專利名稱：：具有改良生長(zhǎng)特性的植物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，并且涉及改良植物生長(zhǎng)特性的方法。更具體的，本發(fā)明涉及通過調(diào)節(jié)編碼A型細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶(CDKA)的植物核酸在植物中的表達(dá)和/或通過調(diào)節(jié)植物CDKA蛋白質(zhì)在植物中的活性來改良植物生長(zhǎng)特性的方法，所述CDKA蛋白質(zhì)包含T161D型突變或所述a)X4核酸編碼這類蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及具有植物CDJL4核酸受調(diào)節(jié)的表達(dá)和/或植物CDKA蛋白質(zhì)受調(diào)節(jié)的活性的植物，所述CDKA蛋白質(zhì)包含T161D型突變或所述核酸編碼這類蛋白質(zhì)并且該植物相對(duì)于相應(yīng)的野生型植物具有改良的生長(zhǎng)特性.本發(fā)明還提供了帶有PSTAIRE基序和T161D型突變的植物CDK，以及編碼這類蛋白質(zhì)的核酸。
背景技術(shù)：
：不斷增加的世界人口和提供的可耕種農(nóng)田面積的縮小促使研究以增加農(nóng)業(yè)效率為方向。作物和園藝改良的常規(guī)手段利用選育技術(shù)來鑒定具有期望特性的植物.然而，這種選育技術(shù)具有若千缺點(diǎn)，即這些技術(shù)一狄勞動(dòng)密集型的，而且產(chǎn)生通常含有異質(zhì)遺傳成分的植物，其并非總是產(chǎn)生自親^險(xiǎn)物傳遞過來的期望性狀。分子生物學(xué)的(艮已經(jīng)允許人類操作動(dòng)物和植物的種質(zhì).植物的遺傳工程需要分離和操作遺傳物質(zhì)(一fclLDNA或RNA的形式)，隨后把該遺傳物質(zhì)引入到植物中。此種技術(shù)能夠使作物或植物具有多種改良的經(jīng)濟(jì)、農(nóng)藝或園藝性狀.具體的經(jīng)濟(jì)利益的性狀是產(chǎn)量。產(chǎn)量通常定義為作物產(chǎn)生的可衡量經(jīng)濟(jì)價(jià)值。這可以從數(shù)量和/或質(zhì)量方面定義。作物產(chǎn)量受到植物或作物所經(jīng)受的特定脅迫的影響.這些脅迫包括環(huán)境(非生物)脅迫(例如反常的高溫或低溫引起的溫度脅迫；營(yíng)養(yǎng)缺陷引起的脅迫；缺水(干旱)引起的脅迫)和生物脅迫(其可由其它植物(種子)、害蟲和病原體引^^)。不僅可以通過抗擊作物或植物所經(jīng)受的一種或多種脅迫增加作物產(chǎn)量，還可以通過調(diào)節(jié)植物固有生長(zhǎng)機(jī)制來增加作物產(chǎn)量。植物的固有生長(zhǎng)機(jī)制以高度有序的事件順序存在，總稱為"細(xì)胞周期"。影響植物細(xì)胞周期(使用重組DNA技術(shù)或使用非重組手段)并且由此調(diào)節(jié)植物的多種生長(zhǎng)特性的能力將在例如增強(qiáng)作物、植物育種、產(chǎn)生觀賞植物、樹木培植、園藝學(xué)、林學(xué)、藻類或植物的產(chǎn)生領(lǐng)域中具有多種應(yīng)用(例如用作產(chǎn)生例如藥物、抗體或疫苗物質(zhì)的生物^^應(yīng)器，或用于有機(jī)廢物的生物轉(zhuǎn)化的生物反應(yīng)器或在高產(chǎn)量藻類和植物情況下用作燃料)。至關(guān)重要。細(xì)胞周期的主要組分在酵母、哺乳動(dòng)物和植物中高度保守。細(xì)胞周期通常被劃分為下列順序的時(shí)期G0-G1-S-G2-M。DNA復(fù)制或合成通常發(fā)生在S期("S"指DNA合成)，在M期發(fā)生染色體的有絲分離("M"指有絲分裂)，以及介于其間的間期G1(DNA復(fù)制之前，此期間內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng))和G2(DNA復(fù)制之后的時(shí)期，此期間內(nèi)細(xì)胞為分裂做準(zhǔn)備)。在M期的最后步驟，胞質(zhì)分裂之后完成細(xì)胞分裂。已經(jīng)退出細(xì)胞周期并且成為休眠的細(xì)胞稱為處于GO期。可以刺激這一期間的細(xì)胞在Gl期i^X細(xì)胞周期。在G1、G2和G0中的"G"代表"間期"。細(xì)胞周期進(jìn)程的完成使每個(gè)子細(xì)胞在細(xì)胞分裂期間接受親本基因組的完整拷貝。細(xì)胞分裂由兩個(gè)主要的細(xì)胞周期事件控制，即DNA合成的起始和有絲分裂的起始。這些關(guān)鍵事件的每一轉(zhuǎn)換是由特定蛋白質(zhì)復(fù)合物(涉及DNA復(fù)制和分裂)所^的限制點(diǎn)控制。在Gl/S邊界DNA合成需要的基因的表達(dá)由哺乳動(dòng)物和植物細(xì)胞中E2F家族轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)(WO96/25494;Muller等人，GenesandDevelopment15，267-285，2001;DeVeylder等人，EMBOJ.21，13602-1368，2002)。通過E2F/Rb復(fù)合體整合信號(hào)并激活細(xì)胞周期基因的轉(zhuǎn)錄從而調(diào)節(jié)/引發(fā)進(jìn)入細(xì)胞周期。由不同的異源二聚體絲氨酸此的細(xì)胞周期進(jìn)程，通常稱上述異源二聚體絲氨^/蘇氨酸蛋白激酶為細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶(CDK)。激活這些激酶的先決條件是與特定細(xì)胞周期蛋白的物理締合，激活時(shí)^M艮大程度上依賴于細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)。細(xì)胞周期蛋白結(jié)合誘導(dǎo)締合的CDK的N端葉片(lobe)發(fā)生構(gòu)象改變并且有助于復(fù)合體的定位和底物特異性。當(dāng)與細(xì)胞周期蛋白締合時(shí)，單體CDK被激活并由此具有激酶活性。細(xì)胞周期蛋白水平在細(xì)胞周期中波動(dòng)而因此M確定CDK激活時(shí)機(jī)的主要因子。在細(xì)胞周期中含有細(xì)胞周期蛋白和CDK的這些復(fù)合體的周期性激活介導(dǎo)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換(限制點(diǎn))的時(shí)間性調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)CDK活性的其它因子包括CDK抑制劑(CKI或ICK、KIP、CIP、INK)、CDK激活激酶(CAK)、CDK磷酸酶(Cdc25)和CDK亞基(CKS)(Mironov等人，PlantCell11，509-522，1999;Reed，S.I.ProgressinCellCycleResearch2，5-27，1996).在植物中，目前已經(jīng)研究的兩種主要類型的CDK被稱為A型和B型CDK。A型CDK調(diào)節(jié)Gl-至-S和G2-至-M的轉(zhuǎn)換，而B型CDK似乎僅控制G2-至-M限制點(diǎn)(Hemerly等人，1995;Magyar等人，1997;Porceddu等人，2001).此外，已報(bào)道存在C型CDK和CDK激活激酶(CAK)(Magyar等人，1997;Umeda等人，1998;Joules等人，2001)，同樣存在D型、E型和F型CDK(Vandepoele等人，PlantCell14，卯3-916，2002),已知A型CDK具有保守的三級(jí)結(jié)構(gòu)(Goldsmith和Cobb，Curr.Opin.Struct.Biol.4，833-840),包括與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合有關(guān)的高度保守的PSTAIRE^^序。CDK的催化核心由N端葉片和C端葉片組成。C端葉片包含一個(gè)催化裂(負(fù)責(zé)ATP和底物結(jié)合)并且還包括在許多激酶家族中保守的蘇氨酸殘基之后命名的，所謂的T環(huán).在人CDK2中，這一蘇氨酸^在位置161,而在S良酒酵母(5^cc/ww附;;cescewv^ae)cdc28中以;S^粟酒裂殖酵母(5^似加柳cc/rflw挑j^es;ioiii6e)cdc2中，其分別位于位置169和167。據(jù)報(bào)道，該蘇氨酸殘基的磷酸化引起T環(huán)中結(jié)構(gòu)構(gòu)象改變，其為激酶轉(zhuǎn)換為活性狀態(tài)所必需的(Gu等人EMBOJ.11，3995-4005)。許多研究描述了T環(huán)中保守蘇氨酸的突變(Ducommun等人，EMBOJ.10，3311-3319，1991;Gould等人，EMBOJ.10，3297-3309;Marcote等人，Mol.Cell.Biol.13，5122-5131，1993;Ducommun等人，MolCell.Biol.11，6177-6184，1991;，18869-18874，1997;Martinez等人，EMBOJ.16，343-354,1997;Gould等人，Mol.Gen.Genet.259,437-448，1998;Booher等人，Mol.Cell.Biol.6，3523-3530,1986;Solomon等人，Mol.Biol.Cell3，13-27，1992;Lim等人，Mol.Cell.Biol.16，4573-4583，1996)，所有檢測(cè)的突變顯示出對(duì)配體的結(jié)合(例如細(xì)胞周期蛋白或Sucl/ICK)和/或激酶活性具有嚴(yán)重影響，在酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生缺陷或致死表型.盡管T169E突變(根據(jù)酵母cdc28的編號(hào))及其相似物T169D突變模擬磷酸化，已證明帶有這樣突變的CDK都不能完全補(bǔ)償酵母.在A型CDK蛋白質(zhì)活性中具有重要作用的其它殘基是位置14的蘇氨酸和位置15的酪氨酸.一^a磷酸化這些氨基酸的至少一個(gè)，CDK失去活性。WO99/54489描述了使用分別由丙氨酸和苯丙氨酸取代蘇氨酸14和酪氨酸15的CDK以增加植物對(duì)鹽脅迫的耐受性.WO00/52171描述了調(diào)節(jié)一個(gè)或多個(gè)植物細(xì)胞周期蛋白介導(dǎo)的形態(tài)、生化和生理特性或特征的方法，其包括在植物中表達(dá)Cdc25磷蛋白磷酸酶。目前已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)包含T161D型突變的A型細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶(CDKA)在植物中的表達(dá)使植物具有改良的生長(zhǎng)特性。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供相對(duì)于相應(yīng)的野生型植物改良植物生長(zhǎng)特性的方法，其包括調(diào)節(jié)具有T161D型突變的A型CDK在植物中的活性和/或調(diào)節(jié)編碼這類A型CDK的核酸的表達(dá)，和任選地選擇具有改良的生長(zhǎng)特性的植物。有利的，實(shí)施本發(fā)明的方法得到了相對(duì)于相應(yīng)的野生型植物具有多種改良的生長(zhǎng)特性的植物，并且該改良的生長(zhǎng)特性至少包括相對(duì)于相應(yīng)的野生型植物增加的產(chǎn)量。本文所定義的術(shù)語"增加的產(chǎn)量"意指分別相對(duì)于相應(yīng)的野生型植物，如下任一項(xiàng)或多項(xiàng)中的增加(i)植物的一個(gè)或多個(gè)部分增加的生物量(重量)，特別是地上(可收獲)部分、增加的根生物量或任何其他可收獲部分增加的生物量；(ii)增加的種子總產(chǎn)量，其包括種子生物量(種子重量)的增加而其可以是每林植物或單個(gè)種子基礎(chǔ)上種子重量的增加；(iii)每個(gè)圓錐花序增加的花("小花")數(shù)量；(iv)增加的(飽滿)種子數(shù)；(v)增加的種子大小，其也可能影響種子的組成；(vi)增加的種子體積，其也可能影響種子的組成(包括油、蛋白質(zhì)和碳7jc化合物總含量和組成)；(vii)增加的單個(gè)種子面積；(viii)增加的單個(gè)種子長(zhǎng)度和/或?qū)挾龋?ix)增加的收獲指數(shù)，其表示為可收獲部分如種子的產(chǎn)量與總生物量的比例；以及(x)增加的千粒重(TKW)，其從所計(jì)的飽滿種子數(shù)和它們的總重量推論出來。增加的TKW可產(chǎn)生自增加的種子大小和/或種子重量。增加的TKW可產(chǎn)生自胚胎大小和/或胚乳大小的增加。以谷類為例，產(chǎn)量增加可以表現(xiàn)為下列一種或多種每/>項(xiàng)或英畝植物數(shù)量增加、每林植物穗數(shù)量的增加、畦數(shù)、每畦種子數(shù)、粒重、TKW、穗的長(zhǎng)JL/直徑的增加等。以稻為例，產(chǎn)量增加可以表現(xiàn)為下列一種或多種的增加每公項(xiàng)或英畝植物數(shù)量、每^M1物的圓錐花序數(shù)量、每個(gè)圃錐花序的小穗數(shù)量、每個(gè)圓錐花序花的數(shù)量，種子飽滿率的增加((以％)表示為飽滿種子數(shù)對(duì)小花數(shù)(種子總數(shù))的比例)、TKW的增加等。產(chǎn)量增加還可產(chǎn)生改變的構(gòu)造或可以作為改變構(gòu)造的結(jié)果發(fā)生。優(yōu)選的，實(shí)施本發(fā)明的方法使植物具有增加的產(chǎn)量，更具體的，具有增加的生物量和/或增加的種子產(chǎn)量，優(yōu)選的，增加的種子產(chǎn)量包括分別相對(duì)于對(duì)照植物在下列一種或多種中的增加(飽滿)種子數(shù)、種子總重量、種子大小、種子體積、千粒重和收獲指數(shù)。因此，本發(fā)明提供了相對(duì)于相應(yīng)的對(duì)照植物增加植物產(chǎn)量的方法，該方法包括調(diào)節(jié)CDK或其同源物在植物中的活性，所述CDK或其同源物具有PSTAIRE基序和T161D型突變，和/或調(diào)節(jié)編碼這類CDKA或其同源物的核酸的表達(dá).由于根據(jù)本發(fā)明的改良植物具有增加的產(chǎn)量，因此，相對(duì)于在其生命周期對(duì)應(yīng)階段的相應(yīng)野生型植物的生長(zhǎng)速度，這些植物很可能表現(xiàn)出增加的生長(zhǎng)速度(至少在其部分的生命周期中)。生長(zhǎng)速度增加可以是對(duì)植物的一個(gè)或多個(gè)部分或植物的細(xì)胞類型(包括種子)特異的，或者可以基本遍布整^^L物。具有增加的生長(zhǎng)速度的植物可以具有更短的生命周期。植物的生命周期意指從干的成熟種子生長(zhǎng)到植物產(chǎn)生干的成熟種子(類似于起始物質(zhì))的階段所需的時(shí)間。此生命周期可以受到如早期活力、生長(zhǎng)速度、開花時(shí)間和種子成熟速度等因素的影響。生M度的增加可以發(fā)生在植物生命周期的一個(gè)或多個(gè)階段或者基本遍布整個(gè)植物生命周期期間。在植物生命周期的早期階段增加的生長(zhǎng)速?gòu)?fù)良映了增強(qiáng)的活力。生M度的增加可以改變植物的收獲周期，這使得植物可以比可能的情形更晚播種和/或更早收獲.如果生M度充分增加，可以允許播種相同植物物種的更多種子(例如在播種和收獲稻植物后，接著播種和收獲更多的稻植物，所有這些都在一個(gè)常規(guī)生長(zhǎng)期內(nèi)).類似的，如果生長(zhǎng)速度充分增加，可以允許播種不同植物物種的更多種子(例如在播種和收獲稻植物后，例如接著播種和任選收獲大豆、馬鈴薯或任何其他適當(dāng)?shù)闹参?。在一些植物的情形下，從同一根狀莖^更多次也是可能的。改變植物的收獲周期可以使得每英畝每年生物量的產(chǎn)出增加(由于任何特定植物可以生長(zhǎng)和收獲次數(shù)(指在一年中)的增加).生長(zhǎng)逸變的增加還使得轉(zhuǎn)基因植物可以比它們的野生型對(duì)應(yīng)物在更廣的地域栽培，這是因?yàn)樯L(zhǎng)作物的區(qū)域性限制通常決定于種植時(shí)(早季)或收獲時(shí)(晚季)的不利環(huán)境條件.如果收獲周期縮短，那么可以避免此類不利條件.可以通過生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)測(cè)繪生長(zhǎng)曲線，得到多個(gè)^:來確定生長(zhǎng)速度,此類參數(shù)可以是T-Mid(植物達(dá)到其最大大小的50%所用的時(shí)間)以及T-卯(植物達(dá)到其最大大小的90%所用的時(shí)間)等.本發(fā)明方法的實(shí)施提供了具有增加的生長(zhǎng)逸變的植物。因此，本發(fā)明提供了增加植物生長(zhǎng)速度的方法，該方法包括在植物中調(diào)節(jié)CDK或其同源物的活性，所述CDK或同源物具有PSTAIRE基序和T161D型突變，和/或調(diào)節(jié)這類CDKA或其同源物的編碼核酸的表達(dá)。與對(duì)照植物相比，無論植物是否在無脅迫條件下或植物是否接觸多種脅迫，發(fā)生產(chǎn)量和/或生長(zhǎng)速度的增加。植物一般通過生長(zhǎng)更加緩慢來應(yīng)答所接觸的脅迫。在嚴(yán)重脅迫條件下，植物甚至完全停止生長(zhǎng).另一方面，本文將中等脅迫定義為植物所接觸的不引起植物完全停止生長(zhǎng)且沒有能力恢復(fù)生長(zhǎng)的任何脅迫。根據(jù)農(nóng)業(yè)實(shí)踐(灌溉、施肥、殺蟲劑處理)的發(fā)展，在栽培的作物植物中通常不會(huì)遇到嚴(yán)重脅迫.因而，中等脅迫誘導(dǎo)的受損生長(zhǎng)通常是農(nóng)業(yè)所不希望的特征。中等脅迫是植物所接觸的典型脅迫。這些脅迫可以;l植物所接觸的日常生物和/或非生物(環(huán)境)脅迫。典型的非生物或環(huán)境脅迫包括由反常的熱或寒冷/凍結(jié)溫度引起的溫度脅迫；鹽脅迫；水脅迫(干旱或過量的水)。非生物脅迫還可以由化學(xué)品引起。生物脅迫通常是那些由病原體，如細(xì)菌、病毒、真菌和昆蟲引起的脅迫。本文所用的術(shù)語"無脅迫條件"是不明顯超出植物可能遇到的每日氣候和其它非生物條件的那些環(huán)境條件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)明白指定地域的正常土壤^ff和氣候4Hf?？梢栽谌魏沃参镏杏欣馗牧忌鲜錾L(zhǎng)特性。本文所用的術(shù)語"植物"包括整^Mi物、植物的祖代和后代以及植物部分，包括種子、枝條、莖、葉、根(包括塊莖)、花，以及組織和器官，其中前述的每種包含目的基因/核酸，或在目的基因/核酸中的特異性修飾.術(shù)語"植物"還包括植物細(xì)胞、懸浮培養(yǎng)物、愈傷組織、胚胎、分生組織區(qū)、配子體、孢子體、花粉和小孢子，同樣的，其中前述的每種包含目的基因/核酸，尤其可用于本發(fā)明方法中的植物包括藻類、蕨類植物以及屬于植物界(Viridiplantae)超家族的所有植物，尤其是單子葉植物和雙子葉植物，包括選自如下物種的祠料或飼料豆科植物、觀賞植物、糧食作物、喬木或灌木秋葵屬某種(^e/挑縱tospp.)、槭樹屬某種(Jcerspp.)、獼猴桃屬某種(勿/"誠(chéng)"spp.)、水草屬某種(勿，戸/fspp.)、蔥芽屬某種(/4///"挑Spp.)、莧屬某種(/i附"l"flW狄"sSpp.)、鳳梨(/4lffl"flSowkw"s)、番菡^L^某種(j/f朋waspp.)、芽菜04/w'謂g/*flveo/e"s)、擬南芥(/4m6iV/o戸's狄a/i朋a)、落花生屬某種04麼Aisspp.)、木波羅屬某種04加caipnsspp.)、石刁柏(/4s/w/*"gMSflj57">ifl/i's)、燕麥04ve/wsa/iVa)、陽*匕(/4ven*/roac"/YiiMfeo/")、冬瓜(5柳VicflsflW，V/a)、巴西栗(5^^。//幼7！ejcce/sefl)、甜菜(5e似vn/gflWsJ、蕓苔屬某種(5rasw'caspp.)、CWa6a/肌7i仍a、大葉茶(CVwif￡///fls/ziews/s)、美人i^、(raw/ifliVi^Wc^0、辣椒屬某種(CVi/w/cii挑spp.)、番木瓜(CVw7'aipa/ia，)、大果假虎刺挑aciw"，)、紅花(Ccw幼fl加MSftVictor/iw)、山核杉&屬某種(GH3^spp.)、栗屬某種(Cflsto/ieflspp.)、苦首(C7c/ici'i/挑e/irf/v/fl)、掉屬某種(0>1/1挑0111挑s/i/;,)、西瓜/fl"她s)、柑橘屬某種(C7加sspp.)、椰子屬某種(C歸sspp.)、咖啡屬某種(CV^flspp.)、Co/flspp.、芋((7o/oaw/flescu/e她)、榛屬某種spp.)、山楂屬某種(Ofl似egwsspp.)、香瓜屬某種(Cmc"挑/sspp.)、南瓜屬某種(C""cwi^/tospp.)、菜薊屬某種(Q7iflmspp.)、胡蘿卜(Da"c"scflwto)、山馬蟥屬某種(Z)es挑orf/"挑spp.)龍g艮(i)/挑oawy"s/ongaw)、薯蕷屬某種(Z)/仍aimispp.,柿樹屬某種(Dw柳柳spp.)、稗屬某種(五cA/"oc似卵spp.)、糝子C^/e"w'"ecoraca"a)、枇杷(五"V6Wi^fl乂fl/w/h'c")、紅仔果(五"ge"/a""(/7wfl)、蕎麥屬某種(/Vigfl^f"iMspp.)、山毛櫸屬某種(Fflg"ssppj、無花果(尸i'cmscflWca)、金桔屬某種CFort""e"a卿.)、草莓屬某種(F/Yigfli7Vispp.)、銀杏((7iVf紐o6歸a)、大豆屬某種(G7"'"espp.)、陸地棉(Gte爐'"加A/rsM加m)、向曰葵屬某種Ofire&Vwf幼iisspp.)、木槿屬某種(歷他面spp.)、大麥屬某種(HitWYsfeM附sppj、甘薯f7^0挑0做datoto^、核書匕屬某種(J"g/a"sspp.)、萬苣(Xac似aisaft'va^、山黨豆屬某種(丄"勿r"sspp.)浮萍屬某種(丄棚"a卿.)、兵豆CM//nar/s)、亞麻(Z^w"挑us/todss/挑"m)、某枝(lftc/rfc/t/;ie/fs/s)、百##屬某種(￡<加5spp.)、棱角絲瓜(丄nj^aacMto/f容iz/a)、羽扇豆屬某種(Z^i/w'"Msspp.)、硬皮豆屬某種(3/flcra印to挑"spp.)、西印度櫻書匕(Mfl/p/g似flg/wflrgiVffl似)》蘋果屬某種(Mia/usspp,)、曼密蘋果(Mia挑挑caflwei7'cfl"fl)、芒果(她"g(^ffl/"必caj、木薯屬某種(Mflw幼Wspp.)、人心果(Affl/i/汰fli""za/w似)、紫苜蓿(M^Kaigosflft'va)、草木樨屬某種(Mc似W"sspp.)、薄荷屬某種(Afe"幼flspp.)、苦瓜屬某種(A/o附onfi'aispp.)、，繁桑(Miw"sw/gffl)、芭蕉屬某種(M"saspp.)、煙草屬某種(iV/airt'fl/fiiwspp.)、木犀欖屬某種(O/eflspp.)、仙人掌屬某種(0/iMWflspp.)、0簡(jiǎn)'幼o(hù)/wsspp.、稻屬某種(Oj^flspp.)、稷(尸fl"/cM挑挑f7/am/m)'雞蛋果(Pas孝wfl^/u//s)、歐防風(fēng)CPflsri"flCflsflriva)、鱘梨屬某種(itoeflspp.)、香芽(尸C/w/i'""附cWs/"/w),菜豆屬某種(PAaseo/"sspp.)、刺葵屬某種(/^o柳ix:spp.)、酸漿屬某種CPA"fl/isspp.)、*>屬某種0/"1spp.)、阿月渾子(i^似"Vivem)、豌豆屬某種(尸&"inspp.)、早熟禾屬某種(jPo"spp.)、楊屬某種(戶c^w/wsspp.)、牧豆樹屬某種(/V仍—sspp.)、李屬某種(/V"/i"sspp.)、番石榴屬某種CPs!Vft'M加spp,)、石插(/Viwf'cflgra/ia^i挑)、西洋梨(i^rnsc0mmK/1&)、標(biāo)屬某種spp.)、蘿卜(及a/7Aa"iis她'v"s)、波葉大黃(及/r戰(zhàn)附由6a由r鵬)、茶蕭子屬某種(及幼esspp.)、懸鉤子屬某種(及"6"sspp.)、甘蔑屬某種CyflccA"/""/wspp,)、接骨木屬某種(5Vi加6iiciisspp.)、，累、麥Oyeai/ccccflfe)、5^s"挑"挑spp.、癡屬某種OSo/fl/iM附spp,)、兩色蜀泰(Sofg/r"挑A/co/or)、菠菜屬某種(^i//faa'aspp.)、蒲書匕屬某種0S)^ygf'"挑spp.)、酸豆(rfl挑fl/77w/"si'mZ/ca)、可可樹(77f^i6iYWMacacao)、車軸草屬某種(7V(/b/i'M附spp.)、7Wft'cosccaferi'mpaui、'J、麥屬某種(7Wft'cfi附spp.)、越桔屬某種(Kflcd"z'M附spp.)、野豌豆屬某種(Wdflspp.)、5L豆屬某種(K/g"fl砂;p.)、葡萄屬某種(F/治spp.)、玉蜀黍(Z做挑"")、北美洲野生稻(Z&a"/a/wr/ws加's)、棗屬某種(Zfei^/iMSspp.)等.根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的特征，植物是包含大豆、向日葵、油菜、苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、馬鈴薯或煙草的作物植物.更優(yōu)選本發(fā)明的植物是單子葉植物，如甘蔗，最優(yōu)選谷類，如稻、玉米、小麥、粟、大麥、黑麥、燕麥或高粱，可以通過調(diào)節(jié)CDKA蛋白質(zhì)的水平來調(diào)節(jié)CDKA蛋白質(zhì)的活性?？蛇x的，當(dāng)CDKA蛋白質(zhì)水平?jīng)]有變化時(shí)，也可以調(diào)節(jié)其活性，這可以在例如通過產(chǎn)生突變體改變多肽固有特性時(shí)發(fā)生。棉^據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的特征，引入包含T161D型突變的CDKA蛋白質(zhì)改變的活性和/或此CDKA編碼核酸改變的表達(dá)，和/或引入包含T161D型突變的CDKA蛋白質(zhì)增加的活性和/或此CDKA編碼核酸增加的表達(dá).本文所定義的術(shù)語"A型CDKA"或"CDKA"可交換地4吏用并且包括具有細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶活性的任何^J^酸序列，而且該序列當(dāng)用于CDK進(jìn)化系統(tǒng)樹的構(gòu)建時(shí)(如在圖1和圖2所示)，在A型CDK而非任何其它CDK類群周圍聚類，且該M酸序列包含PSTAIREM酸序列。GCG、EBI或CLUSTAL包，使用默認(rèn)參數(shù)，可以容易地確定是否研究的任何M財(cái)列落入"A型CDK"的定義內(nèi)(見例如Vandepoele等人，加02),一^建這樣的進(jìn)化系統(tǒng)樹，在A型CDK類群聚類的序列被認(rèn)為落入"A型CDK"或"CDKA"定義之內(nèi)，并將因此用于操作本發(fā)明的方法。優(yōu)選A型CDK還包含與Genbank登錄號(hào)CAA42922(SEQIDNO:8)代表的氨基酸序列或與由SEQIDNO:2代表的其突變體形式具有一定的全序列同一性的多肽，所述全序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?5%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。使用總體比對(duì)算法，如程序GAP(GCGWisconsinPackage,Accelrys)中的NeedlemanWunsch算法，確定全序列同一性.優(yōu)選地，A型CDK屬于1類A型CDK(即CDKA;l).本文將術(shù)語"T161D型突變"定義為對(duì)應(yīng)于人CDC2或小鼠CDKA;1中蘇氨酸161的CDK的保守蘇氨酸突變?yōu)樘於彼峄蚬劝彼?更具體地，術(shù)語"具有T161D型突變的CDK"包含由天冬氨酸或谷氨酸對(duì)T環(huán)中的保守蘇氨酸的取代；優(yōu)選由天冬氨酸取代.蛋白質(zhì)中由天冬氨酸或谷氨酸對(duì)蘇氨酸的取代導(dǎo)致引入負(fù)電荷，從而模擬了由磷酸化引入的磷^團(tuán)的負(fù)電荷。在基因中引入突變產(chǎn)生M酸取代的方法是
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)眾所周知的且包括使用寡核苷酸或通過使用PCR的定點(diǎn)誘變。CDKA蛋白質(zhì)中多個(gè)結(jié)構(gòu)^Ul眾所周知的(DeBondt等人，Nature363，595-602，1993)，并且可以使用專門的數(shù)據(jù)庫(kù)鑒別，如SMART(Schultz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95，5857-5864;Letuni等人(2002)NucleicAcidsRes30,242-244;http:〃smart.embl-hddelberg.de/)、InterPro(Mulder等人，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318;http:〃www.ebi.ac.uk/interpro/)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，Ageneralizedprofilesyntaxforbiomolecularsequencesmotifsanditsfunctioninautomaticsequenceinterpretation.(In)ISMB-94;Proceedings2ndInternationalConferenceonIntelligentSystemsforMolecularBiology.AltmanR.、BrutlagD.、KarpP.、Lathr叩R.、SearlsD.編輯，53-61頁，AAAI出版，MenloPark;Hulo等人，Nucl.Acids.Res.32:D134誦D137，(2004)，http:〃www.expasy.org/prosite/)或Pfam(Bateman等人，NucleicAcidsResearch30(1):276誦280(2002)，http:Vwww.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)。CDK的激酶結(jié)構(gòu)J^AS_TKc型(SMART登錄號(hào)SM00220,Interpro登錄號(hào)IPR0022卯)，并且具有Ser/Thr激酶活性。預(yù)測(cè)的活性位點(diǎn)(VLHRDLKPQNLLI，其中D是預(yù)測(cè)的催化殘基)對(duì)應(yīng)著PROSITE標(biāo)簽PS00108,ATP結(jié)合位點(diǎn)(IGEGTYGWYRARDKVTNETIALK)對(duì)應(yīng)著PROSITE標(biāo)簽PS00107.搜索和鑒定A型CDK同源物的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉了解的。此類方法包括使用本領(lǐng)域熟知的序列比對(duì)或比較的算法，如GAP(Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48;443-453(1970))、BESTFIT(使用Smith和Waterman(AdvancesinAppliedMathematics2;482-489(1981))的局部同源性算法)、BLAST(Altschul，S.F.、Gish，W.、Miller,W.、Myers,E.W.和Lipman，D丄，J.Mol.Biol.215:403-410(19卯))、FASTA和TFASTA(W.R.Pearson和D.J.LipmanProc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444-2448(1988))，將計(jì)算機(jī)可讀形式的SEQIDNO1或2或由GenBank登錄號(hào)CAA42922代表的序列與在公共數(shù)據(jù)庫(kù)如MIPS(http:〃mips.gsf.de/)、GenBank(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)或EMBL核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)(http:〃www.ebi.ac.uk/embl/index.html)中獲得的序列進(jìn)行比較。進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)公開獲得。下面提到的同源物是使用BLAST默認(rèn)參數(shù)(BLOSUM62矩陣，空位開放罰分為11且空位延伸罰分為l)鑒定出的，且優(yōu)選使用全長(zhǎng)序列用于分析。這些比對(duì)方法也使能夠容易地鑒定對(duì)應(yīng)于人CDC2或小鼠CDKA;1(SEQIDNO:8)中蘇氨酸161的保守蘇氨酸。落入"A型CDK或其同源物"定義內(nèi)的蛋白質(zhì)的實(shí)例包括帶有PSTAIRE基序的CDK，例如在表l所列蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員知道多種技術(shù)可以向這些蛋白質(zhì)中引入T161D型突變使其用于本發(fā)明的方法。表1:植物A型CDK蛋白質(zhì)及其GenBank或PIR登錄號(hào)的實(shí)例(修改自Joub6s等人，PlantMol.Biol.43，607-620，2000)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>*編碼蛋白質(zhì)的CDS的GenBank登錄號(hào)應(yīng)該理解術(shù)語"A型CDK或其同源物"不限于由SEQIDNO:2代表的序列，而是符合具有細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶活性、有PSTAIRE結(jié)構(gòu)域、且與SEQIDNO:8具有至少75%序列同一性標(biāo)準(zhǔn)的任何多肽，只要該CDKA或其同源物包含T161D型突變，可以適用于本發(fā)明的方法。優(yōu)選地，A型CDK或其同源物為SEQIDNO:8代表的蛋白質(zhì)的直系同源物.為了確定A型CDK的激酶活性，一些測(cè)定是可用的并且在本領(lǐng)域中眾所周知(例如CurrentProtocolsinMolecularBiology,1和2巻，Ausubel等人(1994)，CurrentProtocols;或者是在線的，例如http:〃www.Drotocol-online.org)'簡(jiǎn)言之，激酶測(cè)定通常包括(l)使激酶蛋白質(zhì)接觸含有待磷酸化的乾位點(diǎn)的底物多肽；(2)在適當(dāng)?shù)臈l件下，在適當(dāng)?shù)募っ妇彌_液中進(jìn)行耙位點(diǎn)的磷酸化；(3)在恰當(dāng)?shù)腲^應(yīng)期后將磷酸化的產(chǎn)物從未磷酸化的底物中分離出來。激酶活性的存在或缺乏是通過磷酸化的靶標(biāo)的存在或缺乏來確定的。另外，可以進(jìn)行定量測(cè)量。純化的CDK蛋白質(zhì)，或者含有或富含CDK蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物可以用作激酶蛋白質(zhì)的來源。組蛋白Hl或小肽尤其適合作為底物。肽在磷酸化位點(diǎn)基序中必須含有一個(gè)或多個(gè)絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基?？梢栽谡fochimicaetBiophysicaActa1314，191-225，(1996)中找到磷酸化位點(diǎn)的匯編。此外，肽底物可以有利地具有凈正電荷，利于結(jié)合到磷酸纖維素濾器上(使能夠?qū)⒘姿峄腗未磷酸化的肽中分離出來并且檢測(cè)磷酸化的肽).如果不知道磷酸化位點(diǎn)基序，可以使用通用Ser/Thr激酶底物.例如，肽"ADAQHATPPKKKRKVEDPKDF"(Marshak等人，J.Cell.Biochem.45,391，1991)是A型CDK的特異性底物.為了確定合成肽磷酸化的動(dòng)力^故，需要肽濃度的范圍。對(duì)于起始反應(yīng)，可以使用0.7-1.5mM的肽濃度，對(duì)于每種激酶，重要的是要確定活性的最佳緩沖液、離子強(qiáng)度和pH。標(biāo)準(zhǔn)5x激酶緩沖液通常含有5mg/mlBSA(防止激酶吸附于測(cè)定管的牛血清白蛋白)、150mMTris-Cl(pH7.5)、100mMMgCl2。必須棉-據(jù)經(jīng)驗(yàn)為每種蛋白激酶確定二價(jià)陽離子的最佳濃度.CDK測(cè)定的合適緩沖液^l;Wi術(shù)領(lǐng)域公知的(例如John等A^Protoplasma161，70-74，1991)。常用的磷絲(phophoryl)基團(tuán)W^是放射性標(biāo)記的Y^PlATP(通常是0.2mM終濃度).在肽中摻入的32P的量可以通過在閃爍計(jì)數(shù)器中硝化纖維素干墊上測(cè)量活性來確定.此外，當(dāng)含有T161D型突變且在稻(Oi^fls她'vii)中的枝條特異性啟動(dòng)子控制下表^J1樣的"CDKA或其同源物或衍生物"時(shí)，與相應(yīng)的野生型植物相比，其種子產(chǎn)量增加?？梢砸栽S多方式測(cè)量種子產(chǎn)量的增加，例如按照種子總重量的增加、從植物收獲的飽滿種子數(shù)的增加或增加的收獲指數(shù)。根據(jù)本發(fā)明的CDKA或其同源物的生物和/或功能活性包括具有至少一種細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶活性或具有如上所述的植物中增加產(chǎn)量的活性。本發(fā)明還提供分離的A型細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶(CDKA)突變體，由以下一種或多種組成(a)SEQIDNO:2代表的^J^^列；(b)SEQIDNO:2代表的蛋白質(zhì)的同源物和/或衍生物，該同源物或衍生物來自植物且包含T161D型突變；(c)如在(a)或(b)中定義的氨基酸序列的活性片段，該活性片段包含T161D型突變。A型CDK蛋白質(zhì)的"活性片段"包括A型CDK蛋白質(zhì)的至少100個(gè)M酸殘基，包括PSTAIRE基序和T161D型突變，該連續(xù)的殘基保留了與包含T161D型突變的天然產(chǎn)生蛋白質(zhì)相似的生物活性和/或功能活性.如本文所定義的CDKA或其同源物是由CDJ"核酸分子編碼的，編碼CDKA或其同源物的核酸可以是任何天然或合成的核酸。因此本文定義的術(shù)語"CD&4核酸分子"或"CDJL4基因"是如上定義的編碼CDKA多肽或其同源物的M核酸分子(包括作為遺傳密碼簡(jiǎn)并結(jié)果的那些)。CDiL4核酸分子的實(shí)例包括由SEQIDNO:l所代表的核酸，以及編碼上述同源物的那些核酸.C7)JL4核酸及其功能性變體可適用于進(jìn)行本發(fā)明的方法，只要它們編碼包含T161D型突變的CDKA蛋白質(zhì)或其同源物.這樣的CDJL4核酸的功能性變體包括a)w核酸分子的部分、等位變體、剪接變體和/或能夠與OWL4核酸分子雜交的核酸。在功能性變體的范圍中，術(shù)語"功能性"指的是編碼具有細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶活性且具有T161D型突變的多肽的變體(即部分或雜交序列)。本發(fā)明還提供分離的核酸分子，其由以下一種或多種組成a.編碼由SEQIDNO:2代表的M酸序列的核酸分子；b.編碼由SEQIDNO:2代表的M酸分子的同源物、衍生物或活性片段的核酸分子，該同源物、衍生物或片段來源于植物并且含有PSTAIRE基序和T161D型突變；c.能夠與以上(a)或(b)的核酸雜交的核酸分子，或其互補(bǔ)序列，其中雜交序列或其互補(bǔ)序列編碼含有PSTAIRE基序和T161D型突變的植物CDKA蛋白質(zhì)；d.根據(jù)以上(a)至(c)的任一項(xiàng)核酸的等位變體，該等位變體編碼含有PSTAIRE基序和T161D型突變的植物CDKA蛋白質(zhì)；和e.根據(jù)(a)至(c)的任一項(xiàng)核酸的備選剪接變體，該備選剪接變體編碼含有PSTAIRE基序且具有T161D型突變的植物CDKA蛋白質(zhì)。本文定義的術(shù)語部分指至少包含300個(gè)核苷酸的編碼CDKA的一段DNA，并且該部分編碼的多肽具有細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶活性、含有PSTAIRE基序和T161D型突變。可以例如，通it^tCDKA核酸的一個(gè)或多個(gè)缺失來制備部分，所述部分可以以分離的形式使用或者它們可以融合到其他編碼(或非編碼)序列，例如以產(chǎn)生組合了多個(gè)活性(其中之一是細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶活性)的蛋白質(zhì).當(dāng)融合到其他編碼序列時(shí)，由翻譯產(chǎn)生得到的多肽可以大于預(yù)測(cè)的CDA^片段.優(yōu)選的功能性部分是CDJL4核酸的部分，更優(yōu)選由SEQIDNO:1代表的核酸分子的部分.CDJL4核酸分子的另一變體是能夠在簡(jiǎn)化的嚴(yán)4MHf下，優(yōu)選在嚴(yán)格條件下與以上定義的CDJL4核酸分子雜交的核酸分子，該雜交序列編碼的CDKA多肽含有PSTAIRE基序和T161D型突變.優(yōu)選的雜交序列能夠與SEQIDNO:1的核酸分子，或編碼上述同源物的核酸，或任意上述序列的部分雜交。最優(yōu)選的雜交序列能夠與SEQIDNO:1的核酸分子雜交.本文所定義的術(shù)語"雜交"是其中基本同源的互補(bǔ)核苷酸序列彼此退火的過程。雜交過程可以完全發(fā)生在溶液中，即兩條互補(bǔ)核酸都在溶液中。雜交過程還可以如此進(jìn)行，即其中互補(bǔ)核酸之一固定于基質(zhì)如磁珠、瓊脂糖珠子或任何其他樹脂上。此外雜交過程可還可以如此進(jìn)行，即其中互補(bǔ)核酸之一固定于固相支持物如硝化纖維素膜或尼龍膜上，或通過例如照相或稱之為核酸芯片):為了使得雜^L生，通常使核酸分子熱變'li或化學(xué)變性，以使雙鏈解鏈成兩條單鏈和/或從單鏈核酸中除去發(fā)夾或其他二級(jí)結(jié)構(gòu)。雜交的嚴(yán)格性受諸如溫度、鹽濃度、離子強(qiáng)度和雜交緩沖液組成*的影響。在諸如Southern雜交和Northern雜交的核酸雜交實(shí)驗(yàn)中，"嚴(yán)格雜交和"嚴(yán)格雜交洗滌條件"是由序列決定的，并且隨環(huán)境M而不同。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到在雜交和洗滌中可以改變多種^，而該^lt將保持或改變嚴(yán);^ff'Tm是在限定的離子強(qiáng)度和pH下，50%的乾標(biāo)序列雜交至完全匹配的探針時(shí)的溫度.Tm依賴于溶液條件、>8^成以及探針的長(zhǎng)度.例如，較長(zhǎng)的序列在較高溫度下特異雜交.最大雜交速率是在低于Tm大約16匸至321C下得到。雜交溶液中一價(jià)陽離子的存在降低了兩條核酸鏈之間的靜電排斥，從而促進(jìn)雜交分子的形成；對(duì)于高達(dá)0.4M的鈉濃度，這個(gè)作用是明顯的。甲酰胺降低了DNA-DNA和DNA-RNA雙鏈體的解鏈溫度，每百分?jǐn)?shù)甲酖胺降低0.6至0.7"C，而加入50。/。的甲B^雖然使雜交速率降低，但使雜交在30至451C進(jìn)行，>5|^錯(cuò)配降低雜交速率和雙鏈體的熱穩(wěn)定性。平均而言，對(duì)于大探針，每％4^錯(cuò)配使Tm降低大約llC.由雜交分子的類型決定，可以使用下列公式計(jì)算T一DNA-DNA雜交分子(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138:267-284，1984):Tra=81.5。C+16.6xlogNa+a+0.41x%G/Cb]一500xLC1一0.61x%甲跣胺DNA-RNA或RNA-RNA雜交分子Tm=79.8+18.5(logn)[NaT)+0.58(%G/Cb)+11.8(%G/Cb)2誦820/Lc寡-DNA或寡-RNAd雜交分子對(duì)于<20個(gè)核苷酸Tm=2(/n)對(duì)于20~35個(gè)核苷酸Tm=22+1.46(/n)"或?qū)τ谄渌粌r(jià)陽離子，但是僅M0.01-0.4M范圍內(nèi)精確，6僅對(duì)于在30。/。至75。/。范圍的。/nGC精確，cL=雙鏈體中>5^1"的長(zhǎng)度。d寡，寡核苷酸；/n，引物的有效長(zhǎng)度=2乂^/<:數(shù))+(^1數(shù))。注對(duì)于每1%甲酰胺，Tm降低大約0.6至0.71C，而6M尿素的存在降低Tm大約30x:。雜交的特異性通常是雜交后洗滌的作用。為了除去非特異性雜交產(chǎn)生的背景，用稀釋的鹽溶液洗滌樣品。此類洗滌的關(guān)鍵因素包括最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度鹽濃M低且洗滌溫度越高，洗滌的嚴(yán)格性越高。洗滌條件通常在雜^P格性或低于雜交嚴(yán)格性下進(jìn)行.總體上，如上所述設(shè)置核酸雜交測(cè)定或基因擴(kuò)增檢測(cè)操作的合適的嚴(yán)*件.也可以選擇相差不多的嚴(yán)格條件.通常，選擇的低嚴(yán)格條件大約比在限定的離子強(qiáng)度和pH下特異性序列的熱解鏈溫度(TJ低501C。中等嚴(yán)格^Hf是低于Tm20t:的溫度，而高嚴(yán);fMHf是低于T加iox:的溫度.例如，嚴(yán)格4Hf是那些至少與例如務(wù)降A(chǔ)-L—樣嚴(yán)格的務(wù)ff;而簡(jiǎn)化的嚴(yán)#泮是至少與例如^HtM-R—樣嚴(yán)格的^K可以使用多種已知技術(shù)中的任意一種，例如用含有蛋白質(zhì)的溶液將膜封閉，添加異源RNA、DNA和SDS至雜交緩沖液中，以及用RNA酶處理，來控制非特異性的結(jié)合.雜交和洗滌M的實(shí)例在表2中列出表2:<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>$"雜交分子長(zhǎng)度"是雜交核酸的預(yù)期長(zhǎng)度。當(dāng)已知序列的核酸雜交時(shí)，可以通過比對(duì)序列和鑒定本文所述的保守區(qū)確定雜交分子長(zhǎng)度.t在雜交和洗滌緩沖液中，SSPE(1xSSPE是0.15MNaCl、10mMNaH2P04和1.25mMEDTA，pH7.4)可以代替SSC(lxSSC是0.15MNaCl和15mM檸檬酸鈉)；在雜交完成后洗滌15分鐘。雜交和洗滌可以另外地包括5xDenhardt試劑、0.5-1.0%SDS、100pg/ml變性的片段化的鮭精DNA、0.5%焦磷酸鈉和高達(dá)50%甲酖胺.*Tb-Tr:對(duì)于預(yù)期長(zhǎng)度少于50個(gè)>8^的雜交分子，雜交溫度應(yīng)該比雜交分子的解鏈溫度Tm低5-10"C，根據(jù)上述公式確定Lt本發(fā)明還包括用PNA或修飾的核酸取代任意一個(gè)或多個(gè)DNA或RNA雜交配偶體。為了定義嚴(yán)格性水平，可以方便地參考Sambrook等人(2001)MolecularCloning:alaboratorymanual,第3版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,CSH,NewYorkortoCurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989)。在雜交和洗滌后，由探針標(biāo)記的類型決定，可以通過放射自顯影(當(dāng)4吏用放射性標(biāo)記探針時(shí))或者通過化學(xué)發(fā)光、免疫檢測(cè)、通過熒光或顯色檢測(cè)4b^r測(cè)雙鏈體。或者，可以進(jìn)行核糖核酸酶保護(hù)測(cè)定來險(xiǎn)測(cè)RNA:RNA雜交分子。CDJ"核酸分子或其變體可以來自任何植物或人工來源.可以通it^細(xì)的人工操作在組成和/或基因組環(huán)境方面對(duì)核酸的天然形式進(jìn)行修飾；在本發(fā)明中使用的核酸具有至少引起T161D取代的突變.核酸優(yōu)選植物來源的，可以是來自相同的植物物種(例如來自其待引入的植物物種)或來自不同的植物物種。核酸可以分離自單子葉物種，優(yōu)選分離自禾本科(Poaceae)，更優(yōu)選分離自稻，更優(yōu)選^分離的CDJL4是CD^4;7。最優(yōu)選，分離的CDJL4,'7以及I^的突變是SEQIDNO:1所代表的，并且?guī)в蠺161D型突變的CDKA絲財(cái)列是SEQIDNO:2所代表的.可以通過引入遺傳修飾(優(yōu)i^OWL4基因的基因座)調(diào)節(jié)具有T161D型突變的CDKA多肽或其同源物的活性和/或這類CDKA編碼核酸的表達(dá)。如本文所定義的基因的基因座意指包括目的基因以及編碼區(qū)的上游或下游10kb的區(qū)域，例如，可以通過以下的任何一種(或多種)方法引入遺傳《務(wù)飾TILLING、定點(diǎn)誘變、定向進(jìn)化和同源重組或者通it^植物中引入和表達(dá)編碼A型CDK的多肽或其同源物的核酸，該CDKA或同源物含有PSTAIRE基序和T161D型突變。在引入遺傳修飾后，接下來的步驟是選擇表達(dá)增加的核酸(該核酸編碼含有PSTAIRE基序和T161D型突變的CDK多肽)和/或選擇活性增加的CDK多肽(所述多肽含有PSTAIRE基序和T161D型突變),這種表達(dá)和/或活性的增加使植物具有改良的生長(zhǎng)特性。也可以使用TILLING技術(shù)(乾向誘導(dǎo)基因組局部損害技術(shù))，把遺傳修飾引入到CD^4基因的基因座中。這是一種誘變技術(shù)，用于產(chǎn)生和/或鑒定，并最終分離核酸分子的誘變變體，所述核酸分子編碼包含T161D型突變，能夠呈現(xiàn)依賴細(xì)胞周期蛋白的激酶活性的A型CDK。TILLING還使能夠選擇攜帶這類突變變體的植物。TILLNG將高密度誘變與高通量篩選方法結(jié)^^來。TILLING—般遵循的步驟是(a)EMS資變(Redei和Koncz(1992)，In:CKoncz，N-HChua，JSchell編輯，MethodsinArabidopsisResearch.WorldScientific,Singapore,16-82頁；Feldmann等人，(1994)In:EMMeyerowitz，CRSomerville編輯，Arabidopsis.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，137-172頁；Lightner和Caspar(1998),In:JMartinez-Zapater，JSalinas編輯，MethodsonMolecularBiology,82巻，HumanaPress,Totowa，NJ，91-104頁)；(b)DNA制備和個(gè)體合并；(c)目標(biāo)區(qū)域的PCR擴(kuò)增；(d)變性和退火使能夠形成異源雙鏈體；(e)DHPLC，其中集合體中異源雙鏈體的存在檢測(cè)為色鐠圖中額外的峰值；(f)鑒定突變個(gè)體；和(g)突變體PCR產(chǎn)物的測(cè)序.TILLING的方法是本領(lǐng)域熟知的(McCallumNatureBiotechnol.18，455457，2000，StempleNatureRev.Genet.5，145-150，2004)?？梢允褂枚c(diǎn)誘變產(chǎn)生保留了活性(例如依賴細(xì)胞周期蛋白的激酶活性)的awL4核酸或其部分的變體.多種方法可用來實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)誘變，最常用的是基于PCR的方法(見例如Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology.Wiley編輯，http:〃www.4ulr.com/products/currentprotocols/iiidex.html),也可以使用定向進(jìn)化產(chǎn)生CDJL4核酸的變體.定向進(jìn)化由重復(fù)的DNA改組組成，繼之以適當(dāng)?shù)暮Y選和/或選擇產(chǎn)生CDJL4核酸或其部分的變體，所述OWL4核酸或其部分編碼具有改變的生物活性的CDKA多肽或同源物或其部分(Castle等人，(2004)Science304(5674):1151-4;美國(guó)專利5，811，238和6,395,547).TILLING、定點(diǎn)誘變和定向進(jìn)化是能夠產(chǎn)生新的CDJL4等位基因和變體的技術(shù)實(shí)例，所述CDA^等位基因和變體保留了CDKA功能因而可用于本發(fā)明的方法中。同源重組能夠在基因組中限定的選擇位置引入選定的核酸。同源重組是生物學(xué)中通常使用的常規(guī)技術(shù)，用于較低等的生物體如酵母或莒蘚PA_vsawH>e//fl。在植物中進(jìn)行同源重組的方法不僅已在模式植物中有描述(Offringa等人(19卯)EMBOJ.9，3077-3084)，而JLfc作物植物，例如稻中也有描述(Terada等人(2002)NatureBiotechnol.20，1030-1034;或Iida和Terada(2004)Curr.Opin.股oteclmol.15，132-138),待把向的核酸(其可以是如上文所定義的OWL4核酸分子或其功能性變體)不需要耙向到CDJL4基因的基因座中，而可以被引入到例如高表達(dá)的區(qū)域.待把向的核酸可以是用于替換內(nèi)源基因的改良的等位基因，或在內(nèi)源基因之外額外引入。引入遺傳修飾(在這一情況中不需要在OWL4基因的基因座中)的優(yōu)選方法是在植物中引入和表達(dá)編碼包含T161D型突變的CDKA多肽或其同源物的核酸.以上提到的且適用于本發(fā)明操作的CDKA多肽或其同源物具有依賴細(xì)胞周期蛋白的激酶活性，其與SEQIDNO:2或SEQIDNO:8所代表的^J^酸序列具有一定的序列同一性，所述序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?5%、80%、85%、卯％、95%、96%、97%、98%、99%或更多，且該CDK多肽包含PSTAIRE基序和T161D型突變.引入植物的核酸可以是如以上定義的部分或雜交序列.蛋白質(zhì)的"同源物"涵蓋相對(duì)于所討論的未M蛋白質(zhì)具有M酸取代、缺失和/或插入，且與其所衍生自的未修飾蛋白質(zhì)具有相似的生物學(xué)活性和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶.術(shù)語"同源物"涵蓋兩種特殊形式的同源性，即直系同源序列和旁系同源序列，它們涉及用于描逸基因遺傳關(guān)系的進(jìn)化概念.優(yōu)選地，用于本發(fā)明的直系同源物和旁系同源物具有與A型CDK相同的結(jié)構(gòu)JUfc交互BLAST搜索中與SEQIDNO:8具有最高相似性且包含T161D型突變.術(shù)語"旁系同源"涉及由物種基因組內(nèi)一個(gè)或多個(gè)基因復(fù)制產(chǎn)生的同源基因。CDKA的旁系同源物可以容易地通過對(duì)來自與查詢序列相同物種的一組序列進(jìn)行BLAST分析來鑒定。術(shù)語"直系同源"涉;Mt不同生物中由于這些基因的祖先關(guān)系形成的同源基因.例如，通過實(shí)施所謂的交互blast搜索可以容易地找到單子葉植物物種中的直系同源物。這可以通過在任何序列數(shù)據(jù)庫(kù)，如可在http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov中找到的公眾可獲得的NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)所討論的序列(例如，來自擬南芥的SEQIDNO15或SEQIDNO16)進(jìn)行第一次blast完成。如果搜索的是稻的直系同源物，所討論的序列將再次對(duì)例如來自NCBI上可用的稻Nipponbare的28,469全長(zhǎng)cDNA克隆進(jìn)行blast。當(dāng)起始于核苷酸時(shí)可以使用BLASTn或tBLASTX，或者當(dāng)起始于蛋白質(zhì)時(shí)可以使用BLASTP或TBLASTN,并使用標(biāo)準(zhǔn)缺省值。可以過濾blast結(jié)果。之后將過濾結(jié)果或未過濾結(jié)果的全長(zhǎng)序列與所討論的序列的來源生物(例如擬南芥)的序列進(jìn)行反向blast(第二次blast).然后對(duì)第一次和笫二次blast的結(jié)果進(jìn)行比較。如果第二次blast的最高相似性來自與查詢序列所源自的相同物種時(shí)，就找到了旁系同源物；如果最高相似性并非來自與查詢序列所源自的相同物種時(shí)，那么就找到了直系同源物.只要這一同源物含有絲氨^/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域并且含有PSTAIRE基序，這樣的直系同源物或旁系同源物也可認(rèn)為是CDKA的同源物。在大家族的情況下，可以使用ClustalW，接著通it^J建相鄰連接樹以幫助觀察相關(guān)基因的聚類(clustering)并且鑒定直系同源物和旁系同源物.同源物可以是蛋白質(zhì)"取代變體"的形式，即其中M酸序列中的至少一個(gè)殘基已經(jīng)被除去，并且在其位置上插入不同的殘基.M酸取代一fcl單個(gè)戎基的，但是取決于對(duì)多肽的功能限制可以是成串的；插入片段通常是大約1到10個(gè)氨基酸殘基。優(yōu)選的，M酸取代包括保守性氨基酸取代(表3)。為了產(chǎn)生此類同源物，蛋白質(zhì)的M酸可以被具有相似性質(zhì)(如相似的疏水性、親水性、抗原性、形成或破壞Of-螺旋結(jié)構(gòu)或P-折疊結(jié)構(gòu)的特性)的其他氨基酸所置換.保守性替換表是本領(lǐng)域所熟知的(見例如Creighton(1984)Proteins.W.H.FreemanandCompany),用于本發(fā)明方法中的取代變體是CDKA多肽的取代變體并含有PSTAIRE基序和T161D型突變。表3:保守性M酸取代的實(shí)例<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>在上述M酸性質(zhì)不是很關(guān)鍵的情況下，可以產(chǎn)生保守性較低的取代。同源物還可以是蛋白質(zhì)的"插入變體"的形式，即將其中一個(gè)或多個(gè)#^酸^引入到蛋白質(zhì)中的預(yù)定位點(diǎn).插入可包括M端和/或lt^端融合，以及單個(gè)或多個(gè)M酸的序列內(nèi)插入，通常，IL^^列內(nèi)的插入將小于^J^貌基端的融合，約為l到io個(gè)殘基的數(shù)量.^J^It^端融合蛋白質(zhì)或肽的實(shí)例包括如用于酵母雙雜交系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或激活結(jié)構(gòu)域、噬菌體外殼蛋白、(組氨酸)6-標(biāo)簽、谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶-標(biāo)簽、A蛋白、麥芽糖結(jié)合蛋白、二氬葉酸還原酶、Ta『100^^位、c-myc表位、FLAG⑧表位、lacZ、CMP(釣調(diào)蛋白結(jié)合肽)、HA表位、C蛋白表位和VSV表位?？捎糜诒景l(fā)明的方法的插入變體是CDKA多肽的插入變體并且含有PSTAIRE基序和T161D型突變。蛋白質(zhì)"缺失變體"形式的同源物的特征在于從蛋白質(zhì)除去一個(gè)或多個(gè)絲酸，并且包含活性片段。使用本領(lǐng)域熟知的肽合成技術(shù)，如固相肽合成等等，或通過重組DNA操作，可以容易的制M白質(zhì)的氛基酸變體。對(duì)DNA序列進(jìn)行操作以產(chǎn)生蛋白質(zhì)的取代、插入或缺失變體的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，在DNA的預(yù)定位點(diǎn)產(chǎn)生突變的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括M13誘變、T7-Gen體外誘變(USB，Cleveland,OH)、快速變換的定點(diǎn)誘變(Stratagene，SanDiego，CA)、PCR-介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變或其他定點(diǎn)誘變方案。帶有PSTAIRE基序的CDKA多肽或其同源物也可以是衍生物。"衍生物"包括肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶，相對(duì)于蛋白質(zhì)天然存在形式的#^酸序列(例如，如GenBank登錄號(hào)CAA42922(SEQIDNO:8)所示的)，其可以包括天然和非天然存在的氨基酸殘基的取代、缺失或添加.蛋白質(zhì)的"衍生物"包括肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶，相對(duì)于多肽天然存在形式的M酸序列，其可以包括天然發(fā)生改變的、糖基化的、S^化的M酸殘基或非天然存在的M酸殘基.相對(duì)于其所衍生自的M酸序列，衍生物還可包含一個(gè)或多個(gè)非4^酸取M，例如與M酸序列共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的報(bào)道分子或其他配體，如結(jié)合以便于檢測(cè)的報(bào)道分子，以;M目對(duì)于天然存在蛋白質(zhì)的M酸序列而言非天然存在的J^酸殘基?？捎糜诒景l(fā)明方法的衍生物是CDKA多肽的衍生物并且含有PSTAIRE基序和T161D型突變。植物中的CDK型激酶具有模塊結(jié)構(gòu)，其由N葉片和C葉片組成，含有一個(gè)催化裂和T環(huán)(DeBondt等人，1993).因此可期望以保留或改變CDK蛋白質(zhì)活性的方式進(jìn)行激酶結(jié)構(gòu)域的基因工程可以產(chǎn)生可用于操作本發(fā)明方法的CDKA突變體，只要產(chǎn)生的CDKA含有PSTAIRE基序和T161D型突變，首選的變體類型包括由結(jié)構(gòu)域缺失、堆積或改組產(chǎn)生的那些變體(見例如He等人，Science288，2360-2363，2000;或US專利5,811,238和6,395,547)。CDKA多肽或其同源物可以由OWL4核酸分子或基因的備選的剪接變體編碼。本文所用的術(shù)語"備選的剪接變體"包括核,列的變體，其中選擇的內(nèi)含子和/或外顯子被切除、替換或添加。這樣的變體可以是編碼包含T161D型突變的多肽并且其中保留了該蛋白質(zhì)的生物活性，其可以通過選擇地保留該蛋白質(zhì)的功能區(qū)段獲得。這樣的剪接變體可以在自然中發(fā)現(xiàn)或可以人工制備。制備這樣的剪接變體的方法是本
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)熟知的。首選的剪接變體來自由SEQIDNO1代表的核酸。另外首選的是其編碼的突變的剪接變體:'A所述同源物還可以由編碼CDKA多肽或其同源物的核酸的等位變體編碼，優(yōu)選由SEQIDNOl代表的核酸的等位變體，只要由等位變體編碼的多肽具有依賴細(xì)胞周期的蛋白激酶活性且含有PSTAIRE基序和T161D型突變。天然存在且包括在本發(fā)明方法中的等位變體使用這些天然的等位基因，只要這些等位基因包含T161D型突變。等位變體包括單核苷酸多態(tài)性(SNP),以及小的插入/缺失多態(tài)性(INDEL).INDEL的大小通常小于100bp.在大多數(shù)生物天然存在的多態(tài)性品系中SNP和INDEL形成了最大類的序列變體.根據(jù)本發(fā)明首選的方面，希望增強(qiáng)或增加本發(fā)明的CDiL4核酸分子或其變體的表達(dá).得到基因或基因產(chǎn)物表達(dá)增強(qiáng)或增加的方法在本領(lǐng)域中有詳細(xì)記栽并且包括例如用適當(dāng)?shù)膯?dòng)子驅(qū)動(dòng)的過量表達(dá)、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或翻譯增強(qiáng)子的使用?？梢詫⒂米鲉?dòng)子或增強(qiáng)子元件的分離的核酸引入至多核苷酸非異源形式的適當(dāng)位置上(一般為上游)，從而上調(diào)本發(fā)明的CDJL4核酸或其變體的表達(dá).例如，可以通過突變、缺失和/或取代來體內(nèi)改變內(nèi)源啟動(dòng)子(參見Kmiec，美國(guó)專利5,565,350號(hào)；Zarling等人，PCT/US93/03868)，或者可以將分離的啟動(dòng)子以與本發(fā)明基因適當(dāng)?shù)姆较蚝途嚯x引入植物細(xì)胞中，從而調(diào)控基因的表達(dá)。如果希望多肽表達(dá)，通常需要在多核苷酸編碼區(qū)的3，-端包括多聚腺苷酸化作用區(qū)域。多聚腺苷酸化作用區(qū)域可以來自天然基因、來自多種其他植物基因或來自T-DNA.待添加的3，端序列可以來自例如胭脂氨酸合酶或章魚磁^合酶基因，或可選的來自其他植物基因，或次優(yōu)選的來自任何其他真核基因.還可以將內(nèi)含子序列添加到5，非翻譯區(qū)或部分編碼序列的編碼序列以增加在胞質(zhì)中聚集的成熟信使的量。已經(jīng)表明在植物和動(dòng)物表^)建體的轉(zhuǎn)錄單位中包含可剪接的內(nèi)含子能在mRNA和蛋白質(zhì)水平上4緣因表達(dá)增加高達(dá)1000倍(Buchman和Berg,Mol.CellBiol.8，43954405(1988);Callis等人，GenesDev.1，1183-1200(1987))。當(dāng)將內(nèi)含子置于轉(zhuǎn)錄單位的5，端附近時(shí)，此類內(nèi)含子的基因表達(dá)的增強(qiáng)通常是最大的。玉米內(nèi)含子Adhl-S內(nèi)含子l、2和6，Bronze-1內(nèi)含子的使用是本領(lǐng)域>￡^的。總體參見TheMaizeHandbook,116章，F(xiàn)reeling和Walbot編輯，Springer,N.Y.(1994).本發(fā)明還提供了遺傳構(gòu)建體和栽體，以便于引入和/或表達(dá)可用于本發(fā)明方法中的核苷酸序列.因此，本發(fā)明提供了基因構(gòu)建體，其包含(i)OWL4核酸分子或其功能性變體，該核酸或變體編碼含有PSTAIRE基序和T161D型突變的A型CDK;(ii)能驅(qū)動(dòng)(i)的核酸序列在植物中表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列；和可選的(iii)轉(zhuǎn)錄終止序列.可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的重組DNA技^l建可用于本發(fā)明方法的構(gòu)建體?？梢詫⒒驑?gòu)建體插入栽體中，該栽體是可商購(gòu)的、適于轉(zhuǎn)化到植物中并適于在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中表達(dá)目的基因的，使用包含目的序列(即根據(jù)本發(fā)明的核酸或其變體)的栽體轉(zhuǎn)化植物.將目的序列有效連接于一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列(至少連接于啟動(dòng)子).術(shù)語"調(diào)節(jié)元件"、"調(diào)控序列"和"啟動(dòng)子"在文中都可以互換使用，且應(yīng)當(dāng)取其廣義，指能影響與它們連接的序列表達(dá)的調(diào)節(jié)核酸序列。上述術(shù)語包括來源于經(jīng)典真核生物基因組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(包括精確轉(zhuǎn)錄起始所需的TATA框，含有或不含CCAAT框序列)以及應(yīng)答發(fā)育和/或外界刺激，或以組織特異性方式改變基因表達(dá)的另外的調(diào)節(jié)元件(即上游激活序列、增強(qiáng)子和沉默子)。該術(shù)語還包括經(jīng)典原核基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，在這種情況下它可以包括-35框序列和/或-10框轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列。術(shù)語"調(diào)節(jié)元件，，也包括合成的融合分子或衍生物，其賦予、激活或增強(qiáng)核酸分子在細(xì)胞、組織或器官中的表達(dá)。如本文所用的術(shù)語"有效連接"指啟動(dòng)子序列與目的基因之間的功能性連接，使得啟動(dòng)子序列能起始目的基因的轉(zhuǎn)錄。有利地，可以使用任何類型的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)核酸序列的表達(dá)。啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，即應(yīng)答發(fā)育、化學(xué)、環(huán)境或物理刺激具有誘導(dǎo)的或增加的轉(zhuǎn)錄起始。另外的或可選的啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子，即在植物的至少一種組織或器官中顯著表達(dá)，J^植物的任何生命階段顯著性表達(dá)的啟動(dòng)子.另外的或可選的，啟動(dòng)子可以是組織偏好的或細(xì)胞偏好的啟動(dòng)子，即其能夠在某些組織如葉、根、種子組織等，或甚至在特定細(xì)胞中優(yōu)選地起始轉(zhuǎn)錄.能夠僅在某些組織或細(xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子在本文中分別稱其為"組織特異性"和"細(xì)胞特異性"，優(yōu)選的，根據(jù)本發(fā)明的OWL4核酸或其變體有效連接到枝條特異性啟動(dòng)子。本文所定義的術(shù)語"枝條特異性"指的是在枝條中顯著性表達(dá)，并在植物的任何生命階段顯著性表達(dá)的啟動(dòng)子.本文所用術(shù)語"枝條"包括植物的全部地上部分，包括莖和枝條、葉、芽、生殖器官，包括枝條衍生的結(jié)構(gòu)，例如匍旬莖、球莖、根莖或塊莖.優(yōu)選地，能夠在整個(gè)枝條中偏好地表達(dá)核酸的枝條特異性啟動(dòng)子是弱啟動(dòng)子.可以例如通過將啟動(dòng)子連度和/或表達(dá)方式.本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一個(gè)合適的報(bào)告基因是P-葡糖醛酸糖苷酶。接著可以將啟動(dòng)子強(qiáng)度和/或表達(dá)方式與充分表征的枝條特異性參考啟動(dòng)子，例如Cab27啟動(dòng)子(弱表達(dá)，GenBankAP004700)或推定的原葉綠素酸酯還原酶啟動(dòng)子(強(qiáng)表達(dá)，GenBankAL606456)相比較。關(guān)于"弱啟動(dòng)子"指驅(qū)動(dòng)編碼序列以低水平表達(dá)的啟動(dòng)子，即在每個(gè)細(xì)胞中約1/10,000轉(zhuǎn)錄物至約1/100,000轉(zhuǎn)錄物，至約1/500,000轉(zhuǎn)錄物的水平.相反地，"強(qiáng)啟動(dòng)子"驅(qū)動(dòng)編碼序列以高水平表達(dá)，或在每個(gè)細(xì)胞中約1/10轉(zhuǎn)錄物至約1/100轉(zhuǎn)錄物，至約1/1000轉(zhuǎn)錄物.最優(yōu)選地，能夠在整個(gè)植物中偏好地表達(dá)核酸的啟動(dòng)子是如SEQIDNO:6代表的來自稻的金屬硫蛋白啟動(dòng)子。應(yīng)該清楚的是本發(fā)明的應(yīng)用不限于由SEQIDNO:1代表的CDX4核酸,也不限于由SEQIDNO:6的金屬硫蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Ci)X4核酸的表達(dá)。任選的，還可在引入植物的構(gòu)建體中使用一個(gè)或多個(gè)終止子序列.術(shù)語"終止子"包i^控序列，其為位于轉(zhuǎn)錄單位末端的DNA序列，標(biāo)志初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的3'加工和多聚腺苷酸化以及轉(zhuǎn)錄的終止。其他調(diào)節(jié)元件可以包括轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子以及翻譯增強(qiáng)子。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉適合用于實(shí)施本發(fā)明的終止子和增強(qiáng)子序列.此類序列是已知的，或本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易的獲得.本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體還可以包括在特定細(xì)胞類型中維持和/或復(fù)制所需的復(fù)制序列的起點(diǎn)。一個(gè)實(shí)例是需要遺傳構(gòu)建體在細(xì)菌細(xì)胞中作為附加型遺傳元件(如質(zhì)粒或黏粒分子)維持的情況.首選的復(fù)制起點(diǎn)包括但不限于fl-ori和colEl。遺傳構(gòu)建體任選地可包M擇性標(biāo)記基因.如本文所用，術(shù)語"選擇性標(biāo)記基因"包括其在細(xì)胞中的表達(dá)賦予表型，以利于細(xì)胞的鑒定和/或選擇的^r基因，所述細(xì)胞是用本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。合適的標(biāo)記可選自賦予抗生素或除草劑抗性的標(biāo)記，其引入新的新陳代謝性狀或允許可M擇。選擇性標(biāo)記基因的實(shí)例包括其編碼的蛋白質(zhì)能賦予抗生素抗性的基因(如磷酸化新霉素和卡那霉素的nptll，或砩酸化潮霉素的hpt)、其編碼的蛋白質(zhì)賦予除草劑抗性的基因(例如提供Basta抗性的bar;提供草甘膦抗性的aroA或gox),或提供陳代謝性狀的基因(如允許植物利用甘S4t作為唯一碳源的挑做j)。編碼可視標(biāo)記蛋白質(zhì)的基因?qū)е滦纬深伾?例如P-葡糖醛酸糖苷酶，GUS)、螢光(如螢光素酶)或熒光(綠色熒光蛋白，GFP，及其衍生物)。本發(fā)明還包括通過本發(fā)明方法獲得的植物或植物細(xì)胞。本發(fā)明因此提供了可通過本發(fā)明方法獲得的植物或植物細(xì)胞，在該植物或植物細(xì)胞中引入了CZ)JL4核酸或其變體，編碼含有PSTAIRE基序且具有T161D型突變的CDKA,物的方法，其包括在植物中引入和表達(dá)編碼包含PSTAIRE基序且具有T161D型突變的CZ)JL4核酸或其變體。更具體的，本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有改良的生長(zhǎng)特性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括(i)向植物或植物細(xì)胞中引入編碼包含T161D型突變的A型CDK或其同源物的核酸；和(ii)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞.可以將核酸直接引入植物細(xì)胞或植物本身(包括引入到植物的組織、器官或任何其他部分)。根據(jù)本發(fā)明首選的特征，優(yōu)選通過轉(zhuǎn)化將核酸引入植物.本文所涉及的術(shù)語"轉(zhuǎn)化"包括將外源多核苷酸轉(zhuǎn)移入宿主細(xì)胞，而不管轉(zhuǎn)移所用的方法如何.無論通過器官發(fā)生還是胚胎發(fā)生能夠隨后克隆繁殖的植物組織，可以用本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，并且從其再生出整林植物。選擇的特定組織將根據(jù)可用且最適于所轉(zhuǎn)化特定物種的克隆繁殖系統(tǒng)而改變.示例性的把標(biāo)組織包括葉盤、花粉、胚胎、子葉、下胚軸、雌配子、胼胝體組織、存在的分生組織(例如，頂端分生組織，腋生的芽和根分生組織)以:SL誘導(dǎo)的分生組織(例如，子葉分生組織和下胚軸分生組織)?？梢运矔r(shí)或穩(wěn)定的將多核苷酸引入宿主細(xì)胞中，且可保持非整合狀態(tài)，例如，作為質(zhì)粒.可選擇的，可以將其整合到宿主基因組中。接著可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，使用所得的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化的植物，植物物種的轉(zhuǎn)化目前是相當(dāng)常規(guī)的技術(shù)，有利的，可以使用任意的一些轉(zhuǎn)化方法將目的基因引入到合適的祖代細(xì)胞中.轉(zhuǎn)化方法包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、增加游離DNA私、的化學(xué)品、直接注射DNA到植物中、基因槍轟擊、使用病毒或花粉轉(zhuǎn)化以及顯微注射.方法可選自用于原生質(zhì)體的鈣/聚乙二醇方法(Krens等人，(1982)Nature296，72-74;Negrutiu等人(1987)PlantMol.Biol.8，363-373);原生質(zhì)體的電穿孔(Shillito等人，(1985)Bio/Technol3，10"-1102);顯微注射到植物材料中(Crossway等人，(l訴6)Mol.Gen.Genet.202，179-185);DNA或RNA包被顆粒轟擊(Klein等人，(1987)Nature327，70);用(非整合型)病毒感染等等。優(yōu)選使用任何用于稻轉(zhuǎn)化的熟知方法，通過農(nóng)桿菌(jgw^i"m'"iw)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生表達(dá)本發(fā)明的CDKA的轉(zhuǎn)基因稻植物，所述稻轉(zhuǎn)化的方法例如在以下任何文獻(xiàn)中描述的方法公開的歐洲專利申請(qǐng)EP1198985Al，Aldemita和Hodges(Planta，199，612-617，1996);Chan等人(PlantMol.Biol.22(3)491-506，1993)，Hid等人(PlantJ.6，271-282，1994)，公開內(nèi)容以其全文在此引用作為參考。在谷物轉(zhuǎn)化情形下，首選方法如在Ishida等人(NatureBiotechnol.14，745-50，1996)或Frame等人(PlantPhysiol.129，13-22，2002)所述，公開內(nèi)容以其全文在此引用作為參考。通常在轉(zhuǎn)化以后，選擇存在與目的基因共轉(zhuǎn)移的由植物可表il基因編碼的一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的植物細(xì)胞或細(xì)胞群，接著將轉(zhuǎn)化的材料再生成整林植物。DNA轉(zhuǎn)移和再生之后，可例如使用Sou也ern分析評(píng)價(jià)推定的轉(zhuǎn)化植物中目的基因的存在、拷貝數(shù)和/或基因組組成.可選的或另外的，可使用Northern和/或Western分析監(jiān)控新引入DNA的表達(dá)水平，兩種技術(shù)都是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的?？赏ㄟ^多種方法繁殖產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物，如通過克隆繁殖或經(jīng)典育種技術(shù).例如，第一代(或T1)轉(zhuǎn)化植物可以自交產(chǎn)生純合的第二代(或T2)轉(zhuǎn)化體，并且T2植物可通過傳統(tǒng)的育種技術(shù)進(jìn)一步繁殖.產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化生物可以是多種形式的.例如，它們可以是轉(zhuǎn)化細(xì)胞與未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的嵌合體；克隆的轉(zhuǎn)化體(例如，所有被轉(zhuǎn)化以含有表達(dá)盒的細(xì)胞)；轉(zhuǎn)化與未轉(zhuǎn)化組織的d^體(例如，在植物中，嫁接到未轉(zhuǎn)化的接穗中的轉(zhuǎn)化的根莖)。本發(fā)明顯然延及由文中描述的任何方法產(chǎn)生的任何植物細(xì)胞或植物，以及所有的植物部分及其繁殖體。本發(fā)明iE^及包括由任何上述方法產(chǎn)生的原代轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、組織、器官或整沐&物的后代，唯一的要求是該后代表現(xiàn)出與由本發(fā)明方法在親代中產(chǎn)生相同的基因型和/或表型特征.本發(fā)明還包括含有分離的植物aw核酸或其變體的宿主細(xì)胞，所述核酸或其變體編碼包含T161D型突變的A型CDK。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的宿主細(xì)胞^1植物細(xì)胞。本發(fā)明還1IX本發(fā)明植物的可收獲部分，例如但不限于種子、葉、果實(shí)、花、莖、根莖、塊莖和鱗莖。本發(fā)明另外涉及來源于，優(yōu)選直接來源于此類植物的可收獲部分的產(chǎn)物，如干的顆?；蚍?、油、脂肪和脂肪酸、淀粉和蛋白質(zhì)。本發(fā)明還包括在CDKA蛋白質(zhì)中的T161D型突變對(duì)于改良植物生長(zhǎng)特性的用途，這類改良的生長(zhǎng)特性如以上所定義。本發(fā)明還包括CWL4核酸或其變體的用途，以及CDKA多肽或其同源物的用途，該CDKA或同源物包含T161D型突變，或該OWL4核酸或變體編碼這類蛋白質(zhì)。此類的用途之一涉及改良植物的生長(zhǎng)特性，具體而言改良產(chǎn)量，特別是種子產(chǎn)量.種子產(chǎn)量可以包括下列一種或多種增加的種子總數(shù)、增加的飽滿種子數(shù)、增加的種子重量、增加的收獲指數(shù)等。CDJL4核酸或其變體，或CDKA多肽或其同源物可以用在育種方案中，其中鑒定了與CDKA基因或其變體遺傳連鎖的DNA標(biāo)記。CDJL4或其變體，或CDKA或其同源物可以用來定義分子標(biāo)記。隨后可以將此DNA或蛋白質(zhì)標(biāo)記用在育種方案中以選擇具有改良的生長(zhǎng)特性的植物.C"X4基因或其變體可以是，例如由SEQIDNO:1所代表的核酸，或編碼任意本文所定義的同源物的核酸。iE4t現(xiàn)包含T161D突變的CDJL4的等位變體可以用于標(biāo)記輔助的育種方案中.此類育種方案有時(shí)需要通過植物的誘變處理，例如使用EMS誘變引入等位變異；可選的，該方案可以從收集無意產(chǎn)生的所謂"天然"來源的等位變體開始.之后通過例如PCR進(jìn)行等位變體的鑒定.接著是選擇步驟，用于選擇所討論序列的優(yōu)良等位變體，其在植物中產(chǎn)生改良的生長(zhǎng)特性。通常通過監(jiān)控含有所討論序列的不同等位變體(例如SEQIDNO:l的不同等位變體，或編碼任意上述同源物的核酸的不同等位變體)的植物的生長(zhǎng)特性來進(jìn)行選擇，監(jiān)控生長(zhǎng)特性可以在溫室或野外進(jìn)行。此外可選的步驟包括使其中已鑒定優(yōu)良等位變體的植物與另一植物雜交.例如，這可用于產(chǎn)生目標(biāo)表型特征的組合。還可使用本發(fā)明的a"L4核酸或其變體作為探針對(duì)其為部分的基因進(jìn)行遺傳和物理作圖，以及作為那些基因有關(guān)性狀的標(biāo)志。此類信息可用于植物育種，以開發(fā)具有期望表型的品系。CZWL4核酸或其變體的此類用途僅需要長(zhǎng)度至少為is個(gè)核苷酸的核酸序列。a>JL4核酸或其變體可用作限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)記。可使用OM^核酸或其變體探測(cè)限制性消化的植物基因組DNA的Southern印跡。然后可以使用計(jì)算機(jī)程序如MapMaker(Lander等人(1987)Genomics1:174-181)對(duì)所得的帶型進(jìn)行遺傳分析，以構(gòu)建遺傳圖譜。此外，該核酸可用于探測(cè)含有限制性核酸內(nèi)切酶處理的基因組DNA的Southern印跡，所述基因組DNA來自代表親本和確定的遺傳雜交后代的一組個(gè)體。記錄DNA多態(tài)性的分離，并用來計(jì)算0>/L4核酸或其變體在先前使用該群體獲得的遺傳圖譜中的位置(Botstdn等人(198t))Am.J.Hum.Genet.32:314-331)。在遺傳作圖中植物基因來源的探針的生產(chǎn)和用途在Bernatzky和Tanksley(Genetics112，887-898，1986)中有描述。眾多出版物描述了使用上述方法或其變通形式對(duì)特定的cDNA克隆進(jìn)行遺傳作圖。例如，可使用F2雜交群體、回交群體、隨機(jī)交配群體、近等基因系及其他的個(gè)體組作圖。這類方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。核酸探針也可用于物理作圖(即將序列置于物理圖上；參見Hoheisel等人，在Non-mammalianGenomicAnalysis:APracticalGuide,Academicpress1996，第319-346頁，以及其中引用的參考文獻(xiàn))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸探針可用于直接熒光原位雜交(FISH)作圖(Trask(1991)TrendsGenet.7:149-154)。雖然現(xiàn)在的FISH作圖方法偏向于使用大的克隆(幾kb到幾百kb;參見Laan等人(1995)GenomeRes.5:13-20)，但是靈敏度的提高允許使用較短的探針進(jìn)行FISH作圖?？梢允褂煤怂徇M(jìn)行多種基于核酸擴(kuò)增方法的遺傳和物理作圖。實(shí)例包括等位基因特異性擴(kuò)增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med11:95-96)、PCR擴(kuò)增片段的多態(tài)性(CAPS;Sheffield等人(1993)Genomics16，325-332)、等位基因特異性連接(Landegren等人(1卵8)ScienceMl:1077_1080)、核苷酸延伸反應(yīng)(Sokolov(19卯)NucleicAcidRes.18:3671)、放射雜交作圖(Walter等人(1997)Nat.Genet.7:22-28)和Happy作圖(Dear和Cook(1989)NucleicAcidRes.17:6795-6807)。為實(shí)施這些方法，使用核酸序列設(shè)計(jì)和生產(chǎn)引物對(duì)用于擴(kuò)增反應(yīng)或引物延伸反應(yīng)。此類引物的設(shè)計(jì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。在使用基于PCR的遺傳作圖方法中，需要鑒定在對(duì)應(yīng)于此核酸序列的區(qū)域之上作圖的親代之間的DNA序列差異。但是這對(duì)作圖方法通常不是必要的?？梢砸源朔绞疆a(chǎn)生、鑒定和/或分離具有改變的依賴細(xì)胞周期蛋白的激酶活性、呈現(xiàn)改良的生長(zhǎng)特性的改良植物。本發(fā)明的O)J"核酸或其變體，或CDKA多肽或其同源物還可以用作生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。由于已經(jīng)表明這些分子可用于改良植物的生長(zhǎng)特性，它們也是有用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，如除草劑或生長(zhǎng)刺激物.本發(fā)明因此提供了用作生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的組合物，其包含CDJL4或其變體，或CDKA多肽或其同源物，連同合適的栽體、稀釋劑或賦形劑，所述CDKA或同源物包含T161D突變，或該CDJL4或變體編碼這樣的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生如上所述的具有改良生長(zhǎng)特性的植物。這些有利的生長(zhǎng)特性也可與其他經(jīng)濟(jì)學(xué)上有利的性狀組合，如進(jìn)一步增加產(chǎn)量的性狀、對(duì)各種脅迫的耐受性、修飾各種結(jié)構(gòu)特征和/或生化和/或生理學(xué)特征的性狀.本發(fā)明現(xiàn)在將參考以下附圖進(jìn)行描述，其中圖1給出帶有PSTAIRE基序的細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶(或A型CDK)的系統(tǒng)發(fā)生樹。圖2詳細(xì)顯示了圖1的A型CDK的聚類，圖3詳述了用于實(shí)施本發(fā)明方法的序列的實(shí)例。SEQIDNO1和SEQIDNO2代表了在實(shí)施例中使用的CDKA的核苷酸和蛋白質(zhì)序列。在SEQIDNO:1中用粗體顯示起始和終止密碼子，SEQIDNO:1和2中用粗體下劃線顯示突變。SEQIDNO:3和SEQIDNO:4是用來分離OWL4,J核酸的引物序列.SEQIDNO:5代表用于本發(fā)明的表達(dá)盒，其包括金屬石克蛋白啟動(dòng)子(內(nèi)參PROOIO9，核苷酸1-l加8)，突變的CDKA的編碼序列(內(nèi)參CDS0644-1(核苷酸1285-2170))和終止子(核苷酸2275-2709)。SEQIDNO:6是金屬硫蛋白啟動(dòng)子的序列。實(shí)施例現(xiàn)在將參考以下實(shí)施例描述本發(fā)明，所述實(shí)施例僅意在說明.DNA操作除非另外說明，重組DNA技術(shù)按照(Sambrook(2001)MolecularCloning:alaboratorymanual,第3版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,CSH，NewYork)或Ausubel等人(1994)，CurrentProtocolsinMolecularBiology，CurrentProtocols的巻1和2方案進(jìn)行。植物分子工作的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法描述于R.D.DCroy的PlantMolecularBiologyLabfax(1993)，由BIOSScientificPublicationsLtd(UK)和BlackwellScientificPublications(UK)出版.差厲義鏖使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)克隆稻并隨即誘變引入T161D取代.接著在標(biāo)準(zhǔn)M下使用HifiTaqDNA聚合酶通過PCR擴(kuò)增突變體(內(nèi)部編碼CDS0644-7)，所用引物為Prm04553(SEQIDNO3，正義)和Prm04554(SEQEDNO4，反向互補(bǔ))，其含有用于Gateway重組的AttB位點(diǎn).使用標(biāo)準(zhǔn)方法純化產(chǎn)生的PCR片段，然后進(jìn)行Gateway操作的第一步，BP反應(yīng)，在此期間，PCR片段與pDONR201質(zhì)粒體內(nèi)重組以產(chǎn)生"進(jìn)入克隆"(entryclone)(根據(jù)Gateway頃術(shù)語)，p06。質(zhì)粒pDONR201作為Gateway技術(shù)的部分購(gòu)自Invitrogen,,滋辨2:戎#^建一裙好脊必繼之在LR反應(yīng)中使用進(jìn)入克隆p06和用于稻轉(zhuǎn)化的目的栽體p03390。該栽體包含T-DNA邊界內(nèi)的功能性元件植物選擇性標(biāo)記；可視標(biāo)記表達(dá)盒；旨在與已克隆到iiA克隆中的目的序列進(jìn)行LR體內(nèi)重組的Gateway盒。用于枝條特異性表達(dá)的稻金屬硫蛋白啟動(dòng)子位于該Gateway盒的上游。LR重組步驟之后，將產(chǎn)生的含有表達(dá)盒SEQIDNO:5的表達(dá)載體p017轉(zhuǎn)化1#菌林LBA4404中，并且I^轉(zhuǎn)化到稻植物中。使轉(zhuǎn)化的稻植物生長(zhǎng)，接著檢測(cè)實(shí)施例3中所述參數(shù)。:^必琳辨^估^長(zhǎng)浙量產(chǎn)生大約15到20個(gè)獨(dú)立的T0轉(zhuǎn)化體.將初級(jí)轉(zhuǎn)化體從組織培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)移到溫室中生長(zhǎng)，并收獲Tl種子.4個(gè)事件得以保留，其中T1后M生3:l的轉(zhuǎn)基因存在/缺乏分離。對(duì)于這些事件中的每一個(gè)，通過可視標(biāo)記篩選10個(gè)包含轉(zhuǎn)基因的Tl幼苗(雜合子和純合子)，以及10個(gè)缺乏轉(zhuǎn)基因的T1幼苗(失效合子)。將選擇的T1植物轉(zhuǎn)移到溫室中。每個(gè)植物具有一個(gè)唯一的條形碼標(biāo)簽以將表型數(shù)據(jù)與對(duì)應(yīng)植物明確聯(lián)系起來。所選擇的Tl植物在10cm直徑花盆的土壤中在下列環(huán)境狀態(tài)下生長(zhǎng)光周期=11.5小時(shí)、日光強(qiáng)度=30,000勒克斯或更多、日間溫度-28匸或更高、夜間溫度=22t、相對(duì)濕度=60-70%.轉(zhuǎn)基因植物和相應(yīng)的失效合子在隨機(jī)位置上并排生長(zhǎng).從播種期到成熟期，使植物幾次通過數(shù)字成像箱。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上從至少6個(gè)不同的角度取得每^Mi物的數(shù)字圖^2048xl536像素，一千六百萬色)。收獲成熟的初級(jí)圃錐花序、裝袋并貼上條碼標(biāo)簽，然后在371C烤箱中干燥三天.隨后將圃錐花序脫粒并且收集所有的種子。使用鼓風(fēng)裝置將飽滿外殼和空外殼分開.在分離后，使用可商購(gòu)的計(jì)數(shù)器對(duì)兩批種子進(jìn)^fi十?dāng)?shù)。棄去空外殼.在分析天平上稱重飽滿的外殼并且使用數(shù)字成像測(cè)量種子的截面積。此方法得到下述一組種子相關(guān)^。這些參fcl使用圖像分析軟件以自動(dòng)方式從數(shù)字圖像中得到，并且進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。將修正不平衡設(shè)計(jì)的雙因素ANOVA(方差分析)用作統(tǒng)計(jì)模型用于植物表型特征的全面評(píng)估。對(duì)用本發(fā)明基因轉(zhuǎn)化的所有植抹全部事件的所有測(cè)量^lt進(jìn)行F測(cè)驗(yàn)。進(jìn)行F檢驗(yàn)以檢查基因?qū)λ修D(zhuǎn)化事件的效應(yīng)，并檢驗(yàn)基因的總效應(yīng)，亦稱之為#基因效應(yīng)。如果F檢驗(yàn)的值顯示數(shù)據(jù)具有顯著性，則結(jié)論是有"基因"效應(yīng)，意味著不僅基因的存在或定位引起了效應(yīng)。真實(shí)整體基因效應(yīng)的顯著性閾值設(shè)置為F測(cè)驗(yàn)的5%概率水平。為了檢查基因在事件中的效應(yīng)，即品系特異性效應(yīng)，在每一事件中使用來自轉(zhuǎn)基因植物和相應(yīng)無效植物的數(shù)據(jù)組進(jìn)行t檢驗(yàn)."無效植物"或"無效分離子"或"無效合子"是與轉(zhuǎn)基因植物以相同方式處理，但是轉(zhuǎn)基因已經(jīng)與其分離的植物。也可以將無效植物描述為純合的陰性轉(zhuǎn)化植物，將t檢驗(yàn)顯著性的閾值設(shè)定為10%概率水平.一些事件的結(jié)果可以高于此閾值或低于此閾值，這是基于這種假設(shè)，即基因可以僅在基因組中的某些位置中具有效應(yīng)，并且這一位置依賴性效應(yīng)的發(fā)生并非罕見。本文中此類基因效應(yīng)也稱為"基因的品系效應(yīng)"。通過比較t值和t分布得到p值，或者備選的，通過比較F值和F分布得到p值。p值給出了無效假設(shè)(即沒有轉(zhuǎn)基因效應(yīng))為正確的概率.將在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中得到的數(shù)據(jù)使用T2植物在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中證實(shí).選擇3個(gè)品系進(jìn)一步分析。通過監(jiān)控標(biāo)記基因表達(dá)來篩選Tl中來自陽性植物(雜合子和純合子)的一批種子.對(duì)于每一個(gè)選擇的事件，！^保存幾批雜合種子用于T2評(píng)估。在每批種子中，在溫室中種植等量的陽性和陰性植物用于評(píng)估.在T2代中評(píng)估總數(shù)為120個(gè)的轉(zhuǎn)化植物，即每個(gè)亊件有40個(gè)植物，其中有20個(gè)為轉(zhuǎn)基因陽性且20個(gè)為陰性.由于進(jìn)行了具有重疊亊件的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行組合分析.這可用于檢查兩個(gè)實(shí)驗(yàn)效應(yīng)的一致性，并且如果在這種情形下，可用于從兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中收集證據(jù)從而增加結(jié)論的可信性.使用的方法是考慮到數(shù)據(jù)的多級(jí)結(jié)構(gòu)(即實(shí)驗(yàn)_事件_分離子)的混合模型方法。通過比較卡方分布的似然比測(cè)定得到p值。當(dāng)對(duì)上述種子進(jìn)行分析時(shí)，發(fā)明A4L現(xiàn)用編碼包含T161D型突變的A型CDK的awr基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物比缺乏a)j^轉(zhuǎn)基因的植物具有增加的飽滿種子數(shù)、增加的種子總重量和增加的收獲指數(shù)。在T2代中再次得到在Tl代植物中所得的陽性結(jié)果。表4中的lt據(jù)顯示了生物量和TKW的總增加％(從T2代的單個(gè)品系的數(shù)據(jù)計(jì)算而來)和各自的p值。在與T1代結(jié)果的組合分析中重新評(píng)估這些T2數(shù)據(jù)，并且得到的p值表明觀察到的效應(yīng)具有顯著性(表4)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>飽滿種子數(shù)通過計(jì)算分離步驟后保留的飽滿外殼數(shù)確定飽滿種子數(shù)。4個(gè)測(cè)試品系中的3個(gè)顯示飽滿種子數(shù)的增加，總計(jì)為186°/。.轉(zhuǎn)基因植物相對(duì)于相應(yīng)的無效分離子產(chǎn)生飽滿種子數(shù)為62%的總增加，該增加具有統(tǒng)計(jì)顯著性(p值0.0012)。在T2代，3個(gè)測(cè)試品系的2個(gè)有增加.T2品系的平均增加為14%，這意味著增加也是統(tǒng)計(jì)顯著性的(p值為0.023).Tl和T2lt據(jù)的組合分析也確定^^基因效應(yīng)具有高顯著性(p值為0.0000)。種子總產(chǎn)量通過對(duì)從植物收獲的所有飽滿外殼稱重測(cè)量每林植物的種子總產(chǎn)量(種子總重量).4個(gè)轉(zhuǎn)基因T1品系中的3個(gè)顯示種子總重量的增加，其在43%至178%之間變化。平均而言，種子產(chǎn)量的增加為60%，且如來自F檢驗(yàn)的P值為0.0019所證明，由轉(zhuǎn)基因的存在對(duì)種子產(chǎn)量產(chǎn)生的這一IH^效應(yīng)具有顯著性。也在T2代中觀察到這些結(jié)果。3個(gè)測(cè)試的品系產(chǎn)量增加在14%和48%之間，平均值為28%。平均增加(15。/。)具有統(tǒng)計(jì)顯著性(p值為0.0392)，且Tl和T2植物的組合分析也顯示存在整體基因效應(yīng)(p值為0.0002)。收獲指數(shù)本發(fā)明中的收獲指數(shù)在本文中定義為種子總產(chǎn)量與地上面積(mmz)之間的比率，乘以因子106。所有4個(gè)測(cè)試的品系顯示增加的收獲指數(shù)范圍在9%至229%之間。收獲指數(shù)(總增加為82%)具有顯著性的整體基因效應(yīng)(與轉(zhuǎn)基因的存在相關(guān)的效應(yīng))，其F檢驗(yàn)的p值為0.0000具有統(tǒng)計(jì)顯著性，在T2植物中獲得相似的效果。收獲指數(shù)顯示17%的總增加(p值為0.0110)。同樣的，Tl和T2數(shù)據(jù)的組合分析顯示^^基因效應(yīng)(p值為0.0000)。此外，有種子總數(shù)增加的趨勢(shì)。4個(gè)Tl品系中的3個(gè)顯示種子總數(shù)的增加(總增加為15%),這些結(jié)果在T2代中被證實(shí)(總增加9。/。)，且根據(jù)組合分析這些增加表現(xiàn)為顯著性(p值為0.0211),權(quán)利要求1.相對(duì)于相應(yīng)的對(duì)照植物，改良植物生長(zhǎng)特性的方法，其包括調(diào)節(jié)含有T161D型突變的A型CDK在植物中的活性，和/或調(diào)節(jié)編碼這類A型CDK的核酸的表達(dá)，以及任選地選擇具有改良的生長(zhǎng)特性的植物。2.權(quán)利要求1的方法，其中通過優(yōu)選在編碼A型CDK基因的基因座引入遺傳^^來實(shí)現(xiàn)所述活性的調(diào)節(jié)。3.權(quán)利要求2的方法，其中通過定點(diǎn)誘變、同源重組、定向進(jìn)化和TILLING之一實(shí)現(xiàn)所述遺傳修飾。4.改良植物生長(zhǎng)特性的方法，包括在植物中導(dǎo)入和表達(dá)編碼含有T161D型突變的A型CDK的核酸。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述編碼含有T161D型突變的A型CDK的核酸在植物中是it^達(dá)的.6.根據(jù)權(quán)利要求4或5中任一項(xiàng)的方法，其中編碼含有T161D型突變的A型CDK的所述核酸來源于植物，優(yōu)選來自單子葉植物，更優(yōu)選來7.根據(jù)權(quán)利要求4到6中任一項(xiàng)的方法，其中編碼含有T161D型突啟動(dòng)子。8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述啟動(dòng)子具有與SEQIDNO:6的稻金屬硫蛋白啟動(dòng)子相似的表達(dá)鐠.9.推4t權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)的方法，其中所述改良的植物生長(zhǎng)特性為相對(duì)于相應(yīng)的野生型植物增加的產(chǎn)量.10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述增加的產(chǎn)量為增加的種子產(chǎn)量。11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述增加的種子產(chǎn)量選自下列中的任一項(xiàng)或多項(xiàng)(i)增加的種子重量；(ii)增加的種子總數(shù)；(iii)增加的飽滿種子數(shù)；(iv)增加的收獲指數(shù)。12.根據(jù)權(quán)利要求1到11中任一項(xiàng)的方法可獲得的植物、植物部分或植物細(xì)胞。13.構(gòu)建體，其包含(i)C7WL4核酸分子或其功能性變體，該核酸或變體編碼包含PSTAIRE基序和T161D型突變的A型CDK;(ii)能夠驅(qū)動(dòng)(i)的核酸序列在植物中表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列；和任選的(iii)轉(zhuǎn)錄終止序列。14.根據(jù)權(quán)利要求13的構(gòu)建體，其中所述調(diào)控序列能夠在枝條中驅(qū)動(dòng)表達(dá)，15.根據(jù)權(quán)利要求14的構(gòu)建體，其中所述調(diào)控序列具有與SEQIDNO:6的稻金屬硫蛋白啟動(dòng)子相似的表達(dá)鐠。16.使用根據(jù)權(quán)利要求13到15的任一項(xiàng)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物、植物部分或植物細(xì)胞。17.生產(chǎn)具有改良的生長(zhǎng)特性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法包括(i)向植物或植物細(xì)胞中導(dǎo)入編碼包含T161D型突變的A型CDK或其同源物的核酸；(ii)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞.18.向植物中導(dǎo)入編碼^^有T161D型突變的A型CDK的核酸而產(chǎn)生的具有改良的生長(zhǎng)特性的轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞.19.根據(jù)權(quán)利要求12、16或18的植物、植物部分或植物細(xì)胞，其中所述植物是單子葉植物，如甘蔗，或其中該植物是谷類，如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、燕麥或高粱。20.根據(jù)權(quán)利要求12、16、18或19的任一項(xiàng)的植物可收獲的部分和/或來自所述植物的產(chǎn)物。21.根據(jù)權(quán)利要求20的可部分，其中所述可收獲部分是種子。22.含有T161D型突變的A型CDK的用途，或者編碼這樣的CDK的核酸的用途，所述用途為改良植物的生長(zhǎng)特性，特別是改良產(chǎn)量，尤其是種子產(chǎn)量中。23.根據(jù)權(quán)利要求22的用途，其中所述種子產(chǎn)量包括下列的一項(xiàng)或多項(xiàng)增加的種子總數(shù)、增加的飽滿種子數(shù)、增加的種子總重量和增加的收獲指數(shù)。24.編碼含有T161D型突變的A型CDK的核酸作為分子標(biāo)記的用途。25.分離的核酸分子，選自以下組成的組(i)編碼由SEQIDNO:2代表的M酸序列的核酸分子；(ii)編碼由SEQIDNO:2代表的^J^酸序列的同源物、衍生物或活性片段的核酸分子，所述同源物、衍生物或活性片段來源于植物并且包含PSTAIRE基序和T161D型突變；(iii)能夠與上述(i)或(ii)的核酸或其互補(bǔ)鏈雜交的核酸分子，其中雜交序列或其互4喊編碼包含PSTAIRE基序和T161D型突變的植物CDKA;(iv)根據(jù)(i)至(iii)中任一項(xiàng)的核酸的等位變體，該等位變體編碼含有PSTAIRE基序和T161D型突變的植物CDKA蛋白質(zhì)；和(v)根據(jù)(i)至(iH)中任一項(xiàng)的核酸可選的剪接變體，該可選的剪接變體編碼包含PSTAIRE基序且含有T161D型突變的植物CDKA蛋白質(zhì)。26.分離的A型CDK突變體，選自以下組成的組(i)由SEQIDNO:2M的M^^列；(ii)由SEQIDNO:2代表的蛋白質(zhì)的同源物和/或衍生物，該同源物或衍生物來源于植物并且包含T161D型突變；(iii)如在(i)或(ii)中定義的氨基酸序列的活性片段，該活性片段包含T161D型突變。27.包含核酸分子的組合物，所述核酸分子編碼含有T161D型突變的植物來源的A型CDK。28.包含具有T161D型突變的植物來源的A型CDK的組合物。全文摘要本發(fā)明涉及改良植物生長(zhǎng)特性的方法，其通過調(diào)節(jié)植物中突變CDKA激酶或其同源物的活性和/或調(diào)節(jié)編碼這類突變CDKA的核酸的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。此類方法包括將突變的CDKA核酸分子或其突變的功能性變體導(dǎo)入植物。本發(fā)明還提供分離的CDKA突變蛋白質(zhì)和編碼這類蛋白質(zhì)的核酸。本發(fā)明還涉及具有改良的生長(zhǎng)特性的轉(zhuǎn)基因植物，該植物具有調(diào)節(jié)的核酸表達(dá)，所述核酸編碼突變的CDKA激酶。本發(fā)明還涉及用于本發(fā)明方法中的構(gòu)建體。文檔編號(hào)C12N9/12GK101107363SQ200580047166公開日2008年1月16日申請(qǐng)日期2005年11月30日優(yōu)先權(quán)日2004年12月1日發(fā)明者W·范坎普申請(qǐng)人:克羅普迪塞恩股份有限公司