專利名稱：改進(jìn)的大范圍核酸酶重組系統(tǒng)的制作方法
改進(jìn)的大范圍核酸酶重組系統(tǒng)本發(fā)明涉及一組試劑，其允許將DNA序列引入靶細(xì)胞基因組中的特定位點(diǎn)。特別地，該DNA序列編碼基因，并通過誘導(dǎo)型同源重組(homologous recombination,HR)事件被引入靶細(xì)胞中。本發(fā)明還涉及ー組遺傳構(gòu)建體，其包含與大范圍核酸酶基因組靶位點(diǎn)側(cè)翼的部分具有同源性的至少兩個(gè)部分和陽性選擇標(biāo)記及陰性選擇標(biāo)記；以及涉及將DNA序列引入靶細(xì)胞基因組的改進(jìn)方法。自超過25年前酵母中的首個(gè)基因祀向?qū)嶒?yàn)(Hinnen等，1978 ;Rothstein, 1983)以來，已在多種細(xì)胞中采用同源重組(HR)來插入、替換和缺失基因組序列(Thomas和Capecchi, 1987 ；Capecchi, 2001 ；Smithies, 2001) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞中革巴向事件的發(fā)生頻率非常低，使得對天然HR的利用變得不切實(shí)際?？梢酝ㄟ^基因座處的特定DNA雙鏈斷裂(DNAdouble-strand break, DSB)來顯著提高同源重組的頻率(Rouet 等，1994 ;Choulika 等，1995) ο該DSB可以由大范圍核酸酶(meganuclease)誘導(dǎo),所述大范圍核酸酶是識(shí)別大DNA識(shí)別靶位點(diǎn)(12至30bp)的序列特異性內(nèi)切核酸酶。
大范圍核酸酶對其DNA靶標(biāo)表現(xiàn)出高特異性，這些蛋白質(zhì)可切割獨(dú)特的染色體序列，因此不影響全基因組完整性。天然大范圍核酸酶主要以歸巢內(nèi)切核酸酶(homingendonuclease)為代表,所述歸巢內(nèi)切核酸酶是見于真核細(xì)胞、細(xì)菌和古細(xì)菌(archae)中的一類廣泛分布的蛋白質(zhì)(Chevalier和Stoddard, 2001)。對Ι-Scel和HO歸巢內(nèi)切核酸酶的早期研究已闡明了可如何將這些蛋白質(zhì)的切割活性用于啟動(dòng)活細(xì)胞中的HR事件，并且已證明了 染色體 DSB 致重組特性(recombinogenic property) (Dujon 等，1986 ；Haber,1995)。從那時(shí)起，大范圍核酸酶誘導(dǎo)的同源重組已成功地在細(xì)菌(Posfai等，1999)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞(Sargent 等，1997 ；Donoho 等，1998 ；Cohen-Tannoudji 等，1998)、小鼠(Gouble等，2006)和植物(Puchta等，1996 ;Siebert和Puchta，2002)中用于基因組工程目的。最近，已改造TAL效應(yīng)子內(nèi)切核酸酶(TAL effector endonuclease, TALEN)以高特異性地識(shí)別和切割DNA靶標(biāo)。這些TALEN包含與核酸酶結(jié)構(gòu)域(例如，F(xiàn)okI)融合的TAL (轉(zhuǎn)錄激活因子樣)效應(yīng)子DNA結(jié)構(gòu)域(Christian等,2010)。另ー類核酸酶也可用于切割基因組靶并因此誘導(dǎo)DSB，該另ー類核酸酶被稱為鋅指核酸酶(Zinc-finger nuclease, ZFN),并且是通過將鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與DNA切割結(jié)構(gòu)域融合產(chǎn)生的人造限制酶?？梢砸耘cTAL類似的方式改造鋅指結(jié)構(gòu)域以靶向任意DNA序列(Kim 等，1996)。雖然可獲得可在靶細(xì)胞基因組中特定位點(diǎn)處誘導(dǎo)DSB的材料在増加，但是還未開發(fā)出常規(guī)可重復(fù)地轉(zhuǎn)化靶細(xì)胞群的方法和材料。所存在的多種原因包括原核生物基因組或更特別是真核生物基因組固有的復(fù)雜性。工作人員越來越多地發(fā)現(xiàn)基因組具有卓越的抗損傷能力，這恰是DSB的本質(zhì)所在。此外，在產(chǎn)生轉(zhuǎn)化方法中，對所有轉(zhuǎn)化方法而言都存在的技術(shù)限制(即從背景未轉(zhuǎn)化細(xì)胞群中常規(guī)地鑒別出稀少轉(zhuǎn)化體的能力)繼續(xù)表現(xiàn)出問題。提供了利用HR在將目的序列引入靶細(xì)胞或生物體的基因組中任意位點(diǎn)的潛能的方法，從而允許可能比以往任何時(shí)候更細(xì)致地進(jìn)行基因組操作。本發(fā)明的發(fā)明人現(xiàn)在已開發(fā)出一組新的遺傳構(gòu)建體，其包含
a)由核酸分子編碼的構(gòu)建體(i)，其至少包含以下組分(N) n-H0M01-P-M-H0M02- (N)m(i)其中，η和m是整數(shù)并且代表O或I,前提是η = I時(shí)，m = 0而當(dāng)η = 0時(shí)，m =I ;因此組分N可設(shè)置在H0M01之前或N0M02之后，并且，組分P和M在H0M01與H0M02之間的順序可設(shè)置為P-M或M-P ；其中N 包含組分(PROMl)-(NEG)-(TERMl) ;P 包含組分(PR0M2) - (POS) - (TERM2)并且 M 包含組分(PR0M3)-(MCS)-(TERM3);以及其中PROMl是第一轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)序列；NEG是陰性選擇標(biāo)記；TERM1是第一轉(zhuǎn)錄終止序列；H0M01是與核酸酶DNA靶序列之前的基因組部分具有同源性的一部分；PR0M2是第二轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)序列；P0S是陽性選擇標(biāo)記；TERM2是第二轉(zhuǎn)錄終止序列；PR0M3是第三轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)序列；MCS是多克隆位點(diǎn)，其中可以插入目的基因(gene of interest, GOI) ;TERM3是第三轉(zhuǎn) 錄終止序列；H0M02是與大范圍核酸酶、TALEN或ZFN的所述DNA靶序列之后的基因組部分具有同源性的部分；b)至少ー種選自包括構(gòu)建體(ii)或(iii)組成的組的構(gòu)建體,所述構(gòu)建體(ii)或(iii)由至少包含ー種以下組分的核酸分子編碼PR0M4-NUCl(ii)；NUC2(iii);或該組還包含序列(iv)，其為至少包含以下組分的分離或重組蛋白質(zhì)NUC3 (iv)；其中PR0M4是第四轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)序列；NUC1是大范圍核酸酶、TALEN或ZFN的開放讀碼框(ORF) ；NUC2是所述大范圍核酸酶、TALEN或ZFN的信使RNA(mRNA)形式；NUC3是所述大范圍核酸酶、TALEN或ZFN的分離或重組蛋白質(zhì)；其中來自構(gòu)建體(ii)或(iii)或者序列(iv)的所述大范圍核酸酶、所述TALEN或所述ZFN識(shí)別并切割所述DNA靶序列；并且其中構(gòu)建體(ii)或(iii)或者序列(iv)設(shè)置成與構(gòu)建體(i)共轉(zhuǎn)染到至少ー種靶細(xì)胞中。更一般地，任何能夠特異性地切割基因組靶并因此誘導(dǎo)DSB并且具有12至45bp雙鏈DNA靶序列的核酸酶均可用于本發(fā)明中。本發(fā)明所包含的核酸酶的非限制性實(shí)例有大范圍核酸酶、TALEN、ZFN，但本發(fā)明也可以與定義為任意融合蛋白的嵌合內(nèi)切核酸酶并用，所述融合蛋白至少包含一種能夠切割基因組靶并因此誘導(dǎo)DSB并且具有12至45bp雙鏈DNA靶序列的內(nèi)切核酸酶。除了可在特定基因組靶標(biāo)處誘導(dǎo)DSB的核酸酶以外，本發(fā)明還包括可在12至45bp的特定基因組祀序列處誘導(dǎo)單鏈斷裂(single strand break, SSB)之核酸酶的用途。SSB還稱為缺ロ(nick)并且這種缺ロ核酸酶明確地包括在本發(fā)明中。在圖I中以非限制性方式示出本發(fā)明的構(gòu)建體，整合基質(zhì)[構(gòu)建體(i)]和核酸酶表達(dá)質(zhì)粒[構(gòu)建體(ii)]被共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中?；诠厕D(zhuǎn)染，經(jīng)改造的核酸酶被表達(dá)，識(shí)別其內(nèi)源識(shí)別位點(diǎn)，與其結(jié)合并在該特定位點(diǎn)誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂。細(xì)胞感知DNA損傷并觸發(fā)同源重組以對其進(jìn)行修復(fù)，采用經(jīng)共轉(zhuǎn)染的整合基質(zhì)作為DNA修復(fù)基質(zhì)，因它包含與周圍斷裂DNA同源的區(qū)域。在該重組事件期間，克隆到整合基質(zhì)的同源區(qū)之間的陽性選擇標(biāo)記(POS)和GOI在大范圍核酸酶識(shí)別位點(diǎn)被整合。于是，可以選擇穩(wěn)定的靶細(xì)胞克隆用于藥物抗性和目的重組蛋白的表達(dá)。
下文中提供了可用于本發(fā)明構(gòu)建體之遺傳元件類型的實(shí)例。這些實(shí)例僅為示例性的并且不應(yīng)被以任何方式理解為限制本發(fā)明的范圍。如下表I中提供了陽性和陰性選擇標(biāo)記基因的列表。表I
權(quán)利要求
1.一組遺傳構(gòu)建體，其包含 a)構(gòu)建體(i)，其由至少包含以下組分的核酸分子所編碼(N) n-H0M01-P-M-H0M02-(N)m(i) 其中,η和m為整數(shù)并且代表O或I,前提是當(dāng)η = I時(shí)m = 0而當(dāng)η = 0時(shí)m = I;因此組分N可被設(shè)置在HOMOl之前或H0M02之后，并且組分P和M可按順序P-M或M-P設(shè)置； 其中 N 包含組分(PROMl)-(NEG)-(TERMl) ;P 包含組分(PR0M2) - (POS) - (TERM2);并且M 包含組分(PR0M3) - (MCS) - (TERM3);以及 其中PROMl為第一轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)序列；NEG為陰性選擇標(biāo)記；TERM1為第一轉(zhuǎn)錄終止序列；H0M01為與核酸酶DNA靶序列之前的基因組部分同源的部分；PR0M2為第二轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)序列；POS為陽性選擇標(biāo)記；TERM2為第二轉(zhuǎn)錄終止序列；PR0M3為第三轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)序列；MCS為多克隆位點(diǎn)；TERM3為第三轉(zhuǎn)錄終止序列；H0M02為與所述核酸酶DNA靶序列之后的基因組部分同源的部分； b)至少一種選自包括構(gòu)建體(ii)或(iii)在內(nèi)的組的構(gòu)建體，所述構(gòu)建體(ii)或(iii)由至少包含以下組分的核酸分子所編碼PR0M4-NUCl(ii)； NUC2(iii);或 所述組還包含序列(iv)，其為至少包含以下組分的分離或重組蛋白質(zhì)NUC3 (iv)； 其中PR0M4為第四轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)序列；NUC1為大范圍核酸酶、TALEN或ZFN的開放讀碼框(ORF) ；MEGA2為所述大范圍核酸酶、所述TALEN或所述ZFN的信使RNA(mRNA)形式；MEGA3為所述大范圍核酸酶、所述TALEN或所述ZFN的分離或重組蛋白質(zhì)；其中來自構(gòu)建體(ii)或(iii)或者序列(iv)的所述大范圍核酸酶、所述TALEN或所述ZFN識(shí)別并切割所述核酸酶DNA靶序列；并且其中構(gòu)建體(ii)或(iii)或者序列(iv)被設(shè)置成與構(gòu)建體⑴共轉(zhuǎn)染到至少一種靶細(xì)胞中。
2.權(quán)利要求I的構(gòu)建體組，其中來自構(gòu)建體(i)的所述組分H0M01和H0M02包含與所述核酸酶DNA靶序列側(cè)翼的靶細(xì)胞基因組部分具有同源性的至少200bp并且不多于6000bp的序列。
3.權(quán)利要求I或2的構(gòu)建體組，其中來自構(gòu)建體(i)的所述組分H0M01和H0M02包含與所述核酸酶DNA靶序列側(cè)翼的靶細(xì)胞基因組部分具有同源性的至少IOOObp并且不多于2000bp的序列ο
4.權(quán)利要求1、2或3的構(gòu)建體組，其中所述組分(POS)選自新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶抗性基因nptl(SEQ ID NO 3)、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶抗性基因hph (SEQ ID NO 4)、嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因pac(SEQ ID N05)、殺稻瘟素S脫氨酶抗性基因bsr (SEQ ID NO 6)、博來霉素抗性基因 sh ble(SEQ ID NO 7)。
5.權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)的構(gòu)建體組，其中所述組分(NEG)選自缺失CpG島的單純皰疹病毒的胸苷激酶基因HSV TK DelCpG(SEQID NO 8)、與缺失CpG島的尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因偶聯(lián)的胞嘧啶脫氨酶CD :UPRT DelCpG (SEQ ID NO 9)。
6.權(quán)利要求I至5中任一項(xiàng)的構(gòu)建體組，其中所述元件PROMl、PR0M2、PR0M3和PR0M4選自巨細(xì)胞病毒的立即早期啟動(dòng)子PCMV(SEQ ID NO 10);猿病毒40啟動(dòng)子pSV40 (SEQID NO 11);人延伸因子la啟動(dòng)子phEFla (SEQ ID NO 12);人磷酸甘油酸激酶啟動(dòng)子phPGK (SEQ ID NO 13);小鼠磷酸甘油酸激酶啟動(dòng)子pmPGK (SEQ ID NO 14);人多聚泛素啟動(dòng)子phUbc (SEQ ID NO 15);來自人單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動(dòng)子pHSV_TK (SEQ ID NO16);人生長抑制特異性5啟動(dòng)子phGAS5(SEQ ID NO 17);四環(huán)素響應(yīng)元件pTRE(SEQ IDN018);來自腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)序列IRES EMCV(SEQ ID NO 19)；來自口蹄疫病毒的 IRES 序列 IRES FMDV(SEQ IDNO 20)，SV40。
7.權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)的構(gòu)建體組，其中所述元件TERM1、TERM2、TERM3和TERM4選自聚腺苷化信號SV40pA(SEQ ID N021)、牛生長激素聚腺苷化信號BGH pA(SEQ ID NO22)。
8.權(quán)利要求I至7中任一項(xiàng)的構(gòu)建體組，其中所述元件MCS在其5’端或3’端包含框內(nèi)肽標(biāo)簽,其中所述肽標(biāo)簽選自FLAG (SEQ ID NO 23)、FLASH/REASH(SEQ ID NO 24), IQ (SEQID NO 25)、組氨酸(SEQID NO 26) ,STREP (SEQ ID NO 27)、鏈霉親和素 結(jié)合蛋白 SBP (SEQIDNO 28)、鈣調(diào)素結(jié)合蛋白 CBP (SEQ ID NO 29)、血凝素 HA (SEQ IDNO 30)、c-myc (SEQ ID NO31)、V5標(biāo)簽序列(SEQ ID NO 32)、來自核質(zhì)蛋白的核定位信號(NLS) (SEQ ID NO 33)、來自 SV40 的 NLS (SEQID NO 34)、NLS 共有序列(SEQ ID NO 35)、凝血酶切割位點(diǎn)(SEQ ID NO36)、P2A 切割位點(diǎn)(SEQ ID NO 37)、T2A 切割位點(diǎn)(SEQ ID NO 38)、E2A 切割位點(diǎn)(SEQ IDNO 39)。
9.權(quán)利要求I至8中任一項(xiàng)的構(gòu)建體組，其中所述元件MCS包含報(bào)告基因，所述報(bào)告基因選自螢火蟲螢光素酶基因(SEQ ID NO 40)、海腎螢光素酶基因(SEQ ID NO 41)、β-半乳糖苷酶酶基因LacZ (SEQ IDNO 42)、人分泌型堿性磷酸酶基因hSEAP (SEQ ID NO 43)、鼠分泌型堿性磷酸酶基因mSEAP(SEQ ID NO 44)。
10.權(quán)利要求I至9中任一項(xiàng)的遺傳構(gòu)建體組，其中構(gòu)建體⑴包含SEQID NO 45或SEQ ID NO 46o
11.一種將編碼GOI的序列引入至少一種細(xì)胞中的試劑盒，其包含根據(jù)權(quán)利要求I至10中任一項(xiàng)的遺傳構(gòu)建體組；以及使用所述遺傳構(gòu)建體組產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞的說明。
12.權(quán)利要求11的試劑盒，其還至少包含一種靶細(xì)胞，所述靶細(xì)胞選自=CHO-Kl細(xì)胞、ΗΕΚ293 細(xì)胞、Caco2 細(xì)胞、U2-0S 細(xì)胞、NIH 3T3 細(xì)胞、NSO 細(xì)胞、SP2 細(xì)胞、CH0-S 細(xì)胞、DG44細(xì)胞。
13.一種通過同源重組轉(zhuǎn)化至少一種細(xì)胞的方法，其包括以下步驟 a)將編碼目的基因的序列克隆到權(quán)利要求I至9中任一項(xiàng)的構(gòu)建體(i)的位置MCS中； b)用步驟b)中的所述構(gòu)建體(i)與權(quán)利要求I至9中任一項(xiàng)的構(gòu)建體(ii)、(iii)或序列(iv)中至少一種共轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞； c)基于以下條件從所述靶細(xì)胞中選擇至少一種細(xì)胞存在組分(POS)以及不存在組分(NEG)。
14.權(quán)利要求13的方法，其中根據(jù)(POS)和(NEG)編碼的基因產(chǎn)物的活性依次進(jìn)行步驟c)中的選擇。
15.權(quán)利要求13的方法，其中根據(jù)(POS)和(NEG)編碼的基因產(chǎn)物的活性同時(shí)進(jìn)行步驟c)中的選擇。
全文摘要
本發(fā)明涉及一組遺傳構(gòu)建體，其至少包含第一致重組構(gòu)建體(i)和第二構(gòu)建體(ii、iii或iv)，所述第一致重組構(gòu)建體(i)具有至少兩個(gè)與位點(diǎn)特異性內(nèi)切核酸酶的DNA靶標(biāo)位點(diǎn)之前和之后的基因組區(qū)域同源的部分，并且還包含插入所述同源部分的陰性選擇標(biāo)記和陽性選擇標(biāo)記以及其中可將目的序列克隆到鄰近陽性選擇標(biāo)記的區(qū)域；所述第二構(gòu)建體(ii、iii或iv)包含大范圍核酸酶。本發(fā)明還涉及包含這些構(gòu)建體的試劑盒以及使用該組構(gòu)建體將目的序列引入到靶細(xì)胞、組織或生物體之基因組中的方法。
文檔編號C12N9/22GK102858966SQ201180014623
公開日2013年1月2日 申請日期2011年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月18日
發(fā)明者克里斯托夫·德朗達(dá), 讓-皮埃爾·卡巴尼奧爾斯 申請人:賽萊克蒂斯公司