專利名稱：新城疫強弱毒株的膠體金快速診斷試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新城疫強弱毒株的膠體金快速診斷試紙條，屬于一種新的動物診斷試劑，主要用來鑒別診斷強毒株感染的家禽；應(yīng)用于畜牧獸醫(yī)學領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
新城疫(Newcastle disease ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus NDV)引起的禽類一種急性高度接觸性傳染疾病，是影響?zhàn)B禽業(yè)最重要的病毒性傳染病之一，其分布十分廣泛，許多發(fā)達國家也時有發(fā)生。其發(fā)病率和死亡率較高，本病被國際獸疫局列為必報疫病名錄之一。新城疫對我國養(yǎng)禽業(yè)的危害仍然很大，盡管我國目前已經(jīng)普遍采取了以免疫預防為主的綜合預防措施，但新城疫還沒有從根本上得到控制。免疫雞群仍然時有新城疫的發(fā)生，原因是多方面的，但與NDV的變異、強弱毒株的混合感染可能有很大關(guān)系，特別是近年來我國一方面非典型新城疫逐年增多，在外界環(huán)境因素的影響下不斷的發(fā)生變異，給新城疫的診斷和預防帶來了難度。研究表明，新城疫病毒基因組編碼兩種囊膜糖蛋白，即血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白 (HN蛋白)和融合蛋白(F蛋白);四種結(jié)構(gòu)蛋白，即基質(zhì)蛋白(M蛋白)、核衣殼蛋白(NP蛋白)、 磷蛋白(P蛋白)和大蛋白(L蛋白)，此外還編碼兩種非結(jié)構(gòu)蛋白。F基因的序列已經(jīng)被測定，其大小為1792bp，編碼553個氨基酸。F蛋白前體H)經(jīng)裂解產(chǎn)生Fl和F2兩個片段后， 才使病毒具有感染性。新城疫病毒根據(jù)毒力的不同分為三種類型，即速發(fā)型、中發(fā)型和緩發(fā)型，對不同毒株F基因的序列分析表明，毒力不同的毒株F基因裂解位點區(qū)氨基酸的組成不同。因此，F(xiàn)基因裂解位點區(qū)的氨基酸組成是新城疫病毒致病力的分子基礎(chǔ)。目前新城疫病毒強弱毒株的鑒定方法有MDT(最小致死量致死雞胚平均死亡時間)、ICPI (I日齡雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù))、IVPI (6周齡雞靜脈接種致病指數(shù))、RT-PCR技術(shù)、蝕斑形成和ELISA。但是，MDT、ICPI、IVPI以及蝕斑形成鑒定NDV株的強弱試驗檢測效率低，耗時長，不適于大量樣品的快速檢測。RT-PCR方法是新興的一種快速診斷方法，但是其受操作人員技術(shù)水平和現(xiàn)場條件的約束較多，不利于在現(xiàn)場進行大規(guī)模樣品的檢測。而 ELISA診斷方法雖然簡便易學，但操作時間長并需要專門的檢測設(shè)備。因此研制特異性強、 靈敏度高、檢測準確的免疫膠體金快速診斷試紙條是新城疫檢疫的當務(wù)之急。免疫膠體金技術(shù)(Immune colloidal gold technique)是以膠體金作為示蹤標志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術(shù)。膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學特性，因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新城疫強弱毒株的膠體金快速診斷試紙條，其利用免疫學抗原抗體能特異性結(jié)合原理，膠體金標記新城疫強毒株F蛋白串聯(lián)多肽后與樣品中特異性抗體結(jié)合，這種抗原抗體結(jié)合物再與SPA結(jié)合，形成抗原-抗體-SPA結(jié)合物在硝酸纖維素膜(NC膜)上出現(xiàn)顏色反應(yīng)，可以肉眼觀察；具有簡單、快速、敏感和特異性好等特點。 并且價格低廉，適用于基層或臨床鑒別診斷新城疫強弱毒株。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的一種鑒別新城疫強弱毒株的膠體金快速診斷試紙條，其特征在于試紙條由樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸收墊依次粘附在不吸水的支撐薄片上；其中結(jié)合墊上包被有膠體金標記的抗新城疫強毒株串聯(lián)F蛋白裂解位點重組蛋白；硝酸纖維素膜上分別包被有SPA構(gòu)成的檢測線T線和抗新城疫強毒株F蛋白串聯(lián)多肽單克隆抗體構(gòu)成的質(zhì)控線C線。所述的結(jié)合墊上包被的膠體金標記的抗新城疫強毒株F蛋白串聯(lián)多肽單克隆抗體1D8的制備方法如下
(I)新城疫病毒強毒株F蛋白裂解位點的串聯(lián)及人工合成，將編碼國內(nèi)外目前普遍流行的新城疫強毒株F蛋白裂解位點區(qū)GRRQRRF、GRRQKRF多肽的氨基酸序列和編碼國內(nèi)外目前新發(fā)現(xiàn)的新城疫強毒株F蛋白裂解位點區(qū)RRRQKRF、GRRKKRF多肽的氨基酸序列以編碼柔性氨基酸(_甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸_，即-G-G-G-G-S-)的氨基酸序列相互聯(lián)結(jié)，人工合成Fp (F protein multitude peptide)四拷貝體4Fp和八拷貝體8Fp堿基。(2)通過連接、轉(zhuǎn)化、酶切鑒定、原核表達制備堿基翻譯成蛋白即抗新城疫強毒株串聯(lián)F蛋白裂解位點重組蛋白。(3)標記膠體金，制備金標抗原，用O. IM碳酸鉀調(diào)膠體金的PH值至8. 2，按IOOug 抗體/毫升膠體金加入抗新城疫強毒株串聯(lián)多肽8Fp，磁力攪拌器混勻30分鐘，加BSA至終濃度為1%，靜置I小時。4°C 13000rpm離心30分鐘，棄上清，沉淀用標記洗滌保存液洗滌兩次，用十分之一初始膠體金體積的洗滌保存液重懸沉淀，4°C備用。(4)將結(jié)合墊浸泡于封閉液即2% BSA、0. 5%吐溫-20、2. 5%蔗糖、O. 05%疊氮鈉、
O.OlM PBS中30分鐘，37°C烘干；然后將制備好的金標抗原均勻噴涂于結(jié)合墊上，每毫升鋪 20平方厘米，凍干、保存。(5)然后制備抗新城疫強毒株串聯(lián)F蛋白裂解位點重組蛋白單克隆抗體，利用免疫Balb/c小鼠、雜交瘤技術(shù)通過細胞融合、細胞克隆篩選建立的抗4Fp、8Fp雜交瘤細胞株 2E9、1D8，經(jīng)ELISA方法檢測，顯示1D8效價高于2E9，因此選用多肽單克隆抗體1D8構(gòu)成的質(zhì)控線作為C線。所述的硝酸纖維素膜上的檢測線T線是選用包被緩沖液稀釋的SPA噴涂于檢測線上，用包被緩沖液將SPA稀釋到50-100ug/ml，調(diào)整機器劃線為檢測線T線，即為檢測線靠近結(jié)合墊，距結(jié)合墊端約5mm。所述的抗新城疫強毒株F蛋白裂解位點串聯(lián)多肽單克隆抗體構(gòu)成的質(zhì)控線C線是選用包被緩沖液稀釋的抗新城疫強毒株F蛋白裂解位點串聯(lián)多肽單克隆抗體噴涂于檢測線上，用包被緩沖液將抗新城疫強毒株串聯(lián)F蛋白裂解位點重組蛋白單克隆抗體稀釋到 50-100ug/ml，調(diào)整機器劃線為質(zhì)控線C線，即為對照線靠近吸收墊，距吸收墊端約3mm ;兩線距離5-8mm，在硝酸纖維素膜NC膜上的質(zhì)控線上，可與金標抗體結(jié)合，以此檢驗試紙條的有效性。所述該紙條的檢測方法是樣品中新城疫病毒強毒株特異性F蛋白裂解位點特異性抗體先和膠體金標記的新城疫強毒株串聯(lián)F蛋白裂解位點重組蛋白結(jié)合，由于毛細管作用，反應(yīng)復合物沿包被膜向前泳動，若樣品中存在新城疫病毒強毒株F蛋白裂解位點特異性抗體，到達檢測線時遇到包被在硝酸纖維素膜上的SPA，就會形成金標抗原-新城疫強毒株F裂解位點特異性抗體-SPA抗復合物，從而凝集在檢測線上，形成特異性的紅色沉淀線； 沒有和新城疫強毒株F蛋白裂解位點特異性抗體結(jié)合的金標抗原則會直接通過檢測線，富集在質(zhì)控線上形成紅色沉淀線，即判為陽性結(jié)果。若樣品中無新城疫強毒，反應(yīng)復合物到達檢測線時遇到SPA就不會形成金標抗原-新城疫強毒F蛋白裂解位點特異性抗體-SPA復合物，反應(yīng)復合物通過檢測T線，富集在質(zhì)控C線上，形成紅色沉淀，即判為陰性結(jié)果。本發(fā)明的積極效果是
I、具有生物安全性，其所使用的金標抗原、SPA及抗新城疫強毒株F裂解位點單克隆抗體，不含活病毒，因此不存在散毒的危險。2、特異性強，膠體金試紙條金標抗原專門針對強毒株F蛋白裂解位點，SPA具有良好的結(jié)合抗體能力，質(zhì)控線為敏感性和特異性較好的單克隆抗體，因此提高了檢測的特異性和敏感性。3、生產(chǎn)成本低,金標抗原由大腸桿菌表達,易于大規(guī)模生產(chǎn),抗新城疫強毒株F裂解位點串聯(lián)多肽單克隆抗體可由相應(yīng)的雜交瘤細胞株產(chǎn)生，便于規(guī)模化生產(chǎn)，二者通過辛酸-硫酸銨純化而大量獲得。4、其可快速檢測即5-10分鐘；不需特殊儀器設(shè)備，可用于現(xiàn)場操作；操作簡單，一步完成，無需專業(yè)人員操作；檢測成本低；儲存方便。


圖I本發(fā)明所涉及單抗的雜交瘤細胞株。圖2本發(fā)明試紙條的結(jié)構(gòu)模式圖。圖3本發(fā)明試紙條結(jié)果判定示意圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實例對本發(fā)明做詳細說明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例I新城疫病毒強毒株串聯(lián)F蛋白裂解位點重組蛋白的原核表達 (O新城疫強毒株F蛋白裂解位點基因的串聯(lián)
將編碼國內(nèi)外目前普遍流行的新城疫強毒株F蛋白裂解位點區(qū)GRRQRRF、GRRQKRF多肽的氨基酸序列和編碼國內(nèi)外目前新發(fā)現(xiàn)的新城疫強毒株F蛋白裂解位點區(qū)RRRQKRF、 GRRKKRF多肽的氨基酸序列以編碼柔性氨基酸(_甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-，即-G-G-G-G-S-)的氨基酸序列相互聯(lián)結(jié)，設(shè)計多肽Fp (F protein multitude peptide)及其四倍體4Fp和八倍體8Fp。實施例2新城疫強毒株串聯(lián)F蛋白裂解位點重組蛋白的原核表達(I)目的基因4Fp和8Fp的克隆
基因片段在PMD-18T中的克隆將合成目的片段4Fp、8Fp，利用T-A原理，與pMD_18T 載體連接，轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)大腸桿菌，涂布于氨芐青霉素的LB片板，12小時后挑取典型白色單菌落培養(yǎng)，提質(zhì)粒DNA。通過XbaI和SpeI雙酶切鑒定，命名為pMD_4Fp和pMD_8Fp ； pMD-4Fp和pMD-8Fp基因在pET_28a中的克隆原核表達載體pET_28a是上游帶有His標簽的高效表達載體，用XbaI和SpeI雙酶切重組質(zhì)粒pMD_4Fp和pMD_8Fp，分別插入片段4Fp (546bp)、8Fp (1086bp)，分別回收其中 546bp、1086bp，用 XbaI 和 SpeI 雙酶切 pET_28a，與帶有相同粘端的4Fp、8Fp基因連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)菌，卡娜青霉素抗性篩選， 挑取單菌落少量培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，小提質(zhì)粒DNA，通過限制性內(nèi)切酶鑒定重組質(zhì)粒，得到重組克隆命名為 pET-28a-4Fp 和 pET_28a_8Fp。(2)目的基因4Fp和8Fp的誘導表達
將含有重組質(zhì)粒的新鮮大腸桿菌(BL-21)單菌落在LB培養(yǎng)基中37°C振蕩培養(yǎng)過夜， 次日按I %體積比轉(zhuǎn)接5ml新鮮培養(yǎng)基，37°C繼續(xù)培養(yǎng)，當菌液0D600值達O. 6-0. 8時，加入無菌IPTG溶液，使其終濃度為lmmol/L。誘導3_4小時后停止培養(yǎng)，取Iml離心收集菌體，PBS (pH7. 4)洗滌，用50 μ I PBS懸浮菌體，與10 μ I 5 X SDS上樣緩沖液混合，煮沸變性 5分鐘。進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，分離膠的丙烯酰胺濃度為12%，將只含載體的大腸桿菌同樣誘導做為陰性對照，O. 25%考馬斯亮蘭染色；經(jīng)鑒定后，大量搖菌， 離心沉淀菌體，超聲破碎后經(jīng)電洗脫得到高純度的重組蛋白，于_80°C保存?zhèn)溆?。實施?抗新城疫強毒株串聯(lián)F蛋白裂解位點重組蛋白的制備如圖I所示；
I、動物免疫選擇6-8周齡健康BALB/ C小鼠以弗氏完全佐劑乳化純化的新城疫強毒株串聯(lián)F蛋白裂解位點重組蛋白免疫小鼠，每只小鼠腹腔注射50 μ g左右，14d后以弗氏不完全佐劑乳化新城疫強毒株串聯(lián)F蛋白裂解位點重組蛋白腹腔注射100μ g，最后一次加強免疫時，直接腹腔注射IOOyg純重組蛋白，融合前3 4d尾靜脈注射50 μ g純重組蛋白。2、細胞融合尾靜脈采血后，取免疫小鼠的脾細胞與SP2/0混合于融合管內(nèi)，以 300g離心10 min,棄去上清，振蕩細胞，使兩種細胞盡量混合均勻，然后45s內(nèi)緩慢滴加預熱的PEG溶液，再緩慢加入無血清的1640培養(yǎng)基終止融合，靜置后再以I 000 r/ min離心10 min，棄去上清后加入HAT培養(yǎng)基，使細胞懸浮并混勻，加入適量飼養(yǎng)細胞， 于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，第IOd換液并開始檢測篩選。3、陽性雜交瘤細胞的篩選和克隆化陽性克隆的篩選采用間接ELISA試驗。間接ELISA中，用合成多肽包被酶標板，并以骨髓瘤細胞上清作為陰性對照，融合前所采小鼠血清作為陽性對照進行平行篩選。對篩選的陽性雜交瘤細胞進行克隆，將檢出的陽性孔再次克隆和亞克隆，直到所有的孔都為陽性，最后選擇OD值高、細胞活力好、只有一株細胞的孔擴大培養(yǎng)，再建株、凍存。通過三次細胞克隆最終獲得抗4Fp單抗2E9、ICl和抗8Fp單抗1D8、3D9雜交瘤細胞株。4、腹水的制備0.5 mL的高壓滅菌的石蠟油注射到小鼠腹腔，7d后注入IO6個雜交瘤細胞于小鼠腹腔，7 10 d后，當小鼠腹部極度膨脹時抽取腹水，將收集好的腹水置 370C 24h，隨后置4°C過夜，第二天將腹水離心，上清56°C滅活30 min即可。5、單克隆抗體的純化用4倍體積醋酸緩沖液稀釋腹水，調(diào)至pH4. 5，緩慢滴加3.3 %的正辛酸，攪拌30 min，離心取上清，加入1/10體積的10倍PBS，調(diào)至pH7. 4，4°C預冷后，用45 %飽和硫酸銨沉淀，離心后取沉淀，用PBS稀釋后移入透析袋，在50倍體積PBS 中透析，透析期間多次換液，透析結(jié)束后，紫外分光光度計280 nm測定蛋白濃度并分裝凍存。6單克隆抗體的特性鑒定
(I)腹水效價測定間接ELISA方法測定，細胞培養(yǎng)上清與腹水分別從10倍和100倍開始做梯度稀釋，同時分別以SP2/0細胞培養(yǎng)上清和腹水做同等稀釋度作為陰性對照。通過檢測得知2E9、1C1、1D8、3D9四株單抗的腹水效價分別為4X 104、1X 104、1X 106、2X IO4。(2)單克隆抗體的Ig亞類鑒定按鼠mAb Ig亞類檢測試劑盒的說明書進行。具體方法是將純化的每株單克隆抗體1000倍稀釋后包被酶標板，每孔100 μ L，37°C孵育I h， 洗滌后每孔加入I 000倍稀釋的抗體亞類試劑100 μ L，37°C孵育I h，洗滌3遍。然后加入羊抗鼠IgG酶標二抗，37°C孵育I h，洗滌后加入底物顯色，確定四株單克隆抗體的亞類分別為 IgG2a、IgM、IgGl、IgM。(3)雜交瘤細胞株染色體的分析采用秋水仙素法對雜交瘤細胞株進行染色體分析，結(jié)果顯示2E9、1C1、1D8、3D9四株雜交瘤細胞的染色體數(shù)目分別為98條、95條、101條、 97條。(4)單克隆抗體特異性鑒定將所獲單克隆抗體分別與將已知強毒株NA-1、 F48E9、青島株、廣州株；中強毒株四平株，昌黎株；NDV弱毒株CC株、V4株、LaSota株及FPV、IBDV、IBV, AIV陽性血清進行間接ELISA試驗，檢測所得四株單克隆抗體與NA-1、 F48E9、青島株、廣州株陽性血清呈強陽性反應(yīng)，與四平株，昌黎株陽性血清呈陽性反應(yīng)，但 OD值明顯低于強毒株，與CC株、V4株、LaSota株及FPV、IBDV、IBV、AIV陽性血清均成陰性反應(yīng)。實施例4膠體金、金標重組蛋白抗原的制備 I、膠體金的制備
用雙蒸去離子水將1%氯金酸稀釋為O. 01%，加熱煮沸，按每100 ml O. 01%氯金酸加入
2ml 1%檸檬酸鈉，繼續(xù)煮沸，直到液體呈亮紅色即停止加熱，冷卻至室溫補足水分。制備好的膠體金外觀應(yīng)純凈、透亮、無沉淀和漂浮物。2、膠體金標記抗原的制備
用O. IM碳酸鉀調(diào)膠體金的PH值至8. 2，按IOOug抗體/毫升膠體金加入新城疫強毒株串聯(lián)F蛋白裂解位點重組蛋白，磁力攪拌器混勻30分鐘，加BSA至終濃度為1%，靜置I小時。40C 13000rpm離心30分鐘,棄上清,沉淀用標記洗漆保存液洗漆兩次,用十分之一初始膠體金體積的洗滌保存液重懸沉淀，4°C備用。實施例5如圖2所示膠體金試紙條的組裝 I、樣品墊I的制備
將樣品墊I浸泡于封閉液(2% BSA、0. 5%吐溫-20、2. 5%蔗糖、O. 05%疊氮鈉、O. OlM PBS)中30分鐘，37 °C烘干，封裝。2、結(jié)合墊2的制備
將結(jié)合墊2浸泡于封閉液(2% BSA、0. 5%吐溫-20、2. 5%蔗糖、O. 05%疊氮鈉、O. OlM PBS) 中30分鐘，37°C烘干。然后將制備好的金標抗體均勻鋪在結(jié)合墊2上，每毫升鋪20平方厘米，凍干、保存。3、硝酸纖維膜3的制備
用包被緩沖液將SPA稀釋到50-100ug/ml，調(diào)整機器劃線為T線6，即為檢測線T線 6靠近結(jié)合墊2，距結(jié)合墊2端約5_ ;用包被緩沖液將抗新城疫強毒株串聯(lián)F蛋白裂解位點重組蛋白單抗1D8稀釋到50-100ug/ml，調(diào)整機器劃線為質(zhì)控線C線7，即為對照線靠近吸收墊4，距吸收墊4端約3mm。兩線距離5_8mm，線應(yīng)細致均勻，37°C烘干，備用。4、試紙條的組裝
將硝酸纖維膜3、吸收墊4、結(jié)合墊2 (玻璃纖維)、樣品墊I、支撐薄片5按圖依次黏貼起來，切成3. 6mm寬的小條，即為膠體金試紙條。封存?zhèn)溆?。實施?膠體金試紙條的應(yīng)用
I、本發(fā)明試紙條的使用方法，如圖3所示；
(I)樣品制備臨床采集待檢動物的血清用于檢測。(2)檢測取出試紙條，室溫平衡20分鐘，打開包裝取出試紙條，將樣品墊I浸入待見樣品中，取出，平放，靜置10-15分鐘，判定結(jié)果。(3)結(jié)果判定當時紙條出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色質(zhì)控線C線7，沒有出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色檢測線T線6，判為陰性，記為“一”；當試紙條出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色質(zhì)控線C線
7,同時出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色檢測線T線6，判為陽性，記為“十”;檢測線T線6顏色深度與待檢抗原量成正比，顏色越深說明待檢抗原滴度越高，檢測線T線6濃厚與質(zhì)控線顏色一致或接近時判為+ + + +，顏色介于+和+ + + +之間酌情判為+ +或+ + +。達到+及以上深度時，判為被檢樣品抗原為陽性。質(zhì)控線C線7無條帶則判為試紙條失效。2、試紙條的敏感性試驗
將已知強毒株NA-1、F48E9、青島株、廣州株；中強毒株四平株，昌黎株陽性陽性血清分別稀釋成HI效價為2^21°的各5份，用試紙條進行檢測，結(jié)果當HI效價為22以下時試紙條檢測強毒株為陰性，HI效價為23及以上時試紙條檢測為強毒株陽性；當HI效價為23以下時試紙條檢測中強毒株為陰性，HI效價為24及以上時試紙條檢測為強毒株陽性。結(jié)果見表I
權(quán)利要求
1.一種鑒別新城疫強弱毒株的膠體金快速診斷試紙條，其特征在于試紙條由樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸收墊依次粘附在不吸水的支撐薄片上；其中結(jié)合墊上包被有膠體金標記的新城疫強毒株串聯(lián)F蛋白裂解位點SFp重組蛋白；硝酸纖維素膜上分別包被有SPA構(gòu)成的檢測線T線和抗新城疫強毒株串聯(lián)F蛋白裂解位點8Fp重組蛋白單抗1D8構(gòu)成的質(zhì)控線C線。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種鑒別新城疫強弱毒株的膠體金快速診斷試紙條，其特征在于所述的結(jié)合墊上包被的膠體金標記的新城疫強毒株串聯(lián)F蛋白裂解位點SFp重組蛋白的制備方法如下(A)首先制備新城疫強毒株串聯(lián)F蛋白裂解位點SFp重組蛋白，人工合成目的基因片段 4Fp和SFp后，通過目的基因克隆和原核表達制備新城疫強毒株串聯(lián)F蛋白裂解位點SFp重組蛋白；(B)選用新城疫強毒株串聯(lián)F蛋白裂解位點SFp重組蛋白標記膠體金，制備金標抗體， 用O. IM碳酸鉀調(diào)膠體金的PH值至8. 2，按IOOug抗體/毫升膠體金加入新城疫強毒株串聯(lián)F蛋白裂解位點SFp重組蛋白，磁力攪拌器混勻30分鐘，加BSA至終濃度為1%，靜置I小時，40C 13000rpm離心30分鐘,棄上清,沉淀用標記洗漆保存液洗漆兩次,用十分之一初始膠體金體積的洗滌保存液重懸沉淀，4°C備用；(C)將結(jié)合墊浸泡于封閉液即2%BSA、0. 5%吐溫-20,2. 5%蔗糖、O. 05%疊氮鈉、O. OlM PBS中30分鐘，37°C烘干；然后將制備好的金標抗原均勻噴涂于結(jié)合墊上，每毫升鋪20平方厘米，凍干、保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種鑒別新城疫強弱毒株的膠體金快速診斷試紙條，其特征在于所述的硝酸纖維素膜上包被有SPA構(gòu)成的檢測線T線是作為抗體捕獲劑噴涂于檢測線上，用包被緩沖液將SPA稀釋到50-100ug/ml，調(diào)整機器劃線為檢測線T線，即為檢測線T線靠近結(jié)合墊，距結(jié)合墊端約5mm。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種鑒別新城疫強弱毒株的膠體金快速診斷試紙條，其特征在于所述的硝酸纖維素膜上包被有抗新城疫強毒株串聯(lián)F蛋白裂解位點SFp重組蛋白單克隆抗體構(gòu)成的檢測線T線，其上抗新城疫強毒株串聯(lián)F蛋白裂解位點8Fp重組蛋白單抗的制備方法如下(A)首先制備抗新城疫強毒株串聯(lián)F蛋白裂解位點SFp重組蛋白單抗，利用雜交瘤技術(shù)通過細胞融合、細胞克隆篩選建立的抗新城疫強毒株串聯(lián)F蛋白裂解位點SFp重組蛋白單克隆抗體4株，所制備單抗具有抗新城疫病毒強毒株及中強毒株特異性，與新城疫弱毒株及實驗所用其他病毒呈陰性反應(yīng)，這就決定了試紙條的特異性；(B)選用抗新城疫強毒株串聯(lián)F蛋白裂解位點SFp重組蛋白單抗構(gòu)成的質(zhì)控線C線是將抗新城疫強毒株串聯(lián)F蛋白裂解位點SFp重組蛋白單抗稀釋到50-100ug/ml，調(diào)整機器劃線為C線，即為對照線靠近吸收墊，距吸收墊端約3mm ;兩線距離5-8mm，在硝酸纖維素膜NC 膜上的質(zhì)控線上，可與金標抗體結(jié)合，以此檢驗試紙條的有效性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鑒別診斷新城疫強弱毒株的膠體金快速診斷試紙條，其特征在于試紙條由樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸收墊依次粘附在不吸水的支撐薄片上；其中結(jié)合墊上包被有膠體金標記的新城疫強毒株串聯(lián)F蛋白裂解位點8Fp重組蛋白；硝酸纖維素膜上分別包被有SPA構(gòu)成的檢測線T線和串聯(lián)F蛋白裂解位點8Fp重組蛋白單克隆抗體1D8構(gòu)成的質(zhì)控線C線。其具有特異性強、靈敏度高、操作簡單和診斷快速的顯著優(yōu)點，可用于新城疫強弱毒株的快速鑒別診斷。
文檔編號C12N15/45GK102608331SQ20121006949
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月16日
發(fā)明者丁壯, 呂字華, 姜翠翠, 張曉東, 朱利塞, 李想, 母連志, 韓明明, 黃志強 申請人:吉林大學