專利名稱：靶向GPMV NP、M基因shRNA的重組慢病毒的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種靶向GPMV NP、M基因shRNA的重組慢病毒的制備，特別是涉及一種靶向鵝源副粘病毒NA-I株NP、M基因shRNA的重組慢病毒的制備方法，屬于ー種新的抗 病育種方法，應(yīng)用于禽類動物疫病防治領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
新城疫是由I型禽副粘病毒引起的雞和火雞急性高度接觸性傳染病，是危害養(yǎng)禽業(yè)最重要的傳染病之一。傳統(tǒng)理論認(rèn)為“雞、火雞、珠雞及野雞對新城疫有易感性；而水禽不能自然感染新城疫”。但是自1997年在我國多個縣市的鵝群中發(fā)生和流行ー種具有高度發(fā)病率和死亡率的鵝傳染病。該病是以消化系統(tǒng)發(fā)生病變?yōu)橹饕呐R床癥狀和病變特征的傳染病，經(jīng)過流行病學(xué)分析并通過對分離毒株的生物學(xué)和分子生物學(xué)特性鑒定，確定為血清I型副粘病毒，也就是新城疫病毒，并定名為鵝副粘病毒病。扭轉(zhuǎn)了曾經(jīng)認(rèn)為新城疫僅侵害雞，水禽即使以強毒感染也不致病的傳統(tǒng)理論。目前，鵝副粘病毒病已經(jīng)成為現(xiàn)代集約化養(yǎng)鵝業(yè)的主要疫病之一。在我國鵝副粘病毒病發(fā)生和流行十分嚴(yán)重，毎年的經(jīng)濟(jì)損失很大，嚴(yán)重威脅著我國養(yǎng)鵝業(yè)的健康發(fā)展。且目前尚未發(fā)現(xiàn)對GPMV有特效的藥物，GPMV防制必須以預(yù)防為主，有計劃地做好鵝群的免疫監(jiān)測和疫苗接種工作是防制本病發(fā)生和流行的重要措施。盡管有多種強毒疫苗和滅活疫苗用于免疫預(yù)防，但是仍然不能控制鵝副粘病毒病的發(fā)生。同時在我國還未見有分離出或研究鵝源副粘病毒弱毒株病毒的報道。目前研究結(jié)果均表明，利用新城疫病毒強毒苗或滅活苗甚至是傳統(tǒng)的Lasota弱毒疫苗來免疫預(yù)防鵝源副粘病毒病不能起到完全免疫保護(hù)作用。因此，對于鵝源副粘病毒我們須尋求ー種新的預(yù)防思路和技術(shù)手段。傳統(tǒng)分子抗病育種工作進(jìn)展緩慢目前畜禽抗病育種的方法主要有三種(1)傳統(tǒng)的育種方法-基于表型性狀進(jìn)行直接或間接選擇；(2)利用DNA多態(tài)標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇(Marker assisted selection, MAS)(3)在獲得抗病基因的基礎(chǔ)上進(jìn)行轉(zhuǎn)基因抗病育種。遺傳抗病性主要是由免疫系統(tǒng)控制的多基因性狀，由于影響動物個體抗病性的基因相當(dāng)復(fù)雜，到目前為止，定位和克隆抗病相關(guān)的DNA標(biāo)記或主效基因的成功報道寥寥無幾。因此依靠DNA標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇和通過制備轉(zhuǎn)抗病基因的轉(zhuǎn)基因動物來進(jìn)行分子抗病育種的エ作進(jìn)展非常緩慢。慢病毒載體介導(dǎo)RNAi的轉(zhuǎn)基因動物方面的研究，慢病毒載體介導(dǎo)在建立轉(zhuǎn)基因動物模型和哺乳動物基因組改造方面，已經(jīng)成為很有發(fā)展前景的ー種新方法。雖然傳統(tǒng)的顯微注射轉(zhuǎn)基因方法已經(jīng)成功的培育出成活的轉(zhuǎn)基因動物個體，但是其轉(zhuǎn)基因效率相對較低，所以有待我們進(jìn)一歩探尋能夠提高轉(zhuǎn)基因效率的方法。慢病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法與傳統(tǒng)方法相比，能夠?qū)⑼庠椿蚋咝д系剿拗骷?xì)胞基因組當(dāng)中，特別是未分裂的細(xì)胞，其介導(dǎo)的外源基因能夠長期穩(wěn)定的表達(dá)，從而可以提高轉(zhuǎn)基因效率。慢病毒載體與SiRNA技術(shù)結(jié)合抑制特異基因的表達(dá)制備轉(zhuǎn)基因動物，對于改良畜牧動物生長性狀、提高飼料利用率和抗病能力等都有重要價值。二者結(jié)合使用可能成為制備抗病毒動物的有用方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種靶向GPMV NP、M基因shRNA的重組慢病毒的制備，該方法容易操作，可獲得滴度較高的重組慢病毒顆粒，且該重組病毒即可感染分裂期細(xì)胞，也可感染非分裂期細(xì)胞，由該重組慢病毒顆粒介導(dǎo)的RNAi可在不同細(xì)胞系中持續(xù)穩(wěn)定的表 達(dá)。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的靶向GPMV NP、M基因shRNA的重組慢病毒的制備，其特征在于首先分別設(shè)計針對鵝源副粘病毒NA-I株NP、M基因的SiRNA干擾序列，然后將其與酶切后的慢病毒載體連接，經(jīng)PCR和測序鑒定；將鑒定正確的重組慢病毒載體質(zhì)粒與其他2個慢病毒包裝系統(tǒng)中的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行重組慢病毒的包裝；包裝后測定該重組慢病毒的滴度；將滴度較高的重組慢病毒感染293T細(xì)胞或veix)細(xì)胞，48h后觀察熒光蛋白表達(dá)情況，并通過PCR方法鑒定，具體步驟如下
1.針對鵝源副粘病毒NA-I株NP、M基因RNAi靶位的設(shè)計
根據(jù)GeneBank上GPMV NA-I株NP、M基因序列及Ambion公司網(wǎng)站設(shè)計siRNA干擾 序列，設(shè)計結(jié)果見表I
2.shRNA序列與pLKD-EGFP載體連接，轉(zhuǎn)化及鑒定
siRNA上下游序列退火后形成shRNA，將其與酶切線性化的pLKD-EGFP載體4°C連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，挑去菌落，應(yīng)用OMEGA質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，通過PCR及測序鑒定結(jié)果顯示該重組慢病毒重組載體構(gòu)建成功分別命名為pLKD-shNPl、pLKD-shNP2、pLKD-shNP3、pLKD-shMl、 pLKD_shM2 、pLKD_shM3 、pLKD_shC0N。結(jié)果如圖1、2
3.慢病毒包裝及其滴度測定
將構(gòu)建成功的慢病毒重組載體與慢病毒包裝系統(tǒng)中2個輔助質(zhì)粒(pCMV-dR8. 2和pCMV-VSV-G)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行重組慢病毒的包裝。包裝后，超速離心將重組慢病毒進(jìn)行濃縮并測定其滴度，結(jié)果如圖3
4.重組慢病毒感染細(xì)胞檢測
將重組慢病毒感染veix)細(xì)胞，48h后觀察熒光蛋白表達(dá)情況，并提取細(xì)胞基因組 DNA,通過PCR方法檢測EGFP基因序列。本發(fā)明的積極效果是可為禽類動物分子抗病育種奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)；同時為新城疫等動物源性病毒病的防治提供新的途徑，其具有深遠(yuǎn)的研究性和廣泛的應(yīng)用性。


圖I為重組慢病毒載體PCR鑒定結(jié)果。圖2為重組慢病毒載體測序結(jié)果。圖3為重組慢病毒滴度測定結(jié)果。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做詳細(xì)說明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為 常規(guī)方法。實施例I RNAi靶位的設(shè)計及shRNA慢病毒載體的構(gòu)建
應(yīng)用Ambion公司的siRNA在線設(shè)計軟件和設(shè)計原則，對GPMV NA-I株NP、M基因進(jìn)行RNAi靶位篩選，同時將得到的靶位序列在GenBank中進(jìn)行BLAST分析；將靶位siRNA寡核苷酸序列送上海生工合成，合成的寡核苷酸序列退火形成雙鏈，與經(jīng)內(nèi)切酶Age I和EcoR I雙酶切后線性化的pLKD-EGFP載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，挑取重組陽性克隆進(jìn)行PCR及測序鑒定(上海生エ公司進(jìn)行測序分析)，產(chǎn)生pLKD-shNP、pLKD-shM慢病毒載體。PCR 鑒定陽性克隆的引物序列F :5’ -AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTG-3’，
R :5’ -TGTCTGTTGCTATTATGTCTACTATTCT- 3’，PCR 反應(yīng)循環(huán)條件94°C預(yù)變性 2 min ；94°C變性 30s，59°C退火 30s，72°C延伸 30s (30 個 cycles);最后 72°C延伸 10 min。實施例2慢病毒包裝
轉(zhuǎn)染前24h，將處于對數(shù)生長期的293T細(xì)胞用O. 25%胰蛋白酶消化，并細(xì)胞計數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)整為5X IO6個/ml，重新接種于T75的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%_80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將慢病毒包裝系統(tǒng)中質(zhì)粒的DNA溶液pLKD-shNP或pLKD-shM :9Pg ;pCMV-dR8. 2 :6. 75μδ和pCMV-VSV-G :2. 25Pg加入到500μ1無雙抗，無血清的DMEM培養(yǎng)液與54μ I,混合均勻，在室溫下溫育20min。將DNA與FuGENG HD轉(zhuǎn)染試劑混合液轉(zhuǎn)移至293T細(xì)胞的培養(yǎng)液中混勻，于37°C、5% C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)6h后棄去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)皿中加入含10% FBS血清的細(xì)胞培養(yǎng)基12ml，于37°C、5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集轉(zhuǎn)染48 h后的293T細(xì)胞上清液。于4°C，4，000r/m離心10 min，除去細(xì)胞碎片。以O(shè). 45ΜΠ1濾器過濾上清液于超速離心管中，4°C，50000r/m離心。然后將病毒沉淀用小體積雙無DMEM重懸，分裝后-80°C長期保存。實施例3 LaSRT法測定慢病毒滴度
293T細(xì)胞以2X IO4/孔接種于96孔培養(yǎng)板，12h后以8孔為I組，更換成含8 μδ/πι1的Polybrene和10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，90μ1/孔。第一孔中加入待測慢病毒原液ΙΟμΙ，此后每孔依次10 I倍比稀釋，設(shè)立并測定3組復(fù)孔。感染48h后，以濃度自高到低的方向，在熒光倒置顯微鏡下觀察各孔GFP陽性細(xì)胞數(shù)量的變化，確定計量孔(第η孔)，并計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)m，病毒滴度(TU/ml)=mX10n+1。實施例4重組慢病毒感染細(xì)胞檢測
將重組慢病毒感染細(xì)胞48h后觀察熒光蛋白表達(dá)情況，并提取感染后細(xì)胞的基因組，以 IyL (50 IOOng)細(xì)胞基因組 DNA 為模板，2 X Taq Mix 12. 5μ L (含 Mg2+、25mM dNTPs,Taq酶)，上下游引物以EGFP序列設(shè)計，EGFP-Pl:
5' -CGGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3';EGFP-P2:5'-CGGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTC-3' 為引物)各 O. 5yL (lOpmol/μ L)，加 ddH20 10. 5 μ L，總體系 25 μ し反應(yīng)條件95 °C預(yù)變性5 min后，94°C變性30 s，60°C退火30 s，72°C延伸30 S，30個循環(huán)，最后72°C延伸
5min, 4°C保存。PCR擴增獲得EGFP基因片段，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
權(quán)利要求
1.一種靶向鵝源副粘病毒NA-I株NP、M基因ShRNA的重組慢病毒的制備方法，其特征在于首先分別設(shè)計針對鵝源副粘病毒NA-I株NP、M基因的SiRNA干擾序列，然后將其連接到酶切后的慢病毒載體的多克隆位點處，經(jīng)PCR和測序鑒定；將鑒定正確的重組慢病毒載體質(zhì)粒與其他2個慢病毒包裝系統(tǒng)中的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行重組慢病毒的包裝；包裝后測定該重組慢病毒的滴度；將滴度較高的重組慢病毒感染293T細(xì)胞或vero細(xì)胞，48h后觀察熒光蛋白表達(dá)情況，并通過PCR方法鑒定，具體步驟如下 1)根據(jù)GeneBank上GPMVNA-I株NP、M基因序列及Ambion公司網(wǎng)站設(shè)計siRNA干擾序列； 2)shRNA序列與pLKD-EGFP載體連接，轉(zhuǎn)化，挑去菌落，應(yīng)用OMEGA質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，通過PCR及測序鑒定結(jié)果顯示該重組慢病毒重組載體構(gòu)建成功； 3)慢病毒包裝及其滴度測定； 4)將重組慢病毒感染veix)細(xì)胞，48h后觀察熒光蛋白表達(dá)情況，并提取細(xì)胞基因組DNA,通過PCR方法檢測EGFP基因序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種靶向鵝源副粘病毒NA-I株NP、M基因shRNA的重組慢病毒的制備方法，其特征在于所設(shè)計的特異性siRNA序列，與含有禽U6啟動子的自身復(fù)制缺陷型慢病毒表達(dá)載體pLKD-EGFP構(gòu)建成重組載體pLKD-EGFP-shNP/M。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種靶向鵝源副粘病毒NA-I株NP、M基因shRNA的重組慢病毒的制備方法，其特征在于重組慢病毒載體的構(gòu)建方法如下 1)特異性siRNA靶序列選擇及設(shè)計合成； 2)將合成的寡核苷酸siRNA序列退火形成雙鏈，與經(jīng)內(nèi)切酶AgeI和EcoR I雙酶切后線性化的pLKD-EGFP載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，挑取重組陽性克隆進(jìn)行PCR及測序鑒定。
全文摘要
本發(fā)明是一種利用慢病毒載體介導(dǎo)RNAi的方法，具體是先對鵝源副粘病毒NA-1株NP、M基因的核酸序列進(jìn)行同源性分析，找出保守區(qū)域，設(shè)計出針對保守區(qū)的siRNA；將siRNA克隆到慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLKD-EGFP后，再與pCMV-dR8.2和pCMV-VSV-G共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞中，收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞上清，經(jīng)超速離心、純化、濃縮后形成了表達(dá)siRNA的高滴度的慢病毒載體，然后將其轉(zhuǎn)導(dǎo)入靶細(xì)胞，使其在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，發(fā)揮抗病毒效應(yīng)。本發(fā)明因其高效的轉(zhuǎn)導(dǎo)率及嚴(yán)格的控制體系可以真實的評價siRNA在體內(nèi)的抗病毒作用，可為禽類動物分子抗病育種奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)；同時為新城疫等動物源性病毒病的防治提供新的途徑。
文檔編號C12N15/867GK102618581SQ201210069488
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月16日
發(fā)明者丁壯, 叢彥龍, 黨源, 姜翠翠, 朱利塞, 李想, 楊建新, 王澤 , 郭育培, 韓明明 申請人:吉林大學(xué)