專利名稱：：瘦素拮抗劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及瘦素(leptin)拮抗劑，尤其涉及瘦素突變體以及包含它們的藥用組合物。
背景技術(shù)：
：瘦素是基因的產(chǎn)物，據(jù)報(bào)道它可通過其受體(稱作OB-R)調(diào)節(jié)大腦飽食中樞(satietycenters)的活性來抑制食欲，并影響體重(FriedmanandHalaas,1998)。不過進(jìn)一步的研究顯示瘦素受體在許多其它組織中都有表達(dá)(Cio伍etal.,1996;Emilssonetal.,1997;Hoggardetal.,1997;Glasowetal.,1998;Briscoeetal.,2001),i兌明瘦素涉及的各種生物功能比從前所預(yù)期要多。系統(tǒng)研究證實(shí)瘦素的血清水平在多種肥胖動(dòng)物^t型和在肥胖人體中都升高(Dagogo-Jacketal.,1996)。有報(bào)道稱OB多肽或"瘦素"降低了遺傳性肥胖小鼠(ob/ob)血漿中胰島素和葡萄糖的水平(Pelleymounteretal.,1995)。目前尚無證據(jù)表明人肥胖的頻繁發(fā)生可能由ob基因的突變而引起。美國(guó)專利6,309,853公開了OB多肽及其片段，及其用于調(diào)節(jié)體重的用途。非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)或II型糖尿病是由脂肪組織、肝臟特別是骨骼肌中對(duì)胰島素的拮抗所引起的。因此即使高胰島素血癥(hyperinsulinaemia),也沒有足夠的胰島素來補(bǔ)償胰島素拮抗作用并將血糖維持在希望的范圍內(nèi)。美國(guó)專利6,399,745^Hf了用人或鼠瘦素片段的瘦素拮抗劑，來治療II型糖尿病和糖尿病患者的胰島素拮抗。美國(guó)專利申請(qǐng)No.2004/0048773^Hf了使用痩素拮抗劑來治療由胰島素分泌不足所引起的失調(diào)和高血糖癥，但是該申請(qǐng)沒有公開具體的瘦素拮抗劑。美國(guó)專利申請(qǐng)No.2004/0072219公開了一種具有人瘦素生物活性的被修飾的分子，該分子在體內(nèi)使用時(shí)基本沒有免疫原性，或者比過計(jì)算機(jī)建模方法設(shè)計(jì)出了所公開的變異瘦素蛋白，但它們既未被合成，也未^L檢驗(yàn)過。這些突變體改變了T細(xì)胞表位，優(yōu)選通過替換一個(gè)唯一氨基酸來改變這些突變體的T細(xì)胞表位，來降低或除去免疫原位點(diǎn)，同時(shí)維持瘦素生物活性。所公開的序列長(zhǎng)13mer，其中天然人瘦素的第39、41或42位氨基酸殘基被丙氨酸所替換。肥胖被認(rèn)為可能會(huì)引起許多癌癥。胖人的血清瘦素水平通常升高。瘦素在許多組織中發(fā)揮了促有絲分裂的功能，因此它可能會(huì)啟動(dòng)癌癥細(xì)胞生長(zhǎng)。事實(shí)上體外實(shí)驗(yàn)已表明，瘦素作為前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)因子發(fā)揮功能，引起前列腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)因子的表達(dá)，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子pi(TGF-(31、石咸性纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)),還促進(jìn)了前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。(Somasundaretal.,2004;Frankenberryetal.,2004)瘦素除了在大腦中發(fā)揮調(diào)節(jié)食物攝取和能量消耗的重要功能外，也作為一種正常和乳癌細(xì)胞生長(zhǎng)的潛在生長(zhǎng)激素。最近也有研究表明瘦素在體外可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的增殖(Choietal.,2004)。近來發(fā)現(xiàn)在幾種動(dòng)物疾病才莫型中，瘦素啟動(dòng)輔助性T淋巴細(xì)胞l(Thl)分化并調(diào)節(jié)自體免疫反應(yīng)的開始和發(fā)展(LaCavaandMatarese,2004)。如果瘦素在Thl介導(dǎo)的自體免疫疾病和炎癥疾病(如炎癥性腸病)中發(fā)揮了基礎(chǔ)性作用，則能預(yù)計(jì)到治療效果可通過阻遏外周痩素作用(peripheralleptinaction)實(shí)現(xiàn)(Matareseetal.,2005)。還發(fā)現(xiàn)瘦素參與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制，并參與實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimentalautoimmuneencephalomyelitis,EAE)(—種多發(fā)性硬化(小鼠模型))的發(fā)展。(Peelmanetal.,2004)。發(fā)明概述現(xiàn)在我們發(fā)現(xiàn)依據(jù)本發(fā)明，通過降低39-42位哺乳動(dòng)物瘦素結(jié)合位點(diǎn)的疏水性，可得到具有瘦素拮抗劑活性的瘦素突變體。因此，本發(fā)明一方面提供了一種合成的瘦素拮抗劑，其中天然瘦素多肽序列39-42位疏水結(jié)合位點(diǎn)的序列LDFI/S中至少兩個(gè)氛基酸殘基被替換為不同氨基酸殘基，從而降低該位點(diǎn)的疏水性，還提供了所述瘦素拮抗劑的片段。另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的DNA分子，該分子編碼所述痩素拮抗劑。再一方面，本發(fā)明提供了一種藥用組合物，該組合物包含所述的合成瘦素拮抗劑或其片段，及一種藥學(xué)上可接受的載體。附圖簡(jiǎn)述圖1A-1C顯示分離的人和綿羊瘦素重組體的純度測(cè)定。(A)凝膠過濾分析，(B)SDS-PAGE分析(15。/o凝膠)，1-5泳道對(duì)應(yīng)野生型(WT)人瘦素、L39A/D40A、F41A/I42A、L39A/D40A/F41A和L39A/D40A/F41A/I42A瘦素突變體，6-10泳道為WT綿羊瘦素及其突變體，(C)反相色譜。圖2顯示了對(duì)雞痩素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(chLBD)與人或綿羊瘦素復(fù)合體在Superdex75HR10/30柱的凝膠過濾分析。在TN緩沖液中按不同摩爾比于室溫下溫育20min以形成復(fù)合體，然后每份取200^1混合物上樣，層析柱用相同緩沖液預(yù)平衡。所有實(shí)驗(yàn)中瘦素的起始濃度均恒定(IOnM)。流速為0.8ml/ml,使柱展開(devdoped)，并用牛血清白蛋白(66kDa)、綿羊胎盤催乳素(23kDa)和溶菌酶(14kDa)校準(zhǔn)柱子。洗脫時(shí)通過220nm處的吸光度來監(jiān)測(cè)蛋白濃度。圖3A-3B顯示用經(jīng)長(zhǎng)型(longform)人瘦素受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了的BAF3細(xì)胞的放射性受體測(cè)定(RRA)。使用1251-綿羊瘦素作為配體，使用人(A)或綿羊(B)瘦素或其類似物作為竟?fàn)幬?。圖4A-4B顯示了人瘦素L39A/D40A/F41A/I42A突變體對(duì)瘦素活性的抑制。(A)在人成神經(jīng)細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞生物測(cè)試中，對(duì)由痩素所誘導(dǎo)的MAPK(erkl/2)磷酸化的抑制，(圖上部描繪了提高痩素劑量的效果)(B)在CHO細(xì)胞中(經(jīng)瘦素受體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染并用6.25nM人瘦素刺激)對(duì)瘦素誘導(dǎo)的安光素酶報(bào)告基因反式激活的抑制。圖5顯示了疏水團(tuán)分析(HCA)。該分析4R設(shè)瘦素位點(diǎn)III與瘦素受體(LEPR)的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(IGD)間的相互作用類似于IL-6與gpl30間的相互作用。突出顯示的疏水團(tuán)主要對(duì)應(yīng)所考慮蛋白的規(guī)則二級(jí)結(jié)構(gòu)，如圖6所示。圖6顯示了病毒IL-6(vIL-6)與gpl30的IGD結(jié)構(gòu)域(上部)和相應(yīng)的人瘦素(下部)間相互作用的對(duì)比3D模型vIL-6與gpl30(上部，僅顯示一個(gè)gpl30分子的Dl結(jié)構(gòu)域，用示于左方的灰色帶代表)間形成復(fù)合體，而人瘦素保持分離狀態(tài)，從中可以觀察到位點(diǎn)m—vIL-6實(shí)驗(yàn)性結(jié)構(gòu)的對(duì)比，因?yàn)樵陔娮用芏葓D中沒有觀察到殘基的無序AB環(huán)(底部，橙色點(diǎn)虛線)。根據(jù)結(jié)構(gòu)性保守螺旋(rmsd2.2疊加在89C±原子上對(duì)比)疊加對(duì)比(superimposed)這兩個(gè)結(jié)構(gòu)。在底部用橙色表示瘦素的Tyrl19殘基。發(fā)明詳述對(duì)瘦素三級(jí)結(jié)構(gòu)的解析揭示了它與長(zhǎng)鏈細(xì)胞因子超家族間的關(guān)聯(lián)性(Zhangetal.,1997)。雖然已經(jīng)確定了瘦素受體的三級(jí)結(jié)構(gòu)，但是對(duì)它的氨基酸序列分析表明它與細(xì)胞因子受體家族I的受體具有高度相似性，如生長(zhǎng)激素(GH)受體、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)受體、白介素-6(IL-6)受體和紅細(xì)胞生成素(EPO)受體。這個(gè)家族的受體在胞外部分具有多個(gè)相似結(jié)構(gòu)域，如C2、CK和F3。與G-CSFR類似，痩素受體具有兩個(gè)重復(fù)的CK-F3結(jié)構(gòu)域，這表明該區(qū)域是配體結(jié)合位點(diǎn)(WellsanddeVos,1996;Livnahetal,，1999;Aritomietal,,1999)。Fong等人將瘦素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LBD)定位在瘦素受體胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)中接近膜的(membrane-proximal)的CK-F3結(jié)構(gòu)域上(200個(gè)氨基酸)(Fongetal.1999)。不過最近的研究數(shù)據(jù)顯示瘦素與其受體間的結(jié)合更加類似于IL-6與其受體間的相互作用(Boulangeretal,2003;Muller-Newen2003)，而定位在遠(yuǎn)端和近端CK-F3之間的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(immunoglobulin-likedomain(IGD))是生產(chǎn)性(productive)瘦素受體二聚作用所必需的(Zabeauetal.2004)。由于沒有任何關(guān)于瘦素受體3D結(jié)構(gòu)的信息，所以可考慮兩個(gè)可能的才莫型。一個(gè)模型，是GH/GHR所特有的，或者是泌乳刺激素(PRL)/PRLR或EPO/EPOR所特有的，其特征在于激素誘導(dǎo)的受體同二聚化(它使并列Jak2發(fā)生相互轉(zhuǎn)磷酸化)(DeVosetal.,1992)，而另一個(gè)模型則建議利用IL-6(Muller-Newen,2003)。在后一模型中逐步形成一個(gè)六聚體，首先是IL-6分子與IL-6R-a發(fā)生相互作用，然后再與gpl30發(fā)生相互作用形成一個(gè)無活性的三聚體，這個(gè)三聚體再二聚化形成一個(gè)活性六聚體。一個(gè)三聚體中的IL-6通過其位點(diǎn)m與另一個(gè)三聚體中g(shù)pl30的IGD發(fā)生相互作用，即形成了六聚體(Boulangeretal.,2003;Muller-Newen，2003)。為了評(píng)估所推測(cè)的瘦素結(jié)合位點(diǎn)m和IGD之間可能的相互作用位點(diǎn)，我們根據(jù)瘦素受體與gpl30(已知它的3D結(jié)構(gòu))的序列比對(duì)建立了瘦素受體^t型。然后將瘦素與IL-6/gp130復(fù)合體的vIL-6進(jìn)行匹配對(duì)比(fiton)(根據(jù)四個(gè)保守才莫塊(conservedblock)的疊力口對(duì)比(superimposition))，將痩素受體IGD與gpl30IGD進(jìn)行匹配對(duì)比。盡管缺少AB環(huán)(loop)的信息，我們?nèi)匀昏b定了瘦素的39-42位氨基酸(在豬中為L(zhǎng)DFS序列，其它哺乳動(dòng)物中為L(zhǎng)DFI序列)，這段序列在所有種類的瘦素都存在，#支推測(cè)為與IGD發(fā)生作用的主要序列。為了證實(shí)這個(gè)假設(shè)并檢驗(yàn)其一般性，我們制備并純化(至均質(zhì))了4個(gè)綿羊和4個(gè)人瘦素重組體(它們?cè)谏鲜鰠^(qū)域發(fā)生丙氨酸突變)，并表明它們能用作竟?fàn)幮赞卓箘?。因此本發(fā)明提供一種合成的瘦素拮抗劑，其中天然哺乳動(dòng)物瘦素多肽序列39-42位疏水結(jié)合位點(diǎn)LDFI/S序列中至少兩個(gè)氨基酸殘基被替換為不同氨基酸殘基，從而降低該位點(diǎn)的疏水性，還提供了所述瘦素拮抗劑的片段。這里所用的術(shù)語(yǔ)"哺乳動(dòng)物"包括人類和其它哺乳動(dòng)物。因此依據(jù)本發(fā)明，天然瘦素可以是人瘦素或者是非人的哺乳動(dòng)物的瘦素，例如但不僅限于綿羊、大鼠、小鼠、馬和豬痩素。LDFI/S序列代表了人類和非人的哺乳動(dòng)物瘦素(豬除夕卜)的39-42LDFI序列，也代表了豬痩素的39-42LDFS序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述痩素為人痩素。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述瘦素為綿羊痩素。這里所用的術(shù)語(yǔ)"痩素拮抗劑"和"瘦素突變體"可交換使用，是指哺乳動(dòng)物痩素多肽，該肽相應(yīng)于野生型人類或非人哺乳動(dòng)物瘦素序列，其3942位氨基酸中至少有兩個(gè)被其它氨基酸所替換，以降低這個(gè)位點(diǎn)的疏水性。"哺乳動(dòng)物瘦素多肽，，包括天然存在的哺乳動(dòng)物瘦素多肽和其具有生物活性的突變體，以及天然存在的瘦素和其突變體的生物活性片段。"突變體"指與哺乳動(dòng)物瘦素不同但保留其基本特性的多肽。根據(jù)本發(fā)明，野生型哺乳動(dòng)物瘦素的39-42位氨基酸殘基中至少有兩個(gè)可被一個(gè)或多個(gè)選自丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸和絲氨酸的氨基酸殘基替換。在首選的實(shí)施方案中，所述氨基酸殘基為丙氨酸。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物痩素多肽序列39-42位氨基酸殘基中有任意兩個(gè)殘基在任意位置被丙氨酸替換，例如替換39、40位，或39、41位，或39、42位，或40、41位，或40、42位，或41、42位。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有兩個(gè)丙氨酸替換的瘦素拮抗劑來源于人瘦素。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，人瘦素拮抗劑是在第39和40位攜帶兩個(gè)丙氨酸突變的人痩素重組多肽，本文稱為人瘦素L39A/D40A突變體(SEQIDNO:1)。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，人瘦素拮抗劑是在第41和42位攜帶兩個(gè)丙氨酸突變的人瘦素重組多肽，本文稱為人瘦素F41A/I42A突變體(SEQIDNO:2)。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，具有兩個(gè)丙氨酸替換的痩素拮抗劑來源于綿羊瘦素。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，綿羊瘦素拮抗劑是在第39和40位攜帶兩個(gè)丙氨酸突變的綿羊瘦素重組體，本文稱為綿羊瘦素L39A/D40A突變體(SEQIDNO:3)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，綿羊瘦素拮抗劑是在第41和42位攜帶兩個(gè)丙氨酸突變的綿羊瘦素重組多肽，本文稱為綿羊瘦素F41A/I42A突變體(SEQIDNO:4)。在本發(fā)明的再一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，瘦素多肽序列的39-42位氨基酸殘基中有任意三個(gè)在任意位置被丙氨酸替換，例如替換39、40、41位，或39、40、42位，或39、41、42位，或40、41、42位。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，具有三個(gè)丙氨酸替換的瘦素拮抗劑來源于人瘦素。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，人瘦素拮抗劑是在第39、40和41位攜帶三個(gè)丙氨酸突變的人痩素重組多肽，本文稱為人瘦素L39A/D40A/F41A突變體(SEQE)NO:5)。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，具有三個(gè)丙氨酸替換的痩素拮抗劑來源于綿羊瘦素。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，綿羊瘦素拮抗劑是在第39、40和41位攜帶三個(gè)丙氨酸突變的綿羊瘦素重組多肽，本文稱為綿羊瘦素L39A/D40A/F41A突變體(SEQIDNO:6)。在本發(fā)明的再一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，瘦素多肽序列的39-42位氨基酸殘基的四個(gè)均被丙氨酸替換。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有四個(gè)丙氨酸替換的瘦素拮抗劑來源于人瘦素，并且是在第39、40、41和42位攜帶四個(gè)丙氨酸突變的人瘦素重組體，本文稱為人瘦素L39A/D40A/F41A/I42A突變體(SEQIDNO:7)。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，具有四個(gè)丙氨酸替換的瘦素拮抗劑來源于綿羊瘦素，并且是在第39、40、41和42位攜帶四個(gè)丙氨酸突變的綿羊瘦素重組體，本文稱為人痩素L39A/D40A/F41A/I42A突變體(SEQIDNO:8)。另一方面，本發(fā)明涉及一種分離的DNA分子，該分子編碼本發(fā)明的瘦素拮抗劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的DNA分子編碼一種來源于人瘦素的瘦素拮抗劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種DNA分子為SEQIDNO:9并編碼人瘦素L39A/D40A雙突變體。在另一實(shí)施方案中，DNA分子為SEQIDNO:10并編碼人瘦素F41A/I42A雙突變體。在再一個(gè)實(shí)施方案中，分離的DNA分子編碼的瘦素拮抗劑來源于綿羊瘦素。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，DNA分子為SEQIDNO:11并編碼綿羊瘦素L39A/D40A雙突變體。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，DNA分子為SEQIDNO:12并編碼綿羊瘦素F41A/I42A雙突變體。本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，DNA分子為SEQIDNO:13并編碼人瘦素L39A/D40A/F41A三突變體。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，DNA分子為SEQIDNO:14并編碼綿羊瘦素L39A/D40A/F41A三突變體。在再一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，DNA分子為SEQIDNO:15并編碼人瘦素L39A/D40A/F41A/I42A四突變體。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，DNA分子為SEQIDNO:16并編碼綿羊痩素L39A/D40A/F41A/I42A四突變體。為制備本發(fā)明的瘦素突變體，通過本領(lǐng)域熟知的方法對(duì)oZ)基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，例如使用商品試劑盒。篩選這些突變并通過測(cè)序確認(rèn)突變的正確性，分離突變質(zhì)粒，使用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞并用來表達(dá)瘦素突變體。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及到合成瘦素拮抗劑片段。與全長(zhǎng)瘦素多肽拮抗劑一樣，所述片段包含一個(gè)位于39-42位氨基酸的突變位點(diǎn)，而所述片段本身就是瘦素拮抗劑。在再一實(shí)施方案中，本發(fā)明的合成痩素拮抗劑凈支聚乙二醇化修飾(PEGylated)，連接有可變數(shù)目的聚乙二醇(PEG)分子。適用的PEG分子量為46kD或40kD。聚乙二醇化修飾增進(jìn)了本發(fā)明的瘦素拮抗劑的穩(wěn)定性、血漿半衰期和藥代動(dòng)力學(xué)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的合成瘦素拮抗劑^^口上SP1植物蛋白標(biāo)簽(Dganyetal.,200勺并發(fā)生寡聚化(oligomerized),從而得到分子量更高、對(duì)受體親和力更強(qiáng)的產(chǎn)物。嵌合的SPl-瘦素拮抗劑蛋白自發(fā)組裝形成穩(wěn)定的寡聚物形式，直至形成十二單體聚合物(dodecamer)。另一方面，本發(fā)明提供了一種藥用組合物，包括本發(fā)明的合成瘦素拮抗劑和藥學(xué)上可接受的載體。這種藥用組合物用于治療任何涉及到內(nèi)生瘦素的不希望的或有害活性的疾病，如II型糖尿病、厭食癥、癌癥和自身免疫疾病如多發(fā)性硬化癥、炎癥性腸病和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中提供了一種藥用組合物來治療II型糖尿病和胰島素抵抗，尤其是伴發(fā)肥胖的人類或其它哺乳動(dòng)物的上述疾病。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，藥用組合物可用于抑制惡性細(xì)胞生長(zhǎng)，從而可用于治療癌癥，如但不僅限于乳癌、結(jié)腸癌、卵巢癌和前列腺癌?？墒褂靡环N或多種生理學(xué)上可接受的栽體或賦形劑，按照常規(guī)方法對(duì)本發(fā)明的藥用組合物進(jìn)行配制。載體必須是"可接受的"，即必須與組合物中的其它成分相容并且對(duì)其受體無害。本發(fā)明藥用組合物的給藥方法包括但不僅限于注射如靜脈注射、M內(nèi)注射、肌肉注射、皮下注射、粘膜途徑(如口頭、鼻內(nèi)、口腔、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、目艮內(nèi))、腦脊髓膜內(nèi)、局部和皮內(nèi)途徑。給藥可以是全身或局部給予。另一方面，本發(fā)明涉及對(duì)II型糖尿病的治療方法，包括給予糖尿病患者有效劑量的本發(fā)明的瘦素拮抗劑或其片段。再一方面，本發(fā)明涉及對(duì)癌癥的治療方法，包括給予癌癥患者有效劑量的本發(fā)明的瘦素拮抗劑或其片段。本發(fā)明的瘦素拮抗劑除了其可能的藥學(xué)應(yīng)用外，還可用作研究瘦素激素的生物活性的研究工具。本發(fā)明將通過以下非限制性實(shí)施例來闡述。實(shí)施例材料與方法(i)材料如先前所述(Gertler"1998,Raverefa/.2002)在我們的實(shí)驗(yàn)室中制備人和綿羊瘦素。類似的，也制備了重組雞瘦素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(chLBD),用以制備人LBD(Sandowskietal2002,Raveretal2003)。在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中使用的限制性酶來自Fermentas(Vilnius,Lithuania)和NewEnglandBiolabs(Beverly,MA)。高純度DNA引物由SigmaCo.(RehovotIsrael)合成。RPMI-1640培養(yǎng)基、白介素-3(IL-3)、萘啶酮酸和溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鐳(漆唑藍(lán)，MTT)購(gòu)自SigmaChemicalCo.(St.Louis，MO)，胎牛血清(FCS)來自BiolabCo.(Jerusalem,Israel),pTrc99A表達(dá)載體、Superdex75HR10/30層析柱、Q-Sepharose來自PharmaciaLKBBiotechnologyAB(Uppsala,Sweden)。研究級(jí)別的CM5傳感器芯片、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、N-乙基-N，-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、乙醇胺-HCl和HBS-EP電泳緩沖液(runningbuffer)(10mMHepes、150mMNaCl、3.4mMEDTA和0.005%(v/v)表面活性劑P20,pH7.4)購(gòu)自Biacore,AB(Uppsala,Sweden)。所有其它化學(xué)試劑均為分析純。(ii)純度和單體舍量的測(cè)定根據(jù)Laemmli所述方法(Laemmli,1970)在還原態(tài)條件下在15%聚丙烯酰胺皿上進(jìn)行SDS-PAGE。用考馬斯亮藍(lán)R對(duì)膠進(jìn)行染色。使用Superdex75HR10/30層析柱進(jìn)行凝膠過濾層析，使用TN緩沖液(25mMTris-HCl，150mMNaCl，pH8)得到每份為0.2ml的QSepharose柱-洗出液。使用Vydax柱進(jìn)行反相色譜，使用的梯度展開液為0.1%的TFA水溶液(溶劑A)和0.1%TFA的MeCN溶液(溶劑B)。(iii)圓二色(CD)鐠的測(cè)定使用AVIVmodel62ADS圓二色譜儀(Lakewood,NJ)和0.020-cm的矩形QSHellma比色皿測(cè)量CD鐠(毫度)。用樟腦磺酸校準(zhǔn)色譜儀。使用AVIVmodel17DSUV-可見光IR分光光度計(jì)和1.000-cmQS比色亞，光^:射4交正后測(cè)量吸收i普。通過Q瓊脂糖凝膠洗提濃縮chLBD后，在20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.5)中透析24h,然后ll,OOOg轉(zhuǎn)速離心15min。使用Peltier熱電元件在25.0。C測(cè)量CD作為對(duì)照，精確到0.1。C。重復(fù)測(cè)量CD譜5次，最后得到平均CD譜。222nm處的平均CD信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差在5%范圍內(nèi)。為確定二級(jí)結(jié)構(gòu)，將CD數(shù)據(jù)以度*厘米2/分摩*(deg*cm2/dmol)為單位，根據(jù)殘基各自的分子量(蛋白計(jì)算值為16kD,由147個(gè)氨基酸殘基組成)，以每平均殘基的單位數(shù)量來表示因?yàn)橐阎诒磉_(dá)過程中N末端的Met-Ala#:碎皮水解(數(shù)據(jù)未顯示)。通過應(yīng)用該過程和CONTIN(ProvencherandGlockner,1981)軟件計(jì)算痩素和痩素突變體的二級(jí)結(jié)構(gòu)。該軟件確定構(gòu)成a-螺旋、P-折疊股(strand)和p-轉(zhuǎn)角這些規(guī)則構(gòu)象的氨基酸殘基所占的百分比。將無規(guī)則構(gòu)象的殘基作為一個(gè)整體而確定，它是減去所有上述二級(jí)結(jié)構(gòu)元件總和后所得的百分比值(VenyaminovandYang,1996)。在本研究中為了使用CONTIN進(jìn)行計(jì)算，使用一套17蛋白的標(biāo)準(zhǔn)CD譜(SreeramaandWoody,1993)。(iv)復(fù)合體化學(xué)計(jì)量學(xué)的確定在TN緩沖液中制備不同摩爾濃度的復(fù)合體，包括chLBD和人(或綿羊)痩素(或瘦素突變體)之間的復(fù)合體。在比例1:1時(shí)，蛋白終濃度為10mM。室溫下溫育20min，然后使200pl樣品通過用TN緩沖液預(yù)平衡的Superdex75HR10/30層析柱。為了確定復(fù)合體的分子量，用幾種純蛋白校準(zhǔn)柱子。(v)瘦素和痩素突變體與chLBD間相互作用的動(dòng)力學(xué)測(cè)量所有實(shí)驗(yàn)均在25°C下用表面等離振子共振(SurfacePlasmonResonance,SPR)進(jìn)4亍。<吏用Biacore3000系統(tǒng)(Uppsala,Sweden)確定人和雞重組LBD與雞和hLep間相互作用的動(dòng)力學(xué)和平衡常數(shù)。使用胺-偶合化學(xué)法(Johnssonetal.,1991)，將瘦素(人、綿羊或雞)固定在研究級(jí)別的CM5(羧曱基葡聚糖)傳感器芯片流量池中。固定步驟在HBS-EB緩沖液中進(jìn)行，流速為5nl/min。使用0.05MN-羥基丁二酰亞胺和0.2MN-乙基-N，(3-二甲M丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽的混合物活化表面7min。注射50pg/ml的瘦素乙酸鹽緩沖液(IOmM,pH3.5)，直到達(dá)到所需水平(1000個(gè)共振單位)。注射乙醇胺(1M,pH8.5)7min以封阻剩余的活化基團(tuán)。通過活化J^基團(tuán)并隨后如上文所迷用乙醇胺封阻活化基團(tuán)，來制備對(duì)照表面。為了研究結(jié)合作用，用HBS-EP緩沖液重懸chLBD，在不同濃度下(15、62、31.25、62.5、125和250nM)通過3個(gè)流量池(攜帶人或綿羊瘦素，或?qū)φ?，流速為30^U/min。使用10mM甘氨酸緩沖液(pH2)的10卞1脈沖在每次作用完畢后再生表面。使用Biacore控制軟件的動(dòng)力學(xué)Wizard來控制實(shí)驗(yàn)，該軟件自動(dòng)校正折射率變化，并通過從LBD和瘦素間相互作用所得數(shù)據(jù)中減去對(duì)照表面所得反應(yīng)，而校正非特異性結(jié)合作用。同時(shí)，使用Biacore評(píng)價(jià)軟件在所有LBD濃度下將所得結(jié)合曲線與結(jié)合與解離相位(phase)進(jìn)行匹配。在所有情況下得到的最佳匹配均來自單純的雙分子反應(yīng)(Langmuir模型)。(vi)結(jié)合實(shí)驗(yàn)使用帶有放射性標(biāo)記的1251-瘦素作為配體，所有其它無標(biāo)記瘦素(或其突變體)用作竟?fàn)幬?。用長(zhǎng)型人瘦素受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BAF/3細(xì)胞，并使用該細(xì)胞勻漿進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在添加有5%FCS和IL-3的RPMI1640中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以將痩素受體的減量調(diào)控降到最低，直到細(xì)胞濃度達(dá)到K)s個(gè)/ml。然后離心細(xì)胞培養(yǎng)液并在-70°C下儲(chǔ)存。在每次實(shí)驗(yàn)之前解凍細(xì)胞，按1.75x106個(gè)細(xì)胞/150nl反應(yīng)緩沖液(12.5mM巴比妥酸鈉，pH8.6緩沖液(含有0.1%牛血清白蛋白、7.5mMEDTA、150mMNaCl和0.1%(w/v)Triton-X100》比例懸浮細(xì)胞，然后使用Polytrone在水上以10000rpm速度勻質(zhì)化細(xì)胞。每支試管^^有150pl反應(yīng)緩沖液，1001251-人痩素(700,000-800，000cpm)和100pl不同的瘦素溶液(每支試管0-5000ng)。將每支試管在室溫下溫育18h。然后向每支試管添加250pi1%(w/v)牛免疫球蛋白和500^120%(w/v)聚乙二醇，使瘦素-受體復(fù)合體沉淀。充分混合試管，在4°C下溫育30min，并在4°C下12000g離心15min。然后小心除去上清液，用y計(jì)數(shù)器計(jì)算沉淀量。根據(jù)先前所述碘化hGH的方法(Gertler"a/.,1984)，碘化人瘦素。(vii)BAF/3增殖測(cè)定用長(zhǎng)型人瘦素受體轉(zhuǎn)染瘦素敏感細(xì)胞BAF/31442-CI4,并計(jì)算該細(xì)胞的增殖速率，用以估計(jì)瘦素突變體的自身活性和拮抗活性，在此過程中使用先前所述的MTT(四唑鐨鹽,溴化3-[4,5-二曱基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑錄)方法(Raver"a/.,2000)。為確定痩素突變體的拮抗活性，向每孔中添加不同濃度的突變瘦素，然后向每孔中加入6.25xlO-HM野生型同源瘦素。將不含瘦素孔(陰性對(duì)照)的平均吸光率作為空白值，用其它孔的吸光率中減去該空白值，以得到校正吸光率。含有野生型瘦素孔的平均吸光率在減去陰性對(duì)照值后，被用作陽(yáng)性對(duì)照以計(jì)算抑制百分率。使用Prizma非線斗生回歸S型單位點(diǎn)4中制專欠4牛(non國(guó)linearregressionsigmoidalonesiteinhibitionprogram)(Prizma,2003)進(jìn)行抑制曲線繪圖，并計(jì)算IC50值。(viii)SH-SY5Y人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞的生物測(cè)定用DMEM培養(yǎng)基(添加有10%熱失活胎牛血清，100U/ml青霉素和100pg/ml鏈霉素)，在含5%032、37。C環(huán)境下培養(yǎng)SH-SY5Y人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞；用視黃酸(RA)處理細(xì)胞使細(xì)胞分化。RA處理15d后使用分化細(xì)胞，因?yàn)榇藭r(shí)可得到高百分比的形態(tài)明顯分化的細(xì)胞。用無血清DMEM培養(yǎng)基使SH-SY5Y細(xì)胞饑餓16h，然后在不同濃度瘦素拮抗劑(6.25-320nM)的存在下(或不存在)預(yù)處理15min,然后用人痩素(6.25nM)激活10min。此后收集細(xì)胞，用水冷PBS漂洗，再轉(zhuǎn)入裂解緩沖液中(含有20mMTris-HCl(pH7.5),137mMNaCl,lmMMgCl2,lmMCaCl2,，l%Nonidet-P40，10%甘油，蛋白酶抑制劑(0.35mg/mlPMSF,2pg/ml亮抑酶肽，2^g/ml抑肽酶和10mM苯曱脒)和磷酸酯酶抑制劑(10mM氟化鈉，1mM原釩酸鈉和20mM(3-甘油,粦酸鈉))。在水上裂解30min后，離心(4。C,15000rpm,30min)除去不可溶物質(zhì)，然后用蛋白測(cè)定試劑盒(Pierce,Chemical)測(cè)定所得裂解液中的蛋白含量。用SDS-PAGE分開蛋白，并轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上(Schleicher&Schuell)。用脫脂干燥奶封阻免疫印跡，并在抗-Phospho-MAP激酶或抗-總MAP激酶(ERK41/42)(來自CellSignaling)的存在下溫育，然后加入合適的可與HRP偶聯(lián)的二級(jí)抗體并溫育，洗滌硝化纖維膜，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(ECL;AmershamBiosciences)探測(cè)目的蛋白。(ix)通過活化螢光素酶^a告基因確定生物活性用HAM-F12培養(yǎng)基(含有10。/。FCS)在37°C的加濕環(huán)境中(培養(yǎng)大氣中含有9"/?？諝夂?%CO》培養(yǎng)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。在激素誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)前使用的GC3基本培養(yǎng)基由DMEM-12組成，并添加有谷氨酸、100pg/ml青霉素/鏈霉素、非必需氨基酸、鐵傳遞蛋白和胰島素。用pCH110、STAT3-響應(yīng)pAH32焚光素酶和小鼠LERRb編碼質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。所有轉(zhuǎn)染均按照使用說明書使用ExGen500(Euromedex,Souffdweyersheim,France)進(jìn)行。為了測(cè)試生物活性，隨后將轉(zhuǎn)染細(xì)胞至于GC3培養(yǎng)基中(其中含有不同濃度的人和綿羊瘦素，以及(或不含有)各自的瘦素突變體)，溫育24hr。用磷酸鹽緩沖液洗滌多孔板，然后按先前所迷(Bignonetal.1993,Sotiropoulusetal.1996)確定酶活。所得結(jié)果表達(dá)為誘導(dǎo)倍數(shù)(foldinduction),此前已通過校正為P-半乳糖香酶活性將螢光素酶活性規(guī)格化，如前所述。實(shí)施例l.痩素突變體的制備為制備本發(fā)明的瘦素突變體，使用編碼野生型(WT)綿羊或人瘦素的pMon3401表達(dá)質(zhì)粒作為起始原料。使用StratageneQuickCh肌ge突變?cè)噭┖?LaJolla,CA)根據(jù)使用說明書對(duì)瘦素插入片段進(jìn)行修飾，其中使用了兩個(gè)互補(bǔ)引物(表1)。設(shè)計(jì)引物以改變堿基(用粗體標(biāo)出)，從而得到各自的突變體(仍保留合適氨基酸序列)，并加入特異的限制性位點(diǎn)(下劃線部分)用于克隆篩選。步驟包括使用尸/w聚合酶進(jìn)行的12個(gè)PCR循環(huán)。然后使用Z)p"I限制性酶消化突變后的構(gòu)建體，該酶特異識(shí)別曱基化和半甲基化的DNA(目的序列5，-Gm6ATC-3，)，以消化才莫板并選擇出含有合成DNA的突變。然后用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染XL1感受態(tài)細(xì)胞。使用設(shè)計(jì)好的特異性限制性位點(diǎn)，對(duì)每種突變體篩選5個(gè)克隆以得到正確的突變體，顯示突變效率達(dá)80%以上。每種突變體中對(duì)兩個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)得到了含有目的突變同時(shí)不含不希望有的碎皮錯(cuò)誤加入的核苦酸。用突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化XL-1感受態(tài)細(xì)胞，在5-10mlLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)并分離突變質(zhì)粒。然后用突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Monl05感受態(tài)細(xì)胞，以進(jìn)行表達(dá)。引物序列見SEQIDNO所示。表1中列出了本實(shí)驗(yàn)中用以制備瘦素突變體編碼DNA分子的17-23號(hào)引物。修飾的限制性位點(diǎn)(下劃線所示)為BshTI(-)(人瘦素)和BshTI(綿羊瘦素)。表l.用于制備瘦素突變體的引物引物8引物序列SEQIDNO.aS-有義引物；A-反義引物，所有突變位置均用粗體標(biāo)出。實(shí)施例2.人和綿羊瘦素及其突變體的表達(dá)和重折疊用合適的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化MON105細(xì)胞，然后在2.5L培養(yǎng)基中添加萘啶酮酸(50pg/ml)以誘導(dǎo)表達(dá)，得到在N-末端攜帶有額外蛋氨酸-丙氨酸的野生型(WT)人瘦素的重組體或突變體。用5個(gè)2.5L搖瓶，每瓶中使用500mlTerrificBroth(TB)培養(yǎng)基，在37°C下?lián)u速恒定為200rpm,培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)菌直至A^。達(dá)到0.9。添加萘咬酮酸4h后lOOOOg轉(zhuǎn)速離心收集細(xì)胞，并在-20。C下保存。將來自2.5L培養(yǎng)基的細(xì)菌沉淀在水上解凍，并用裂解緩沖液(IOmMTris-HCl,10mMEDTA,pH人瘦素L39A/D40A-5L39/AD40A-3F41A/I42A-5F41A/I42A-3L39A/D40A/F4lA-5L39A/D40A/F41A-3L39A/D40A/F41A/I42A-5L39A/D40A/F41A/I42A-3綿羊瘦素L39A/D40Ar5L39A/D40A-3F41A/I42A-5F41A/T42A-3L39A/D40AF41A-5L39A/D40AF41A-3L39A/D40A/F41A/I42A-5I39A/D40A/F41A/142A-3S5，-CCAAACAGAAAGTCAClfiQIGCGGCTTTCATTCCTGGGCTC-3,A5,"GAGCCCAGGAATGAAAGCCGCACCASIGACTTTCTGTTrGG^3S5，"CCAAACAGAAAGTCAOe01TrGGACGCCGCTCCTGGGCTCCACC-3，A5，-GGTGGAGCCCAGGAGCGGCGTCCAAACCAQ!GACnTCTCTTTGG^3，S5，-CCAAACAGAAAGTCAC1G01GCGGCCGCCATTCCTGGGCTC-3，A5，-GAGCCCAGGAATGGCGGCCGCACCAfilGACTTTCTGTnGG3，S5，"CCAAACAGAAAGTCAClflOIGCGGCCGCCGCTCCTGGGCTCCACC-3，A5、GGTGGAGCCCAGGAGCGGCGGCCGCACCAG!CJACTTTCTGTTTGG-3，S5，-CAGAGGGTCACCGSIGCTGCTTTCATCCCTGGGCTCCACCC-3A5，"GGGTGGAGCCCAGGGATGAAAGCAGCACCQG1GACCCTCTG-3，S5，"CCrcCAAACAGAfiGGTCACCQQlTTGGACGCTGCTCCTGGGCTC-3,A5，"GAGCCCAGGAGCAGCGTCCAAACCQ2rGACCCTCTCTTTGGAGG-3，S5，-TCCAAACAGAGGGTCACCGQ!GCTGCAGCTATCCCTGGGCTCCACCC-3，A5，"GGGTCGAGCCCAGGGATAGCTGCAGCACGOfilGACCCTCTGTTTGGA-3，S5，墨CAGAGGGTCACCfiQ!GCTGCTGCTGCTCCCGGGCTCCACCC-3，A5，-GGGTGGAGCCCGGGAGCAGCAGCAGCACCQQ1GACCCTCTG-3，780S01-23456789012nsss2ws222223338)重懸浮。然后按照先前文獻(xiàn)所述(GertlerWa/.,1998;Raver"a/.,2002)制備包涵體(m)并凍存。隨后使用300ml含有4.5M尿素、40mMTris和10mM半胱氨酸的溶液，使來自2.5L培養(yǎng)基的包涵體溶解。當(dāng)處理綿羊瘦素或其突變體的包涵體時(shí)，與上文類似使用200ml溶液處理來自l.OL培養(yǎng)基的包涵體。用NaOH將所得包涵體溶液的pH調(diào)節(jié)到11.5。4°C下攪拌2h，然后加入3倍體積的精氨酸溶液(0.67M)直到終濃度達(dá)到0.5M,并攪拌過夜。次日早晨將溶液轉(zhuǎn)移到透析管中，在5xl01的10mMTris-HCl(pH9,當(dāng)處理人瘦素突變體時(shí))中透析，或者在10mMTris-HCl(pH8，當(dāng)處理綿羊瘦素突變體時(shí))中透析，進(jìn)行60h，每6-10h更換一次透析外液。實(shí)施例3.瘦素突變體的純化和化學(xué)鑒定使用Q-Sepharose陰離子交換柱(床體積30ml),對(duì)實(shí)施例2所述的人痩素突變體進(jìn)行重折疊和透析后所得的片段加以純化，使用最大最大流速(400-500ml/h)，用10mMTris-HCl緩沖液(pH9)平衡，非連續(xù)NaCl梯度(50、100、150和400mMNaCl溶于10mMTris-HCl中)洗脫。收集50ml洗脫液，通過280nm的吸光率來確定蛋白濃度。用50mMNaCl洗提收集液，所得產(chǎn)物含有95%以上的純單體，然后在NaHC03溶液(pH8)中透析，蛋白:鹽的比例為4:1(w/w)，隨后凍干。使用Tris-HCl緩沖液(pH8)按照類似的方法純化綿羊瘦素。來自2.5L細(xì)菌培養(yǎng)基的人瘦素突變體產(chǎn)量在160-220mg之間，而來自1.0L細(xì)菌培養(yǎng)基的綿羊痩素突變體產(chǎn)量在80-120mg之間。使用三種獨(dú)立的方法來確定純化后突變體的純度和均質(zhì)性。自然條件下凝膠過濾(pH8)得到單個(gè)的單體峰(由95%以上的單體組成)，相應(yīng)的分子量為16kD(圖1A)。還原條件下的SDS-PAGE結(jié)果中只觀察到一條分子量16kD的條帶(圖1B),而反相色譜也只得到一個(gè)單峰(圖1C)。表2中列出了從CD諳計(jì)算得到的人和綿羊瘦素(及其突變體)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。高含量的ct-螺旋(52-63。/。)，[3-折疊片(8-11%)和14-18。/。含量的p-轉(zhuǎn)角是所有蛋白的顯著特征，這說明發(fā)生正常的重折疊。唯一的例外是綿羊F41A/I42A突變體(SEQIDNO.4)，在其中觀察到正常重折疊有一些破壞發(fā)生。按照Paceetal.(1995)所述方法，計(jì)算0.1%蛋白溶液在280nm處的摩爾消光系數(shù)(因?yàn)榧僭O(shè)在N末端有額外的丙氨酸)。野生型(WT)人痩素及L39A/D40A(SEQIDNO.l)、F41雄2A(SEQEDNO.2)、L39A/D40A/F41A(SEQIDNO.5)和L39A/D40A/F41A/I42A(SEQIDNO.7)突變體的計(jì)算值分別為0.885、0.8900.892、0.895和0.897，綿羊瘦素的對(duì)應(yīng)值分別為0.201、0.202、0.202、0.203和0.203。在4°C和37。C下測(cè)量人和綿羊瘦素(及其突變體)的穩(wěn)定性。野生型(WT)瘦素以及突變體的0.1mM無菌溶液(pH6或8)均可在這兩個(gè)溫度下至少保存20d,其單體含量不發(fā)生任何改變，并且保持其在Baf/3生物測(cè)試中的活性。實(shí)施例4.通過凝膠過濾探測(cè)chLBD-瘦素或chLBD-瘦素突變體復(fù)合氹為了表征人或綿羊瘦素(或其突變體)與chLBD間的結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)，將相應(yīng)配體與chLBD以不同摩爾比混合，并使用Superdex75分析柱通過凝膠過濾進(jìn)行分離，以在非變性條件下確定結(jié)合復(fù)合體的分子量。實(shí)驗(yàn)中使用的各配體濃度均為5mM,而chLBD濃度為2.5、5或IOmM。chLBD:WT痩素間相互作用的結(jié)果見圖2。結(jié)果表明兩種瘦素與chLBD結(jié)合的摩爾比都為1:1。當(dāng)按照相同摩爾比混合反應(yīng)成分時(shí)僅出現(xiàn)一個(gè)單峰，同時(shí)當(dāng)反應(yīng)成分中有一種過量時(shí)即出現(xiàn)另外一個(gè)峰，這兩個(gè)現(xiàn)象都確認(rèn)了上文所述的計(jì)量關(guān)系。根據(jù)峰的保留時(shí)間計(jì)算，復(fù)合體的分子量為41kDa，這與預(yù)測(cè)的40.5kDa接近。在所有8個(gè)突變體中都觀察到幾乎相同的反應(yīng)模式(數(shù)據(jù)未列出)，這說明突變沒有影響突變體與chLBD間形成1:1復(fù)合體的能力。實(shí)施例5.通過表面等離振子共振(SPR)確定chLBD或其突變體與瘦素間的相互作用為了進(jìn)一步鑒定chLBD與人或綿羊瘦素(及其突變體)間的結(jié)合能力，采用表面等離振子共振(SPR)技術(shù)，通過可溶性chLBD的胺偶合和結(jié)合作用，分別將痩素(或瘦素突變體)固定在傳感器芯片。使用義2分析，結(jié)果顯示從與理論才莫型1:1的對(duì)照得到了最可行的相互作用。表3中列出了計(jì)算數(shù)據(jù)(兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的均值)。各自的動(dòng)力學(xué)常數(shù)間觀察到有高達(dá)3倍的差異，而各自的Kd值間差異較小，并且這些差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。實(shí)施例6.結(jié)合實(shí)驗(yàn)在所有竟?fàn)帉?shí)驗(yàn)中使用碘化人瘦素作為配體，分別使用野生型(WT)人和綿羊瘦素及其丙氨酸突變體作為竟?fàn)幬?。使用長(zhǎng)型人瘦素受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BAF/3細(xì)胞，制備該細(xì)胞的新鮮勻漿用作受體來源。每支試管使用來自1.75x106個(gè)細(xì)胞的勻漿，這會(huì)發(fā)生6-7%的特異性結(jié)合。抑制曲線(兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值)見圖3,從抑制曲線計(jì)算得到的WT人瘦素和L39A/D40A(SEQIDNO.1)、F41A/I42A(SEQIDNO.2)、L39A/D40A/F41A(SEQIDNO.5)、L39A/D40A/F41A/I42A(SEQIDNO.7)突變體的IC^值分別為5.33、4.16、6.82、5.21、5.43nM。野生型綿羊瘦素及相應(yīng)突變體的ICs。值分別為1.47、1.83、3.44、2.20、1.83nM。瘦素及其突變體對(duì)應(yīng)值間的較小差異(Minordifferences)并不顯著(E〉0.05)，而F41A/I42A突變體(SEQIDNO.2)除外，它的親和力稍低(位于統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的臨界處)實(shí)施例7.體外生物活性在Ba仍生物測(cè)試中，人和綿羊瘦素幾乎表現(xiàn)出同樣的活性，它們的ECs。值分別為22和37pM，這與先前公開的結(jié)果(Raveretal.,2000;Raveretal.,2002)相似。與此相反，所有四種人或綿羊痩素突變體完全沒有任何激動(dòng)劑活性。為確定拮抗活性，在存在各自突變體(1-125nM)時(shí)(或不存在時(shí))，用62.5pM人或綿羊瘦素刺激BAF/3細(xì)胞。重復(fù)該實(shí)驗(yàn)2-7次，計(jì)算ICs。平均值(表4)。所有8種突變體都表現(xiàn)出拮抗劑活性，并且在人和綿羊瘦素突變體之間沒有觀察到顯著差異。L39A/D40A/F41A突變體(SEQEDNO.5)和L39A/D40A/F41A/I42A突變體(SEQIDNO.7)，比L39A/D40A突變體(SEQIDNO.1)和F41A/I42A突變體(SEQIDNO.2)更加有效。為確認(rèn)對(duì)Ba仍細(xì)胞增殖抑制的特異性，在存在(或不存在)人和綿羊瘦素突變體時(shí)，用IL-3(55pM)刺激Baf73細(xì)胞。在所有情況下，即使在125nM突變體存在時(shí)也沒有觀察到抑制。也通過SH-SY5Y人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞生物測(cè)試檢驗(yàn)了幾種瘦素突變體，也通過對(duì)CHO細(xì)胞(用痩素受體進(jìn)行了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)中的熒光素酶才艮告基因進(jìn)行反式激活進(jìn)行了檢驗(yàn)。如圖4A所示，用人L39A/D40A/F41A/I42A突變體(SEQIDNO.7)瘦素拮抗劑進(jìn)行預(yù)處理，這完全封阻了^MAPK的瘦素-誘導(dǎo)活化(圖4A)，而L39A/D40A/F41A/I42A突變體(SEQIDNO.7)逐步削弱了熒光素酶的瘦素-誘導(dǎo)活化(圖4B)。在拮抗劑比激動(dòng)劑過量約10倍時(shí)，達(dá)到了50%的抑制。實(shí)施例8.聚乙二醇化痩素拮抗劑的制備任何蛋白在體內(nèi)發(fā)揮生物功能的能力依賴于許多因素，這不僅包括蛋白與其受體的親和力，也包括蛋白在循環(huán)中的清除速率。一些激素如小心房利尿鈉肽由蛋白酶介導(dǎo)發(fā)生清除，清除速率很快(^.5=0.5min)，而其它分子量15-25kD的激素如瘦素(未公開觀察結(jié)果)、生長(zhǎng)素(GH)、泌乳剌激素和PLs的清除速率則更慢(^5=8-30min),它們主要通過腎臟代謝(Johnsonetal.1979;Haffneretal1994)。因?yàn)槟I臟介導(dǎo)的清除主務(wù)農(nóng)賴于分子量，而分子量大于70-80kD的蛋白清除速率明顯更慢，所以要提高激素的體內(nèi)半衰期應(yīng)把注意力集中在提高其分子量上。這可通過乙二醇化來進(jìn)行，這樣可在提高激素分子量的同時(shí)不影響其活性。添加上一些聚乙二醇(PEG)到激素分子上會(huì)提高蛋白的流體力學(xué)體積，從而降低其清除速率(Abuchowskietal.;1977)。最令人吃驚的結(jié)果之一，是最近發(fā)現(xiàn)乙二醇化的人生長(zhǎng)素(hGH)盡管親和力和體外活性下降了500倍，但是體內(nèi)活性卻顯著提高了，這主要是因?yàn)槠溲h(huán)半衰期提高了25倍。因此，可認(rèn)為提高循環(huán)半衰期可補(bǔ)償受體結(jié)合親和力的下降(Clarketal.，1996)。使用常用方法(Clarketal.,1996),或根據(jù)使用說明書(NektarTherapeutics),通過使純化的痩素突變體與聚乙二醇(MW40kDa)在a-氨基或s-氨基上發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，來進(jìn)行乙二醇化反應(yīng)。我們使用綿羊瘦素得到的研究結(jié)果表明，乙二醇化不會(huì)降低瘦素的生物活性(RaverandGertler，數(shù)據(jù)未^Hf)。這些結(jié)果使我們預(yù)測(cè)，對(duì)痩素突變體進(jìn)行乙二醇化也不會(huì)影響它們與瘦素受體相互作用的能力，從而不影響它們的拮抗活性。因此，通過乙二醇化或者其它任何緩慢釋放制劑形式，都可能會(huì)延長(zhǎng)瘦素突變體在體內(nèi)的有益作用。實(shí)施例9.制備帶有SPl-標(biāo)簽的人痩素制備一個(gè)嵌合蛋白，由人瘦素突變體-29氨基酸連接序列和SP1植物蛋白組成(Dganyetal.,2004)。將此構(gòu)建體亞克隆到pET29a表達(dá)栽體上，并在IPTG的誘導(dǎo)下作為可溶性蛋白包涵體(IB)而表達(dá)。蛋白電泳得到的主要條帶分子量為32kDa,接近理論值31420Da。將該嵌合蛋白溶解、重折疊并純化至均質(zhì)。使用Superdex75和Sepharose6B柱進(jìn)行的皿過濾結(jié)果表明，分子量至少為100kDa，并且可能比該值高很多。為了評(píng)價(jià)嵌合蛋白結(jié)合chLBD的能力，在不同摩爾比下(LBD濃度不變)預(yù)溫育兩種蛋白，然后用Superdex柱進(jìn)行分離。不出現(xiàn)chLBD峰標(biāo)志著復(fù)合體的形成。結(jié)果表明，完全不出現(xiàn)chLBD峰時(shí)的摩爾比為3:1，基本不出現(xiàn)chLBD峰時(shí)的摩爾比為2:1，這說明一個(gè)嵌合蛋白分子結(jié)合4-6個(gè)chLBD分子。結(jié)果匯總與討論I型細(xì)胞因子通過保守的結(jié)合位點(diǎn)(位點(diǎn)I和II)與它們的受體相互作用。G-CSF和gpl30家族細(xì)胞因子，包括IL-6具有另一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(位點(diǎn))，最近IL-6-gp130復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)表明，這個(gè)位點(diǎn)與受體的類Ig結(jié)構(gòu)域(IGD)相互作用(Chowetal.,2001;Boulangeretal.,2003)，作用以2:2的排列形式出現(xiàn)。預(yù)測(cè)痩素/瘦素受體相互作用會(huì)形成類似的復(fù)合體形式，這是因?yàn)槭菟?痩素受體與G-CSF和gpl30家族細(xì)胞因子(激素與受體)間有類似的序列和總體結(jié)構(gòu)(Zabeauetal.，2004;Peelmanetal.,2004)。因此我們根據(jù)gpl30IGD結(jié)構(gòu)(pdbcodelilr;Chowetal.,2001)建立了瘦素受體IGD結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)模型，并將此才莫型與gpl30-vIL-6復(fù)合體進(jìn)行匹配。這個(gè)實(shí)驗(yàn)性瘦素結(jié)構(gòu)(如分離所觀察到的那樣(pdbcodelax8;Zhangetal.,1997》，根據(jù)相應(yīng)于a-螺旋的4個(gè)保守性區(qū)域，與vIL-6結(jié)構(gòu)進(jìn)行匹配。如圖5的vIL-6-gp130結(jié)構(gòu)(pdblilr;Chowetal.,2001)所示，頂部為IL-6-gpl30-IL-6R復(fù)合體(pdblp9m;Boulangeretal.，2003)，位點(diǎn)III包括N末端的螺旋D(深藍(lán)色標(biāo)出)、環(huán)C-D(淺藍(lán)色標(biāo)出)和環(huán)A-B(橙色標(biāo)出)，并且與受體的IGD(圖左方，用灰色標(biāo)出)相接觸。在細(xì)胞因子中位點(diǎn)III表現(xiàn)為可變性最大的區(qū)域。值得注意的是，A-B環(huán)(圖5中用橙色標(biāo)出)長(zhǎng)度可變，它在分離的人瘦素結(jié)構(gòu)(pdblax8;Zhangetal.,1997)中，或甚至在IL-6-gpl30-IL-6R(pdblp9m;Boulangeretal.,2003)中顯得無序，在電子密度圖中沒有可見殘基。環(huán)C-D(圖5中用淺藍(lán)色標(biāo)出)也是可變的。很顯著的是，在vIL-6-gp130復(fù)合體(pdblilr;Chowetal.,2001)中，A-B環(huán)包含一個(gè)短(i-折疊股(p-strand),該折疊股通過與受體D1結(jié)構(gòu)域上第一個(gè)(3-折疊股之間的主鏈H-鍵，形成了一個(gè)類似p-折疊片結(jié)構(gòu)(圖6，頂端)。另外，在C末端的螺旋A和這個(gè)j3-折疊股之間也觀察到一個(gè)伸展的類似(5-折疊股的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)與受體D1結(jié)構(gòu)域(圖6)的兩個(gè)(3-折疊片結(jié)構(gòu)中的一個(gè)共同形成了一個(gè)相對(duì)平的接觸面。4艮設(shè)瘦素位點(diǎn)III與LEPR的IGD相互作用類似IL-6發(fā)生的作用，盡管有巨大的序列差異，我們使用疏水性團(tuán)分析(HydrophobicClusterAnalysis,HCA)預(yù)測(cè)可能出現(xiàn)在痩素AB環(huán)中的規(guī)則二級(jí)結(jié)構(gòu)。這種兩維方法可以從已知的單鏈序列信息出發(fā)精確的預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)(Gaboriaudetal.,1987;Callebautetal.,1997;Hennetinetal.，2003)。圖6以2D形式表現(xiàn)了人痩素和病毒IL-6(1IR1)。突出的疏水團(tuán)主要相應(yīng)于所考慮蛋白的規(guī)則二級(jí)結(jié)構(gòu)。在這兩種蛋白中，一個(gè)可變長(zhǎng)度的環(huán)將螺旋A與螺旋B相區(qū)別。但是在IL-6中該環(huán)包含的基團(tuán)為典型的伸展結(jié)構(gòu)((3-折疊股)。中間的環(huán)相應(yīng)于(3-折疊股，它與g130的IGD相互作用。這種情況與痩素不同，甚至比它更加筒單，因?yàn)檫@個(gè)環(huán)長(zhǎng)度更短并僅包含一個(gè)基團(tuán)，典型為P-折疊股結(jié)構(gòu)(VTGLDFI/S;該基團(tuán)與(3-折疊股有77%的相關(guān)性(我們的統(tǒng)計(jì)，數(shù)椐未公開))。該結(jié)構(gòu)因此可以試驗(yàn)性的與IL-6的IGD-相互作用(3-折疊股進(jìn)行比對(duì)，這個(gè)J3-折疊股的序列為L(zhǎng)EPAAIF。建立瘦素相應(yīng)接觸面的才莫型，這個(gè)模型忽略了部分的分離分子(圖5底部，用橙色虛線標(biāo)出)的晶體結(jié)構(gòu)，但是這個(gè)模型不可能正確，因?yàn)樗鄙俸线m的AB環(huán)模板，也因?yàn)樵谑荏w識(shí)別時(shí)鄰近的CD環(huán)很可能發(fā)生構(gòu)象變化。另一方面，病毒IL-6與gpl30和相關(guān)CD環(huán)的接觸面的核心，是由3個(gè)芳族氨基酸Tyr143、Trpl44和Phel48形成的(Chowetal.,2001，圖5頂部，用紫色標(biāo)出)。盡管在瘦素的嚴(yán)格相應(yīng)位置處沒有芳族氨基酸，但是一個(gè)酪氨酸殘基(Tyr119,圖6底部，用粉紅色標(biāo)出)可能在與瘦素受體接觸時(shí)發(fā)揮類似的作用。為了驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，我們將這個(gè)堿基突變?yōu)锳la,并制備重組Y119A突變體。盡管CD譜表明該突變體發(fā)生了正確的重折疊，但是它表現(xiàn)出顯著低的激動(dòng)劑活性，并且完全沒有任何拮抗劑活性(數(shù)據(jù)未^Hf)。因此我們認(rèn)為痩素AB環(huán)的保守p-折疊股作為靶點(diǎn)和突變LDFI/S序列(39-42位M酸)，與受體IGD的一個(gè)(i-折疊片形成了分子間的聯(lián)系。從制備R128Q突變體以來，所有突變均在綿羊和人瘦素中同時(shí)進(jìn)行，我們先前已經(jīng)觀察到突變的影響可能是種類特異性的(Raveretal.,2002)。制備了8個(gè)產(chǎn)出良好的突變體，4個(gè)為綿羊瘦素，4個(gè)為人瘦素。所有突變體均被純化為均質(zhì)，這通過凝膠過濾、SDS-PAGE和反相色譜而驗(yàn)證(圖1),并且所有突變體均由95%以上的單體組成。對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)除綿羊L39A/D40A突變體(SEQIDNO.3)外，所有突變體均發(fā)生正確的重折疊(表2)。所有8個(gè)突變體都發(fā)揮了真實(shí)的拮抗劑作用，即它們以與野生型激素類似的親和力與LEPR發(fā)生相互作用，這通過SPR和RRA來驗(yàn)證(表3，圖3)，類似于WT瘦素，它們與chLBD形成1:1的復(fù)合體，并且它們?cè)贐afG生物檢測(cè)中沒有生物活性，并特異性抑制瘦素活性(表4)。人L39A/D40A/F41A/I42A突變體(SEQIDNO.7)在其它體外生物檢測(cè)中也抑制由瘦素誘導(dǎo)的作用(圖4)。表2.中性pH下人和綿羊瘦素及其丙氨酸突變體的二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)試蛋白"~0螺旋(％)~p-折疊片cyo)p-轉(zhuǎn)角cv。)隨機(jī)(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>結(jié)果以均值士SD的形式給出。通過CONTIN程序中的該組標(biāo)準(zhǔn)蛋白CD譜，使得誤差僅來自實(shí)驗(yàn)性CD譜匹配的不確定性。沒有包含CD測(cè)量和蛋白濃度測(cè)定中的誤差。2[6]222為每摩爾殘基的摩爾橢圓率，單位為kdegcmMmol"。表3.通過表面等離振子共振(SRP)測(cè)量的WT瘦素及其突變體與固定化chLBD間相互作用的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)常數(shù)突變體knkorrKdX平方2(molVx105)(sec、103)(Mx108)人痩素突變體1野生型痩素1.49±0.344.3±0.12.88士0.531.71-1.87L39A/D40A5.45±0.5512.5±1.52.29±0.093.15.-3.83F41A/I42A3.62±0.1511.5±0.43.18±0.211.73■■4.29L39A/D40A/F41A3.58±0.5410.2±0.82.85土0.482.53.-4.73L39A/D40A/F41滿2A1.35±0.476.8±1.05.03土3.960.43--0.54綿羊瘦素突變體1野生犁瘦素1.62±0.943.7±0.82.28±2.150.58-1.57L39A/D40A2.37±0.035.7±0.12.40±0.062.31-5.18F41A/I42A2.50±0.153.2±0.21.28±0.031.80-3.54L39A/D40A/F41AI.8I±0.062.5±0.2U8±0.131.74-4.57L39A/D40A/F41M42A1.09±0.183.2±0.12.93±0.561.24-3.181—兩個(gè)實(shí)驗(yàn)土SD的均值。2—數(shù)值低說明匹配'f生更好。表4.人和綿羊突變體在BAF/3細(xì)胞(用長(zhǎng)型LEPR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染)中的拮抗劑活性IC50(nM),均值土SEM2瘦素突變體1人瘦素綿羊瘦素L39A/D40A17.7±3.76(4)41.8±14.1(7)F41A/I42A15.6±3.87(4)31.0±19.9(3)L39A/D40A/F41A10.0±0.903(2)17.1士4.4(3)L39A/D40A/F41A/I42A9.3±1.60(5)9.5±4.6(3)1—用0.0625nM的瘦素刺激細(xì)胞，2—括號(hào)內(nèi)的數(shù)字說明試驗(yàn)次數(shù)，3—均值土SD。為將我們制備的突變體與最近報(bào)道(Peelmanetal2004)的人瘦素S120A/T121A突變體(它表現(xiàn)有拮抗劑活性)進(jìn)行活性比較，我們制備并純化(至均質(zhì))了另兩種人痩素突變體，S120A/T121A和L39A/D40A/F41A/I42A/S120A/T121A。兩種突變體均與chLBD結(jié)合，親和力分別為2.95xlO-SM和2.69xlO-8M,這與WT人痩素親和力相似(2.88xIO-8M)。但是在Ba仍生物檢測(cè)中，S120A/T121A突變體表現(xiàn)為低激動(dòng)劑活性，同時(shí)抑制iq。比L39A/D40A/F41A或L39A/D40A/F41A/I42A高150多倍(S120A/T121A突變體為165±81nM，5個(gè)實(shí)驗(yàn)的均值士SEM,相比后兩者的10.0和9.3nM，見表4)，這說明該突變體有較低的拮抗劑活性。與此相反，L39A/D40A/F41A/I42A/S120A/T121A的IC50(14.3±1.34，2個(gè)實(shí)驗(yàn)的均值±CD)與L39A/D40A/F41A或L39A/D40A/F41A/I42A突變體相當(dāng)。因此我們認(rèn)為本發(fā)明的突變體優(yōu)于S120A/T121A突變體，并且聯(lián)用兩種突變體沒有優(yōu)勢(shì)。結(jié)論是，本發(fā)明的突變體是瘦素的竟?fàn)幮赞卓箘??？稍诳肆考?jí)的水平上方便的制備這些突變體，并將它們作為體內(nèi)和體外研究瘦素功能的一種新型工具。另外，對(duì)瘦素發(fā)揮拮抗作用很可能可用以治療自身免疫疾病，并且可能對(duì)動(dòng)脈硬化癥具有療效。因此，瘦素拮抗劑是一種闡明哺乳動(dòng)物生理學(xué)和病理學(xué)中瘦素作用的新型工具。參考文獻(xiàn)Abuchowski,A.,McCoy,J.R.,Palczuk,N.C.，VanEs,T.andDavis,F.F.(1977),在牛肝臟過氧化氫酶上共價(jià)連接聚乙二醇的影響，Effectofcovalentattachmentofpolyethyleneglycolonimmunogenicityandcirculatinglifeofbovinelivercatalase./.5/o/.CTiem.252,3582-3586.Aritomi,M.，Kunishima,N.，Okamoto,T.，Kuroki,R.,Ota,Y.，andMorikawa,K.(1999),表現(xiàn)出新型細(xì)胞因子-受體識(shí)別機(jī)制的GCSF-受體復(fù)合體的原子結(jié)構(gòu)AtomicstructureoftheGCSF-receptorcomplexshowinganewcytokine-receptorrecognitionscheme.TVafwre401,713-7.Bignon,C.,Daniel,N.,andDjiane,J.(1993)，96孔板上進(jìn)行的(3-半乳糖苷酶和氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶實(shí)驗(yàn)，Beta-galactosidaseandchloramphenicolacetyltransferaseassaysin96-wellplates.萬/0Zi2c/2m々wes15，243-246.Boulanger，M丄，Chow,D.C.,Brevnova,E.E.，andGarcia,K.C.(2003)白介素-6/IL-6a-受體/gp130復(fù)合體的六聚體結(jié)構(gòu)和裝配，Hexamericstructureandassemblyoftheinterleukin-6/IL-6■receptor/gpl30complex.5Wewce300,2101-104.Briscoe,CP.,Hanif,S.,Arch,J.R.,andTadayyon,M.(2001),在人肝細(xì)胞系中痩素受體長(zhǎng)型信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，Leptinreceptorlong-formsignallinginahumanlivercellline.C,A/we14,225-9.Callebaut,I.，Labesse,G.,Durand,P.,Poupon，A.，Canard，L.,Chomilier,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劑是聚乙二醇化形式。20.—種藥用組合物，所述組合物包含權(quán)利要求1的合成瘦素拮抗劑或其片段，以及藥學(xué)上可接受的栽體。21.權(quán)利要求20的藥用組合物，所述組合物含有聚乙二醇化形式的合成瘦素拮抗劑。全文摘要本發(fā)明涉及合成瘦素拮抗劑及所述瘦素拮抗劑的片段，其中瘦素多肽序列39-42位疏水結(jié)合位點(diǎn)的序列LDFI/S中至少有兩個(gè)氨基酸殘基被不同氨基酸殘基替換，從而使得該位點(diǎn)的疏水性降低。文檔編號(hào)C12N15/10GK101189335SQ200580047120公開日2008年5月28日申請(qǐng)日期2005年11月24日優(yōu)先權(quán)日2004年11月26日發(fā)明者A·格特勒,I·卡勒鮑特,J·德賈恩申請(qǐng)人:耶路撒冷希伯來大學(xué)伊森姆研究發(fā)展公司;皮埃爾和瑪麗居里大學(xué)(巴黎6);國(guó)家農(nóng)業(yè)研究院