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案，檢測探針包含熒光團(tuán)和淬滅基團(tuán)。根據(jù)本發(fā)明的更優(yōu)選的實(shí)施方案，雜交探針在其5’末端包含熒光團(tuán)FAM(6-羧基-熒光素)或ROX(6-羧基-X-羅丹明)和在其3’末端包含淬滅基團(tuán)(Dabsyl)。在下文中，這種雜交探針稱為“分子信標(biāo)”。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，同時(shí)進(jìn)行步驟B和C。該優(yōu)選的實(shí)施方案可用于“實(shí)時(shí)NASBA”，所述“實(shí)時(shí)NASBA”在單個(gè)步驟中組合了NASBA擴(kuò)增技術(shù)和使用“分子信標(biāo)”的實(shí)時(shí)檢測技術(shù)。在試管中進(jìn)行NASBA反應(yīng)，產(chǎn)生了這樣的單鏈RNA，即其同時(shí)可與特異性的“分子信標(biāo)”雜交，產(chǎn)生熒光信號。通過在熒光讀出器中連續(xù)測定信號來實(shí)時(shí)測量新RNA分子的形成。與通過RT-PCR的擴(kuò)增相反，NASBA中的擴(kuò)增可在樣品中存在DNA的情況下進(jìn)行。因此，不必在RNA的提取過程中驗(yàn)證DNA實(shí)際上被完全除去。
如下面的例子所示，當(dāng)我們希望檢測ESR1靶基因(參照序列NCBI目錄號X03635)時(shí)，下列序列優(yōu)選地用于步驟b)
□第一引物SEQ ID No.1或21，□第二引物SEQ ID No.2和步驟C)□包含SEQ ID No.9的檢測探針。
如下面的例子所示，當(dāng)我們希望檢測編碼PGR的靶基因(參照序列NCBI目錄號NM_000926)，下列序列優(yōu)選地用于步驟b)□第一引物SEQ ID No.3或22，□第二引物SEQ ID No.4和步驟C)□包含SEQ ID No.10的檢測探針。
如下面的例子所示，當(dāng)我們希望檢測編碼ESR2的靶基因(參照序列NCBI目錄號MN_001437)，下列序列優(yōu)選地用于步驟b)□第一引物SEQ ID No.5或23，□第二引物SEQ ID No.6和步驟C)□包含SEQ ID No.11的檢測探針。
如下面的例子所示，當(dāng)我們希望檢測編碼HER2的靶基因(參照序列NCBI目錄號NM_00448)，下列序列優(yōu)選地用于步驟b)□第一引物SEQ ID No.7或24，□第二引物SEQ ID No.8和步驟C)□包含SEQ ID No.12的檢測探針。
如下面的例子所示，當(dāng)我們希望檢測PPIB管家基因(參照序列NCBI目錄號M60857)，下列序列優(yōu)選地用于步驟b)□第一引物SEQ ID No.27或30，□第二引物SEQ ID No.28和步驟C)□包含SEQ ID No.29的檢測探針。
當(dāng)在步驟B中使用獲得對于管家基因特異性的擴(kuò)增子的擴(kuò)增引物對時(shí)，可以與前面描述的方式相似的方法，特別是可通過使用檢測探針來檢測所述對于管家基因特異性的擴(kuò)增子。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案，管家基因是編碼親環(huán)蛋白B的PPIB基因并且檢測探針包含選自SEQ ID No.27至29的核苷酸序列的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基。優(yōu)選地，該檢測探針包含熒光團(tuán)和淬滅基團(tuán)。
本發(fā)明也涉及這樣的擴(kuò)增引物，即其包含選自SEQ ID No.1至SEQ ID No.20的至少10個(gè)，優(yōu)選地15個(gè)，和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案，擴(kuò)增引物包含這樣的啟動(dòng)子，即其允許通過噬菌體T7的聚合酶起始轉(zhuǎn)錄。特別地該引物可以是SEQ IDNo.21至24中的任一個(gè)，并優(yōu)選地用于NASBA擴(kuò)增反應(yīng)中。
本發(fā)明也涉及選自下列引物對的引物對□包含核苷酸序列SEQ ID No.1的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.2的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；例如，當(dāng)?shù)谝灰镆許EQ ID No.1作為其序列，第二引物以SEQID No.2作為其序列時(shí)，獲得對編碼ESR1的基因特異性的、具有202個(gè)堿基對大小的擴(kuò)增子，該擴(kuò)增子對應(yīng)于編碼ESR1的參照序列(Genbank X03635)上的序列1427-1629。
□包含核苷酸序列SEQ ID No.3的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.4的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；例如，當(dāng)?shù)谝灰镆許EQ ID No.3作為其序列，第二引物以SEQID No.4作為其序列時(shí)，獲得對編碼PGR的基因特異性的、具有184個(gè)堿基對大小的擴(kuò)增子，該擴(kuò)增子對應(yīng)于編碼PGR的參照序列(Genbank NM_000926)上的序列2761-2945。
□包含核苷酸序列SEQ ID No.5的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.6的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；例如，當(dāng)?shù)谝灰镆許EQ ID No.5作為其序列，第二引物以SEQID No.6作為其序列時(shí)，獲得對編碼ESR2的基因特異性的、具有210個(gè)堿基對大小的擴(kuò)增子，該擴(kuò)增子對應(yīng)于編碼ESR2的參照序列(Genbank MN_001437)上的序列1640-1850。
□包含核苷酸序列SEQ ID No.7的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.8的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；例如，當(dāng)?shù)谝灰镆許EQ ID No.7作為其序列，第二引物以SEQID No.8作為其序列時(shí)，獲得對編碼HER2的基因特異性的、具有185個(gè)堿基對大小的擴(kuò)增子，該擴(kuò)增子對應(yīng)于編碼HER2的參照序列(Genbank MN_004448)上的序列2567-2752。
□包含核苷酸序列SEQ ID No.13的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ IDNo.14的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；例如，當(dāng)?shù)谝灰镆許EQ ID No.13作為其序列，第二引物以SEQ ID No.14作為其序列時(shí)，獲得對編碼ESR1的基因特異性的、具有858個(gè)堿基對大小的擴(kuò)增子，該擴(kuò)增子對應(yīng)于編碼ESR1的參照序列(Genbank X03635)上的序列808-1666。
□包含核苷酸序列SEQ ID No.15的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ IDNo.16的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；例如，當(dāng)?shù)谝灰镆許EQ ID No.15作為其序列，第二引物以SEQ ID No.16作為其序列時(shí)，于是獲得對編碼PGR的基因特異性的、具有658個(gè)堿基對大小的擴(kuò)增子，該擴(kuò)增子對應(yīng)于編碼PGR的參照序列(Genbank NM_000926)上的序列2319-2977。
□包含核苷酸序列SEQ ID No.17的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ IDNo.18的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；例如，當(dāng)?shù)谝灰镆許EQ ID No.17作為其序列，第二引物以SEQ ID No.18作為其序列時(shí)，于是獲得對編碼ESR2的基因特異性的、具有702個(gè)堿基對大小的擴(kuò)增子，該擴(kuò)增子對應(yīng)于編碼ESR2的參照序列(Genbank MN_001437)上的序列1246-1948。
□包含核苷酸序列SEQ ID No.19的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ IDNo.20的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；例如，當(dāng)?shù)谝灰镆許EQ ID No.19作為其序列，第二引物以SEQ ID No.20作為其序列時(shí)，于是獲得對編碼HER2的基因特異性的、具有928個(gè)堿基對大小的擴(kuò)增子，該擴(kuò)增子對應(yīng)于編碼HER2的參照序列(Genbank MN_004448)上的序列2123-3051。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案，所述第一引物包含這樣的啟動(dòng)子，即其允許通過噬菌體T7的聚合酶起始轉(zhuǎn)錄。特別是該引物可以是SEQ ID 21至24中的任一個(gè)。當(dāng)?shù)谝灰锇试S噬菌體T7聚合酶啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子時(shí)，該第一引物優(yōu)選地存在于選自下列的引物對的引物對中□第一擴(kuò)增引物SEQ ID No.21和包含核苷酸序列SEQ ID No.2的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)，更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；□第一擴(kuò)增引物SEQ ID No.22和包含核苷酸序列SEQ ID No.4的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)，更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；□第一擴(kuò)增引物SEQ ID No.23和包含核苷酸序列SEQ ID No.6的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)，更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；□第一擴(kuò)增引物SEQ ID No.24和包含核苷酸序列SEQ ID No.8的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)，更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；本發(fā)明也涉及前面定義的至少一個(gè)擴(kuò)增引物和/或前面定義的至少一對引物在NASBA擴(kuò)增反應(yīng)中的用途。
本發(fā)明也涉及用于獲得對于管家基因特異性的擴(kuò)增子的擴(kuò)增引物。該擴(kuò)增引物優(yōu)選地包含選自SEQ ID No.25至29的序列的至少10個(gè)，優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基。
本發(fā)明也涉及用于獲得對于管家基因特異性的擴(kuò)增子的擴(kuò)增引物對，所述引物對選自下列引物對□包含核苷酸序列SEQ ID No.27的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ IDNo.28的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；例如，當(dāng)?shù)谝灰镆許EQ ID No.27作為其序列，第二引物以SEQ ID No.28作為其序列時(shí)，獲得對PPIB基因特異性的、具有239個(gè)堿基對大小的擴(kuò)增子，該擴(kuò)增子對應(yīng)于PPIB參照序列(GenbankM60857)上的序列231-470。
□包含核苷酸序列SEQ ID No.25的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ IDNo.26的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；例如，當(dāng)?shù)谝灰镆許EQ ID No.25作為其序列，第二引物以SEQ ID No.26作為其序列時(shí)，獲得對PPIB基因特異性的、具有639個(gè)堿基對大小的擴(kuò)增子，該擴(kuò)增子對應(yīng)于PPIB參照序列(GenbankM60857)上的序列11-650。
根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施方案，所述用于獲得對于管家基因特異性的擴(kuò)增子的擴(kuò)增引物對包含這樣的第一引物，即其包含允許通過噬菌體T7聚合酶啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。所述第一擴(kuò)增引物優(yōu)選地是SEQ ID No.30，所述第二擴(kuò)增引物優(yōu)選地包含核苷酸序列SEQ ID No.28的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基。本發(fā)明也涉及這樣的檢測探針，即其包含選自SEQ ID No.1至SEQ ID No.20的核苷酸序列的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基。
優(yōu)選地，該檢測探針包含熒光團(tuán)和淬滅基團(tuán)。
本發(fā)明也涉及用于檢測對于管家基因特異性的擴(kuò)增子的雜交探針。優(yōu)選地，該檢測探針包含選自SEQ ID No.27至29的核苷酸序列的至少10個(gè)、優(yōu)選地15個(gè)和更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸殘基。優(yōu)選地，該檢測探針包含熒光團(tuán)和淬滅基團(tuán)。
本發(fā)明也涉及使用至少一個(gè)如前面所定義的引物和/或至少一對如前面所定義的引物對和/或至少一個(gè)如前面所定義的檢測探針診斷/預(yù)后乳腺癌。
本發(fā)明最后涉及用于乳腺癌的診斷/預(yù)后的試劑盒，其包含至少一個(gè)如前面所定義的引物和/或至少一對如前面所定義的引物對和/或至少一個(gè)如前面所定義的檢測探針。
如下面的實(shí)施例中所示的，當(dāng)我們希望檢測編碼ESR1的靶基因時(shí)，試劑盒還包含□第一引物SEQ ID No.1或21□第二引物SEQ ID No.2□包含SEQ ID No.9的檢測探針。
如下面的實(shí)施例中所示的，當(dāng)我們希望檢測編碼PGR的靶基因時(shí)，試劑盒優(yōu)選地包含□第一引物SEQ ID No.3或22□第二引物SEQ ID No.4□包含SEQ ID No.10的檢測探針。
如下面的實(shí)施例中所示的，當(dāng)我們希望檢測編碼ESR2的靶基因(參照序列NCBI目錄號MN_001437)時(shí)，試劑盒優(yōu)選地包含□第一引物SEQ ID No.5或23□第二引物SEQ ID No.6□包含SEQ ID No.11的檢測探針。
如下面的實(shí)施例中所示的，當(dāng)我們希望檢測編碼HER2的靶基因(參照序列NCBI目錄號NM_00448)時(shí)，試劑盒優(yōu)選地包含□第一引物SEQ ID No.7或24□第二引物SEQ ID No.8□包含SEQ ID No.12的檢測探針。
如下面的實(shí)施例中所示的，和根據(jù)本發(fā)明的特定實(shí)施方案，試劑盒還包含
□第一引物SEQ ID No.27或30□第二引物SEQ ID No.28□包含SEQ ID No.29的檢測探針。
下面的圖是以舉例說明的方式給出并且絕不是限制性的。其將有助于理解本發(fā)明。


圖1顯示實(shí)施例1-3a中描述的對基因ESR1(圖1a)、PGR(圖1b)、ESR2(圖1c)、HER2(圖1d)和PPIB(圖1e)獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線。各基因的各標(biāo)準(zhǔn)曲線(基于質(zhì)粒中對于所述基因特異性的參照序列在體外轉(zhuǎn)錄成RNA而獲得的)表示出現(xiàn)擴(kuò)增指數(shù)期所需的時(shí)間(也稱為TTP陽性，閾值時(shí)間)，其為在NASBA擴(kuò)增起始時(shí)存在的RNA的拷貝數(shù)的函數(shù)(在擴(kuò)增起始時(shí)RNA拷貝的初始數(shù)目越大，出現(xiàn)指數(shù)期所需的時(shí)間越短)。
下列的實(shí)施例是以舉例說明的方式給出的并且絕不是限制性的。其有助于理解本發(fā)明。
實(shí)施例1-編碼ESR1、PGR、ESR2和HER2的mRNAs的擴(kuò)增和實(shí)時(shí)檢測1/獲得和制備樣品使用腫瘤細(xì)胞的三個(gè)品系進(jìn)行該實(shí)施例，之前通過IHC法或放射性配體法(或LBA)確定了所述腫瘤細(xì)胞的激素受體的表達(dá)，使用的三個(gè)系是MCF-7(表達(dá)受體ESR1和PGR)、T47D(不表達(dá)ESR1受體但表達(dá)PGR受體)以及BT-549(既不表達(dá)ESR1受體也不表達(dá)PGR受體)。從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Manassas，USA)獲得這些品系。將這些細(xì)胞在37℃下、含有5％CO2的氣體環(huán)境中培養(yǎng)在含有胎牛血清(10％)、L-谷氨酸(2mM)、非必需氨基酸(1％)和鏈霉素(10μg/ml)的DMEM培養(yǎng)基(MCF-7)或RPMI 1640(T47D和BT-549)中。
也使用來自患有乳腺癌的患者(n＝102)的腫瘤進(jìn)行該實(shí)施例，之前已根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法通過放射性配體法(LBA)確定了所述腫瘤的激素受體ER和PR(也稱作ESR1和PGR)的表達(dá)。LBA技術(shù)告訴我們功能性受體ER和PR在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的存在。之前已按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法，通過定量PCR法(為我們提供關(guān)于HER2基因擴(kuò)增的信息)和ELISA法(提供關(guān)于由HER2基因編碼的膜蛋白的表達(dá)的信息)確定了HER2的表達(dá)。
2/總RNAs的提取根據(jù)試劑盒提供商(Invitrogen，Canada)的推薦使用Trizol試劑從細(xì)胞系中提取總RNAs。在260和280nm確定RNA的質(zhì)量和數(shù)量并在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行證實(shí)。然后將RNAs在-70℃下凍存待用。
也以相似的方法從來自患有乳腺癌的患者的腫瘤中提取總RNAs。
3)NASBA擴(kuò)增NASBA擴(kuò)增反應(yīng)基于禽類成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV-RT)的逆轉(zhuǎn)錄酶、大腸桿菌(E.coli)的RNA酶H和噬菌體T7的RNA聚合酶的同時(shí)活性(Compton J，1991，Nature，35091-92)。如前面所述，使用NuclisensEasyQ讀出器(bioMérieux BV，the Netherlands)和“分子信標(biāo)”檢測探針進(jìn)行擴(kuò)增子的實(shí)時(shí)檢測。NASBA中的定量基于標(biāo)準(zhǔn)曲線的使用，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線是始于質(zhì)粒中的對于靶基因特異性的參照序列在體外轉(zhuǎn)錄成RNA而獲得的。該標(biāo)準(zhǔn)曲線表示出現(xiàn)擴(kuò)增的指數(shù)期所需的時(shí)間，其為在NASBA擴(kuò)增起始時(shí)存在的RNA的拷貝數(shù)的函數(shù)(擴(kuò)增起始時(shí)RNA的起始拷貝數(shù)越大，出現(xiàn)指數(shù)期所需的時(shí)間越短)。
a)基因ESR1、PGR、ESR2、HER2和PPIB管家基因的擴(kuò)增-獲取標(biāo)準(zhǔn)典線編碼ESR1的靶基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線對于編碼ESR1的靶基因(參照序列NCBI目錄號X03635)，使用分別位于參照序列的位點(diǎn)808-832和1646-166的第一引物SEQ IDNo.135′TACAGGCCAA ATTCAGATAA TCGAC 3′和第二引物SEQ ID No.14 5′GGAACCGAGAT GATGTAGCCA 3′，以通過PCR產(chǎn)生(第一循環(huán)的變性(95℃；1分鐘)；然后35個(gè)包括下列步驟的循環(huán)變性94℃；1分鐘；雜交60℃；1分鐘；延伸72℃；2分鐘，以及最后的循環(huán)，其包括變性步驟72℃；7分鐘)858個(gè)堿基對大小的、對編碼ESR1的基因特異性的擴(kuò)增子(其被稱為“ESR1擴(kuò)增子”)。
然后將如上所述獲得的ESR1擴(kuò)增子克隆為質(zhì)粒pGEM-T(Promega，Madison，USA)。
通過測序(Biofidal，Vaulx en Velin，F(xiàn)rance)驗(yàn)證這些ESR1擴(kuò)增子的序列以確保其確實(shí)對應(yīng)于待擴(kuò)增的靶基因的序列。獲得的擴(kuò)增子對于ESR1基因確實(shí)是特異性的。
然后使用RNA聚合酶(T7或SP6(Megascriptkit，Ambion，Austin，USA)，依賴于擴(kuò)增子方向)在體外將擴(kuò)增子轉(zhuǎn)錄成RNA。在用DNA酶除去質(zhì)粒后，使用RneasyMini試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)對RNAs進(jìn)行純化和定量(RNA6000Nano，AgilentTechnologies，Walbronn，Germany)。
將上面獲得的RNAs稀釋成各種濃度(母液0.2×1011拷貝/μl，以0.2×1011拷貝/μl至0.2×102拷貝/μl進(jìn)行級聯(lián)稀釋)。在特異性引物ESR1 SEQ ID No.1和ESR1 No.2以及“分子信標(biāo)”SEQ ID No.9存在的情況下，使用Nuclisens basic試劑盒(bioMérieux BV，theNetherlands)通過NASBA擴(kuò)增級聯(lián)稀釋的這些稀釋物□0.2μM的第一ESR1引物SEQ ID No.15′CTCCACCATGCCCTCTACACA3′，在其5′末端，其包含(并以小寫字母顯示)含有T7聚合酶啟動(dòng)子的序列，即其全長序列是SEQ ID No.215′aattctaata cgactcactatagggagaag gCTCCACCAT GCCCTCTACA CA 3′的第一引物，□0.2μM的第二ESR1引物SEQ ID No.2 5′ACATGATCAACTGGGCGAAGA3′，□0.1μM的“分子信標(biāo)”，其包含在5’端標(biāo)記有熒光團(tuán)FAM(6-羧基熒光素)和在3’標(biāo)記有“淬滅基團(tuán)”(Dabsyl)的SEQ ID No.9 5′GATCCTGATGATTGGTCTCG 3′(完整序列5′FAM-cgatcgGATC CTGATGATTGGTCTCGcgat cg-Dabsyl 3′)。
隨著擴(kuò)增進(jìn)行，信號按產(chǎn)生的擴(kuò)增子的量成比例增強(qiáng)。作為時(shí)間函數(shù)的熒光曲線使得可能確定擴(kuò)增的指數(shù)期出現(xiàn)的時(shí)間(也稱為TTP陽性，閾值時(shí)間)。在NASBA擴(kuò)增中，標(biāo)準(zhǔn)曲線ESR1使最初存在于溶液中的轉(zhuǎn)錄物的數(shù)目成為檢測到的TTP的函數(shù)。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算靶基因拷貝的絕對數(shù)目。最后，在管家基因(在本情況下是PPIB基因)的基礎(chǔ)上規(guī)范化該值。該標(biāo)準(zhǔn)曲線ESR1顯示于圖1a。
編碼PGR的靶基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)和對于ESR1的原理相同的原理構(gòu)建編碼PGR的靶基因的曲線，除了使用的對PGR特異性的擴(kuò)增引物和“分子信標(biāo)”。
因此，對于編碼PGR的靶基因(參照序列NCBI目錄號NM_000926)，使用分別位于參照序列的位點(diǎn)2319-2340和2955-2977的第一引物SEQ ID No.15 5′TGACAAGTCTTAATCAACTAGG 3′和第二引物SEQ ID No.16 5′TCACTTTTTAT GAAAGAGAAGGG 3′。通過測序(Biofidal，Vaulx en Velin，F(xiàn)rance)驗(yàn)證這些PGR擴(kuò)增子的序列以確保其確實(shí)對應(yīng)于待擴(kuò)增的靶基因的序列。獲得的擴(kuò)增子對于PGR基因確實(shí)是特異性的。
然后使用RNA聚合酶(T7或SP6(Megascript試劑盒，Ambion，Austin，USA)，依賴于擴(kuò)增子方向)在體外將擴(kuò)增子轉(zhuǎn)錄成RNA。在用DNA酶除去質(zhì)粒后，使用RneasyMini試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)對RNAs進(jìn)行純化和定量(RNA6000Nano，AgilentTechnologies，Walbronn，Germany)。
將上面獲得的RNAs稀釋成各種濃度(母液0.2×1011拷貝/μl，以0.2×1011拷貝/μl至0.2×102拷貝/μl進(jìn)行級聯(lián)稀釋)。在下列物質(zhì)存在的情況下，使用Nuclisens basic試劑盒(bioMérieux BV，theNetherlands)通過NASBA擴(kuò)增這些經(jīng)級聯(lián)稀釋的稀釋物□0.1μM的第一PGR引物SEQ ID No.3 5′TCCCTGCCAATATCTTGGGTA3′，在其5′末端，其包含(并以小寫字母顯示)含有T7聚合酶啟動(dòng)子的序列，即第一引物的完整序列是SEQ ID No.225′aattctaatacgactcacta tagggagaag gTCCCTGCCA ATATCTTGGG TA 3′，□0.1μM的第二PGR引物SEQ ID No.4 5′AGTTGTGTCGAGCTCACAGC3′，□使用0.1μM的“分子信標(biāo)”，其包含在其5’端標(biāo)記有熒光團(tuán)FAM(6-羧基熒光素)和在其3’標(biāo)記有“淬滅基團(tuán)”(Dabsyl)的SEQ IDNo.10 5′CGGGCACTGAGTGTTGAATT 3′(完整序列5′FAM-cgatcgCGGG CACTGAGTGT TGAATTcgat cg-Dabsyl 3′)。
標(biāo)準(zhǔn)曲線PGR顯示于圖1B。
編碼ESR2的靶基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)和對于ESR1的原理相同的原理構(gòu)建編碼ESR2的靶基因的曲線，除了使用的對于ESR2是特異性的擴(kuò)增引物和“分子信標(biāo)”。
因此，對于編碼ESR2的靶基因(參照序列NCBI目錄號MN_001437)，使用分別位于參照序列的位點(diǎn)1246-1263和1928-1948的第一引物SEQ ID No.17 5′GCCGCCCCAT GTGCTGAT 3′和第二引物SEQ ID No.18 5′GGACCCCGTGA TGGAGGACTT 3′。通過測序(Biofdal，Vaulx en Velin，F(xiàn)rance)驗(yàn)證這些ESR2擴(kuò)增子的序列以確保其確實(shí)對應(yīng)于待擴(kuò)增的靶基因的序列。獲得的擴(kuò)增子對于ESR2基因確實(shí)是特異性的。
然后使用RNA聚合酶(T7或SP6(Megascript試劑盒，Ambion，Austin，USA)，依賴于擴(kuò)增子方向)在體外將擴(kuò)增子轉(zhuǎn)錄成RNA。在用DNA酶除去質(zhì)粒后，使用RneasyMini試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)對RNAs進(jìn)行純化和定量(RNA6000Nano，AgilentTechnologies，Walbronn，Germany)。
將上面獲得的RNAs稀釋成各種濃度(母液0.2×1011拷貝/μl，以0.2×1011拷貝/μl至0.2×102拷貝/μl進(jìn)行級聯(lián)稀釋)。在下列物質(zhì)存在的情況下，使用Nuclisens basic試劑盒(bioMérieux BV，theNetherlands)通過NASBA擴(kuò)增這些經(jīng)級聯(lián)稀釋的稀釋物□0.2μM的第一ESR2引物SEQ ID No.5 5′TGAGCAGATGTTCCATGCCCT3′，在其5′末端包含(并以小寫字母顯示)含有T7聚合酶啟動(dòng)子的序列，即第一引物的完整序列是SEQ ID No.235′aattctaatacgactcacta tagggagaag gTGAGCAGAT GTTCCATGCC CT 3′，□0.2μM的第二ESR2引物SEQ ID No.6 5′TCCAGTATGT ACCCTCTGGT3′，□0.1μM的“分子信標(biāo)”，包含在其5’端標(biāo)記有熒光團(tuán)FAM(6-羧基熒光素)和在其3’標(biāo)記有“淬滅基團(tuán)”(Dabsyl)的SEQ ID No.115′GATGCTTTGGTTTGGGTGAT 3′。
標(biāo)準(zhǔn)曲線ESR2顯示于圖1C。
編碼HER2的靶基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)和對于ESR1的原理相同的原理構(gòu)建編碼HER2的靶基因的曲線，除了使用的擴(kuò)增引物和“分子信標(biāo)”對于HER2是特異性的。
因此，對于編碼HER2的靶基因(參照序列NCBI目錄號NM_00448)，使用分別位于參照序列的位點(diǎn)2123-2147和3027-3051的第一引物SEQ ID No.19 5′TGGTTGGCAT TCTGCTGGTC GTGGT 3′和第二引物SEQ ID No.20 5′TGGCCGACAT TCAGAGTCAA TCATC 3′。通過測序(Biofidal，Vaulx en Velin，F(xiàn)rance)驗(yàn)證這些HER2擴(kuò)增子的序列以確保其確實(shí)對應(yīng)于待擴(kuò)增的靶基因的序列。獲得的擴(kuò)增子對于HER2基因確實(shí)是特異性的。
然后使用RNA聚合酶(T7或SP6(Megascript試劑盒，Ambion，Austin，USA)，依賴于擴(kuò)增子方向)在體外將擴(kuò)增子轉(zhuǎn)錄成RNA。在用DNA酶除去質(zhì)粒后，使用RneasyMini試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)對RNAs進(jìn)行純化和定量(RNA6000Nano，AgilentTechnologies，Walbronn，Germany)。
將上面獲得的RNAs稀釋成各種濃度(母液0.2×1011拷貝/μl，以0.2×1011拷貝/μl至0.2×102拷貝/μl進(jìn)行級聯(lián)稀釋)。在下列物質(zhì)存在的情況下，使用Nuclisens basic試劑盒(bioMérieux BV，theNetherlands)通過NASBA擴(kuò)增這些經(jīng)級聯(lián)稀釋的稀釋物□0.2μM的第一HER2引物SEQ ID No.7 5′GAGCCAGCCC GAAGTCTGTA3′，在其5′末端包含(并以小寫字母顯示)T7聚合酶啟動(dòng)子，即第一引物的完整序列是SEQ ID No.245′aattctaata cgactcactatagggagaag g GAGCCAGC CCGAAGTCTG TA 3′，□0.2μM的第二HER2引物SEQ ID No.8 5′TCTTAGACCA TGTCCGGGAAA 3′，□0.1μM的使用的“分子信標(biāo)”，包含在其5’端標(biāo)記有熒光團(tuán)FAM(6-羧基熒光素)和在其3’末端標(biāo)記有“淬滅基團(tuán)”(Dabsyl)的SEQ IDNo.12 5′GGAGGATGTG CGGCTCGTAC 3′。
標(biāo)準(zhǔn)曲線HER2顯示于圖1D。
PPIB靶基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)和對于ESR1的原理相同的原理構(gòu)建編碼PPIB靶基因的曲線，除了使用的擴(kuò)增引物和“分子信標(biāo)”對于PPIB是特異性的。
因此，對于PPIB管家基因(參照序列NCBI目錄號M60857)，使用分別位于參照序列的位點(diǎn)11-30和631-650的第一引物SEQ ID No.25 5′ACATGAAGGT GCTCCTTGCC 3′和第二引物SEQ ID No.26 5′GTCCCTGTGC CCTACTCCTT 3′。通過測序(Biofidal，Vaulx en Velin，F(xiàn)rance)驗(yàn)證這些PPIB擴(kuò)增子的序列以確保其確實(shí)對應(yīng)于待擴(kuò)增的靶基因的序列。獲得的擴(kuò)增子對于PPIB基因確實(shí)是特異性的。
然后使用RNA聚合酶(T7或SP6(Megascript試劑盒，Ambion，Austin，USA)，依賴于擴(kuò)增子方向)在體外將擴(kuò)增子轉(zhuǎn)錄成RNA。在用DNA酶除去質(zhì)粒后，使用RneasyMini試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)對RNAs進(jìn)行純化和定量(RNA6000Nano，AgilentTechnologies，Walbronn，Germany)。
將上面獲得的RNAs稀釋成各種濃度(母液0.2×1011拷貝/μl，以0.2×1011拷貝/μl至0.2×102拷貝/μl進(jìn)行級聯(lián)稀釋)。在下列物質(zhì)存在的情況下，使用Nuclisens basic試劑盒(bioMérieux BV，theNetherlands)通過NASBA擴(kuò)增這些經(jīng)級聯(lián)稀釋的稀釋物□0.2μM的第一PPIB引物SEQ ID No.27 5′CAGGCTGTCTTGACTGTCGT GA 3′，在其5′末端包含(并以小寫字母顯示)含有T7聚合酶啟動(dòng)子的序列，即第一引物的完整序列是SEQ ID No.305′aattctaata cgactcacta tagggagaag gCAGGCTGTC TTGACTGTCG TGA 3′，□0.2μM的第二PPIB引物SEQ ID No.28 5′AGGAGAGAAAGGATTTGGCT 3′，□0.1μM的“分子信標(biāo)”，其包含在其5’端標(biāo)記有熒光團(tuán)ROX(6-羧基-X-羅丹明)和在其3’標(biāo)記有“淬滅基團(tuán)”(Dabsyl)的SEQ IDNo.29 5′GATCCAGGGCGGAGACTTCA 3′(完整序列5′ROX-cgatcgGATC CAGGGCGGAG ACTTCAcgat cg-Dabsyl 3′)。
標(biāo)準(zhǔn)曲線PPIB顯示于圖1E。
b)NASBA擴(kuò)增反應(yīng)b1)ESR1和PPIB基因的雙重?cái)U(kuò)增使用Nuclisens basic試劑盒(bioMérieux BV，theNetherlands)進(jìn)行該擴(kuò)增反應(yīng)。為進(jìn)行該反應(yīng)，將5ng從不同細(xì)胞系中提取的總RNA加入10μl NASBA緩沖液(在20μl的反應(yīng)介質(zhì)中的終濃度40mM Tris HCl pH8.5、12mM MgCl2、70mM KCl、5mM二硫蘇糖醇、15％v/v DMSO、1mM各dNTP、2mM各NTP)。
將0.1μM包含□SEQ ID No.9 5′GATCCTGATGATTGGTCTCG 3′，在5’端標(biāo)記有熒光團(tuán)FAM(6-羧基熒光素)和在其3’標(biāo)記有“淬滅基團(tuán)”(Dabsyl)，(完整序列5′FAM-cgatcgGATC CTGATGATTG GTCTCGcgatcg-Dabsyl 3′，用于檢測ESR1基因的RNAs)，□SEQ ID No.29 5′GATCCAGGGCGGAGACTTCA 3′，在5’端標(biāo)記有熒光團(tuán)FOX(6-羧基-X-羅丹明)和在3’標(biāo)記有“淬滅基團(tuán)”(Dabsyl)，(完整序列5′ROX-cgatcgGATC CAGGGCGGAGACTTCAcgat cg-Dabsyl 3′，用于檢測PPIB基因的RNAs)，的“分子信標(biāo)”加入該介質(zhì)。
也將下列引物加入至該介質(zhì)
□0.2μM的第一ESR1引物SEQ ID No.1 5′CTCCACCATG CCCTCTACACA 3′，在其5′末端包含(并以小寫字母顯示)含有T7聚合酶啟動(dòng)子的序列，即其完整序列是SEQ ID No.215′aattctaata cgactcactatagggagaag gCTCCACCAT GCCCTCTACA CA 3′的第一引物，□0.2μM的第二ESR1引物SEQ ID No.2 5′ACATGATCAA CTGGGCGAAGA 3′，□0.2μM的第一PPIB引物SEQ ID No.27 5′CAGGCTGTCTTGACTGTCGTGA 3′，在其5′末端包含(并以小寫字母顯示)含有T7聚合酶啟動(dòng)子的序列，即其完整序列是SEQ ID No.305′aattctaatacgactcacta tagggagaag gCAGGCTGTC TTGACTGTCG TGA 3′的第一引物，□0.2μM的第二PPIB引物SEQ ID No.28 5′AGGAGAGAAAGGATTTGGCT 3′。
在41℃下溫育2分鐘之前，在65℃下預(yù)溫育2分鐘。加入5μl體積的酶混合物(0.08U的RNA酶H、32U的RNA聚合酶T7、6.4U的AMV-RT)，并在41℃下溫育90分鐘。
對經(jīng)轉(zhuǎn)錄的RNAs進(jìn)行實(shí)時(shí)定量(NucliSens EasyQ，bioMérieux)，NASBA反應(yīng)產(chǎn)生這樣的擴(kuò)增子，即特異性的“分子信標(biāo)”可與其同時(shí)雜交，產(chǎn)生熒光信號。通過在熒光讀出器(NucliSens EasyQ分析儀)上連續(xù)監(jiān)控信號來實(shí)時(shí)測量新的RNA分子的形成。由Nuclisens TTP軟件(bioMérieux BV，the Netherlands)提供分析和結(jié)果的自動(dòng)報(bào)告。使用前面所定義的標(biāo)準(zhǔn)曲線(經(jīng)轉(zhuǎn)錄的RNA的稀釋度108至102拷貝)對各靶ESR1基因和PPIB管家基因的表達(dá)進(jìn)行定量，以推斷每個(gè)樣品的mRNA拷貝數(shù)。靶基因表達(dá)的量表示為mRNA拷貝數(shù)/5ng總RNA。
表1顯示使用5ng來源于細(xì)胞系MCF-7、T47D和BT-549的總RNA定量的ESR1基因的表達(dá)。
表1-ESR1基因在MCF-7，T47D，BT-549細(xì)胞中的表達(dá)(NC不能被計(jì)算)ESR1基因的表達(dá)表示為靶基因的mRNA拷貝數(shù)與管家基因的mRNA拷貝數(shù)的比例。因此，ESR1的mRNAs在MCF-7細(xì)胞中表達(dá)而其未在BT-549細(xì)胞中被檢測到，與這些細(xì)胞的激素受體的表達(dá)一致。注意雖然ESR1的mRNAs在T47D細(xì)胞中表達(dá)，但只有PGR受體表達(dá)，暗示著ESR1基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。
表2顯示使用50ng獲自IHC+腫瘤(即表達(dá)腫瘤細(xì)胞的核激素受體)或來自IHC-腫瘤(即不表達(dá)核激素受體)的總RNA定量的ESR1基因的表達(dá)(3-7個(gè)腫瘤的平均值)
表2-ESR1基因在IHC+和IHC-腫瘤中的表達(dá)ESR1的表達(dá)表示為靶基因的mRNA的拷貝數(shù)與管家基因的mRNA拷貝數(shù)的比例。在IHC+腫瘤中觀察到ESR1基因的過量表達(dá)。
基于前面構(gòu)建的ESR1和PPIB標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定雙重?cái)U(kuò)增的ESR1和PPIB基因的檢測極限和定量極限。對于ESR1和PPIB，觀察到定量極限為100個(gè)mRNA拷貝。對于ESR1和PPIB，檢測極限是100個(gè)mRNA拷貝。
通過在對于PGR特異性的“分子信標(biāo)”存在的情況下擴(kuò)增ESR1和通過在特異性針對ESR1的“分子信標(biāo)”存在的情況下擴(kuò)增PGR來檢測ESR1/PPIB雙體的特異性。沒有檢測到信號。類似地，當(dāng)以從BT-549(ESR1和PGR呈陰性的細(xì)胞系)中獲得的總RNAs起始進(jìn)行NASBA時(shí)，沒有觀測到信號。
使用另外的擴(kuò)增技術(shù)(定量RT-PCR)確認(rèn)所有這些結(jié)果。此外，使針對ESR1基因的通過NASBA技術(shù)在信使RNA水平上獲得的結(jié)果和通過LBA法(配體結(jié)合測定法)(ESRr＝0.77，p＜0.0001；Spearman相關(guān)性統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)(Spearman statistical test of correlation))在蛋白質(zhì)水平上獲得的結(jié)果產(chǎn)生關(guān)聯(lián)。這些結(jié)果顯示ESR1的mRNAs的表達(dá)與細(xì)胞質(zhì)中功能性受體的存在關(guān)聯(lián)，肯定了在mRNA水平上觀測該基因的表達(dá)的有利方面。
這些結(jié)果表明NASBA中的ESR1/PPIB雙體允許在非常少量的總RNA的基礎(chǔ)上，和，更廣義地在非常少量腫瘤細(xì)胞的基礎(chǔ)上對ESR1基因的表達(dá)進(jìn)行定量，并且其完全適合用于研究乳腺癌的診斷/預(yù)后和患者對特定治療的反應(yīng)。
b2)PGR和PPIB基因的雙重?cái)U(kuò)增使用Nuclisens basic試劑盒(bioMérieux BV，theNetherlands)進(jìn)行該擴(kuò)增反應(yīng)。為進(jìn)行該反應(yīng)，將5ng從不同細(xì)胞系中提取的總RNA加入至10μl NASBA緩沖液(在20μl的反應(yīng)介質(zhì)中的終濃度40mM Tris HCl pH8.5、12mM MgCl2、70mM KCl、5mM二硫蘇糖醇、15％v/v DMSO、1mM各dNTP、2mM NTP)。
將0.1μM包含□SEQ ID No.10 5′CGGGCACTGAGTGTTGAATT 3′，在其5’末端標(biāo)記有熒光團(tuán)FAM(6-羧基熒光素)和在其3’末端標(biāo)記有“淬滅基團(tuán)”(Dabsyl)(完整序列5′FAM-cgatcgCGGG CACTGAGTGTTGAATTcg at cg-Dabsyl 3′)，用于在PGR/親環(huán)蛋白B雙重?cái)U(kuò)增中檢測編碼PGR的RNAs。
□SEQ ID No.29 5′GATCCAGGGCGGAGACTTCA 3′，在5’端標(biāo)記有熒光團(tuán)ROX(6-羧基-X-羅丹明)和在其3’標(biāo)記有“淬滅基團(tuán)”(Dabsyl)，(完整序列5′ROX-cgatcgGATC CAGGGCGGAGACTTCAcgat cg-Dabsyl 3′，用于檢測編碼PPIB基因的RNAs)，的“分子信標(biāo)”加入至該介質(zhì)。
也將下列引物加入該介質(zhì)□0.1μM的第一PGR引物SEQ ID No.3 5′TCCCTGCCAA TATCTTGGGTA 3′，在其5′末端包含(并以小寫字母顯示)含有T7聚合酶啟動(dòng)子的序列，即其完整序列是SEQ ID No.225′aattctaata cgactcactatagggagaag gTCCCTGCCA ATATCTTGGG TA 3′的第一引物，□0.1μM的第二PGR引物SEQ ID No.4 5′AGTTGTGTCG AGCTCACAGC3′，□0.2μM的第一PPIB引物SEQ ID No.27 5′CAGGCTGTCTTGACTGTCGTGA 3′，在其5′末端包含(并以小寫字母顯示)含有T7聚合酶啟動(dòng)子的序列，即其完整序列是SEQ ID No.305′aattctaatacgactcacta tagggagaag gCAGGCTGTC TTGACTGTCG TGA 3′的第一引物，□0.2μM的第PPIB引物SEQ ID No.28 5′AGGAGAGAAAGGATTTGGCT 3′。
在41℃下溫育2分鐘之前，在65℃下先預(yù)溫育2分鐘。加入5μl體積的酶混合物(0.08U的RNA酶H、32U的RNA聚合酶T7、6.4U的AMV-RT)，并在41℃下溫育90分鐘。
根據(jù)和對于ESR1的原理相似的原理對經(jīng)轉(zhuǎn)錄的RNAs進(jìn)行實(shí)時(shí)定量。使用如前面所定義的標(biāo)準(zhǔn)曲線(經(jīng)轉(zhuǎn)錄的RNA的稀釋度108至102拷貝)對各靶PGR基因和PPIB管家基因的表達(dá)進(jìn)行定量，以推斷每個(gè)樣品的mRNA拷貝數(shù)。靶基因表達(dá)的量表示為mRNA拷貝數(shù)/5ng總RNA。
表3顯示使用5ng來源于細(xì)胞系MCF-7、T47D和BT-549的總RNA定量的PGR基因的表達(dá)。
表3-PGR基因在MCF-7，T47D，BT-549細(xì)胞中的表達(dá)PGR基因的表達(dá)表示為靶基因的mRNA拷貝數(shù)與管家基因的mRNA拷貝數(shù)的比例。因此，PGR的mRNAs在MCF-7和T47D細(xì)胞中表達(dá)但其在BT-549細(xì)胞中未被檢測到，與這些細(xì)胞的激素受體的表達(dá)一致。
表4顯示使用50ng獲自IHC+腫瘤(即在腫瘤細(xì)胞的表面表達(dá)激素受體)或來自IHC-腫瘤(即不在其表面表達(dá)激素受體)的總RNA定量的PGR基因的表達(dá)(3-7個(gè)腫瘤的平均值)
表4-PGR基因在IHC+和IHC-腫瘤中的表達(dá)PGR基因的表達(dá)表示為靶基因的mRNA的拷貝數(shù)與管家基因的mRNA拷貝數(shù)的比例。在IHC+腫瘤中觀察到PGR基因的過量表達(dá)。
基于前面構(gòu)建的PGR和PPIB標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定雙重?cái)U(kuò)增的PGR和PPIB基因的檢測極限和定量極限。對于PGR和PPIB，分別觀察到定量極限為100和1000個(gè)mRNA拷貝。對于PGR和PPIB，檢測極限是100個(gè)mRNA拷貝。
通過在對于ESR1特異性的“分子信標(biāo)”存在的情況下擴(kuò)增PGR來檢測PGR/PPIB雙體的特異性。沒有檢測到信號。類似地，當(dāng)以從BT-549(PGR呈陰性的細(xì)胞系)中獲得的總RNAs起始進(jìn)行NASBA時(shí)，沒有觀測到信號。
使用另外的擴(kuò)增技術(shù)(定量RT-PCR)來確認(rèn)所有這些結(jié)果。此外，使針對PGR基因的通過NASBA技術(shù)在信使RNA水平上獲得的結(jié)果和通過LBA法(配體結(jié)合測定法)(PGRr＝0.87，p＜0.0001，n＝102；Spearman相關(guān)性統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)(Spearman statistical test ofcorrelation))在蛋白質(zhì)水平上獲得的結(jié)果關(guān)聯(lián)。這些結(jié)果顯示PGR的mRNAs的表達(dá)與細(xì)胞質(zhì)中功能性受體的存在關(guān)聯(lián)，肯定了在mRNA水平上研究該基因表達(dá)的有利方面。
這些結(jié)果表明NASBA中的PGR/PPIB雙體允許在非常少量的總RNA的基礎(chǔ)上，和，更廣義地在非常少量腫瘤細(xì)胞的基礎(chǔ)上對PGR基因的表達(dá)進(jìn)行定量，并且其完全適合用于研究乳腺癌的診斷/預(yù)后和患者對特定治療的反應(yīng)。
b3)ESR2和PPIB基因的雙重?cái)U(kuò)增使用Nuclisens basic試劑盒(bioMérieux BV，theNetherlands)進(jìn)行該擴(kuò)增反應(yīng)。為進(jìn)行該反應(yīng)，將5ng從不同細(xì)胞系中提取的總RNA加入至10μl NASBA緩沖液(在20μl的反應(yīng)介質(zhì)中的終濃度40mM Tris HCl pH8.5、12mM MgCl2、70mM KCl、5mM二硫蘇糖醇、15％v/v DMSO、各dNTP 1mM、各NTP 2mM)。
將0.1μM包含□SEQ ID No.11 5′GATGCTTTGGTTTGGGTGAT 3′，在其5’末端標(biāo)記有熒光團(tuán)FAM(6-羧基熒光素)和在其3’末端標(biāo)記有“淬滅基團(tuán)”(Dabsyl)。
□SEQ ID No.29 5′GATCCAGGGCGGAGACTTCA 3′，在5’端標(biāo)記有熒光團(tuán)ROX(6-羧基-X-羅丹明)和在其3’標(biāo)記有“淬滅基團(tuán)”(Dabsyl)，(完整序列5′ROX-cgatcgGATC CAGGGCGGAGACTTCAcgat cg-Dabsyl 3′，用于檢測編碼親環(huán)蛋白B的PPIB基因的RNAs)，的“分子信標(biāo)”加入該介質(zhì)。
也將下列引物加入該介質(zhì)□0.2μM的第一ESR2引物SEQ ID No.5 5′TGAGCAGATG TTCCATGCCCT 3′，在其5′末端包含(并以小寫字母顯示)T7聚合酶啟動(dòng)子，即其完整序列是SEQ ID No.235′aattctaata cgactcactatagggagaag gTGAGCAGAT GTTCCATGCC CT 3′的第一引物，□0.2μM的第二ESR2引物SEQ ID No.6 5′TCCAGTATGT ACCCTCTGGT3′，□0.2μM的第一PPIB引物SEQ ID No.27 5′CAGGCTGTCTTGACTGTCGTGA 3′，在其5′末端包含(并以小寫字母顯示)T7聚合酶啟動(dòng)子，即其完整序列是SEQ ID No.305′aattctaata cgactcactatagggagaag gCAGGCTGTC TTGACTGTCG TGA 3′的第一引物，0.2μM的第二PPIB引物SEQ ID No.28 5′AGGAGAGAAA GGATTTGGCT 3′。
在41℃下溫育2分鐘之前，在65℃下先預(yù)溫育2分鐘。加入5μl體積的酶混合物(0.08U的RNA酶H、32U的RNA聚合酶T7、6.4U的AMV-RT)，并在41℃下溫育90分鐘。
對經(jīng)轉(zhuǎn)錄的RNAs進(jìn)行實(shí)時(shí)定量(NucliSens EasyQ，bioMérieux)，NASBA反應(yīng)產(chǎn)生這樣的擴(kuò)增子，即特異性的“分子信標(biāo)”可與其同時(shí)雜交，產(chǎn)生熒光信號。通過在熒光讀出器(NucliSens EasyQ分析儀)上連續(xù)監(jiān)控信號來實(shí)時(shí)測量新的RNA分子的形成。由Nuclisens TTP軟件(bioMérieux BV，the Netherlands)提供分析和結(jié)果的自動(dòng)報(bào)告。使用前面所定義的標(biāo)準(zhǔn)曲線(經(jīng)轉(zhuǎn)錄的RNA的稀釋度108至102拷貝)對各靶ESR2基因和PPIB管家基因的表達(dá)進(jìn)行定量，使得可能推斷每個(gè)樣品的mRNA拷貝數(shù)。
基于前面構(gòu)建的ESR2和PPIB標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定各基因的檢測極限和定量極限。對于ESR2和PPIB，分別觀察到定量極限為1000和10000個(gè)mRNA拷貝。對于ESR2和PPIB，檢測極限是1000個(gè)mRNA拷貝。
通過在對于HER2特異性的“分子信標(biāo)”存在的情況下擴(kuò)增ESR2，和通過在對于ESR2特異性的“分子信標(biāo)”存在的情況下擴(kuò)增HER2來檢測ESR2/PPIB雙體的特異性。沒有檢測到信號。
這些結(jié)果表明NASBA中的ESR2/PPIB雙體允許在非常少量的總RNA的基礎(chǔ)上特異性和靈敏性地?cái)U(kuò)增ESR2基因，使得該雙體完全適合用于研究乳腺癌的診斷/預(yù)后和患者對特定治療的反應(yīng)。
b4)HER2和PPIB基因的雙重?cái)U(kuò)增使用Nuclisens basic試劑盒(bioMérieux BV，theNetherlands)進(jìn)行該擴(kuò)增反應(yīng)。為進(jìn)行該反應(yīng)，將5ng從不同細(xì)胞系中提取的總RNA加入至10μl NASBA緩沖液(在20μl的反應(yīng)介質(zhì)中的終濃度40mM Tris HCl pH8.5、12mM MgCl2、70mM KCl、5mM二硫蘇糖醇、15％v/v DMSO、各dNTP 1mM、各NTP 2mM)。
將0.1μM包含□SEQ ID No.12 5′GGAGGATGTG CGGCTCGTAC 3′，在其5’末端標(biāo)記有熒光團(tuán)FAM(6-羧基熒光素)和在其3’末端標(biāo)記有“淬滅基團(tuán)”(Dabsyl)，用于在HER2/PPIB雙重?cái)U(kuò)增中檢測編碼HER2的RNA，□SEQ ID No.29 5′GATCCAGGGCGGAGACTTCA 3′，在5’端標(biāo)記有熒光團(tuán)ROX(6-羧基-X-羅丹明)和在其3’標(biāo)記有“淬滅基團(tuán)”(Dabsyl)，(完整序列5′ROX-cgatcgGATC CAGGGCGGAGACTTCAcgat cg-Dabsyl 3′，用于檢測編碼親環(huán)蛋白B的PPIB基因的RNAs)，的“分子信標(biāo)”加入至該介質(zhì)。
也將下列引物加入該介質(zhì)□0.2μM的第一HER2引物SEQ ID No.7 5′GAGCCAGCCC GAAGTCTGTA3′，在其5′末端包含(并以小寫字母顯示)T7聚合酶啟動(dòng)子，即其完整序列是SEQ ID No.245′aattctaata cgactcacta tagggagaagg GAGCCAGC CCGAAGTCTG TA 3′的第一引物，□0.2μM的第二HER2引物SEQ ID No.8 5′TCTTAGACCA TGTCCGGGAAA 3′，
□0.2μM的第一親環(huán)蛋白B引物SEQ ID No.27 5′CAGGCTGTCTTGACTGTCGTGA 3′，在其5′末端包含(并以小寫字母顯示)T7聚合酶啟動(dòng)子，即其完整序列是SEQ ID No.305′aattctaata cgactcactatagggagaag gCAGGCTGTC TTGACTGTCG TGA 3′的第一引物，0.2μM的第二親環(huán)蛋白B引物SEQ ID No.28 5′AGGAGAGAAA GGATTTGGCT 3′。
在41℃下溫育2分鐘之前，在65℃下先預(yù)溫育2分鐘。加入5μl體積的酶混合物(0.08U的RNA酶H、32U的RNA聚合酶T7、6.4U的AMV-RT)，并在41℃下溫育90分鐘。
對經(jīng)轉(zhuǎn)錄的RNAs進(jìn)行實(shí)時(shí)定量(NucliSens EasyQ，bioMérieux)，NASBA反應(yīng)產(chǎn)生這樣的擴(kuò)增子，即特異性的“分子信標(biāo)”可與其同時(shí)雜交，產(chǎn)生熒光信號。通過在熒光讀出器(NucliSens EasyQ分析儀)上連續(xù)監(jiān)控信號來實(shí)時(shí)測量新的RNA分子的形成。由Nuclisens TTP軟件(bioMérieux BV，the Netherlands)提供分析和結(jié)果的自動(dòng)報(bào)告。使用前面所定義的標(biāo)準(zhǔn)曲線(經(jīng)轉(zhuǎn)錄的RNA的稀釋度108至102拷貝)對各靶HER2基因和PPIB管家基因的表達(dá)進(jìn)行定量，這使得可能推斷出每個(gè)樣品的mRNA拷貝數(shù)。
基于前面構(gòu)建的HER2和PPIB標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定各基因的檢測極限和定量極限。對于HER2和PPIB，分別觀察到定量極限為1000和10000個(gè)mRNA拷貝。對于HER2和PPIB，檢測極限是100個(gè)mRNA拷貝。
通過在對于HER2特異性的“分子信標(biāo)”存在的情況下擴(kuò)增ESR2，和通過在特異性針對ESR2的“分子信標(biāo)”存在的情況下擴(kuò)增HER2來檢測HER2/PPIB雙體的特異性。沒有檢測到信號。
這些針對HER2基因通過NASBA技術(shù)在信使RNA水平上獲得的結(jié)果和在定量PCR(r＝0.54，p＜0.0001，n＝97，Spearman相關(guān)性統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn))中和在ELISA(r＝0.50，p＜0.0001，n＝93；Spearman相關(guān)性統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn))中獲得的結(jié)果相關(guān)聯(lián)。這些結(jié)果顯示HER2的mRNA的表達(dá)與基因的擴(kuò)增以及HER2膜受體的過量表達(dá)相關(guān)聯(lián)，肯定了在mRNA水平上研究該基因表達(dá)的有利方面。
這些結(jié)果表明NASBA中的HER2/PPIB雙體允許在非常少量的總RNA的基礎(chǔ)上特異性和靈敏性地?cái)U(kuò)增HER2基因，使得該雙體完全適合用于研究乳腺癌的診斷/預(yù)后和患者對特定治療的反應(yīng)。
序列表<110>bioMérieux SA<120>用于乳腺癌的診斷/預(yù)后的方法<130>未知<160>30<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>21<212>DNA<213>智人<400>1ctccaccatg ccctctacac a 21<210>2<211>21<212>DNA<213>智人<400>2acatgatcaa ctgggcgaag a 21
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<400>6tccagtatgt accctctggt20<210>7<211>20<212>DNA<213>智人<400>7gagccagccc gaagtctgta20<210>8<211>21<212>DNA<213>智人<400>8tcttagacca tgtccgggaa a 21<210>9<211>20<212>DNA<213>智人<400>9gatcctgatg attggtctcg20<210>10
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<213>智人<400>17gccgccccat gtgctgat 18<210>18<211>21<212>DNA<213>智人<400>18ggaccccgtg atggaggact t 21<210>19<211>25<212>DNA<213>智人<400>19tggttggcat tctgctggtc gtggt 25<210>20<211>25<212>DNA<213>智人<400>20tggccgacat tcagagtcaa tcatc 25
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1.用于乳腺癌的診斷/預(yù)后的方法，其包括下列步驟A-從生物學(xué)樣品中提取核物質(zhì)，B-使用至少一對擴(kuò)增引物獲取核物質(zhì)中的至少一個(gè)靶序列的擴(kuò)增子，C-使用至少一種檢測探針檢測所述擴(kuò)增子的存在，其特征在于，在步驟B中，所述引物對包含至少一個(gè)擴(kuò)增引物，該擴(kuò)增引物含有選自SEQ ID No.1至SEQ ID No.20的核苷酸序列的至少10個(gè)核苷酸殘基，和/或在步驟C中，所述檢測探針包含選自SEQ ID No.1至SEQ ID No.20的核苷酸序列的至少10個(gè)核苷酸殘基。
2.權(quán)利要求1中所述的用于乳腺癌的診斷/預(yù)后的方法，基特征在于，在步驟B中，所述引物對選自下列引物對□包含核苷酸序列SEQ ID No.1的至少10個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.2的至少10個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；□包含核苷酸序列SEQ ID No.3的至少10個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.4的至少10個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；□包含核苷酸序列SEQ ID No.5的至少10個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.6的至少10個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；□包含核苷酸序列SEQ ID No.7的至少10個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.8的至少10個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；□包含核苷酸序列SEQ ID No.13的至少10個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.14的至少10個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；□包含核苷酸序列SEQ ID No.15的至少10個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.16的至少10個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；□包含核苷酸序列SEQ ID No.17的至少10個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.18的至少10個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；□包含核苷酸序列SEQ ID No.19的至少10個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.20的至少10個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物。
3.權(quán)利要求1或2中所述的用于乳腺癌的診斷/預(yù)后的方法，其中所述引物對包含至少一個(gè)擴(kuò)增引物，所述擴(kuò)增引物包含允許通過噬菌體T7聚合酶啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。
4.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)中所述的用于乳腺癌的診斷/預(yù)后的方法，其中，在步驟C中，檢測探針包含熒光團(tuán)和淬滅基團(tuán)。
5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中靶序列包含在選自ESR1、ESR2、PGR、HER2的基因之中。
6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中同時(shí)進(jìn)行步驟B和C。
7.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在步驟B中，還使用至少一對擴(kuò)增引物以獲得對于管家基因特異性的擴(kuò)增子。
8.權(quán)利要求7中所述的方法，其特征在于用于獲得對于管家基因特異性的擴(kuò)增子的擴(kuò)增引物包含選自SEQ ID No.25至29的序列的至少10個(gè)核苷酸殘基。
9.權(quán)利要求7中所述的方法，其特征在于用于獲得對于管家基因特異性的擴(kuò)增子的所述擴(kuò)增引物對選自下列引物對□包含核苷酸序列SEQ ID No.27的至少10個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.28的至少10個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；□包含核苷酸序列SEQ ID No.25的至少10個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.26的至少10個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物。
10.包含選自SEQ ID No.1至SEQ ID No.20；25至29的核苷酸序列的至少10個(gè)核苷酸殘基的擴(kuò)增引物。
11.權(quán)利要求10中所述的擴(kuò)增引物，其包含允許通過噬菌體T7的聚合酶起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。
12.選自下列引物對的擴(kuò)增引物對□包含核苷酸序列SEQ ID No.1的至少10個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.2的至少10個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；□包含核苷酸序列SEQ ID No.3的至少10個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.4的至少10個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；□包含核苷酸序列SEQ ID No.5的至少10個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.6的至少10個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；□包含核苷酸序列SEQ ID No.7的至少10個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.8的至少10個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；□包含核苷酸序列SEQ ID No.13的至少10個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.14的至少10個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；□包含核苷酸序列SEQ ID No.15的至少10個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.16的至少10個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；□包含核苷酸序列SEQ ID No.17的至少10個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.18的至少10個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物；□包含核苷酸序列SEQ ID No.19的至少10個(gè)核苷酸殘基的第一擴(kuò)增引物和包含核苷酸序列SEQ ID No.20的至少10個(gè)核苷酸殘基的第二擴(kuò)增引物。
13.權(quán)利要求12中所述的引物對，其中所述第一引物包含允許通過噬菌體T7的聚合酶啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。
14.權(quán)利要求10或11中所述的至少一個(gè)擴(kuò)增引物和/或權(quán)利要求12或13中所述的引物對在NASBA擴(kuò)增反應(yīng)中的用途。
15.包含選自SEQ ID No.1至SEQ ID No.20的核苷酸序列的至少10個(gè)核苷酸殘基的檢測探針。
16.權(quán)利要求15中所述的檢測探針，其包含熒光團(tuán)和淬滅基團(tuán)。
17.權(quán)利要求10或11中所述的至少一個(gè)引物和/或權(quán)利要求12或13中所述的至少一對引物和/或權(quán)利要求15或16中所述的至少一種檢測探針在乳腺癌的診斷/預(yù)后中的用途。
18.用于乳腺癌的診斷/預(yù)后的試劑盒，其包含權(quán)利要求10或11中所述的至少一個(gè)引物和/或權(quán)利要求12或13中所述的至少一對引物和/或權(quán)利要求15或16中所述的至少一種檢測探針。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于乳腺癌的診斷/預(yù)后的方法，其包括下列步驟A)從生物學(xué)樣品中提取核物質(zhì)，B)使用至少一對擴(kuò)增引物獲得核物質(zhì)的至少一個(gè)靶序列的擴(kuò)增子C)使用至少一種檢測探針檢測所述擴(kuò)增子的存在。其特征在于，在步驟B)中，所述引物對包含至少一個(gè)含有選自SEQID No.1至SEQ ID No.24的核苷酸序列的至少10個(gè)核苷酸殘基的擴(kuò)增引物，和/或在步驟C)中，所述檢測探針包含選自SEQ ID No.1至SEQ ID No.20的核苷酸序列的至少10個(gè)核苷酸殘基。本發(fā)明也涉及可用于該方法的擴(kuò)增引物和雜交探針以及用于乳腺癌的診斷/預(yù)后的試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK1890387SQ200480036744
公開日2007年1月3日 申請日期2004年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月9日
發(fā)明者T·韋爾雅 申請人:拜奧默里克斯公司