專利名稱：具有改良生長特性的植物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，并且涉及改良植物生長特性的方法。更具體的，本發(fā)明涉及通過增加SNF1相關(guān)蛋白激酶(SnRK2)或其同源物在植物中的活性來增加植物產(chǎn)量和/或生物量的方法。本發(fā)明還涉及具有SnRK2蛋白激酶或其同源物的編碼核酸表達(dá)增加的植物，該植物相對于對應(yīng)的野生型植物具有改良的生長特性。本發(fā)明還提供了可用于本發(fā)明方法的構(gòu)建體。
鑒于不斷增長的世界人口和農(nóng)業(yè)用地面積的縮小，增加農(nóng)業(yè)效率和增加園藝植物的多樣性一直是農(nóng)業(yè)研究的主要目標(biāo)。作物和園藝改良的常規(guī)手段利用選育技術(shù)來鑒定具有期望特性的植物。然而，這種選育技術(shù)具有若干缺點(diǎn)，即這些技術(shù)一般是勞動密集型的，而且產(chǎn)生通常含有異質(zhì)遺傳成分的植物，這并非總是產(chǎn)生自親本植物傳遞過來的期望性狀。分子生物學(xué)的發(fā)展已經(jīng)允許人類操作動物和植物的種質(zhì)。植物的遺傳工程需要分離和操作遺傳物質(zhì)(一般是DNA或RNA的形式)，隨后把該遺傳物質(zhì)引入到植物中。此種技術(shù)導(dǎo)致具有多種改良的經(jīng)濟(jì)學(xué)、農(nóng)藝學(xué)或園藝性狀的植物的開發(fā)。具有特殊經(jīng)濟(jì)利益的性狀是生長性狀，例如高產(chǎn)量。產(chǎn)量通常定義為作物產(chǎn)生的可衡量經(jīng)濟(jì)價值。這可以從數(shù)量和/或質(zhì)量方面定義。產(chǎn)量直接取決于一些因素，例如，器官的數(shù)量和尺寸，植物結(jié)構(gòu)(例如，枝條的數(shù)量)，種子產(chǎn)量等等。根的發(fā)育、營養(yǎng)吸收和脅迫耐受性也是確定產(chǎn)量的重要因素?？梢酝ㄟ^優(yōu)化上述因素之一來提高作物產(chǎn)量。
據(jù)報道酵母蛋白激酶SNF1參與對葡萄糖饑餓應(yīng)激的應(yīng)答。假設(shè)它通過磷酸化阻抑蛋白Mig1來激活葡萄糖阻抑的基因。在其他生物中SNF1具有直系同源物，如哺乳動物中AMP-活化的蛋白激酶(AMPK)。ATP減少產(chǎn)生的增加的5’-AMP濃度使得AMPK被激活，所述的ATP減少由應(yīng)激條件如熱激或葡萄糖饑餓引起。植物也具有SNF1相關(guān)激酶，稱為SnRK。植物SnRK分為3個亞組SnRK1到SnRK3。SnRK1亞組在結(jié)構(gòu)和功能上均與SNF1最緊密相關(guān)；而亞組SnRK2和SnRK3對植物是獨(dú)特的。SnRK2蛋白質(zhì)缺少在SNF1中發(fā)現(xiàn)的C端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，但是在其C端具有谷氨酸和天冬氨酸的酸性序列段。SnRK2蛋白質(zhì)具有約40kDa的分子量并且由小基因家族編碼據(jù)報道擬南芥屬(Arabidopsis)和稻都具有10個SnRK2基因。第一個植物SNF1相關(guān)蛋白激酶2(SnRK2)(稱作PKABA1)是由Anderberg和Walker-Simmons分離的(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，10183-10187，1992)。發(fā)現(xiàn)其是脫落酸(ABA)和脫水作用誘導(dǎo)的。之后，分離出了相關(guān)蛋白質(zhì)，如ASK1和ASK2(Park等人，Plant Molecular Biology22，615-624，1993)。據(jù)報道這些基因在一些植物器官中表達(dá)，但是在葉中是最豐富的。SnRK2亞組的另一個成員是OST1(Mustilli等人，Plant Cell14，3089-3099，2002)。OST1在氣孔保衛(wèi)細(xì)胞和維管組織中表達(dá)，并且認(rèn)為它在脫落酸(ABA)感受和引發(fā)氣孔閉合的活性氧中間體產(chǎn)生之間發(fā)揮作用。在稻中，發(fā)現(xiàn)所有的SnRK2蛋白質(zhì)被高滲脅迫激活，并且它們中的一些還被ABA激活(Kobyashi等人，Plant Cell 16，1163-1177，2004)。據(jù)報道REK(又命名為SAPK3，Kobyashi等人，2004)在葉和成熟的種子中表達(dá)，但是不在莖或根中表達(dá)。重組REK蛋白質(zhì)在Ca2+存在時表現(xiàn)出增加的自磷酸化作用。
WO98/05760公開了20多個參與磷攝取和新陳代謝的蛋白質(zhì)(psr蛋白質(zhì))的編碼核苷酸序列。這些psr蛋白質(zhì)之一是蛋白激酶psrPK——在磷酸鹽饑餓時表達(dá)的SnRK2的相關(guān)蛋白質(zhì)。據(jù)推測，此蛋白質(zhì)及其他psr蛋白質(zhì)可用于操作磷新陳代謝，但是沒有實現(xiàn)所建議的表型(它們中的一些與增加的脅迫抗性相關(guān))。Assmann和Li(WO01/02541)描述了另一個與SnRK2相關(guān)的蛋白激酶AAPK。據(jù)報道AAPK功能的喪失減少了對脫落酸誘導(dǎo)的氣孔閉合的敏感性。因此建議其反過來(增加的AAPK表達(dá)或增加的活性)會使植物具有增加的干旱脅迫抗性。但是作者沒有說明這確實是這種情況。至今為止，可用的SnRK2相關(guān)蛋白質(zhì)的實驗數(shù)據(jù)主要表明其在植物脅迫應(yīng)答中的作用。
先前的本領(lǐng)域文獻(xiàn)沒有證實或提示相對于對應(yīng)的野生型及無脅迫的植物，增加的SnRK2蛋白質(zhì)表達(dá)，或增加的活性和/或表達(dá)導(dǎo)致產(chǎn)量增加。
現(xiàn)在令人驚訝的發(fā)現(xiàn)相對于對應(yīng)的野生型植物，植物中SnRK2蛋白質(zhì)增加的活性和/或表達(dá)使得植物具有改良的生長特性，尤其是產(chǎn)量。這些結(jié)果是在標(biāo)準(zhǔn)植物生長條件下得到的，并且產(chǎn)量增加不是由于抗脅迫性增加。
在結(jié)構(gòu)上，SnRK2蛋白質(zhì)是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其具有歸為SMART數(shù)據(jù)庫中的S_TKc類型(SMART登錄號SM00220)的催化結(jié)構(gòu)域?；钚晕稽c(diǎn)對應(yīng)PROSITE特征，PS00108(Prosite，Swiss Institute ofBioinformatics，http://us.expasy.org)[LIVMFYC]-x-[HY]-x-D-[LIVMFY]-K-x(2)-N-[LIVMFYCT](3)。C端部分包含未知功能的一段聚(Glu和/或Asp)殘基。
本發(fā)明的一個實施方案提供了改良植物生長特性的方法，其包括在植物中增加SnRK2多肽或其同源物的活性和/或表達(dá)，以及任選選擇具有改良生長特性的植物。
有利的，實施本發(fā)明的方法得到了具有多種改良生長特性的植物，如改良的生長、改良的產(chǎn)量、改良的生物量、改良的構(gòu)造或改良的細(xì)胞分裂，每種都是相對于對應(yīng)的野生型植物。優(yōu)選的，改良的生長特性至少包括比對應(yīng)的野生型植物增加的產(chǎn)量。優(yōu)選的，增加的產(chǎn)量是增加的生物量和/或增加的種子產(chǎn)量，包括下列一種或多種增加的(飽滿)種子數(shù)，增加的種子總重量、增加的千粒重和增加的收獲指數(shù)。要注意的是產(chǎn)量增加不是由于抗脅迫性增加。
本文所定義的術(shù)語“增加的產(chǎn)量”意指分別相對于對應(yīng)的野生型植物，如下任何一個或多個方面的增加(i)植物的一個或多個部分增加的生物量(重量)，特別是地上(可收獲)部分、增加的根生物量或任何其他可收獲部分的增加的生物量；(ii)增加的總種子產(chǎn)量，其包括種子生物量(種子重量)的增加并且其可以是每株植物種子重量的增加或單個種子基礎(chǔ)上的增加；(iii)增加的(飽滿)種子數(shù)；(iv)增加的種子尺寸；(v)增加的種子體積；(vi)增加的單個種子面積；(vii)增加的單個種子長度；(viii)增加的收獲指數(shù)，它表示為可收獲部分如種子的產(chǎn)量對總生物量的比例；(ix)每個圓錐花序小花增加的數(shù)量，其從所計數(shù)的種子總數(shù)以及初級圓錐花序的數(shù)量推論出來；以及(x)增加的千粒重(TKW)，其從所計的飽滿種子數(shù)和它們的總重量推論出來。增加的TKW可源于增加的種子尺寸(長度、寬度或其二者)和/或種子重量。增加的TKW可源于胚胎尺寸和/或胚乳尺寸的增加。
以谷類為例，產(chǎn)量增加可以表現(xiàn)為下列一種或多種每公頃或英畝植物數(shù)量增加、每株植物穗數(shù)量的增加、畦數(shù)、每畦種子數(shù)、粒重、TKW、穗的長度/直徑的增加等。以稻為例，產(chǎn)量增加可以表現(xiàn)為下列一種或多種的增加每公頃或英畝植物數(shù)量、每株植物的圓錐花序數(shù)量、每個圓錐花序的小穗數(shù)量、每個圓錐花序花的數(shù)量，種子飽滿率的增加、TKW的增加等。產(chǎn)量的增加還可產(chǎn)生改變的構(gòu)造或可以作為改變的構(gòu)造的結(jié)果發(fā)生。
優(yōu)選的，實施本發(fā)明的方法使得植物具有增加的產(chǎn)量，更具體的，具有增加的生物量和/或增加的種子產(chǎn)量。優(yōu)選的，增加的種子產(chǎn)量包含分別相對于對照植物，在下列一種或多種中的增加(飽滿)種子數(shù)、總種子重量、種子尺寸、千粒重和收獲指數(shù)。因此，本發(fā)明提供了增加植物產(chǎn)量的方法，該方法包括在植物中增加SnRK2多肽或其同源物的活性和/或表達(dá)。
由于根據(jù)本發(fā)明的改良植物具有增加的產(chǎn)量，因此，相對于在其生活周期對應(yīng)階段的相應(yīng)野生型植物的生長速度，這些植物很可能表現(xiàn)出增加的生長速度(至少是在其生活周期的一部分)。生長速度增加可以是對植物的一個或多個部分或細(xì)胞類型(包括種子)特異性的，或者可以基本遍布整株植物。具有增加的生長速度的植物可以具有更短的生活周期。植物的生活周期意指從干的成熟種子生長到植物產(chǎn)生干的成熟種子(類似于起始物質(zhì))的階段所需的時間。此生活周期可以受到如早期活力、生長速度、開花時間和種子成熟速度等因素的影響。生長速度的增加可以發(fā)生在植物生活周期的一個或多個階段或者基本遍布整個植物生活周期期間。在植物生活周期的早期階段增加的生長速度反映了增強(qiáng)的活力。生長速度的增加可以改變植物的收獲周期，這使得植物可以比可能的情形更晚播種和/或更早收獲。如果生長速度充分增加，可以允許播種相同植物物種的更多種子(例如在播種和收獲稻植物后，接著播種和收獲更多的稻植物，所有這些都在一個常規(guī)生長期內(nèi))。類似的，如果生長速度充分增加，可以允許播種不同植物物種的更多種子(例如在播種和收獲稻植物后，例如接著播種和任選收獲大豆、馬鈴薯或任何其他適當(dāng)?shù)闹参?。在一些植物的情形下，從同一根狀莖收獲多次也是可能的。改變植物的收獲周期可以使得每英畝每年生物量的產(chǎn)出增加(由于任何特定植物可以生長和收獲次數(shù)(指在一年中)的增加)。生長速度的增加還使得轉(zhuǎn)基因植物可以比它們的野生型對應(yīng)物在更廣的地域栽培，這是因為生長作物的區(qū)域性限制通常決定于種植時(初期)或收獲時(晚期)的不利環(huán)境條件。如果收獲周期縮短，那么可以避免此類不利條件?？梢酝ㄟ^生長實驗測繪生長曲線，得到多個參數(shù)來確定生長速度，此類參數(shù)可以是T-Mid(植物達(dá)到其最大尺寸的50％時所用的時間)以及T-90(植物達(dá)到其最大尺寸的90％時所用的時間)等。
本發(fā)明方法的實施提供了具有增加的生長速度的植物。因此，本發(fā)明提供了增加植物生長速度的方法，該方法包括在植物中增加SnRK2多肽或其同源物的活性和/或表達(dá)。
與對照植物相比，無論植物是否在無脅迫條件下或植物是否接觸多種脅迫，產(chǎn)生產(chǎn)量和/或生長速度的增加。植物一般通過生長更加緩慢來應(yīng)答所接觸的脅迫。在嚴(yán)重的脅迫條件下，植物甚至完全停止生長。另一方面，本文將中等脅迫定義為植物所接觸的不引起植物完全停止生長且沒有能力恢復(fù)生長的任何脅迫。根據(jù)農(nóng)業(yè)實踐(灌溉、施肥、殺蟲劑處理)的發(fā)展，在栽培的作物植物中通常不會遇到嚴(yán)重脅迫。因而，中等脅迫誘導(dǎo)的受損生長通常是農(nóng)業(yè)所不希望的特征。中等脅迫是植物所接觸的典型脅迫。這些脅迫可以是植物所接觸的日常生物和/或非生物(環(huán)境)脅迫。典型的非生物或環(huán)境脅迫包括由反常的熱或寒冷/凍結(jié)溫度引起的溫度脅迫；鹽脅迫；水脅迫(干旱或過量的水)。非生物脅迫還可以由化學(xué)制劑引起。生物脅迫通常是那些由病原體，如細(xì)菌、病毒、真菌和昆蟲引起的脅迫。
在任何植物中可以有利地改良上述生長特性。
本文所用的術(shù)語“植物”包括整株植物、植物的祖代和后代以及部分植物，包括種子、枝條、莖、葉、根(包括塊莖)、花，以及組織和器官，其中前述每種包括目的基因/核酸，或在目的基因/核酸中的遺傳修飾。術(shù)語“植物”還包括植物細(xì)胞、懸浮培養(yǎng)物、愈傷組織、胚胎、分生組織區(qū)、配子體、孢子體、花粉和小孢子，同樣的，其中每種前述包含目的基因/核酸。
尤其可用于本發(fā)明方法中的植物包括藻類、蕨類植物以及屬于植物界(Viridiplantae)超家族的所有植物，尤其是單子葉植物和雙子葉植物，包括選自如下物種的飼料或飼料豆科植物、觀賞植物、糧食作物、喬木或灌木秋葵屬物種(Abelmoschus spp.)、槭樹屬物種(Acer spp.)、獼猴桃屬物種(Actinidia spp.)、冰草屬物種(Agropyron spp.)、蔥芹屬物種(Allium spp.)、莧屬物種(Amaranthus spp.)、鳳梨(Ananas comosus)、番荔枝屬物種(Annona spp.)、芹菜(Apium graveolens)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、落花生屬物種(Arachis spp.)、木波羅屬物種(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麥(Avenasativa)、陽桃(Averrhoa carambola)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、蕓苔屬物種(Brassicaspp.)、Cadaba farinosa、大葉茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Cannaindica)、辣椒屬物種(Capsicum spp.)、番木瓜(Carica papaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、紅花(Carthamus tinctorius)、山核桃屬物種(Carya spp.)、栗屬物種(Castanea spp.)、苦苣(Cichoriumendivia)、樟屬物種(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑橘屬物種(Citrus spp.)、椰子屬物種(Cocos spp.)、咖啡屬物種(Coffeaspp.)、Cola spp.、芋(Colocasia esculenta)、榛屬物種(Corylus spp.)、山楂屬物種(Crataegus spp.)、香瓜屬物種(Cucumis spp.)、南瓜屬物種(Cucurbita spp.)、菜薊屬物種(Cynara spp.)、胡蘿卜(Daucuscarota)、山馬蟥屬物種(Desmodium spp.)、龍眼(Dimocarpus longan)、薯蕷屬物種(Dioscorea spp.)、柿樹屬物種(Diospyros spp.)、稗屬物種(Echinochloa spp.)、穇子(Eleusine coracana)、枇杷(Eriobotryajaponica)、紅仔果(Eugenia uniflora)、蕎麥屬物種(Fagopyrum spp.)、山毛櫸屬物種(Fagus spp.)、無花果(Ficus carica)、金桔屬物種(Fortunella spp.)、草莓屬物種(Fragaria spp.)、銀杏(Ginkgo biloba)、大豆屬物種(Glycine spp.)、陸地棉(Gossypium hirsutum)、向日葵屬物種(Helianthus spp.)、木槿屬物種(Hibiscus spp.)、大麥屬物種(Hordeum spp.)、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃屬物種(Juglans spp.)、萵苣(Lactuca sativa)、山黧豆屬物種(Lathyrus spp.)、浮萍屬物種(Lemna spp.)、兵豆(Lens culinaris)、亞麻(Linum usitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脈根屬物種(Lotus spp.)、棱角絲瓜(Luffaacutangula)、羽扇豆屬物種(Lupinus spp.)、硬皮豆屬物種(Macrotylomaspp.)、西印度櫻桃(Malpighia emarginata)、蘋果屬物種(Malus spp.)、曼密蘋果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、木薯屬物種(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、紫苜蓿、草木樨屬物種(Melilotus spp.)、薄荷屬物種(Mentha spp.)、苦瓜屬物種(Momordicaspp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉屬物種(Musa spp.)、煙草屬物種(Nicotianum spp.)、木犀欖屬物種(Olea spp.)、仙人掌屬物種(Opuntiaspp.)、Ornithopus spp.、稻屬物種(Oryza spp.)、稷(Panicummiliaceum)、雞蛋果(Passiflora edulis)、歐防風(fēng)(Pastinaca sativa)、鱷梨屬物種(Persea spp.)、香芹(Petroselinum crispum)、菜豆屬物種(Phaseolus spp.)、刺葵屬物種(Phoenix spp.)、酸漿屬物種(Physalisspp.)、松屬物種(Pinus spp.)、阿月渾子(Pistacia vera)、豌豆屬物種(Pisum spp.)、早熟禾屬物種(Poa spp.)、楊屬物種(Populus spp.)、牧豆樹屬物種(Prosopis spp.)、李屬物種(Prunus spp.)、番石榴屬物種(Psidium spp.)、石榴(Punica granatum)、西洋梨(Pyrus communis)、櫟屬物種(Quercus spp.)、蘿卜(Raphanus sativus)、波葉大黃(Rheumrhabarbarum)、茶藨子屬物種(Ribes spp.)、懸鉤子屬物種(Rubus spp.)、甘蔗屬物種(Saccharum spp.)、接骨木屬物種(Sambucus spp.)、黑麥(Secale cereale)、Sesamum spp.、茄屬物種(Solanum spp.)、兩色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜屬物種(Spinacia spp.)、蒲桃屬物種(Syzygium spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可樹(Theobromacacao)、車軸草屬物種(Trifolium spp.)、Triticosecale rimpaui、小麥屬物種(Triticum spp.)、越桔屬物種(Vaccinium spp.)、野豌豆屬物種(Viciaspp.)、豇豆屬物種(Vigna spp.)、葡萄屬物種(Vitis spp.)、玉蜀黍(Zeamays)、北美洲野生稻(Zizania palustris)、棗屬物種(Ziziphus spp.)等。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的特征，植物是包含大豆、向日葵、油菜、苜蓿、油菜籽或棉花的作物植物。更優(yōu)選的，本發(fā)明的植物是單子葉植物，如甘蔗。最優(yōu)選的是谷類，如稻、玉米、小麥、粟、大麥、黑麥、燕麥或高粱。
可以通過增加SnRK2多肽的水平來增加SnRK2蛋白質(zhì)的活性?？蛇x的，當(dāng)SnRK2水平?jīng)]有變化或者甚至是當(dāng)SnRK2水平減少時，活性也可以增加。當(dāng)多肽的內(nèi)部性質(zhì)改變時，例如通過產(chǎn)生突變體或選擇比野生型更有活性的變體，可以發(fā)生這種情況。
本文所定義的術(shù)語“SnRK2或其同源物”意指多肽，其包含(i)功能性絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，(ii)保守性特征序列W(F/Y)(L/M/R/T)(K/R)(N/G/R)(L/P/I)(P/L)(A/G/V/R/K/I)(D/E/V)(SEQ IDNO6)和(iii)起始于SEQ ID NO6的末尾殘基的酸性C端結(jié)構(gòu)域?！癝nRK2或其同源物”與SEQ ID NO2所代表的氨基酸具有一定的全序列同一性的多肽，所述全序列同一性按照增加的優(yōu)選順序為至少55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的全序列同一性。使用總體對比算法，如程序GAP(GCG Wisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，確定全序列同一性。
此外，與對應(yīng)的野生型植物相比，當(dāng)在稻(Oryza sativa)栽培種Nipponbare的GOS2啟動子調(diào)控下表達(dá)時，此類“SnRK2或其同源物”增加地上的生物量和/或種子產(chǎn)量。種子產(chǎn)量的這種增加可以以一些方式測量，例如為千粒重的增加。
使用特型數(shù)據(jù)庫可以鑒別SnRK2蛋白質(zhì)中的多種結(jié)構(gòu)域，所述的數(shù)據(jù)庫如SMART(Schultz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，5857-5864；Letuni等人(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244；http://smart.embl-heidelberg.de/)、InterPro(Mulder等人，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318；http://www.ebi.ac.uk/interpro/)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，A generalized profile syntax for biomolecular sequencesmotifs and its function in automatic sequence interpretation.(In)ISMB-94；Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems forMolecular Biology.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，Lathrop R.，Searls D.，編著，53-61頁，AAAI出版，Menlo Park；Hulo等人，Nucl.Acids.Res.32D134-D137，(2004)，http://www.expasy.org/prosite/)或Pfam(Bateman等人，Nucleic Acids Research 30(1)276-280(2002)，http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)。
SnRK2的激酶結(jié)構(gòu)域是S_TKc類型(SMART登錄號SM00221，Interpro登錄號IPR002290)，并且當(dāng)其具有Ser/Thr激酶活性時是有功能的。預(yù)測的活性位點(diǎn)(ICHRDLKLENTLL，其中D是預(yù)測的催化殘基)對應(yīng)著PROSITE特征PS00108。ATP結(jié)合位點(diǎn)(IGAGNFGVARLMKVKNSKELVAMK)對應(yīng)著PROSITE特征PS00107。
優(yōu)選的，SEQ ID NO6的保守性特征序列具有序列W(F/Y)(L/M/R)K(N/R)(L/I)P(A/G/V/R/K/I)(D/E)，SEQ ID NO6的保守性特征序列更優(yōu)選具有序列W(F/Y)LKNLP(R/K)E；SEQ ID NO6的保守性特征序列最優(yōu)選具有序列WFLKNLPRE。
本文所用的酸性C端結(jié)構(gòu)域定義為SnRK2蛋白質(zhì)的C端部分，其起始于如上定義的保守性特征序列的末尾殘基(SEQ ID NO6中的D或E)，并且該C端部分具有的等電點(diǎn)(pI)在2.6和4.1之間，優(yōu)選在3.6和3.9之間，酸性C端結(jié)構(gòu)域的pI最優(yōu)選是3.7。使用EMBOSS包(Rice等人，Trendsin Genetics 16，276-277，2000)計算pI值。
搜索和鑒定SnRK2同源物的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉了解的。此類方法包括使用本領(lǐng)域熟知的用于比對或比較序列的算法，如GAP(Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48；443-453(1970))、BESTFIT(使用Smith和Waterman(Advances in Applied Mathematics 2；482-489(1981))的局部同源性算法)、BLAST(Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.& Lipman，D.J.，J.Mol.Biol.215403-410(1990))、FASTA和TFASTA(W.R.Pearson和D.J.Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444-2448(1988))，比較計算機(jī)可讀形式的SEQ ID NO 1或2代表的序列和在公共數(shù)據(jù)庫如MIPS(http://mips.gsf.de/)、GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)或EMBL Nucleotide Sequence Database(http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html)中獲得的序列。進(jìn)行BLAST分析的軟件通過National Centre for Biotechnology Information(NCBI)公開可用。下面提到的同源物是使用BLAST默認(rèn)參數(shù)(BLOSUM62矩陣，空位開放罰分為11且空位延伸罰分為1)鑒定出的，優(yōu)選使用全長序列用于分析。
落入“SnRK2多肽或其同源物”定義中的實例包括擬南芥蛋白質(zhì)和來自其他物種如稻、大豆和煙草的蛋白質(zhì)。
同源性的兩種特殊形式，直系同源和旁系同源是用來描述基因遺傳關(guān)系的進(jìn)化概念。術(shù)語“旁系同源”涉及某物種基因組內(nèi)的一個或多個基因復(fù)制產(chǎn)生的同源基因。術(shù)語“直系同源”涉及根據(jù)這些基因的遺傳關(guān)系在不同的生物中的同源基因。
可以通過對一組來自與查詢序列相同物種的序列進(jìn)行BLAST分析，可容易的鑒定SnRK2多肽的旁系同源物。例如，單子葉植物物種中的直向同源物可以通過實施所謂的交互blast搜索很容易地找到。這可以通過第一次blast完成，其包括在任何序列數(shù)據(jù)庫如可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov中找到的公眾可用的NCBI數(shù)據(jù)庫中，對所討論的序列(例如SEQ ID NO1或SEQ ID NO2，來自擬南芥(Arabidopsisthaliana))進(jìn)行blast。如果尋找的是稻的直系同源物，所討論的序列將再次與例如來自NCBI上可用的稻Nipponbare的28,469的全長cDNA克隆進(jìn)行blast。當(dāng)起始于核苷酸時可以使用BLASTn或tBLASTX，或者當(dāng)起始于蛋白質(zhì)時可以使用BLASTP或TBLASTN，并使用標(biāo)準(zhǔn)缺省值。可以過濾blast結(jié)果。之后將過濾結(jié)果或未過濾結(jié)果的全長序列與所討論的序列所來源生物(有時是擬南芥)的序列進(jìn)行反向blast(第二次blast)。然后對第一次和第二次blast的結(jié)果進(jìn)行比較。當(dāng)?shù)诙蝏last的結(jié)果與查詢SnRK2核酸或SnRK2多肽具有最高相似性時，就找到了直系同源物。如果對于具體的查詢序列，最符合的是SnRK2的旁系同源物，那么此類查詢序列也認(rèn)為是SnRK2的同源物，倘若此同源物包含如上所定義的功能性絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域、SEQ ID NO6的保守性特征序列和酸性C端區(qū)域。在大家族的情況下，可以使用ClustalW，接著使用相鄰連接樹以幫助觀察聚類(clustering)本文所用的術(shù)語“同源物”還包括可用于本發(fā)明方法中的蛋白質(zhì)的旁系同源物和直系同源物。來自擬南芥的旁系同源物包括下列基因文庫登錄號所給出的蛋白質(zhì)NP_172563、NP_849834(SEQ ID NO8)、NP_201170(SEQ ID NO10)、NP_196476(SEQ ID NO12)、NP_567945(SEQ ID NO14)、NP_179885(SEQ ID NO16)、NP_201489(SEQ ID NO18)、NP_974170(SEQ ID NO20)、NP_190619(SEQ ID NO22)、NP_195711(SEQ ID NO24)。使用交互BLAST方法鑒定了來自稻的直系同源物和旁系同源物(包括基因文庫登錄號BAD17997(SEQ ID NO26)、BAD17998(SEQ ID NO28)、BAD17999(SEQ ID NO30)、BAD18000(SEQ ID NO32)、BAD18001(SEQ ID NO34)、BAD18002(SEQ ID NO36)、BAD18003(SEQ ID NO38)、BAD18004(SEQ ID NO40)、BAD18005(SEQ ID NO42)、BAD18006(SEQ ID NO44))、來自油菜(B.napus)的直系同源物和旁系同源物(AAA33003(SEQ ID NO46)和AAA33004(SEQ ID NO48))、來自大豆的直系同源物和旁系同源物(AAB68961(SEQ ID NO50)和AAB68962(SEQ ID NO52))和來自煙草的直系同源物和旁系同源物(AAL89456(SEQ ID NO54))?？捎糜诒景l(fā)明的直系同源物和旁系同源物優(yōu)選具有和SnRK2相同的結(jié)構(gòu)和活性，并且在交互BLAST搜索中與SEQID NO2所代表的SnRK2具有最高的相似性。
應(yīng)當(dāng)理解的是術(shù)語SnRK2多肽或其同源物不限于SEQ ID NO2所代表的序列，也不限于上面列出的同源物，而是符合下列標(biāo)準(zhǔn)的任何多肽都適合用在本發(fā)明的方法中包含如上所定義的功能性絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，以及SEQ ID NO6的保守性特征序列和C端酸性結(jié)構(gòu)域，和/或是SnRK2的旁系同源物或直系同源物或與SEQ ID NO2的序列具有至少55％的序列同一性。
為了確定SnRK2的激酶活性，一些測定是可用的并且在本領(lǐng)域中眾所周知(例如Current Protocols in Molecular Biology，1和2卷，Ausubel等人(1994)，Current Protocols；或者是在線的，例如http://www.protocol-online.org)。
簡要的，激酶測定通常包括(1)使激酶蛋白質(zhì)接觸含有待磷酸化的靶位點(diǎn)的底物多肽；(2)在適當(dāng)?shù)臈l件下，在適當(dāng)?shù)募っ妇彌_液中進(jìn)行靶位點(diǎn)的磷酸化；(3)在恰當(dāng)?shù)姆磻?yīng)期后將磷酸化的產(chǎn)物從未磷酸化的底物中分離出來。激酶活性的存在或缺乏是通過磷酸化的靶標(biāo)的存在或缺乏來確定的。另外，可以進(jìn)行定量測量。
純化的SnRK2蛋白質(zhì)，或者含有或富含SnRK2蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物可以用作激酶蛋白質(zhì)的來源。作為底物，小肽是尤其適合的。肽在磷酸化位點(diǎn)基序中必須含有一個或多個絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基?？梢栽贐iochimica et Biophysica Acta 1314，191-225，(1996)中找到磷酸化位點(diǎn)的匯編。此外，肽底物可以優(yōu)選具有凈正電荷，以利于結(jié)合到磷酸纖維素濾器上(可用于將磷酸化的肽從未磷酸化的肽中分離出來并且檢測磷酸化的肽)。如果不知道磷酸化位點(diǎn)基序，可以使用常規(guī)酪氨酸激酶底物。例如，“Src相關(guān)肽”(RRLIEDAEYAARG)是許多受體和非受體酪氨酸激酶的底物。為了確定合成肽磷酸化的動力參數(shù)，要求肽濃度的范圍。對于起始反應(yīng)，要使用0.7-1.5mM的肽濃度。
對于每種激酶，重要的是要確定活性的最佳緩沖液、離子強(qiáng)度和pH。標(biāo)準(zhǔn)5×激酶緩沖液通常含有5mg/ml BSA(防止激酶對測定管吸附的牛血清蛋白)、150mM Tris-Cl(pH7.5)、100mM MgCl2。絕大部分酪氨酸激酶需要二價陽離子，盡管一些酪氨酸激酶(例如胰島素-、IGF-1-和PDGF受體激酶)需要MnCl2替代MgCl2(或除了MgCl2外還需要MnCl2)。要根據(jù)經(jīng)驗為每種蛋白激酶確定二價陽離子的最佳濃度。
常用的磷?；?phophoryl)基團(tuán)供體是放射性標(biāo)記的[γ-32P]ATP(通常是0.2mM終濃度)。在肽中混合的32p可以通過在閃爍計數(shù)器中的硝化纖維素干墊上測量活性來確定。
可選的，SnRK2蛋白質(zhì)或其同源物的活性可以通過在稻栽培種Nipponbare中，在GOS2啟動子調(diào)控下表達(dá)SnRK2蛋白質(zhì)或其同源物來測定，這使得植物比相應(yīng)的野生型植物具有增加的地上生物量和/或增加的種子產(chǎn)量?？梢砸砸恍┓绞綔y量種子產(chǎn)量的這種增加，例如按照千粒重的增加。
SnRK2多肽或其同源物的編碼核酸可以是任何天然或合成核酸。如本文所定義的SnRK2多肽或其同源物是由SnRK2核酸分子編碼的。因此本文定義的術(shù)語“SnRK2核酸分子”或“SnRK2基因”是如上所定義的SnRK2多肽或其同源物的任何編碼核酸分子。SnRK2核酸分子的實例包括由SEQID NO1所代表的那些核酸，以及編碼上述同源物的那些核酸。SnRK2核酸及其功能性變體可適用于進(jìn)行本發(fā)明的方法。SnRK2核酸的功能性變體包括部分SnRK2核酸分子和/或能夠與SnRK2核酸分子雜交的核酸。在功能性變體的范圍中，術(shù)語“功能性”指的是編碼這種多肽的變體SnRK2核酸(即一部分或雜交序列)，所述的多肽包含如上所定義的功能性激酶結(jié)構(gòu)域、SEQ ID NO6的保守性特征序列和酸性C端結(jié)構(gòu)域。
植物中SnRK2型激酶具有模塊結(jié)構(gòu)，其由激酶結(jié)構(gòu)域和酸性富含E和/或D結(jié)構(gòu)域組成。因此，設(shè)想以保留或改變SnRK2蛋白質(zhì)活性的這種方式改造激酶和/或酸性結(jié)構(gòu)域可用于實施本發(fā)明的方法。優(yōu)選的變體包括結(jié)構(gòu)域缺失、堆積或改組產(chǎn)生的那些(參見例如He等人，Science 288，2360-2363，2000，或美國專利5,811,238和6,395,547)。
本文定義的術(shù)語部分指的是一段至少包含700個核苷酸的DNA，并且該部分包含如上所定義的功能性激酶結(jié)構(gòu)域、SEQ ID NO6的保守性特征序列和酸性C端結(jié)構(gòu)域。例如，可以通過對SnRK2核酸制造一個或多個缺失來制備部分。部分可以以分離的形式使用或者例如，它們可以融合到其他編碼(或非編碼)序列以產(chǎn)生組合了一些活性(它們中的一種是蛋白激酶活性)的蛋白質(zhì)。當(dāng)融合到其他編碼序列時，由翻譯產(chǎn)生得到的多肽要比所SnRK2片段預(yù)測的多肽大?？捎糜诒景l(fā)明方法的部分至少包含如上所定義的功能性激酶結(jié)構(gòu)域、SEQ ID NO6的保守性特征序列和酸性C端結(jié)構(gòu)域。功能性部分可以是SEQ ID NO7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51和53中任一項所代表的核酸的一部分。優(yōu)選的，功能性部分是由SEQ ID NO1所代表的核酸的一部分。
本文所定義的術(shù)語“雜交”是基本同源的互補(bǔ)核苷酸序列相互退火的過程。雜交過程可以完全發(fā)生在溶液中，即互補(bǔ)核酸都在溶液中。雜交過程還可以如此進(jìn)行，即其中互補(bǔ)核酸之一固定于基質(zhì)如磁珠、瓊脂糖珠子或任何其他樹脂上。此外雜交過程可還可以如此進(jìn)行，即其中互補(bǔ)核酸之一固定于固相支持物如硝化纖維素膜或尼龍膜上，或通過例如照相平版印刷術(shù)固定到例如硅酸玻璃支持物上(后者稱之為核酸陣列或微陣列，或稱之為核酸芯片)。為了使得雜交發(fā)生，通常使核酸分子熱變性或化學(xué)變性，以使雙鏈解鏈成兩條單鏈和/或從單鏈核酸中除去發(fā)夾或其他二級結(jié)構(gòu)。雜交的嚴(yán)格性受諸如溫度、鹽濃度和雜交緩沖液組成等條件的影響。
在諸如Southern雜交和Northern雜交的核酸雜交實驗中，“嚴(yán)格雜交條件”和“嚴(yán)格雜交洗滌條件”是序列依賴性的，并且隨環(huán)境參數(shù)而不同。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到在雜交和洗滌中可以改變多種參數(shù)，并且所述變化將保持或改變嚴(yán)格條件。
Tm是在確定的離子強(qiáng)度和pH下，50％的靶標(biāo)序列與完全匹配的探針雜交時的溫度。Tm依賴于溶液條件、堿基組成以及探針的長度。例如，較長的序列在較高溫度下特異雜交。雜交的最大速率是在Tm低于大約16℃到32℃下得到的。雜交溶液中一價陽離子的存在降低了兩條核酸鏈之間的靜電排斥，從而促進(jìn)雜交體的形成；對于高達(dá)0.4M的鈉濃度，這個作用是明顯的。甲酰胺降低了DNA-DNA和DNA-RNA雙鏈體的解鏈溫度，每百分?jǐn)?shù)甲酰胺降低0.6至0.7℃，加入50％的甲酰胺雖然使雜交速率降低，但使雜交在30至45℃進(jìn)行。堿基對錯配降低了雜交速率和雙鏈體的熱穩(wěn)定性。一般對于大探針，每％堿基錯配使Tm降低大約1℃。取決于雜交體的類型，Tm可以使用下列公式計算·DNA-DNA雜交體(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138267-284，1984)Tm＝81.5℃+16.6×log[Na+]a+0.41×％[G/Cb]-500×[Lc]-1-0.61×％甲酰胺·DNA-RNA或RNA-RNA雜交體Tm＝79.8+18.5(log10[Na+]a)+0.58(％G/Cb)+11.8(％G/Cb)2-820/Lc·寡-DNA或寡-RNAd雜交體對于＜20個核苷酸Tm＝2(ln)對于20-35個核苷酸Tm＝22+1.46(ln)a或?qū)τ谄渌粌r陽離子，但是僅僅在0.01-0.4 M的范圍精確。
b僅僅對30％至75％范圍的％GC精確。
cL＝雙鏈體中堿基對的長度。
d寡，寡核苷酸；ln，引物的有效長度＝2×(G/C數(shù)目)+(A/T數(shù)目)。
注解對于每1％甲酰胺，Tm降低大約0.6至0.7℃，而6M尿素的存在降低Tm大約30℃。
雜交的特異性通常是后雜交洗滌的作用。為了移除非特異性雜交產(chǎn)生的背景，用稀釋的鹽溶液洗滌樣品。此類洗滌的關(guān)鍵因素包括最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度鹽濃度越低以及洗滌溫度越高，洗滌的嚴(yán)格性越高。洗滌條件通常在雜交嚴(yán)格性或低于雜交嚴(yán)格性下進(jìn)行。總體上，對于核酸雜交測定或基因擴(kuò)增檢測方法恰當(dāng)?shù)膰?yán)格條件如上述說明。也可以選擇差不多的嚴(yán)格條件?？傮w上，低嚴(yán)格條件選擇是大約比在確定的離子強(qiáng)度和pH下特異性序列的熱解鏈溫度(Tm)低50℃。中等嚴(yán)格條件是當(dāng)溫度比Tm低20℃時并且高嚴(yán)格條件時當(dāng)溫度比Tm低10℃時。例如，嚴(yán)格條件是那些至少與例如條件A-L一樣嚴(yán)格的條件；并且減少的嚴(yán)格條件是至少與例如條件M-R一樣嚴(yán)格的條件。非特異性的結(jié)合可以使用任意一種的一些已知技術(shù)(例如用含有溶液的蛋白質(zhì)將膜封閉，添加異源的RNA、DNA和SDS到雜交緩沖液中，以及用RNA酶處理)來調(diào)控。
雜交和洗滌條件的實例在表1中列出表1
“雜交體長度”是雜交核酸的預(yù)期長度。當(dāng)已知序列的核酸雜交時，可以通過比對序列和鑒別本文所述的保守區(qū)來確定雜交體長度。
雜交和洗脫緩沖液中可以用SSPE(1×SSPE是0.15M NaCl、10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA，pH7.4)代替SSC(1×SSC是0.15MNaCl和15mM檸檬酸鈉)；在雜交完成后洗脫15分鐘。雜交和洗脫可以另外地包括5×Denhardt試劑、0.5-1.0％ SDS、100μg/ml變性的片段化的鮭精DNA、0.5％焦磷酸鈉和高速50％甲酰胺。
*Tb-Tr對于預(yù)期長度少于50個堿基對的雜交體，雜交溫度應(yīng)該比雜交體的熔解溫度Tm低5-10℃，根據(jù)上述公式確定Tm。
±本發(fā)明還包括用PNA或修飾的核酸取代任意一個或多個DNA或RNA雜交體配偶體。
為了定義嚴(yán)格性水平的目的，通常參考Sambrook等人(2001)Molecular Cloninga laboratory manual，第3版，Cold Spring HarborLaboratory Press，CSH，New York or to Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)。
例如，編碼SEQ ID NO2或其同源物的核酸可以用在雜交實驗中。可選的，其片段可以用作探針。根據(jù)鑒別SnRK2蛋白質(zhì)的序列原料庫，可以選擇不同的雜交片段。例如，當(dāng)需要有限數(shù)量的與SnRK2具有高序列同一性的同源物時，可以使用保守性較低的片段用于雜交。通過比對SEQID NO2及其同源物，可以設(shè)計可用作雜交探針的相當(dāng)?shù)暮怂崞巍?br> 在雜交和洗滌后，依賴于探針標(biāo)記的類型，可以通過放射自顯影(當(dāng)使用放射性探針時)或者通過化學(xué)發(fā)光、免疫檢測、通過熒光或顯色檢測來檢測雙鏈體?？蛇x的，可以進(jìn)行核糖核酸酶保護(hù)試驗來檢測RNA:RNA雜交體。
SnRK2核酸分子或其功能性變體可以來自任何天然來源或人工來源。可以從微生物來源如細(xì)茵、酵母或真菌，或者從植物、藻類或動物(包括人)來源中分離核酸/基因或其功能性變體?？梢酝ㄟ^嚴(yán)謹(jǐn)?shù)娜斯げ僮髟诮M成和/或基因組環(huán)境方面從其天然形式對核酸進(jìn)行修飾。核酸優(yōu)選是植物來源的，可以是來自相同的植物物種(例如來自其待引入的植物物種)或來自不同的植物物種。核酸可以分離自雙子葉物種，優(yōu)選的分離自十字花科(Brassicaceae)，更優(yōu)選的分離自擬南芥。更優(yōu)選的，分離自擬南芥的SnRK2是SEQ ID NO1所代表的并且SnRK2氨基酸序列是SEQ ID NO2所代表的。
SnRK2多肽或其同源物可以由SnRK2核酸分子或基因的可選的剪接變體編碼。本文所用的術(shù)語“可選擇的剪接變體”涵蓋這樣的核酸序列變體，即其中選定的內(nèi)含子和/或外顯子已經(jīng)切除、置換或添加。這樣的變體是其中上述蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性保持未受影響的那些變體，其可以通過選擇性的保留蛋白質(zhì)的功能片段來獲得。此類剪接變體可以是天然發(fā)現(xiàn)的或人造的。制備此類剪接變體的方法是本領(lǐng)域熟知的。優(yōu)選的剪接變體是來自SEQ ID NO3所代表的核酸的所有剪接變體，如SEQ ID NO1。更優(yōu)選的剪接變體編碼此類多肽，所述多肽具有如上所定義的SEQ ID NO6的保守性特征序列側(cè)翼的功能性激酶結(jié)構(gòu)域和C端酸性結(jié)構(gòu)域。
同源物也可以由SnRK2多肽或其同源物的編碼核酸的等位變體編碼，優(yōu)選由SEQ ID NO1所代表的核酸的等位變體編碼。更優(yōu)選的，由等位變體編碼的多肽具有如上所定義的SEQ ID NO6的保守性特征序列側(cè)翼的功能性激酶結(jié)構(gòu)域和C端酸性結(jié)構(gòu)域。等位變體天然存在，并且包括在本發(fā)明方法中的是這些天然等位基因的用途。等位變體包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)以及小的插入/缺失多態(tài)性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。在大多數(shù)生物天然存在的多態(tài)性品系中SNP和INDEL形成了最大的一類序列變體。
可以通過以引入遺傳修飾(優(yōu)選在SnRK2基因的基因座中)來增加SnRK2多肽或其同源物的活性和/或表達(dá)。如本文中所定義的基因的基因座意指包括目的基因和編碼區(qū)域上游或下游10kb的基因組區(qū)域。
例如，遺傳修飾可以通過以下的任何一種(或多種)方法引入TDNA激活、TILLING、定點(diǎn)誘變、同源重組、定向進(jìn)化或者通過在植物中引入和表達(dá)編碼SnRK2多肽或其同源物的核酸。在引入遺傳修飾后，接下來的步驟是選擇SnRK2多肽增加的活性和/或表達(dá)，這種活性和/或表達(dá)的增加使得植物具有改良的生長特性。
T-DNA激活特征(Hayashi等人Science 258，1350-1353，1992)涉及在目標(biāo)基因的基因組區(qū)域或基因編碼區(qū)域上游或下游10KB中插入通常包含啟動子(也可以是翻譯增強(qiáng)子或內(nèi)含子)的T-DNA，如此構(gòu)型以便啟動子指引靶基因表達(dá)。通常，破壞靶基因天然啟動子對其的表達(dá)調(diào)控，而使該基因處于新引入的啟動子的控制之下。該啟動子一般嵌入到T-DNA中。例如，T-DNA通過農(nóng)桿菌屬感染隨機(jī)插入到植物基因組中，并導(dǎo)致靠近該插入T-DNA的基因過量表達(dá)。由于接近引入的啟動子的基因過量表達(dá)，所得的轉(zhuǎn)基因植物顯示出顯性表型。待引入的啟動子可以是能指導(dǎo)基因在所需的生物體(在本案中為植物)中表達(dá)的任何啟動子。例如，組成型、組織偏好的、細(xì)胞類型偏好的以及誘導(dǎo)型啟動子都適合用于T-DNA激活。
也可以使用TILLING技術(shù)(靶向誘導(dǎo)基因組局部損害技術(shù))，把遺傳修飾引入到SnRK2基因的基因座中。這是一種誘變技術(shù)，可用于產(chǎn)生和/或鑒定，并分離能顯示SnRK2活性的SnRK2核酸分子的誘變變體。TILLING還能夠選擇攜帶這類突變變體的植物。這些突變變體甚至可表現(xiàn)出比該基因的天然形式所表現(xiàn)出的更高的SnRK2活性。TILLNG將高密度誘變與高通量篩選方法結(jié)合起來。TILLING一般遵循的步驟是(a)EMS誘變(Redei和Koncz(1992)，InC Koncz，N-H Chua，J Schell編著，Methods inArabidopsis Research.World Scientific，Singapore，16-82頁；Feldmann等人，(1994)InEM Meyerowitz，CR Somerville編著，Arabidopsis.ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，137-172頁；Lightner和Caspar(1998)，InJ Martinez-Zapater，J Salinas編著，Methodson Molecular Biology，82卷，Humana Press，Totowa，NJ，91-104頁)；(b)DNA制備和個體合并；(c)目標(biāo)區(qū)域的PCR擴(kuò)增；(d)變性和退火以允許形成異源雙鏈體；(e)DHPLC，其中庫中異源雙鏈體的存在檢測為色譜圖中額外的峰值；(f)鑒定突變個體；和(g)突變PCR產(chǎn)物的測序。TILLING的方法是本領(lǐng)域熟知的(McCallum Nature Biotechnol.18，455-457，2000，Stemple Nature Rev.Genet.5，145-150，2004)。
定點(diǎn)誘變可用于產(chǎn)生保留了活性(即蛋白激酶活性)的SnRK2核酸或其部分的變體。一些方法可用來實現(xiàn)定點(diǎn)誘變，最常用方法是基于PCR的方法(見例如Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology.Wiley編著，http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html)。
定向進(jìn)化也可以用來產(chǎn)生具有上述增加的生物學(xué)活性的SnRK2多肽或同源物或其部分的編碼SnRK2核酸分子的功能性變體。定向進(jìn)化由下列組成DNA改組的重復(fù)，隨后是適當(dāng)?shù)暮Y選和/或選擇(Castle等人，(2004)Science 304(5674)1151-4；美國專利5,811,238和6,395,547)。
TDNA激活、TILLING、定點(diǎn)誘變和定向進(jìn)化是能夠產(chǎn)生保留了如上所述的SnRK2功能并因此可用于本發(fā)明方法中的新的SnRK2等位基因和功能性變體的技術(shù)的實例。
同源重組能夠在基因組的指定選擇位置引入選定的核酸。同源重組是生物學(xué)中通常使用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，用于較低等的生物體如酵母或苔蘚physcomitrella。用于在植物中進(jìn)行同源重組的方法不僅已在模式植物中描述(Offringa等人(1990)EMBO J.9，3077-3084)，而且在作物植物例如稻中描述(Terada等人，(2002)Nature Biotechnol.20，1030-1034；或Iida和Terada(2004)Curr.Opin.Biotechnol.15，132-138)。例如，待靶向的核酸(其可以是如上文所定義的SnRK2核酸分子或其功能性變體)不需要靶向到SnRK2基因的基因座中，但是可以被引入到高表達(dá)的區(qū)域。待靶向的核酸可以是改良的等位基因，用于替換內(nèi)源基因，或另外引入到內(nèi)源基因中。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，可以通過在植物中引入和表達(dá)編碼SnRK2多肽或其同源物的核酸來改良植物的生長特性。
引入遺傳修飾(在本案中不需要在SnRK2基因的基因座中)的優(yōu)選方法是在植物中引入和表達(dá)編碼SnRK2多肽或其同源物的核酸。上述SnRK2多肽或其同源物是具有激酶活性的一類，與SEQ ID NO2所代表的氨基酸序列具有一定的全序列同一性，所述全序列同一性按照增加的優(yōu)選順序為至少55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，并且另外包含如上所定義的激酶結(jié)構(gòu)域，SEQ ID NO6所代表的保守性特征序列和C端酸性結(jié)構(gòu)域。
蛋白質(zhì)的“同源物”涵蓋相對于所討論的未修飾蛋白質(zhì)具有氨基酸取代、缺失和/或插入，且與其所衍生自的未修飾蛋白質(zhì)具有相似的生物學(xué)活性和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶。
同源物可以是蛋白質(zhì)“取代變體”的形式，即其中氨基酸序列中的至少一個殘基已經(jīng)被除去，并且不同的殘基插入到它的位置上。氨基酸取代一般是單殘基的，但是取決于對多肽構(gòu)成的功能限制可以是成串的；插入片段通常是大約1到10個氨基酸殘基。優(yōu)選的，氨基酸取代包括保守性氨基酸取代(表2)。為了產(chǎn)生此類同源物，蛋白質(zhì)的氨基酸可以被其他具有相似性質(zhì)(如類似的疏水性、親水性、抗原性、形成或破壞α-螺旋結(jié)構(gòu)或β-折疊結(jié)構(gòu)的傾向)的氨基酸所置換。保守性替換表是本領(lǐng)域所熟知的(見例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company)。
表2保守性氨基酸取代的實例
在上述氨基酸性質(zhì)不是很關(guān)鍵的情況下，可以產(chǎn)生保守性較低的取代。
同源物還可以是蛋白質(zhì)的“插入變體”的形式，即將其中一個或多個氨基酸殘基引入到蛋白質(zhì)中的預(yù)定位點(diǎn)。插入可包括氨基端和/或羧基端融合，以及單個或多個氨基酸的序列內(nèi)插入。通常，氨基酸序列內(nèi)的插入將小于氨基或羧基端的融合，約為1到10個殘基的數(shù)量。氨基或羧基端融合蛋白質(zhì)或肽的實例包括如用于酵母雙雜交系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或激活結(jié)構(gòu)域、噬菌體外殼蛋白、(組氨酸)6-標(biāo)簽、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶-標(biāo)簽、A蛋白、麥芽糖結(jié)合蛋白、二氫葉酸還原酶、Tag·100表位、c-myc表位、FLAG表位、lacZ、CMP(鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽)、HA表位、C蛋白表位和VSV表位。
蛋白質(zhì)“缺失變體”形式的同源物的特征在于從蛋白質(zhì)除去一個或多個氨基酸。
使用本領(lǐng)域熟知的肽合成技術(shù)，如固相肽合成等等，或通過重組DNA操作，可以很容易的制備蛋白質(zhì)的氨基酸變體。對DNA序列進(jìn)行操作以產(chǎn)生蛋白質(zhì)的取代、插入或缺失變體的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，在DNA的預(yù)定位點(diǎn)產(chǎn)生突變的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括M13誘變、T7-Gen體外誘變(USB，Cleveland，OH)、快速變換的定點(diǎn)誘變(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變或其他定點(diǎn)誘變方案。
SnRK2多肽或其同源物可以是衍生物?！把苌铩卑摹⒐央?、多肽、蛋白質(zhì)和酶，與蛋白質(zhì)天然存在形式的氨基酸序列相比，例如，如SEQID NO2所示的，其可以包括天然和非天然存在氨基酸殘基的取代、缺失或添加。蛋白質(zhì)的“衍生物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶，與多肽天然存在形式的氨基酸序列相比，其可以包括天然存在的改變的、糖基化的、酰基化的氨基酸殘基或非天然存在的氨基酸殘基。與其所衍生自的氨基酸序列相比，衍生物還可包括一個或多個非氨基酸取代基，例如與氨基酸序列共價或非共價結(jié)合的報道分子或其他配體，如結(jié)合以便于其檢測的報道分子，以及相對于天然存在蛋白質(zhì)的氨基酸序列而言非天然存在的氨基酸殘基。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的方面，希望增強(qiáng)或增加SnRK2核酸分子或其功能性變體的表達(dá)。得到基因或基因產(chǎn)物表達(dá)增強(qiáng)或增加的方法在本領(lǐng)域中詳細(xì)記載并且包括例如用適當(dāng)?shù)膯幼域?qū)動的過量表達(dá)、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或翻譯增強(qiáng)子的使用?？梢詫⒆饔脼閱幼踊蛟鰪?qiáng)子元件的分離的核酸引入至多核苷酸非異源形式的適當(dāng)位置上(一般為上游)，從而上調(diào)SnRK2核酸或其功能性變體的表達(dá)。例如，可以通過突變、缺失和/或取代來體內(nèi)改變內(nèi)源啟動子(參見Kmiec，美國專利5,565,350號；Zarling等人，PCT/US93/03868)，或者可以將分離的啟動子以適當(dāng)?shù)姆较蚝团c本發(fā)明基因的距離引入植物細(xì)胞中，從而調(diào)控基因的表達(dá)。
如果希望多肽表達(dá)，通常需要在多核苷酸編碼區(qū)的3’-端包含聚腺苷酸化作用區(qū)域。聚腺苷酸化作用區(qū)域可以來自天然基因、來自多種其他植物基因或來自T-DNA。待添加的3’端序列可以來自例如胭脂氨酸合成酶或章魚堿合酶基因，或可選的來自其他植物基因，或較小優(yōu)選的來自其他真核基因。
還可以將內(nèi)含子序列添加到5’非翻譯區(qū)或部分編碼序列的編碼序列以增加在細(xì)胞溶膠中聚集的成熟信息的量。已經(jīng)表明在植物和動物表達(dá)構(gòu)建體中的轉(zhuǎn)錄單位中包含可剪接的內(nèi)含子能在mRNA和蛋白質(zhì)水平上使基因表達(dá)增加達(dá)1000倍(Buchman和Berg，Mol.Cell Biol.8，4395-4405(1988)；Callis等人，Genes Dev.1，1183-1200(1987))。當(dāng)將內(nèi)含子置于轉(zhuǎn)錄單位的5’端附近時，基因表達(dá)的此類內(nèi)含子增強(qiáng)通常是最大的。本領(lǐng)域已知玉米內(nèi)含子Adh1-S內(nèi)含子1、2和6，Bronze-1內(nèi)含子的用途?？傮w上參見The Maize Handbook，116章，F(xiàn)reeling和Walbot編著，Springer，N.Y.(1994)。
本發(fā)明還提供了遺傳構(gòu)建體和載體，以便于引入和/或表達(dá)可用于本發(fā)明方法中的核苷酸序列。
因此，本發(fā)明提供了基因構(gòu)建體，其包含(i)SnRK2核酸分子或其功能性變體(ii)能驅(qū)動(i)中核酸序列表達(dá)的一個或多個調(diào)控序列；及可選的
(iii)轉(zhuǎn)錄終止序列。
可用于本發(fā)明方法的構(gòu)建體可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建?；驑?gòu)建體可插入到載體中，該載體可以是商購的，適于轉(zhuǎn)化到植物中并適于在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中表達(dá)目的基因。
植物使用包含目的序列(即SnRK2核酸或其功能性變體)的載體轉(zhuǎn)化。目的序列與一個或多個調(diào)控序列(至少與啟動子)有效連接。術(shù)語“調(diào)節(jié)元件”、“調(diào)控序列”和“啟動子”在文中都可以互換使用，且應(yīng)當(dāng)取其廣義，是指能影響與它們連接的序列表達(dá)的調(diào)節(jié)核酸序列。上述術(shù)語包括來源于經(jīng)典真核生物基因組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(包括精確轉(zhuǎn)錄起始所需的TATA框，帶或不帶CCAAT框序列)以及根據(jù)發(fā)育和/或外界刺激，或以組織特異性方式改變基因表達(dá)的另外的調(diào)節(jié)元件(即上游激活序列、增強(qiáng)子和沉默子)。該術(shù)語還包括經(jīng)典原核基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，在這種情況下它可以包括-35框序列和/或-10框轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列。術(shù)語“調(diào)節(jié)元件”也包括合成的融合分子或衍生物，其使得核酸分子能夠在細(xì)胞、組織或器官中表達(dá)，激活或增強(qiáng)這種表達(dá)。如本文所用的術(shù)語“有效連接”指啟動子序列與目的基因之間的功能性連接，使得啟動子序列能起始目的基因的轉(zhuǎn)錄。
有利地，可以使用任何類型的啟動子來驅(qū)動核酸序列的表達(dá)。啟動子可以是誘導(dǎo)型啟動子，即對發(fā)育、化學(xué)、環(huán)境或物理刺激應(yīng)答而具有誘導(dǎo)的或增加的轉(zhuǎn)錄起始。作為脅迫誘導(dǎo)型啟動子(即當(dāng)植物接觸多種脅迫條件時激活的啟動子)的誘導(dǎo)型啟動子的實例是水脅迫誘導(dǎo)型啟動子WS118。另外的或可選的，啟動子可以是組織特異性啟動子，即能夠優(yōu)選的在特定組織如葉、根、種子組織等中起始轉(zhuǎn)錄的這種。種子特異性啟動子的實例是稻油質(zhì)蛋白18kDa啟動子(Wu等人(1998)J Biochem 123(3)386-91)。
優(yōu)選的，SnRK2核酸或其功能性變體有效連接到組成型啟動子。本文所定義的術(shù)語“組成型”指的是在植物的至少一個組織或器官中顯著性表達(dá)，以及在植物的任何生命階段顯著性表達(dá)的啟動子。該啟動子優(yōu)選在整株植物中顯著性表達(dá)。優(yōu)選的，能夠使核酸在整株植物中顯著性表達(dá)的組成型啟動子具有與GOS2啟動子相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)模式。更優(yōu)選的，組成型啟動子具有與稻GOS2啟動子相同的表達(dá)模式，最優(yōu)選的，能有使核酸在整株植物中顯著性表達(dá)的啟動子是SEQ ID NO55代表的來自稻的GOS2啟動子。要明確的是本發(fā)明的適用性并不限于由SEQ ID NO1所代表的SnRK2核酸，本發(fā)明的適用性也不限于由GOS2啟動子所驅(qū)動的SnRK2核酸的表達(dá)。其他也可以用來驅(qū)動SnRK2核酸表達(dá)的組成型啟動子的實例在下表3中顯示。
表3組成型啟動子的實例
任選的，一個或多個終止子序列也可引入植物的構(gòu)建體中。術(shù)語“終止子”包括調(diào)控序列，其位于轉(zhuǎn)錄單位末端的DNA序列，標(biāo)志初級轉(zhuǎn)錄本的3′加工和聚腺苷酸化以及轉(zhuǎn)錄的終止。其他調(diào)節(jié)元件可以包括轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子以及翻譯增強(qiáng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉適合用于實施本發(fā)明的終止子和增強(qiáng)子序列。此類序列是已知的，或本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易的獲得。
本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體還可以包括在特定細(xì)胞類型中維持和/或復(fù)制所需要的復(fù)制原點(diǎn)序列。一個實例是需要遺傳構(gòu)建體在細(xì)菌細(xì)胞中作為附加型基因元件(如質(zhì)粒或黏粒)維持的情況。優(yōu)選的復(fù)制原點(diǎn)包括但不局限于f1-ori和colE1。
遺傳構(gòu)建體任選地可包含選擇標(biāo)記基因。如本文所用，術(shù)語“選擇性標(biāo)記基因”包括賦予表達(dá)該基因細(xì)胞表型，以便于鑒定和/或選擇用本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的任何基因。合適的標(biāo)記可選自賦予抗生素或除草劑抗性的標(biāo)記，其引入新的新陳代謝性狀或允許可視選擇。選擇標(biāo)記基因的實例包括能賦予抗生素抗性的基因(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII，或磷酸化潮霉素的hpt)、賦予除草劑抗性的基因(例如提供Basta抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox)的基因，或提供陳代謝性狀的基因(如允許植物利用甘露糖作為唯一碳源的manA)?？梢晿?biāo)記基因?qū)е骂伾男纬?例如β-葡糖苷酸酶，GUS)、發(fā)光(如熒光素酶)或熒光(綠色熒光蛋白GFP及其衍生物)。
本發(fā)明還包括通過本發(fā)明方法獲得的植物。本發(fā)明因此提供了可通過本發(fā)明方法獲得的植物，該植物在其中引入了SnRK2核酸或其功能性變體，或者該植物在其中引入了遺傳修飾，優(yōu)選在SnRK2基因的基因座中。
本發(fā)明還提供了產(chǎn)生具有改良生長特性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括在植物中引入和表達(dá)SnRK2核酸或其功能性變體。
更具體的，本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有改良的生長特性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括(i)向植物或植物細(xì)胞中引入SnRK2核酸或其功能性變體；并且(ii)在促進(jìn)植物生長和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞。
核酸可以直接引入到植物細(xì)胞或植物本身(包括引入到植物的組織、器官或任何其他部分)之中。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的特征，核酸優(yōu)選通過轉(zhuǎn)化引入植物中。
本文所涉及的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”包括把外源多核苷酸向宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)移，而不管轉(zhuǎn)移所用的方法如何。無論是通過器官發(fā)生還是胚胎發(fā)生能夠隨后克隆繁殖的植物組織，可以用本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，并從其再生出整株植物。選擇的特定組織將根據(jù)可用于且最適于待轉(zhuǎn)化的特定物種的克隆繁殖系統(tǒng)而不同。例示性的靶標(biāo)組織包括葉圓盤、花粉、胚胎、子葉、下胚軸、雌配子體、胼胝體組織、已存在的分生組織(例如，頂端分生組織，腋生的芽和根分生組織)以及誘導(dǎo)的分生組織(例如，子葉分生組織和下胚軸分生組織)。多核苷酸可以瞬時或穩(wěn)定的被引入到宿主細(xì)胞中，并可保持非整合狀態(tài)，例如，作為質(zhì)粒。可選擇的，它可以整合到宿主基因組中。以本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的方法，所得的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞然后可用來再生轉(zhuǎn)化植物。
植物物種的轉(zhuǎn)化目前是一種相當(dāng)常規(guī)的技術(shù)。有利的，任何轉(zhuǎn)化方法都可用于將目的基因引入到合適的祖代細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化方法包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、能增加游離DNA攝入的化學(xué)品、直接注射DNA到植物中、基因槍顆粒轟擊、使用病毒或花粉進(jìn)行轉(zhuǎn)化以及顯微注射。方法可選自用于原生質(zhì)體的鈣/聚乙二醇方法(Krens等人，(1982)Nature 296，72-74；Negrutiu等人(1987)Plant Mol.Biol.8，363-373)；原生質(zhì)體的電穿孔(Shillito等人，(1985)Bio/Technol 3，1099-1102)；顯微注射到植物材料中(Crossway等人，(1986)Mol.Gen.Genet.202，179-185)；DNA或RNA包被顆粒轟擊(Klein等人，(1987)Nature 327，70)；用(非整合型)病毒感染等等。優(yōu)選使用任何用于稻轉(zhuǎn)化的熟知方法，通過農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生表達(dá)SnRK2轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因稻植物，所述的方法例如在任何以下文獻(xiàn)中描述的方法公開的歐洲專利申請EP 1198985 A1，Aldemita和Hodges(Planta，199，612-617，1996)；Chan等人(Plant Mol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hiei等人(Plant J.6，271-282，1994)，其公開的內(nèi)容以其全文在此引用作為參考。在谷類轉(zhuǎn)化情形下，優(yōu)選的方法如Ishida等人(Nature Biotechnol.14，745-50，1996)或Frame等人(Plant Physiol.129，13-22，2002)中所述，其公開的內(nèi)容以其全文在此引用作為參考。
通常在轉(zhuǎn)化以后，選擇存在有與目的基因共轉(zhuǎn)移的植物可表達(dá)基因所編碼的一個或多個標(biāo)記的植物細(xì)胞或細(xì)胞群，接著將轉(zhuǎn)化的材料再生成整株植物。
DNA轉(zhuǎn)移和再生之后，可評價推定轉(zhuǎn)化植物中目的基因的存在、拷貝數(shù)和/或基因組結(jié)構(gòu)，例如使用Southern分析?？蛇x的或另外的，新引入DNA的表達(dá)水平可使用Northern和/或Western分析進(jìn)行監(jiān)控，兩種技術(shù)都是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。因此將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞培養(yǎng)為成熟植物包括步驟選擇和/或再生和/或生長至成熟。
產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物可通過多種方法進(jìn)行繁殖，如通過克隆繁殖或經(jīng)典育種技術(shù)。例如，第一代(或T1)轉(zhuǎn)化植物可以自花授精以產(chǎn)生純合的第二代(或T2)轉(zhuǎn)化體，并且T2植物可進(jìn)一步通過經(jīng)典的育種技術(shù)進(jìn)行繁殖。
產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化生物可以是多種形式的。例如，它們可以是轉(zhuǎn)化細(xì)胞與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的嵌合體；克隆轉(zhuǎn)化體(例如，所有的細(xì)胞都被轉(zhuǎn)化以含有表達(dá)盒)；轉(zhuǎn)化與未轉(zhuǎn)化組織的嫁接體(例如，在植物中，轉(zhuǎn)化的根莖被嫁接到未轉(zhuǎn)化的接穗中)。
本發(fā)明顯然延及由文中描述的任何方法產(chǎn)生的任何植物細(xì)胞或植物，以及所有的植物部分及其繁殖體。本發(fā)明還延及囊括由任何上述方法產(chǎn)生的原代轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞、組織、器官或整株植物的后代，唯一的要求是該后代表現(xiàn)出與由本發(fā)明方法在親代中產(chǎn)生的基因型和/或表型特征相同的基因型和/或表型特征。本發(fā)明還包括含有分離的SnRK2核酸或其功能性變體的宿主細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。本發(fā)明還延及本發(fā)明植物的可收獲部分，例如但不限于種子、葉、果實、花、莖、根莖、塊莖和鱗莖。本發(fā)明另外涉及直接來自此類植物的可收獲部分的產(chǎn)物，如干的顆?；蚍?、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還包括SnRK2核酸或其功能性變體的用途，以及SnRK2多肽或其同源物的用途。
一種此類用途涉及改良植物的生長特性，尤其是改良產(chǎn)量，如增加的生物量和/或增加的種子產(chǎn)量。種子產(chǎn)量可以包括下列一種或多種增加的(飽滿)種子數(shù)、增加的種子重量、增加的收獲指數(shù)、增加的千粒重等。
SnRK2核酸或其變體，或SnRK2多肽或其同源物可以用在育種方案中，其中鑒定了與SnRK2基因或其變體遺傳連鎖的DNA標(biāo)記。SnRK2或其變體，或SnRK2蛋白質(zhì)或其同源物可以用來定義分子標(biāo)記。之后可以將此DNA或蛋白質(zhì)標(biāo)記用在育種方案中以選擇具有改良的生長特性的植物。例如，SnRK2基因或其變體可以是由的SEQ ID NO1所代表的核酸，或編碼任意上述同源物的核酸。
還發(fā)現(xiàn)SnRK2基因的等位變體在標(biāo)記輔助的育種方案中的用途。此類育種方案有時需要通過植物的誘變處理引入等位變異，例如使用EMS誘變；可選的，該方案可以開始于收集無意引起的“天然”來源的等位變體。之后通過例如PCR進(jìn)行等位變體的鑒定。接著是選擇步驟，用于選擇所討論序列的優(yōu)良等位變體，其在植物中產(chǎn)生改良的生長特性。通常通過監(jiān)控含有所討論序列的不同等位變體的植物的生長特性來進(jìn)行選擇，所述的所討論序列的等位變體如SEQ ID NO1的不同等位變體，或編碼任意上述同源物的核酸的不同等位變體。監(jiān)控生長特性可以在溫室或野外進(jìn)行。此外可選的步驟包括使已鑒定優(yōu)良等位變體的植物與另一種植物雜交。例如，這可用于產(chǎn)生目標(biāo)表型特征的組合。
SnRK2核酸或其變體還可用作探針，以對基因進(jìn)行遺傳和物理作圖，這些基因是與之連鎖的性狀的一部分和標(biāo)志。此類信息可用于植物育種，以開發(fā)具有所需表型的品系。SnRK2核酸或其變體的此類用途僅需要長度至少為10個核苷酸的核酸序列。SnRK2核酸或其變體可用作限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)記。限制性消化的植物基因組DNA的Southern印跡可使用SnRK2核酸或其變體進(jìn)行探測。然后可以使用計算機(jī)程序如MapMaker(Lander等人(1987)Genomics 1174-181)對所得的帶型進(jìn)行遺傳分析，以構(gòu)建遺傳圖譜。此外，該核酸可用于探測Southern印跡，該Southern印跡含有代表親本和確定的遺傳雜交后代的一組個體的限制酶處理的基因組DNA。記錄DNA多態(tài)性的分離，并用來計算SnRK2核酸或其變體在之前使用該群體獲得的遺傳圖譜中的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32314-331)。
在遺傳作圖中植物基因來源的探針的制備和用途在Bematzky和Tanksley(Plant Mol.Biol.Reporter 4，37-41，1986)中描述。眾多出版物描述了使用上述方法或其變通形式對特定的cDNA克隆進(jìn)行遺傳作圖。例如，F(xiàn)2雜交群體、回交群體、隨機(jī)交配群體、近親同基因系及其他的個體組可用于作圖。這類方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
核酸探針也可用于物理作圖(即將序列置于物理圖上；參見Hoheisel等人，在Non-mammalian Genomic AnalysisA Practical Guide，Academic press 1996，第319-346頁，以及其中引用的參考文獻(xiàn))。
在另一個實施方案中，核酸探針可用于直接熒光原位雜交(FISH)作圖(Trask(1991)Trends Genet.7149-154)。雖然現(xiàn)在的FISH作圖方法偏向于使用大的克隆(幾個到幾百kb；參見Laan等人(1995)Genome Res.513-20)，但是靈敏度的提高允許使用較短的探針進(jìn)行FISH作圖。
遺傳和物理作圖的多種基于核酸擴(kuò)增的方法可以使用所述核酸進(jìn)行。實例包括等位基因特異性擴(kuò)增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med 1195-96)、PCR擴(kuò)增片段的多態(tài)性(CAPS；Sheffield等人(1993)Genomics 16，325-332)、等位基因特異性連接(Landegren等人(1988)Science 2411077-1080)、核苷酸延伸反應(yīng)(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.183671)、放射雜交作圖(Walter等人(1997)Nat.Genet.722-28)和Happy作圖(Dear和Cook(1989)Nucleic Acid Res.176795-6807)。為實施這些方法，使用核酸序列設(shè)計和制備引物對，以用于擴(kuò)增反應(yīng)或引物延伸反應(yīng)。此類引物的設(shè)計是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。在采用基于PCR的遺傳作圖方法中，有必要鑒定跨越了對應(yīng)于此核酸序列區(qū)域作圖的親代之間的DNA序列差異。但是，這對作圖方法通常不是必要的。
在此方式中，可以實施產(chǎn)生、鑒定和/或分離具有改變的SnRK2活性和/或表達(dá)，表現(xiàn)出改良的生長特性的改良植物。
SnRK2核酸或其功能性變體，或SnRK2多肽或其同源物還可以用作生長調(diào)節(jié)劑。由于已經(jīng)表明這些分子可用于改良植物的生長特性，它們也是有用的生長調(diào)節(jié)劑，如除草劑或生長刺激物。本發(fā)明因此提供了一種用作生長調(diào)節(jié)劑的組合物，其包含SnRK2核酸或其功能性變體，或SnRK2多肽或其同源物以及合適的載體、稀釋劑或賦形劑。
根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生如上所述的具有改良生長特性的植物。這些改良的生長特性也可與其他經(jīng)濟(jì)學(xué)上有利的性狀組合，如進(jìn)一步增產(chǎn)性狀、對各種脅迫的耐受性、修飾各種結(jié)構(gòu)特征和/或生化和/或生理學(xué)特征的性狀。


本發(fā)明現(xiàn)在將參考以下附圖進(jìn)行描述，其中圖1給出了SnRK2的全圖。五角星形代表了激酶結(jié)構(gòu)域，而淺灰色的C端區(qū)域代表了富含Asp和/或Glu的酸性區(qū)域。
圖2顯示了二元載體，其用來在稻中轉(zhuǎn)化和表達(dá)受到稻GOS2啟動子(內(nèi)參PRO0129)調(diào)控的擬南芥SnRK2(內(nèi)參CDS0758)的。
圖3詳細(xì)描述了可用于進(jìn)行本發(fā)明方法的序列的實例。SEQ ID NO1和SEQ ID NO2代表了用于實施例中的SnRK2的核苷酸和蛋白質(zhì)序列。SEQ ID NO3代表了SnRK2未剪接的DNA序列。SEQ ID NO4和SEQ IDNO5是用來分離SnRK2核酸的引物序列。SEQ ID NO6代表了在SnRK2蛋白質(zhì)中保守部分的共有序列。SEQ ID NO7到53是SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所給出的SnRK2編碼序列和蛋白質(zhì)序列的同源物的核苷酸和蛋白質(zhì)序列。
實施例本發(fā)明現(xiàn)在將參考以下實施例進(jìn)行描述，其僅僅是為了例證說明。
DNA操作除非另外說明，否則重組DNA技術(shù)按照(Sambrook(2001)Molecular Cloninga laboratory manual，第3版，Cold Spring HarborLaboratory Press，CSH，New York)或Ausubel等人(1994)，CurrentProtocols in Molecular Biology，Current Protocols的卷1和2(http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.htmD中描述的標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行。用于植物分子工作的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法描述于R.D.D Croy的Plant Molecular Biology Labfase(1993)，由BIOS Scientific PublicationsLtd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版。
實施例1基因克隆使用擬南芥幼苗cDNA文庫(Invitrogen，Paisley，UK)作為模板，PCR擴(kuò)增擬南芥SnRK2(內(nèi)部編碼CDS0758)。對從幼苗提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以后，把cDNA克隆到pCMV Sport6.0中。文庫的平均插入大小為1.5kb，并且克隆的原始數(shù)為1.59×107cfu。原始滴度確定為9.6×105cfu/ml，并且在第一輪擴(kuò)增以后變成6×1011cfu/ml。質(zhì)粒提取以后，將200ng的模板用于50μl PCR混合物。用于PCR擴(kuò)增的引物prm02295(SEQ IDNO4，正義)和prm02296(SEQ ID NO5，反向互補(bǔ))包含用于Gateway重組的AttB位點(diǎn)。使用Hifi Tag DNA聚合酶，在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行PCR。同樣使用標(biāo)準(zhǔn)方法擴(kuò)增和純化1130bp的PCR片段(無attB位點(diǎn))。然后進(jìn)行Gateway方法的第一步，即BP反應(yīng)，在此期間，PCR片段與pDONR201質(zhì)粒體內(nèi)重組以產(chǎn)生“進(jìn)入克隆”(entry clone)”(根據(jù)Gateway術(shù)語)。質(zhì)粒pDONR201作為Gatewaytechnology的一部分購自Invitrogen。
實施例2載體構(gòu)建和稻的轉(zhuǎn)化繼之在LR反應(yīng)中使用進(jìn)入克隆p028和用于稻轉(zhuǎn)化的目的載體p03069。該載體包含位于T-DNA邊界內(nèi)的以下部分作為功能性元件植物選擇性標(biāo)記；可視標(biāo)記表達(dá)盒；旨在與已克隆到進(jìn)入克隆中的目的序列進(jìn)行LR體內(nèi)重組的Gateway盒。用于組成型表達(dá)的稻GOS2啟動子位于該Gateway盒的上游。
LR重組步驟之后，將得到的表達(dá)載體p033(圖2)轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌屬菌株LBA4404中，并且隨后轉(zhuǎn)化到稻植物中。使轉(zhuǎn)化的稻植物生長，并且然后檢驗實施例3中所述的參數(shù)。
實施例3轉(zhuǎn)化體的評估生長測量產(chǎn)生了大約15到20個獨(dú)立的T0轉(zhuǎn)化體。將初級轉(zhuǎn)化體從組織培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)移到溫室中生長，并收獲T1種子。5個事件得以保留，其中T1后代發(fā)生3∶1的轉(zhuǎn)基因存在/缺乏分離。對于這些事件中的每一個，通過可視標(biāo)記選擇，選擇了10個包含轉(zhuǎn)基因的T1幼苗(雜合子和純合子)，以及10個缺乏轉(zhuǎn)基因的T1幼苗(失效合子)。將選擇的T1植物轉(zhuǎn)移到溫室中。每個植物具有一個唯一的條形標(biāo)簽以將表型數(shù)據(jù)與對應(yīng)植物明確聯(lián)系起來。所選擇的T1植物在10cm直徑花盆的土壤中并在下列環(huán)境狀態(tài)下生長光周期＝11.5小時、日光強(qiáng)度＝30,000勒克斯或更多、日間溫度＝28℃或更高、夜間溫度＝22℃、相對濕度＝60-70％。轉(zhuǎn)基因植物和相應(yīng)的失效合子在隨機(jī)位置上并排生長。從播種期到成熟期，植物幾次通過數(shù)字成像箱。在每個時間點(diǎn)上對每株植物從至少6個不同的角度取得數(shù)字圖像(2048×1536像素，1千6百萬色)。
收獲成熟的初級圓錐花序、裝袋并貼上條碼標(biāo)簽，然后在37℃烤箱中干燥三天。隨后將圓錐花序脫粒并且收集所有的種子。使用鼓風(fēng)裝置將飽滿外殼和空外殼分開。在分離后，使用可商購的計數(shù)儀器對兩批種子進(jìn)行計數(shù)。棄去空外殼。在分析天平上稱重飽滿的外殼并且使用數(shù)字成像測量種子的截面積。此方法得到一組下面描述的種子相關(guān)參數(shù)。
這些參數(shù)是使用圖像分析軟件，以自動方式從數(shù)字圖像中得到并且進(jìn)行統(tǒng)計分析的。將對不平衡設(shè)計進(jìn)行修正的雙因素ANOVA(方差分析)用作統(tǒng)計模型，用于植物表型特征的全面評估。對用本發(fā)明基因轉(zhuǎn)化的所有植株的所有事件的所有測量參數(shù)進(jìn)行F測驗。進(jìn)行F檢驗以檢查基因?qū)λ修D(zhuǎn)化事件的效應(yīng)，并檢驗基因的總效應(yīng)，亦稱之為整體基因效應(yīng)。如果F檢驗的值顯示數(shù)據(jù)具有顯著性，那么結(jié)論是有“基因”效應(yīng)，這意味著基因的存在或定位引起了效應(yīng)。真實整體基因效應(yīng)的顯著性閾值設(shè)置為F測驗的5％概率水平。
為了檢查基因在事件中的效應(yīng)，即品系特異性效應(yīng)，在每一事件中使用來自轉(zhuǎn)基因植物和相應(yīng)無效植物的數(shù)據(jù)集進(jìn)行t檢驗。“無效植物”或“無效分離子”或“無效合子”是以與轉(zhuǎn)基因植物相同的方式處理的，但是轉(zhuǎn)基因已經(jīng)從中分離的植物。也可以將無效植物描述為純合的陰性轉(zhuǎn)化植物。將t檢驗顯著性的閾值設(shè)定為10％概率水平。一些事件的結(jié)果可以高于此閾值或低于此閾值。這是基于這種假設(shè)，即基因可以僅在基因組中的某些位置中具有效應(yīng)，并且此位置依賴性效應(yīng)的發(fā)生不是罕見的。本文中此類基因效應(yīng)也稱為“基因的線性效應(yīng)(line effect of the gene)”。通過比較t值和t分布得到p值，或者通過比較F值和F分布得到p值。p值給出了零假設(shè)(即沒有轉(zhuǎn)基因的作用)為正確的概率。
將在第一個實驗中得到的數(shù)據(jù)在使用T2植物的第二個實驗中來證實。選擇了具有正確表達(dá)模式的3個品系用于進(jìn)一步分析。通過監(jiān)控標(biāo)記基因表達(dá)來篩選T1中的來自陽性植物(雜合子和純合子)的一批種子。對于每一個所選事件，隨后保存幾批雜合種子用于T2評估。在每批種子中，在溫室中種植等量的陽性和陰性植物用于評估。
在T2代中評估了總數(shù)為120的SnRK2轉(zhuǎn)化的植物，即每個事件有40個植物，其中有20個轉(zhuǎn)基因陽性以及20個陰性。
由于進(jìn)行了具有重疊事件的兩個實驗，進(jìn)行組合分析。這可用于檢查兩個實驗中效應(yīng)的一致性，并且如果在這種情形下，其可用于從兩個實驗中收集證據(jù)從而增加結(jié)論的可信性。使用的方法是考慮到數(shù)據(jù)的多級結(jié)構(gòu)(即實驗-事件-分離子)的混合模型方法。通過對比卡方分布的似然比測定得到p值。
實施例4轉(zhuǎn)化體的評估產(chǎn)量相關(guān)參數(shù)的測量當(dāng)對上述種子進(jìn)行分析時，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)用SnRK2基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物比缺乏SnRK2轉(zhuǎn)基因的植物具有更高的生物量(表示為總Areamax)和增加的千粒重(TKW)。在T1代中植物所得的陽性結(jié)果(增加的千粒重以及9％的生物量增加(p值為0.0309))在T2代中再次得到。在表4中，數(shù)據(jù)顯示了生物量和TKW的總％增加(從T2代的單獨(dú)品系的數(shù)據(jù)中計算出來)以及來自F檢驗的各個p值。這些T2數(shù)據(jù)在與T1代結(jié)果的組合分析中進(jìn)行再次評估，并且得到的p值顯示觀察到的效應(yīng)是顯著性的。
表4

地上生物量
通過計算區(qū)別于背景的來自地上植物部分的像素總數(shù)來確定植物地上面積。平均在同一時間點(diǎn)從不同的角度取得的圖片得到此值，并且通過校準(zhǔn)將此值轉(zhuǎn)變?yōu)橐云椒胶撩妆硎镜奈锢肀砻嬷?總Areamax)。實驗表明以此方式測量的地上植物面積與地上植物部分的生物量相關(guān)。在T1代中，存在地上生物量的顯著性增加，并且其在T2代中得到的確認(rèn)(p值分別在T1中是0.0309，T2中是0.0158)。組合分析還顯示在生物量中得到的增加是高顯著性的(p值0.0006)。
千粒重千粒重(TKW)是從所計的飽滿種子數(shù)和它們的總重量推斷出來的。在T1代和T2代中有TKW增加的傾向，這表明增加是可靠的總效應(yīng)并且是顯著性的。具體的，4個測試的T2品系中的2個表現(xiàn)出顯著性的TKW增加。
序列表<110>克羅普迪塞恩股份有限公司<120>具有改良生長特性的植物及其制備方法<130>CD-119-prio<150>EP 04103421.6<151>2004-07-16<150>US 60/589,765<151>2004-07-21<160>55<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>1092<212>DNA<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1atggacaagt acgagctggt gaaagacata ggtgctggga attttggagt tgccaggctc 60atgaaggtca aaaactctaa ggaacttgtt gccatgaagt acatcgagcg tggtcctaag 120attgatgaga atgtggcaag agagatcatt aatcacagat cacttcgcca tccgaatata 180atccggttca aggaggtggt gttgactcca acccatcttg ccattgccat ggaatatgct 240gctggtggtg aactattcga gcgtatatgc agtgctggaa gatttagtga ggatgaggcg 300agatatttct tccagcagct tatatcaggt gttagctatt gccatgctat gcaaatatgc 360catagagatc tgaagctcga gaatacgctc ttggatggaa gtcctgctcc acgtctgaaa 420atctgtgatt ttggttattc caagtcctct ctgctgcact ctaggcccaa atcaacagtt 480ggaactccag catatattgc acctgaggtc ctttctcgaa gagaatatga tggcaagatg 540gctgatgtat ggtcttgtgg tgtgactctt tatgtcatgc tggttggagc atacccattt 600gaagaccagg aagaccccaa gaacttcagg aaaacaatac aaaaaataat ggctgtccag 660tacaagatcc cggactacgt ccatatctca caggattgta aaaatctcct ttcccgtata 720tttgtcgcca attcactcaa gaggatcacc attgcagaaa tcaagaaaca ttcatggttc 780ctaaagaatt tgccaaggga actcacagag acagctcaag ctgcatattt caagaaagag 840aacccaacct tctcccttca gaccgttgaa gagatcatga agatagtggc tgacgccaaa 900acaccgcctc ctgtttcccg atccatcgga ggttttggct ggggaggaaa tggggatgca 960gatggaaaag aggaagatgc agaagacgtg gaggaggaag aggaggaggt ggaagaagag1020gaagacgatg aggatgaata cgataagact gtaaaggaag tacacgcaag tggagaagtg1080agaataagtt ga1092<210>2<211>363<212>PRT<213>擬南芥<400>2Met Asp Lys Tyr Glu Leu Val Lys Asp Ile Gly Ala Gly Asn Phe Gly1 5 10 15Val Ala Arg Leu Met Lys Val Lys Asn Ser Lys Glu Leu Val Ala Met20 25 30
Lys Tyr Ile Glu Arg Gly Pro Lys Ile Asp Glu Asn Val Ala Arg Glu35 40 45Ile Ile Asn His Arg Ser Leu Arg His Pro Asn Ile Ile Arg Phe Lys50 55 60Glu Val Val Leu Thr Pro Thr His Leu Ala Ile Ala Met Glu Tyr Ala65 70 75 80Ala Gly Gly Glu Leu Phe Glu Arg Ile Cys Ser Ala Gly Arg Phe Ser85 90 95Glu Asp Glu Ala Arg Tyr Phe Phe Gln Gln Leu Ile Ser Gly Val Ser100 105 110Tyr Cys His Ala Met Gln Ile Cys His Arg Asp Leu Lys Leu Glu Asn115 120 125Thr Leu Leu Asp Gly Ser Pro Ala Pro Arg Leu Lys Ile Cys Asp Phe130 135 140Gly Tyr Ser Lys Ser Ser Leu Leu His Ser Arg Pro Lys Ser Thr Val145 150 155 160Gly Thr Pro Ala Tyr Ile Ala Pro Glu Val Leu Ser Arg Arg Glu Tyr165 170 175Asp Gly Lys Met Ala Asp Val Trp Ser Cys Gly Val Thr Leu Tyr Val180 185 190Met Leu Val Gly Ala Tyr Pro Phe Glu Asp Gln Glu Asp Pro Lys Asn195 200 205Phe Arg Lys Thr Ile Gln Lys Ile Met Ala Val Gln Tyr Lys Ile Pro210 215 220Asp Tyr Val His Ile Ser Gln Asp Cys Lys Asn Leu Leu Ser Arg Ile225 230 235 240Phe Val Ala Asn Ser Leu Lys Arg Ile Thr Ile Ala Glu Ile Lys Lys245 250 255His Ser Trp Phe Leu Lys Asn Leu Pro Arg Glu Leu Thr Glu Thr Ala260 265 270Gln Ala Ala Tyr Phe Lys Lys Glu Asn Pro Thr Phe Ser Leu Gln Thr275 280 285Val Glu Glu Ile Met Lys Ile Val Ala Asp Ala Lys Thr Pro Pro Pro290 295 300Val Ser Arg Ser Ile Gly Gly Phe Gly Trp Gly Gly Asn Gly Asp Ala305 310 315 320Asp Gly Lys Glu Glu Asp Ala Glu Asp Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu325 330 335Val Glu Glu Glu Glu Asp Asp Glu Asp Glu Tyr Asp Lys Thr Val Lys340 345 350
Glu Val His Ala Ser Gly Glu Val Arg Ile Ser355 360<210>3<211>3121<212>DNA<213>擬南芥<400>3caaacatgta tggatcgcat ggaaacttgt gggtccctct ttcttttaaa aaatctcgta 60ttaattaaat aaatggaaaa aaaaacatga tgggagtttg tttaggcagg ggagattctt 120cttcattctc atcattattt ctctattaat ttcaccccaa aaaagaaaaa agaaaaattc 180caacaagaaa aaaaaaagaa aaagaaagtt gattcttcgc ttaggcttga aatctctcca 240atccaaatct caaattaacc ttccatcgtc atctctttcc cttttttttt cccactttct 300ttgcgaatcg cgagatctcg gaatcgcatc cttgattttg ggatactgtt tttttttttt 360ttaatcttgt ttcattttca cgtgaaattc ttagctgcta gaactggact tgaatttcaa 420cgagaatttt ggagattttt tttttgtttg ggtttttcct ttctgttttg tgtgtttgga 480attagggttg tcgagcgaga atggacaagt acgagctggt gaaagacata ggtgctggga 540attttggagt tgccaggctc atgaaggtca aaaactctaa ggaacttgtt gccatgaagt 600acatcgagcg tggtcctaag gtatattcct ctctgttttt gtgttttcat tgctctccat 660gagctggtga tcctataccc agatatgcat aattggaatg aattgctatt aagcagaaga 720gtcgattttt ttttgtaaat ttcttatcgt tagctgattg ggtgtttaac gtaacgttag 780ttatcttgta gttgtaatat ttttcctgaa aagatttgta caatgagtat ttgctttgtt 840tgtttttttt gatacagatt gatgagaatg tggcaagaga gatcattaat cacagatcac 900ttcgccatcc gaatataatc cggttcaagg aggttagtga atttcttgtt gcttgacatg 960ggtggtgttc ttgctatgaa aaagtttgtt gataatctct tatatctttc atcttgcatt1020ccttgttggg tttatggatt ttataggtgg tgttgactcc aacccatctt gccattgcca1080tggaatatgc tgctggtggt gaactattcg agcgtatatg cagtgctgga agatttagtg1140aggatgaggt gagcttgcca tttgaaaaat tgtgctgtgc ttttgcgaat atgaaattac1200tagtatttag gataatctgc atggtctttg gaaagattag gaggaaggga acaagagaaa1260acatgtgaac ctccttttat ttagtatcag gcattaaaca gttagggtct acgttctaat1320cctttctctc ttttccaggc gagatatttc ttccagcagc ttatatcagg tgttagctat1380tgccatgcta tggtaatgta gagacaatga cttaagcaaa atttacttat ccattggctg1440tttgaagtcg ttttttttta atcatgtgtt gactattttg ttgcagcaaa tatgccatag1500agatctgaag ctcgagaata cgctcttgga tggaagtcct gctccacgtc tgaaaatctg1560tgattttggt tattccaagg tctgacacta aaaaaaaatc caagttcccc ccttgtcgac1620gagatcctct tttgtgattt gttattctct tttttttagt cctctctgct gcactctagg1680cccaaatcaa cagttggaac tccagcatat attgcacctg aggtcctttc tcgaagagaa1740tatgatggca aggtaatcaa gcatcatgca caatgcaatg aacttccata aacccatgag1800tatttatgat attgtcatgc tctttacatt tttacttttg aatttaaaaa gtcatctttg1860tggaagtcgc taagatttga agcatttttt cttctttcag atggctgatg tatggtcttg1920tggtgtgact ctttatgtca tgctggttgg agcataccca tttgaagacc aggaagaccc1980caagaacttc aggaaaacaa tacaagtagg tttctttttt gaagccatgt atctgcatat2040ctcgctttcg ccacatccta ttcgtcaatg tgtgatcttg ttatacagaa aataatggct2100gtccagtaca agatcccgga ctacgtccat atctcacagg attgtaaaaa tctcctttcc2160cgtatatttg tcgccaattc actcaaggta tacatcaatc aactgaacta aatgttttca2220aagatgcctt ttgatttttc tgaacaattg agctacttgt tgtttcgtag aggatcacca2280ttgcagaaat caagaaacat tcatggttcc taaagaattt gccaagggaa ctcacagaga2340cagctcaagc tgcatatttc aagaaagaga acccaacctt ctcccttcag accgttgaag2400agatcatgaa gatagtggct gacgccaaaa caccgcctcc tgtttcccga tccatcggag2460gttttggctg gggaggaaat ggggatgcag atggaaaaga ggaagatgca gaagacgtgg2520aggaggaaga ggaggaggtg gaagaagagg aagacgatga ggatgaatac gataagactg2580taaaggaagt acacgcaagt ggagaagtga gaataagttg atattttggt ttttggtctg2640tgtaagaaag aagtcgtcgt tggtttgttg aaactgaaaa gtctctgttc tcgtgtttgc2700ctttacaatg ctttggctaa ggttttggtt ctggttttgg agatttgtaa aatttgcagt2760ataagatgaa caaacagaga ggttgatgat gagaatgagt cctttgctac gcatggtact2820atgaacattg tgacctccaa taaatatttt tgtaaattag attttatttt ccgaaaagat2880tcatgtattt gatttttgga tttcttattt ttattttttt tcgttcctta tcattttttt2940
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<223>正向引物prm02295<400>4ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatggac aagtacgagc tggt54<210>5<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物prm02296<400>5ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc gacgacttct ttcttacaca g 51<210>6<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>保守性特征序列<220>
<221>混合特征<222>(2)..(2)<223>Xaa可以是Phe或Tyr<220>
<221>混合特征<222>(3)..(3)<223>Xaa可以是Leu、Met或Thr<220>
<221>混合特征<222>(5)..(5)<223>Xaa可以是Asn、Gly或Arg<220>
<221>混合特征<222>(6)..(6)<223>Xaa可以是Leu、Pro或Ile<220>
<221>混合特征<222>(7)..(7)<223>Xaa可以是Pro或Leu<220>
<221>混合特征<222>(8)..(8)<223>Xaa可以是Ala、Gly、Val、Arg、Lys或Ile<220>
<221>混合特征<222>(9)..(9)<223>Xaa可以是Asp、Glu或Val<400>6Trp Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5<210>7<211>1086<212>DNA<213>擬南芥<400>7atggacaagt acgagcttgt taaagacatc ggtgctggga attttggagt ggcgaggctc 60atgagagtca aaaactccaa ggaactcgtt gctatgaagt acatcgagcg tggacctaag 120attgatgaga acgtggcgag agagattatt aaccacagat cacttcgtca tcccaatatt 180atccggttta aggaggtggt tttgacacca acgcacatcg ccattgctat ggaatatgct 240gctggcggtg agctatttga gcgtatatgt agcgctggaa gattcagtga ggatgaggca 300agatactttt tccagcagct tatctcagga gtcagctatt gtcatgctat gcaaatatgc 360cacagagatc tgaagcttga aaataccctc ttagatggaa gtcctgctcc acgcctgaag 420atctgtgatt ttggttattc caagtcctca ctgttgcact ctatgcccaa atcaactgtt 480ggaactccag catatattgc acctgaggtt ctttctcgcg gagagtatga tggcaagatg 540gctgatgtat ggtcttgtgg tgtgactctt tatgtcatgc tggtgggagc atacccattt 600gaagaccaag aggatcccaa aaacttcaaa aaaacaatac aaagaataat ggctgtcaag 660tacaagatcc cggactatgt ccatatctca caagattgca aacatctoct ctcccgtata 720tttgtcacca actcgaataa gaggattacg ataggtgaca tcaagaaaca tccatggttc 780ctaaagaacc tgccaaggga acttacagaa atagctcaag ctgcatactt caggaaagag 840aacccgacat tctcactcca aagcgtcgaa gagataatga agattgtgga agaggcaaaa 900actccagctc gtgtttctcg gtcgattgga gcatttgggt ggggaggagg agaagatgcc 960gagggcaagg aggaagatgc agaggaagaa gttgaggaag tagaagaaga agaagacgaa1020gaagatgagt atgataagac ggtgaagcaa gtgcatgcta gcatgggaga agtccgagtc1080agttaa 1086<210>8<211>361<212>PRT<213>擬南芥<400>8Met Asp Lys Tyr Glu Leu Val Lys Asp Ile Gly Ala Gly Asn Phe Gly1 5 10 15Val Ala Arg Leu Met Arg Val Lys Asn Ser Lys Glu Leu Val Ala Met20 25 30
Lys Tyr Ile Glu Arg Gly Pro Lys Ile Asp Glu Asn Val Ala Arg Glu35 40 45Ile Ile Asn His Arg Ser Leu Arg His Pro Asn Ile Ile Arg Phe Lys50 55 60Glu Val Val Leu Thr Pro Thr His Ile Ala Ile Ala Met Glu Tyr Ala65 70 75 80Ala Gly Gly Glu Leu Phe Glu Arg Ile Cys Ser Ala Gly Arg Phe Ser85 90 95Glu Asp Glu Ala Arg Tyr Phe Phe Gln Gln Leu Ile Ser Gly Val Ser100 105 110Tyr Cys His Ala Met Gln Ile Cys His Arg Asp Leu Lys Leu Glu Asn115 120 125Thr Leu Leu Asp Gly Ser Pro Ala Pro Arg Leu Lys Ile Cys Asp Phe130 135 140Gly Tyr Ser Lys Ser Ser Leu Leu His Ser Met Pro Lys Ser Thr Val145 150 155 160Gly Thr Pro Ala Tyr Ile Ala Pro Glu Val Leu Ser Arg Gly Glu Tyr165 170 175Asp Gly Lys Met Ala Asp Val Trp Ser Cys Gly Val Thr Leu Tyr Val180 185 190Met Leu Val Gly Ala Tyr Pro Phe Glu Asp Gln Glu Asp Pro Lys Asn195 200 205Phe Lys Lys Thr Ile Gln Arg Ile Met Ala Val Lys Tyr Lys Ile Pro210 215 220Asp Tyr Val His Ile Ser Gln Asp Cys Lys His Leu Leu Ser Arg Ile225 230 235 240Phe Val Thr Asn Ser Asn Lys Arg Ile Thr Ile Gly Asp Ile Lys Lys245 250 255His Pro Trp Phe Leu Lys Asn Leu Pro Arg Glu Leu Thr Glu Ile Ala260 265 270Gln Ala Ala Tyr Phe Arg Lys Glu Asn Pro Thr Phe Ser Leu Gln Ser275 280 285Val Glu Glu Ile Met Lys Ile Val Glu Glu Ala Lys Thr Pro Ala Arg290 295 300Val Ser Arg Ser Ile Gly Ala Phe Gly Trp Gly Gly Gly Glu Asp Ala305 310 315 320Glu Gly Lys Glu Glu Asp Ala Glu Glu Glu Val Glu Glu Val Glu Glu325 330 335Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Tyr Asp Lys Thr Val Lys Gln Val His340 345 350
Ala Ser Met Gly Glu Val Arg Val Ser355 360<210>9<211>1083<212>DNA<213>擬南芥<400>9atggacaagt atgaggttgt gaaggatttg ggagctggaa attttggtgt ggctcgtctt 60cttagacaca aagagaccaa agagctcgtt gctatgaaat acattgagag aggtcgcaag 120attgatgaga atgtggcaag agagattatc aatcatagat cacttaggca tcctaatatc 180atcagattca aggaggtgat tctgactcca actcatcttg caattgtaat ggagtatgct 240tctggaggag agctctttga aagaatctgt aatgctggta gattcagtga agctgaggct 300agatacttct ttcagcagct gatttgtggc gtggattact gtcattcact gcaaatatgt 360catagagatt tgaagcttga gaatacactg cttgatggta gtccagcccc gcttttgaaa 420atctgtgatt ttggttactc caagtcatct ctgcttcact ctagacctaa atcaactgtt 480ggtactccag cttatatcgc acctgaagtt ctttcccgaa gagaatatga cggaaagcat 540gcggatgttt ggtcctgtgg tgtgactctt tatgtgatgt tagttggagg ttatccgttt 600gaagacccgg atgatccgag aaacttcagg aaaacaatcc aacgtataat ggctgtccag 660tacaagatcc cggattacgt tcatatatcg caggagtgca gacaccttct ctctcgcata 720tttgtcacta attcagctaa gagaatcaca cttaaagaga tcaagaagca tccatggtac 780ttaaagaact tgccaaagga gcttacagag cctgctcaag cggcgtacta caagagagaa 840accccaagct tttccctcca aagcgtagag gacataatga agatcgttgg agaagccagg 900aatccagctc cgtcttctaa tgccgtcaag ggctttgatg atgatgagga agatgtggag 960gacgaggttg aagaagaaga agaagaagaa gaagaagagg aggaagaaga ggaagaggaa1020gaagatgaat acgagaagca tgttaaagag gcccattctt gtcaagagcc tcccaaagct1080taa 1083<210>10<211>360<212>PRT<213>擬南芥<400>10Met Asp Lys Tyr Glu Val Val Lys Asp Leu Gly Ala Gly Asn Phe Gly1 5 10 15Val Ala Arg Leu Leu Arg His Lys Glu Thr Lys Glu Leu Val Ala Met20 25 30Lys Tyr Ile Glu Arg Gly Arg Lys Ile Asp Glu Asn Val Ala Arg Glu35 40 45Ile Ile Asn His Arg Ser Leu Arg His Pro Asn Ile Ile Arg Phe Lys50 55 60Glu Val Ile Leu Thr Pro Thr His Leu Ala Ile Val Met Glu Tyr Ala65 70 75 80Ser Gly Gly Glu Leu Phe Glu Arg Ile Cys Asn Ala Gly Arg Phe Ser85 90 95Glu Ala Glu Ala Arg Tyr Phe Phe Gln Gln Leu Ile Cys Gly Val Asp100 105 110
Tyr Cys His Ser Leu Gln Ile Cys His Arg Asp Leu Lys Leu Glu Asn115 120 125Thr Leu Leu Asp Gly Ser Pro Ala Pro Leu Leu Lys Ile Cys Asp Phe130 135 140Gly Tyr Ser Lys Ser Ser Leu Leu His Ser Arg Pro Lys Ser Thr Val145 150 155 160Gly Thr Pro Ala Tyr Ile Ala Pro Glu Val Leu Ser Arg Arg Glu Tyr165 170 175Asp Gly Lys His Ala Asp Val Trp Ser Cys Gly Val Thr Leu Tyr Val180 185 190Met Leu Val Gly Gly Tyr Pro Phe Glu Asp Pro Asp Asp Pro Arg Asn195 200 205Phe Arg Lys Thr Ile Gln Arg Ile Met Ala Val Gln Tyr Lys Ile Pro210 215 220Asp Tyr Val His Ile Ser Gln Glu Cys Arg His Leu Leu Ser Arg Ile225 230 235 240Phe Val Thr Asn Ser Ala Lys Arg Ile Thr Leu Lys Glu Ile Lys Lys245 250 255His Pro Trp Tyr Leu Lys Asn Leu Pro Lys Glu Leu Thr Glu Pro Ala260 265 270Gln Ala Ala Tyr Tyr Lys Arg Glu Thr Pro Ser Phe Ser Leu Gln Ser275 280 285Val Glu Asp Ile Met Lys Ile Val Gly Glu Ala Arg Asn Pro Ala Pro290 295 300Ser Ser Asn Ala Val Lys Gly Phe Asp Asp Asp Glu Glu Asp Val Glu305 310 315 320Asp Glu Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu325 330 335Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Tyr Glu Lys His Val Lys Glu Ala His340 345 350Ser Cys Gln Glu Pro Pro Lys Ala355 360<210>11<211>1062<212>DNA<213>擬南芥<400>11atggacaagt atgacgttgt caaggatctg ggagctggaa atttcggtgt ggctcgcctt 60ctcaggcaca aggacaccaa agagcttgtt gccatgaaat acatcgagag aggtcgcaag 120atagatgaga acgtggcgag agagattatt aatcacagat cacttaaaca tcctaatatc 180atccggttca aggaggtgat cctgacacct actcatcttg ctattgtgat ggagtatgct 240tctggaggag agctctttga tcgaatctgt actgccggta gatttagtga agctgaggct 300
aggtacttct ttcaacagct gatttgtggt gttgattact gccattcctt gcaaatatgt 360catagagacc tgaagcttga gaacacactg ctcgatggga gccctgctcc gcttttgaaa 420atctgtgatt ttggttactc taagtcatct atactacatt ctaggcctaa atcaactgtt 480ggaactccag cttacatagc acctgaagtt ctttcacgga gagaatatga tggcaagcac 540gcggatgtgt ggtcatgtgg agtaaccctt tatgtgatgc tggtgggagc ttacccgttt 600gaggacccta atgatccaaa aaacttcagg aaaacaatcc agcgcataat ggctgtacaa 660tacaagatcc cggactatgt tcacatatct caggaatgca aacatcttct ctctcgcata 720ttcgtcacta actctgctaa gagaatcaca cttaaggaga tcaagaatca tccgtggtac 780ttgaagaatt tgccaaagga gctgctagag tcggctcaag cggcgtatta caagagagac 840acaagcttct ctcttcaaag cgtagaggac ataatgaaga tagttggaga agcaaggaat 900ccagctccat caactagtgc tgtcaaaagc tcgggctcag gagctgatga agaagaggaa 960gaggacgttg aagctgaagt ggaagaggaa gaagatgatg aagacgaata cgagaagcat1020gtcaaagagg cacagtcttg tcaagagtct gacaaagctt aa 1062<210>12<211>353<212>PRT<213>擬南芥<400>12Met Asp Lys Tyr Asp Val Val Lys Asp Leu Gly Ala Gly Asn Phe Gly1 5 10 15Val Ala Arg Leu Leu Arg His Lys Asp Thr Lys Glu Leu Val Ala Met20 25 30Lys Tyr Ile Glu Arg Gly Arg Lys Ile Asp Glu Asn Val Ala Arg Glu35 40 45Ile Ile Asn His Arg Ser Leu Lys His Pro Asn Ile Ile Arg Phe Lys50 55 60Glu Val Ile Leu Thr Pro Thr His Leu Ala Ile Val Met Glu Tyr Ala65 70 75 80Ser Gly Gly Glu Leu Phe Asp Arg Ile Cys Thr Ala Gly Arg Phe Ser85 90 95Glu Ala Glu Ala Arg Tyr Phe Phe Gln Gln Leu Ile Cys Gly Val Asp100 105 110Tyr Cys His Ser Leu Gln Ile Cys His Arg Asp Leu Lys Leu Glu Asn115 120 125Thr Leu Leu Asp Gly Ser Pro Ala Pro Leu Leu Lys Ile Cys Asp Phe130 135 140Gly Tyr Ser Lys Ser Ser Ile Leu His Ser Arg Pro Lys Ser Thr Val145 150 155 160Gly Thr Pro Ala Tyr Ile Ala Pro Glu Val Leu Ser Arg Arg Glu Tyr165 170 175Asp Gly Lys His Ala Asp Val Trp Ser Cys Gly Val Thr Leu Tyr Val180 185 190Met Leu Val Gly Ala Tyr Pro Phe Glu Asp Pro Asn Asp Pro Lys Asn195 200 205
Phe Arg Lys Thr Ile Gln Arg Ile Met Ala Val Gln Tyr Lys Ile Pro210 215 220Asp Tyr Val His Ile Ser Gln Glu Cys Lys His Leu Leu Ser Arg Ile225 230 235 240Phe Val Thr Asn Ser Ala Lys Arg Ile Thr Leu Lys Glu Ile Lys Asn245 250 255His Pro Trp Tyr Leu Lys Asn Leu Pro Lys Glu Leu Leu Glu Ser Ala260 265 270Gln Ala Ala Tyr Tyr Lys Arg Asp Thr Ser Phe Ser Leu Gln Ser Val275 280 285Glu Asp Ile Met Lys Ile Val Gly Glu Ala Arg Asn Pro Ala Pro Ser290 295 300Thr Ser Ala Val Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ala Asp Glu Glu Glu Glu305 310 315 320Glu Asp Val Glu Ala Glu Val Glu Glu Glu Glu Asp Asp Glu Asp Glu325 330 335Tyr Glu Lys His Val Lys Glu Ala Gln Ser Cys Gln Glu Ser Asp Lys340 345 350Ala<210>13<211>1089<212>DNA<2l3>擬南芥<400>13atggatcgac cagcagtgag tggtccaatg gatttgccga ttatgcacga tagtgatagg 60tatgaactcg tcaaggatat tggctccggt aattttggag ttgcgagatt gatgagagac 120aagcaaagta atgagcttgt tgctgttaaa tatatcgaga gaggtgagaa gatagatgaa 180aatgtaaaaa gggagataat caaccacagg tccttaagac atcccaatat cgttagattc 240aaagaggtta tattaacacc aacccattta gccattgtta tggaatatgc atctggagga 300gaacttttcg agcgaatctg caatgcaggc cgcttcagcg aagacgaggc gaggtttttc 360ttccagcaac tcatttcagg agttagttac tgtcatgcta tgcaagtatg tcaccgagac 420ttaaagctcg agaatacgtt attagatggt agcccggccc ctcgtctaaa gatatgtgat 480ttcggatatt ctaagtcatc agtgttacat tcgcaaccaa aatcaactgt tggaactcct 540gcttacatcg ctcctgaggt tttactaaag aaagaatatg atggaaaggt tgcagatgtt 600tggtcttgtg gggttactct gtatgtcatg ctggttggag catatccttt cgaagatccc 660gaggaaccaa agaatttcag gaaaactata catagaatcc tgaatgttca gtatgctatt 720ccggattatg ttcacatatc tcctgaatgt cgccatttga tctccagaat atttgttgct 780gaccctgcaa agaggatatc aattcctgaa ataaggaacc atgaatggtt tctaaagaat 840ctaccggcag atctaatgaa cgataacacg atgaccactc agtttgatga atcggatcaa 900ccgggccaaa gcatagaaga aattatgcag atcattgcag aagcaactgt tcctcctgca 960ggcactcaga atctgaacca ttacctcaca ggaagcttgg acatagatga cgatatggag1020gaagacttag agagcgacct tgatgatctt gacatcgaca gtagcggaga gattgtgtac1080gcaatgtga1089<210>14<211>362<212>PRT
<213>擬南芥<400>14Met Asp Arg pro Ala Val Ser Gly Pro Met Asp Leu Pro Ile Met His1 5 10 15Asp Ser Asp Arg Tyr Glu Leu Val Lys Asp Ile Gly Ser Gly Asn Phe20 25 30Gly Val Ala Arg Leu Met Arg Asp Lys Gln Ser Asn Glu Leu Val Ala35 40 45Val Lys Tyr Ile Glu Arg Gly Glu Lys Ile Asp Glu Asn Val Lys Arg50 55 60Glu Ile Ile Asn His Arg Ser Leu Arg His Pro Asn Ile Val Arg Phe65 70 75 80Lys Glu Val Ile Leu Thr Pro Thr His Leu Ala Ile Val Met Glu Tyr85 90 95Ala Ser Gly Gly Glu Leu Phe Glu Arg Ile Cys Asn Ala Gly Arg Phe100 105 110Ser Glu Asp Glu Ala Arg Phe Phe Phe Gln Gln Leu Ile Ser Gly Val115 120 125Ser Tyr Cys His Ala Met Gln Val Cys His Arg Asp Leu Lys Leu Glu130 135 140Asn Thr Leu Leu Asp Gly Ser Pro Ala pro Arg Leu Lys Ile Cys Asp145 150 155 160Phe Gly Tyr Ser Lys Ser Ser Val Leu His Ser Gln Pro Lys Ser Thr165 170 175Val Gly Thr Pro Ala Tyr Ile Ala Pro Glu Val Leu Leu Lys Lys Glu180 185 190Tyr Asp Gly Lys Val Ala Asp Val Trp Ser Cys Gly Val Thr Leu Tyr195 200 205Val Met Leu Val Gly Ala Tyr Pro Phe Glu Asp Pro Glu Glu Pro Lys210 215 220Asn Phe Arg Lys Thr Ile His Arg Ile Leu Asn Val Gln Tyr Ala Ile225 230 235 240Pro Asp Tyr Val His Ile Ser Pro Glu Cys Arg His Leu Ile Ser Arg245 250 255Ile Phe Val Ala Asp Pro Ala Lys Arg Ile Ser Ile Pro Glu Ile Arg260 265 270Asn His Glu Trp Phe Leu Lys Asn Leu Pro Ala Asp Leu Met Asn Asp275 280 285Asn Thr Met Thr Thr Gln Phe Asp Glu Ser Asp Gln Pro Gly Gln Ser290 295 300
Ile Glu Glu Ile Met Gln Ile Ile Ala Glu Ala Thr Val Pro Pro Ala305 310 315 320Gly Thr Gln Asn Leu Asn His Tyr Leu Thr Gly Ser Leu Asp Ile Asp325 330 335Asp Asp Met Glu Glu Asp Leu Glu Ser Asp Leu Asp Asp Leu Asp Ile340 345 350Asp Ser Ser Gly Glu Ile Val Tyr Ala Met355 360<210>15<211>1020<212>DNA<213>擬南芥<400>15atggagaagt atgagatggt gaaggattta ggatttggta atttcggatt ggctcggctt 60atgcgtaata agcaaacaaa cgagcttgtg gctgtcaaat tcatcgatcg aggctacaag 120atagatgaga acgttgcaag agaaataatc aatcatagag ctctcaacca tccgaatatt 180gttcggttta aagaggttgt tttaactccg acacatcttg gaatagtaat ggagtatgca 240gctggaggag aactgttcga gcggatatct agcgtgggtc gatttagcga agctgaggca 300agatatttct ttcaacaact catttgtgga gtccattact tacatgcatt gcaaatatgc 360catagagatc tgaaattaga aaacacattg cttgatggaa gcccagcacc acgtttaaaa 420atttgtgatt ttggctactc aaagtcttct gttctgcact ccaacccaaa atcaacggtg 480ggaactccgg catatatagc accggaagtt ttttgtcgat cggaatacga cggaaagtca 540gttgatgtgt ggtcttgtgg agtggccctc tatgttatgt tggtaggagc ttatccattc 600gaagacccta aagaccctcg caatttccga aaaactgttc agaaaataat ggccgtaaac 660tacaagattc caggatatgt tcacatatcc gaagactgca gaaagttact atctcgtata 720tttgttgcca atccgttaca tagaagtacg cttaaagaga ttaagagtca tgcatggttc 780ctaaagaatt tgccaagaga attaaaggag ccagcacaag caatctatta ccaaaggaat 840gttaatctta ttaatttttc tcctcaaaga gtagaggaga ttatgaagat agttggtgag 900gcaagaacca ttccaaacct ttctcgcccg gtcgaatcgc ttggatcaga taaaaaagat 960gatgatgaag aagaatattt ggatgctaat gatgaagaat ggtatgatga ttacgcatag1020<210>16<211>339<212>PRT<213>擬南芥<400>16Met Glu Lys Tyr Glu Met Val Lys Asp Leu Gly Phe Gly Asn Phe Gly1 5 10 15Leu Ala Arg Leu Met Arg Asn Lys Gln Thr Asn Glu Leu Val Ala Val20 25 30Lys Phe Ile Asp Arg Gly Tyr Lys Ile Asp Glu Asn Val Ala Arg Glu35 40 45Ile Ile Asn His Arg Ala Leu Asn His Pro Asn Ile Val Arg Phe Lys50 55 60Glu Val Val Leu Thr Pro Thr His Leu Gly Ile Val Met Glu Tyr Ala65 70 75 80
Ala Gly Gly Glu Leu Phe Glu Arg Ile Ser Ser Val Gly Arg Phe Ser85 90 95Glu Ala Glu Ala Arg Tyr Phe Phe Gln Gln Leu Ile Cys Gly Val His100 105 110Tyr Leu His Ala Leu Gln Ile Cys His Arg Asp Leu Lys Leu Glu Asn115 120 125Thr Leu Leu Asp Gly Ser pro Ala Pro Arg Leu Lys Ile Cys Asp Phe130 135 140Gly Tyr Ser Lys Ser Ser Val Leu His Ser Asn Pro Lys Ser Thr Val145 150 155 160Gly Thr Pro Ala Tyr Ile Ala Pro Glu Val Phe Cys Arg Ser Glu Tyr165 170 175Asp Gly Lys Ser Val Asp Val Trp Ser Cys Gly Val Ala Leu Tyr Val180 185 190Met Leu Val Gly Ala Tyr Pro Phe Glu Asp Pro Lys Asp Pro Arg Asn195 200 205phe Arg Lys Thr Val Gln Lys Ile Met Ala Val Asn Tyr Lys Ile Pro210 215 220Gly Tyr Val His Ile Ser Glu Asp Cys Arg Lys Leu Leu Ser Arg Ile225 230 235 240Phe Val Ala Asn Pro Leu His Arg Ser Thr Leu Lys Glu Ile Lys Ser245 250 255His Ala Trp Phe Leu Lys Asn Leu Pro Arg Glu Leu Lys Glu Pro Ala260 265 270Gln Ala Ile Tyr Tyr Gln Arg Asn Val Asn Leu Ile Asn Phe Ser Pro275 280 285Gln Arg Val Glu Glu Ile Met Lys Ile Val Gly Glu Ala Arg Thr Ile290 295 300Pro Asn Leu Ser Arg Pro Val Glu Ser Leu Gly Ser Asp Lys Lys Asp305 310 315 320Asp Asp Glu Glu Glu Tyr Leu Asp Ala Asn Asp Glu Glu Trp Tyr Asp325 330 335Asp Tyr Ala<210>17<211>1086<212>DNA<213>擬南芥<400>17atggatcgag ctccggtgac cacaggaccg ttggatatgc cgattatgca cgacagtgat 60cgatatgact tcgttaagga tattggttct ggtaatttcg gtgttgctcg tcttatgaga 120
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Glu Asp Glu Tyr Glu Lys Gln Val Lys Gln Ala His Glu Ser Gly Glu340 345 350Val Arg Leu Thr355<210>55<211>2193<212>DNA<213>稻<400>55aatccgaaaa gtttctgcac cgttttcacc ccctaactaa caatataggg aacgtgtgct 60aaatataaaa tgagacctta tatatgtagc gctgataact agaactatgc aagaaaaact 120catccaccta ctttagtggc aatcgggcta aataaaaaag agtcgctaca ctagtttcgt 180tttccttagt aattaagtgg gaaaatgaaa tcattattgc ttagaatata cgttcacatc 240tctgtcatga agttaaatta ttcgaggtag ccataattgt catcaaactc ttcttgaata 300aaaaaatctt tctagctgaa ctcaatgggt aaagagagag atttttttta aaaaaataga 360atgaagatat tctgaacgta ttggcaaaga tttaaacata taattatata attttatagt 420ttgtgcattc gtcatatcgc acatcattaa ggacatgtct tactccatcc caatttttat 480ttagtaatta aagacaattg acttattttt attatttatc ttttttcgat tagatgcaag 540gtacttacgc acacactttg tgctcatgtg catgtgtgag tgcacctcct caatacacgt 600tcaactagca acacatctct aatatcactc gcctatttaa tacatttagg tagcaatatc 660tgaattcaag cactccacca tcaccagacc acttttaata atatctaaaa tacaaaaaat 720aattttacag aatagcatga aaagtatgaa acgaactatt taggtttttc acatacaaaa 780aaaaaaagaa ttttgctcgt gcgcgagcgc caatctccca tattgggcac acaggcaaca 840acagagtggc tgcccacaga acaacccaca aaaaacgatg atctaacgga ggacagcaag 900tccgcaacaa ccttttaaca gcaggctttg cggccaggag agaggaggag aggcaaagaa 960aaccaagcat cctcctcctc ccatctataa attcctcccc ccttttcccc tctctatata1020ggaggcatcc aagccaagaa gagggagagc accaaggaca cgcgactagc agaagccgag1080cgaccgcctt cttcgatcca tatcttccgg tcgagttctt ggtcgatctc ttccctcctc1140cacctcctcc tcacagggta tgtgcccttc ggttgttctt ggatttattg ttctaggttg1200tgtagtacgg gcgttgatgt taggaaaggg gatctgtatc tgtgatgatt cctgttcttg1260gatttgggat agaggggttc ttgatgttgc atgttatcgg ttcggtttga ttagtagtat1320ggttttcaat cgtctggaga gctctatgga aatgaaatgg tttagggtac ggaatcttgc1380gattttgtga gtaccttttg tttgaggtaa aatcagagca ccggtgattt tgcttggtgt1440aataaaagta cggttgtttg gtcctcgatt ctggtagtga tgcttctcga tttgacgaag1500ctatcctttg tttattccct attgaacaaa aataatccaa ctttgaagac ggtcccgttg1560atgagattga atgattgatt cttaagcctg tccaaaattt cgcagctggc ttgtttagat1620acagtagtcc ccatcacgaa attcatggaa acagttataa tcctcaggaa caggggattc1680cctgttcttc cgatttgctt tagtcccaga attttttttc ccaaatatct taaaaagtca1740ctttctggtt cagttcaatg aattgattgc tacaaataat gcttttatag cgttatccta1800gctgtagttc agttaatagg taatacccct atagtttagt caggagaaga acttatccga1860tttctgatct ccatttttaa ttatatgaaa tgaactgtag cataagcagt attcatttgg1920attatttttt ttattagctc tcaccccttc attattctga gctgaaagtc tggcatgaac1980t9tcctcaat tttgttttca aattcacatc gattatctat gcattatcct cttgtatcta2040cctgtagaag tttctttttg gttattcctt gactgcttga ttacagaaag aaatttatga2100agctgtaatc gggatagtta tactgcttgt tcttatgatt catttccttt gtgcagttct2160tggtgtagct tgccactttc accagcaaag ttc 219權(quán)利要求
1.相對于對應(yīng)的野生型植物，改良植物生長特性的方法，其包括增加SnRK2多肽或其同源物的活性，和/或通過增加SnRK2編碼核酸分子的表達(dá)，以及任選選擇具有改良生長特性的植物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述增加活性和/或增加表達(dá)通過優(yōu)選在SnRK2多肽或其同源物的編碼基因的基因座中引入遺傳修飾來實現(xiàn)。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述遺傳修飾通過定點(diǎn)誘變、同源重組、TILLING、定向進(jìn)化和T-DNA激活中的一種來實現(xiàn)。
4.相對于對應(yīng)的野生型植物，改良植物生長特性的方法，其包括在植物中引入和表達(dá)SnRK2核酸分子或其功能性變體。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述功能性變體是部分SnRK2核酸分子或能夠與SnRK2核酸分子雜交的序列，其中所述功能性變體包含激酶結(jié)構(gòu)域、SEQ ID NO6的保守性序列特征以及酸性C端結(jié)構(gòu)域。
6.權(quán)利要求4或5的方法，其中所述SnRK2核酸分子或其功能性變體在植物中過量表達(dá)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4到6中任一項的方法，其中所述SnRK2核酸分子或其功能性變體是植物來源的，優(yōu)選來自雙子葉植物，進(jìn)一步優(yōu)選來自十字花科，所述核酸更優(yōu)選來自擬南芥。
8.根據(jù)權(quán)利要求4到7中任一項的方法，其中所述功能性變體編碼SnRK2的直系同源物或旁系同源物。
9.根據(jù)權(quán)利要求4到8中任一項的方法，其中所述SnRK2核酸分子或其功能性變體與組成型啟動子有效連接。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述組成型啟動子是GOS2啟動子。
11.根據(jù)權(quán)利要求1到10中任一項的方法，其中所述改良的植物生長特性是增加的產(chǎn)量。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述增加的產(chǎn)量是增加的生物量和/或增加的種子產(chǎn)量。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述增加的種子產(chǎn)量選自(i)增加的種子生物量；(ii)增加的(飽滿)種子數(shù)；(iii)增加的種子尺寸；(iv)增加的種子體積；(v)增加的收獲指數(shù)(HI)；以及(vi)增加的千粒重(TKW)中的任一項或多項。
14.根據(jù)權(quán)利要求1到13中任一項的方法獲得的植物或植物細(xì)胞。
15.構(gòu)建體，其包括(i)SnRK2核酸分子或其功能性變體；(ii)能夠驅(qū)動(i)中核酸序列表達(dá)的一個或多個調(diào)控序列；及任選的(iii)轉(zhuǎn)錄終止序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的構(gòu)建體，其中所述調(diào)控序列是組成型啟動子。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的構(gòu)建體，其中所述組成型啟動子是GOS2啟動子。
18.根據(jù)權(quán)利要求15到17中任一項的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞。
19.制備具有改良生長特性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括(i)向植物中引入SnRK2核酸分子或其功能性變體；(ii)在促進(jìn)植物生長和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞。
20.相對于對應(yīng)的野生型植物，具有改良生長特性的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，所述改良生長特性由引入所述植物或植物細(xì)胞中的SnRK2核酸分子或其功能性變體產(chǎn)生，或由優(yōu)選在SnRK2多肽或其同源物的編碼基因的基因座中的遺傳修飾產(chǎn)生。
21.根據(jù)權(quán)利要求14、18或20的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，其中所述植物是單子葉植物，如甘蔗，或其中植物是谷類，如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、燕麥或高粱；或其中所述植物細(xì)胞來自單子葉植物，如甘蔗，或其中所述植物細(xì)胞來自谷類，如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、燕麥或高粱。
22.根據(jù)權(quán)利要求14、18、20或21中任一項的植物的可收獲部分，和/或直接來自其的產(chǎn)物。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的可收獲部分，其中所述可收獲部分是種子。
24.SnRK2核酸分子或其功能性變體的用途，或者SnRK2多肽或其同源物的用途，其用于改良植物的生長特性，特別是改良產(chǎn)量，尤其是改良生物量和/或種子產(chǎn)量。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的用途，其中所述改良的種子產(chǎn)量至少包括增加的千粒重。
26.SnRK2核酸分子或其功能性變體作為分子標(biāo)記的用途。
27.用于改良植物的生長特性，優(yōu)選用作生長調(diào)節(jié)劑的組合物，其包含SnRK2核酸分子或其功能性變體。
28.用于改良植物的生長特性，優(yōu)選用作生長調(diào)節(jié)劑的組合物，其包含SnRK2蛋白質(zhì)或其同源物。
全文摘要
本發(fā)明涉及改良植物生長特性的方法，其通過增加植物中SnRK2激酶或其同源物的活性和/或表達(dá)來實現(xiàn)。此類方法之一包括將SnRK2核酸分子或其功能性變體引入植物。本發(fā)明還涉及具有改良生長特性的轉(zhuǎn)基因植物，該植物具有調(diào)節(jié)的SnRK2激酶編碼核酸的表達(dá)。本發(fā)明還涉及可用于本發(fā)明方法中的構(gòu)建體。
文檔編號C12N15/82GK101018865SQ200580030860
公開日2007年8月15日 申請日期2005年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月16日
發(fā)明者V·弗蘭卡德, V·米羅諾夫 申請人:克羅普迪塞恩股份有限公司