專利名稱：：蛋白分離和純化的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明提供純化在重組蛋白體樣組裝體(RPBLA)中積聚的重組蛋白的方法。更具體地，本發(fā)明提供分離重組蛋白體樣組裝體中的重組融合蛋白，所述重組蛋白體樣組裝體能夠根據(jù)密度的不同允許從其它宿主細胞細胞器中進行分離，其中目的重組蛋白能夠被濃縮、與其它細胞成分分離且容易回收。
背景技術：
：蛋白體(PB)是專用于蛋白質積聚的亞細胞細胞器(或較大的小泡，直徑約l-3微米，被膜包圍)。它們在諸如種子的某些特定植物組織中天然形成，并且作為用于萌發(fā)和幼苗生長的氨基酸的主要來源。貯藏蛋白通過信號肽共翻譯地插入內(nèi)質網(wǎng)(ER)的內(nèi)腔中，以便被包裝在ER中或進入液泡中(Galilietal.，19937Vem^Ce〃3:437-443)并且在這些亞細胞區(qū)室中裝配成多體單元，發(fā)育成凈皮稱為(ER)-書亍生蛋白體(PB)或蛋白貯藏液泡(PSV)的特定細胞器(OkitaandRogers,1996Jwwi/.尸/<3"^PAjas7'o/tV/o/.5z'o/.47:327-350;HermanandLarkins,1999尸/贈Ce//11:601-613;SanderfootandRaikel，1999尸/a"^Ce〃11:629-642)。雙子葉植物中的貯藏蛋白主要是可溶性蛋白，例如7S球蛋白或豌豆球蛋白型、IIS球蛋白或豆球蛋白型蛋白，并且與其它蛋白(即蛋白酶抑制劑、蛋白水解酶類、凝集素等等)、糖和鹽一起被隔離在PSV中。與PSV相反，PB(l-3微米)主要隔離谷醇溶蛋白且缺乏其它輔助蛋白，谷醇溶蛋白是谷類的高度疏水的貯藏蛋白(例如玉米的玉米醇溶蛋白和小麥的麥醇溶蛋白)(HermanandLarkins,1999P/a"Ce〃11:601-613)。目前，除ER體外，尚未在除植物種子之外的組織中發(fā)現(xiàn)PB。ER體的大小較小(0.2-0.4微米)，并且只有在創(chuàng)傷和被昆蟲咬食時才在擬南芥的葉子中形成而不在正常條件下發(fā)生(Matsushimaetal.,2003P/朋f丄33:493-502)。已使用遺傳工程方法來研究植物PB的形成、貯藏蛋白的裝配和靶向。已經(jīng)顯示當重組蛋白，主要是植物貯藏蛋白，在擬南芥和煙草中表達和包裝時，本來不含有PB的植物組織(例如營養(yǎng)組織)"從頭"產(chǎn)生出這些細胞器(Baggaetal.,1997尸/朋ZCe〃9:1683-1696;Baggaetal.，1995P/aW尸一o/.107:13-23;美國專利第5,990,384號、第5,215,912號和第5,589,616號；以及Gelietal.，1994P/滅Ce〃6:1911-1922)。當在轉基因煙草植抹中表達時，葉細胞中玉米的j8-玉米醇溶蛋白被正確地耙向在新形成的ER-衍生的PB中(Baggaetal.，1995尸/a^尸/^z'o/.107:13-23)。在擬南芥植抹中表達的玉米y玉米醇溶蛋白和截短的7-玉米醇溶蛋白cDNA也積蓄在葉子中新的ER-書f生的PB中(Gelietal.，1994尸/a^Ce〃6:1911-1922)。在玉米胚乳中表達的富含賴氨酸的7-玉米醇溶蛋白(Torrentetal.1997P/a"fMo/.5"/.34(1):139-149)積蓄在玉米PB中并且與內(nèi)源玉米醇溶蛋白共定位。表達a-玉米醇溶蛋白基因的轉基因煙草植抹證明a-玉米醇溶蛋白不能形成PB。然而，當a-玉米醇溶蛋白和7-玉米醇溶蛋白共表達時，a-玉米醇溶蛋白的穩(wěn)定性提高并且兩種蛋白共定位在ER-衍生的蛋白體中(Colemanetal.，1996戶/a^CW/8:2335-2345)。在用富含蛋氨酸的10kDaS-玉米醇溶蛋白轉化的轉基因大豆中也描述了新PB的形成(Baggaetal.,2000尸/a^，:21-28)。重組貯藏蛋白也在諸如非洲爪蟾卵母細胞和酵母的非植物宿主系統(tǒng)的PB樣細胞器中裝配。Rosenberg等人，1993P/a"f戶/^w'o/102:61-69中報道了小麥7-麥醇溶蛋白在酵母中的表達。該基因被正確表達且蛋白在ER-衍生的PB中積蓄。在非洲爪蟾卵母細胞中，Torrent等人，1994P/朋M192:512-518證明當編碼7-玉米醇溶蛋白的轉錄本被顯孩炎注射進卵母細胞中時，該蛋白也在PB樣細胞器中積蓄。Hurkman等人，1981/.Ce〃5zo/。87:292-299使用a-玉米醇溶蛋白以及Altschuler等人，1993尸/朋？Ce〃5:443-450使用7-麥醇溶蛋白在非洲爪蟾卵母細胞中得到了類似的結果。生物技術(遺傳工程)領域的一項基本成就是遺傳地操作生物以生產(chǎn)用于治療、營養(yǎng)或工業(yè)用途的蛋白質的能力。提供用于從細菌、酵母、作物植物和哺乳動物細胞培養(yǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)液中生產(chǎn)和回收重組蛋白的方法。已經(jīng)描述了在宿主細胞中表達蛋白的不同方法。這些方法的基本目標是蛋白表達水平、蛋白穩(wěn)定性和蛋白回收(Menkhausetal"20045z她c/mo/.20:1001-1014;Evangelistaetal"19985她由o/.尸，14:607-614)?？梢越鉀Q蛋白回收問題的一種策略是分泌。然而，分泌有時涉及較差的表達水平和產(chǎn)物的不穩(wěn)定。另一策略是在細胞中最有益的位置積蓄重組蛋白。通過工程化四肽(HDEL/KDEL)的C-末端延伸將重組蛋白導向ER使得這一策略被廣泛使用(ConradandFiedler,1998尸/a"fMo/.Sz'o/.38:101-109)。含有植物貯藏蛋白或與異源蛋白融合的貯藏蛋白結構域的融合蛋白是將重組蛋白導向ER的另一方法(WO2004003207)。一個有趣的融合策略是產(chǎn)生與油質蛋白融合的重組蛋白，油質蛋白是植物油體的組成型蛋白。油體的特定特征有益于使用二相系統(tǒng)容易地回收蛋白(vanRooijenandMoloney,1995所o/7ec/mo/ogy13:72-77)。在植物細胞中已經(jīng)成功地表達了異源蛋白(綜述在Hornetal.，2004Ce〃鄉(xiāng).22:711-720;Twymanetal"2003,7Ve油5zotec/mo/ogy21:570-578;Maetal"1995，Sc/ewce268:716-719;Richteretal.，2000Waf.18:1167-1171)，并且在某些情況中，重組蛋白的表達被導向ER-衍生的PB或PSV(PSV)。Yang等人，2003尸/a"^z216:597-603使用麥谷蛋白和球蛋白貯藏蛋白的種子特異性啟動子在大米種子中表達了人溶菌酶。免疫細胞化學結果表明該重組蛋白位于ER-PB中并且與內(nèi)源大米球蛋白和麥谷蛋白一起積蓄。已經(jīng)使用大米的麥谷蛋白啟動子進行了在轉基因煙草植抹中表達人巨細胞病毒的糖蛋白B。Tackaberryetal.,1999P^cczVze17:3020-3029。最近，Arcalisetal.,2004戶/a"尸A"Zo/ogy136:1-10在大米種子中表達具有C-末端延伸(KDEL)的人血清白蛋白(HSA)。重組HAS與內(nèi)源大米貯藏蛋白一起積蓄在PSV中。使用植物作為生物工廠的一個障礙是需要關于下游處理的更多研究。由于植物系統(tǒng)的復雜性，從植物純化蛋白是艱難的任務。提取物的植物固體較大、密實并且相對較高(9-20%重量比)(參見綜述Menkhausetal,，20045她由o/.iVog.20:1001-1014)。目前，重組蛋白純化技術包括提取物的澄清、使用溶劑處理以除去脂質和色素以及通過若干離子交換和凝膠過濾層析柱進行蛋白質或肽的純化。現(xiàn)有的實驗方案依賴于對每一植物-宿主系統(tǒng)和重組蛋白使用特定的溶劑或水溶液。本領域需要從轉化宿主中回收重組蛋白的有效和通用的方法。在必須分離在植物宿主中產(chǎn)生的重組蛋白的情況下，此需要是特別相關的。宿主和蛋白的多樣性以及它們之間不同的物理化學特性需要濃縮和回收重組產(chǎn)物的有效方法。下文公開的發(fā)明提供使從諸如真菌等非高等植物生物和哺乳動物細胞中回收重組表達的蛋白變得容易并且提高所述回收的一種方法。發(fā)明的簡要描述本發(fā)明提供用于從轉化宿主中回收重組蛋白的有效和通用的操作和方法。本文提出的解決方案基于以下發(fā)現(xiàn)通過基于密度的技術、特別是通過密度墊層或密度梯度離心技術從其它宿主細胞細胞器蛋白中有效分離重組蛋白體樣組裝體(RPBLA),并能夠達到意想不到的良好收率。更具體地，本發(fā)明涉及用于純化在宿主細胞中作為RPBLA表達的重組融合蛋白的方法。才艮據(jù)涉及的方法，提供以RPBLA表達融合蛋白的轉化宿主細胞的水性勻漿。這些RPBLA具有預定密度，所述密度可以在不同的融合蛋白中不同，但對于欲分離的特定融合蛋白來說是已知的。RPBLA的預定密度通常大于勻漿中基本上所有內(nèi)源宿主細胞蛋白的密度，并且通常為約1.1g/ml至約1.35g/ml。形成勻漿的不同密度的區(qū)域以提供含有濃度相對提高的RPBLA的區(qū)域和含有濃說明書第5/31頁度相對匱乏的RPBLA的區(qū)域。從RPBLA濃度相對提高的區(qū)域中分離RPBLA匱乏的區(qū)域，由此純化所述融合蛋白。然后可以收集RPBLA濃度相對提高的區(qū)域，或者使用一種或多種試劑處理該區(qū)域，或者在分離RPBLA或其中的融合蛋白之前先使該區(qū)域經(jīng)歷一個或多個才喿作。在優(yōu)選實踐中，融合蛋白含有兩個連接在一起的多肽序列，其中一個序列是蛋白體誘導序列(PBIS)的序列，而另一個是目的產(chǎn)物的序列，所述產(chǎn)物例如藥物分子、酶等等。優(yōu)選的蛋白體誘導序列是谷醇溶蛋白化合物的那些序列，所述谷醇溶蛋白化合物例如7-玉米醇溶蛋白、a-玉米醇溶蛋白或大米谷醇溶蛋白。此處的宿主細胞是真核細胞，例如高等植物、真菌和酵母的細胞、諸如哺乳動物細胞的動物細胞以及藻類細胞。那些細胞可以是新鮮的，例如從新鮮生物質直接得到的，或者可以是干燥的，例如從干燥生物質得到的；應當理解生物質指從活生物體或細胞得到的物質，例如培養(yǎng)基或活生物體，例如植物葉子。附圖的簡要說明在構成本公開內(nèi)容一部分的附圖中圖1是在煙草植株的瞬時轉化(農(nóng)桿菌滲入)和穩(wěn)定轉化中使用的雙元載體的示意圖，在該圖的上部顯示。在該圖的中部顯示在酵母轉化中使用的兩個載體。在下部顯示在哺乳動物細胞培養(yǎng)物的瞬時轉染中使用的載體。RX3,27kD7-玉米醇溶蛋白的N-末端結構域；22aZ,22kD的a-玉米醇溶蛋白；22aZt,22kDa-玉米醇溶蛋白的N-末端結構域；rP13,13kD谷醇溶蛋白；以及CS,切割位點。圖2有四個部分圖2A-2D。圖2A顯示RX3-T20和RX3-EGF融合蛋白在轉基因煙草植林的葉子中積蓄。從野生型(wt)和轉基因煙草植一朱的葉子中提取可溶蛋白(泳道2和泳道4),在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分析，并且轉移到硝化纖維素膜上，然后使用7-玉米醇溶蛋白抗血清進行免疫印跡分析。分子量在左側標明。箭頭指示RX3衍生融合的單體(M)和二聚體(D)。圖2B顯示密度梯度部分中的RX3-T20和RX3-EGF融合蛋白的免疫印跡分析。轉化煙草的濕(新鮮)葉子的澄清勻漿被上樣到分級蔗糖梯度上(42%-49%-56%-65%w/w)。通過使用7_玉米醇溶蛋白抗體的免疫印跡來分析積蓄在勻漿、上清液、界面和沉淀部分的RX3-EGF和RX3-T20融合蛋白。每條泳道對應等體積的所有部分。H,勻漿；S，上清液；F42，42-49%w/w界面；F49,49-56%w/w界面；F56，56-65%%w/w界面；F65,65%蔗糖之下的沉淀。分子量在左側標明。箭頭指示RX3衍生融合的單體(M)和二聚體(D)。圖2C顯示密度梯度部分中的RX3-EGF融合蛋白的SDS-PAGE和4艮染分析，該RX3-EGF融合蛋白由pl9RX3EGF在轉化煙草的葉子中表達。煙草濕(新鮮)葉子在緩沖液PBP中的澄清勻漿被上樣到分級蔗糖梯度上(42%-49%-56%-65%w/w)。通過15%的SDS-PAGE且用銀染顯色來分析積蓄在勻漿、上清液、界面和沉淀部分的RX3-EGF融合蛋白。每條泳道對應等體積的所有部分。箭頭指示RX3-EGF蛋白。H，勻漿；S，上清液；F42，42-49%w/w界面；F49，49-56%w/w界面；F56，56-65%%w/w界面；F65，65%蔗糖之下的沉淀。分子量在左側標明。圖2D顯示積蓄在濕和干的煙草葉子中的RX3-T20和RX3-EGF的SDS-PAGE和免疫印跡結果。將煙草葉子在37。C下干燥1周并且在干燥容器中儲存5個月。從等量的濕的(W)和干的(D)轉化煙草葉子中提取可溶蛋白，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠和使用7-玉米醇溶蛋白抗血清的免疫印跡來分析(泳道1和泳道2)。通過將干燥葉子的勻漿在蔗糖梯度(20%-30%-42%-56%w/w)中分級來分析RX3-EGF和RX3-T20在干燥樣品的密實結構中的積蓄。通過使用7-玉米醇溶蛋白抗體的免疫印跡來分析積蓄在上清液、界面和沉淀部分的RX3-EGF和RX3-T20融合蛋白。加入等量的每一部分。S,上清液；F20,20-30%w/w蔗糖界面；F30，30-42%w/w蔑糖界面；F42,42-56%w/w蔗糖界面；F56，56%蔗糖之下的沉淀。圖3有兩部分，圖3A和3B。圖3A顯示RX3-EGF和RX3-T20在農(nóng)桿菌滲入的煙草小植抹中的積蓄。通過SDS-PAGE和使用醇溶蛋白抗血清的免疫印跡來分析總可溶蛋白。Wt-野生型對照煙草小植抹；分子量在左側標明。箭頭指示RX3衍生融合的單體(M)、二聚體(D)和三聚體(T)。圖3B顯示農(nóng)桿菌滲入的煙草小植抹的亞細胞部分。澄清的小植抹勻漿被上樣到分級蔗糖梯度上(20%-30%-42%-56%w/w)。通過使用7-玉米醇溶蛋白抗體的免疫印跡來分析RX3-T20和RX3-hGH融合蛋白在上清液、界面和沉淀部分的積蓄。向每條泳道中加入等量的每一部分。S，上清液；F20,20-30%w/w蔗糖界面；F30,30-42%w/w蔗糖界面；F42,42-56%w/w蔗糖界面；F56,56%蔗糖之下的沉淀。分子量在左側標明。箭頭指示RX3衍生融合的單體(M)和二聚體(D)。圖4有三部分，圖4A、4B和4C。圖4A顯示通過蔗糖墊層離心之后RX3-T20和RX3-EGF蛋白的濃度。將轉基因煙草葉子的澄清勻漿上樣到蔗糖墊層上(42。/ow/w)。離心后，通過使用7-玉米醇溶蛋白抗體的免疫印跡來分析RX3-EGF和RX3-T20融合蛋白在上清液和沉淀中的積蓄。每條泳道對應等量的部分。H，勻漿；S,上清液；P，沉淀墊層。分子量在左側標明。箭頭指示RX3衍生融合的單體(M)和二聚體(D)。圖4B顯示通過蔗糖墊層離心之后RX3-EGF蛋白的純化。將轉基因煙草葉子的澄清勻漿上樣到蔗糖墊層上(42%w/w)。離心后，通過15%的SDS-PAGE和銀染來分析勻漿、上清液和沉淀部分的蛋白模式。每條泳道對應等量的部分。箭頭指示RX3-EGF的單體(M)和二聚體(D)。H，勻漿；S，上清液；P,沉淀墊層。分子量在左側標明。圖4C顯示低速離心(LSC)后RX3-EGF蛋白的濃度和純化。將表達RX3-EGF的煙草葉子的澄清勻漿在1000xg離心IO分鐘，并且通過凝膠電泳和使用7-玉米醇溶蛋白抗體的免疫印跡來分析沉淀(Pl，泳道2)和上清液(S，泳道l)。用緩沖的、含有5%TritonX-100的培養(yǎng)基洗滌低速離心(LSC)沉淀Pl，并且在第二次離心后，通過15%的SDS-PAGE和4艮染來分析等量的LSCPl沉淀(泳道7)、洗滌后的上清液(W,泳道8)和最終沉淀P2(泳道9)。這些樣品與來自沉淀Pl(泳道3)的相等樣品(泳道3-5)進行比較，沉淀Pl是在一次蔗糖墊層離心后獲得的且經(jīng)過了與LSC沉淀相同的洗滌過程。箭頭指示RX3-EGF的單體(M)和二聚體(D)。圖5有兩部分圖5A和5B。圖5A顯示積蓄在轉染哺乳動物細胞中的RX3-Ct、RX3-EGF和RX3-hGH重組融合蛋白的亞細胞分布。將轉染細胞勻漿上樣到分級蔗糖梯度上(20%-30%-42%-56%w/w)。通過^f吏用7-玉米醇溶蛋白抗體的免疫印跡來分析離心后RX3-Ct、RX3-EGF和RX3-hGH融合蛋白在上清液、界面和沉淀部分的積蓄。經(jīng)質粒pECFP-Nl(Clontech)轉染的、表達ECGP的細胞#1用作對照并且使用抗GFP抗血清來免疫檢測ECGP，ECGP是GFP的青色熒光變體。H，勻漿；S,上清液；F20，20-30%w/w蔗糖界面；F30,30-42%w/w蔗糖界面；F42，42-56%w/w蔗糖界面；F56，56%蔗糖之下的沉淀。圖5B顯示低速離心后由CHO表達的RX3-EGF蛋白濃度。將表達RX3-EGF的CHO細胞勻漿在2500xg離心10分鐘，并且通過凝膠電泳和使用7-玉米醇溶蛋白抗體的免疫印跡來分析沉淀(P，泳道2)和上清液(S，泳道l)。分子量在左側標明。圖6顯示積蓄在轉化酵母細胞中的RX3-EGF和RX3-hGH重組融合蛋白的亞細胞分布。將來自轉化酵母的溶胞球漿體上樣到分級蔗糖梯度上(20%-30%-42%-56%w/w)。離心后，通過使用r玉米醇溶蛋白抗體的免疫印跡來分析RX3-EGF和RX3-hGH融合蛋白在上清液、界面和沉淀部分的積蓄。H，溶胞球漿體勻漿；S,上清液；F20,20-30%w/w蔗糖界面；F30,30-42%w/w蔗糖界面；F42，42-56%w/w蔗糖界面；F56,56%蔗糖之下的沉淀。分子量在左側標明。圖7A顯示積蓄在農(nóng)桿菌滲入的煙草小植抹中的重組融合蛋白的亞細胞分布。將澄清的小植林勻漿上樣到分級蔗糖梯度上(20%-30%-42%-56%w/w)。通過^f吏用抗降鈣素、抗EGF和抗hGH抗體的免疫印跡來分析rP13-Ct、rP13-EGF和rP13-hGH融合蛋白在上清液、界面和沉淀梯度部分的積蓄。使用兩個版本的a-玉米醇溶蛋白基因進行等效研究。降鈣素(Ct)和EGF與ce-玉米醇溶蛋白(22aZt)的N-末端結構域融合，并且hGH與完整a-玉米醇溶蛋白基因(22aZ)融合。向每條泳道中上樣等量的每一部分。S，上清液；F20,20-30%w/w蔗糖界面；F30,30-42%w/w蔗糖界面；F42，42-56%w/w蔗糖界面；F56,56%蔗糖之下的沉淀。圖7B顯示使用來自轉基因煙草株的澄清的葉勻漿上樣到分級蔗糖梯度(10%-42%-56%-62%w/w)上的結果。使用抗EGF抗體的免疫印跡顯示等量的rP13-EGF和22aZt-EGF在每一部分中的分布。S,上清液；F10,10-42%w/w蔗糖界面；F42，42-56%w/w蔗糖界面；F56，56-62%w/w蔗糖界面；F62,62%蔗糖之下的沉淀。圖8顯示從RPBLA中回收RX3-T20和RX3-EGF融合蛋白。在還原劑的存在下重新懸浮從密度墊層或分級梯度得到的RPBLA部分。通過使用7-玉米醇溶蛋白抗血清的免疫印跡來分析可溶(S)和不可溶(P)蛋白。分子量在左側標明。箭頭指示RX-3衍生融合單體(M)、雙體(D)和三體(T)。本發(fā)明具有若干長處和優(yōu)點。一項長處是本發(fā)明的使用使得能夠根據(jù)表達產(chǎn)物與其余可溶細胞物質在密度上的不同相對簡單和快速地純化被表達的蛋白，。因此，本發(fā)明的優(yōu)點是其提供從宿主生物體和細胞培養(yǎng)物中除去內(nèi)源化合物(或非重組產(chǎn)物)的方法。本發(fā)明的另一長處是其提供從新鮮或干燥的生物質(宿主生物體)中純化重組肽或蛋白的可靠和可重復的方法。優(yōu)選實施方案的詳細描述本發(fā)明總體涉及從轉化生物體或細胞培養(yǎng)物中分離和純化目的重組蛋白和肽的下游過程。更特別地，本發(fā)明涉及用于純化在宿主細胞中表達并作為重組蛋白體樣組裝體(RPBLA)積蓄的重組融合蛋白的方法。RPBLA是由在細胞內(nèi)形成高密度堆積的貯藏蛋白結構域誘導的重組蛋白體樣組裝體。這些密實堆積可以在胞漿、細胞器的內(nèi)網(wǎng)系統(tǒng)、線粒體、質體中積蓄或者可以被分泌。根據(jù)涉及的方法，提供以RPBLA表達的融合蛋白的轉化宿主細胞的水性勻漿。優(yōu)選使用澄清勻漿。形成勻漿的不同密度的區(qū)域以提供含有濃度相對提高的RPBLA的區(qū)域和含有濃度相對匱乏的RPBLA的區(qū)域。從RPBLA濃度相對提高的區(qū)域中分離RPBLA匱乏的區(qū)域，由此純化所述融合蛋白。然后可以收集RPBLA濃度相對提高的區(qū)域，或者使用一種或多種試劑處理該區(qū)域，或者在分離RPBLA或其中的融合蛋白之前先使該區(qū)域經(jīng)歷一個或多個操作。在優(yōu)選實踐中，融合蛋白含有兩個連接在一起的多肽序列，其中一個序列是蛋白體誘導序列(PBIS)的序列，而另一個是目的多肽產(chǎn)物的序列，所述多肽產(chǎn)物例如藥物分子、酶等等。優(yōu)選的PBIS是谷醇溶蛋白化合物的那些序列，所述谷醇溶蛋白化合物例如7-玉米醇溶蛋白、a-玉米醇溶蛋白或大米谷醇溶蛋白。本方法一方面包括提供宿主生物體或細胞培養(yǎng)物的水性勻漿或其它適當?shù)奶崛∥?本文中總稱為勻漿)，所述宿主生物體或細胞表達且以重組蛋白體樣組裝體(RPBLA)積蓄期望的融合蛋白。通常在使用前預先澄清(澄清)勻漿以例如通過過濾除去細胞碎片。將含有含有融合蛋白的蛋白體樣結構(RPBLA)、脂質、可溶蛋白、細胞器、糖類、色素和類堿的勻漿直接上樣到分級密度梯度上，并且所述勻漿根據(jù)其成分的密度被分開，例如通過離心。離心期間形成勻漿的不同密度的區(qū)域，以提供含有濃度相對提高的RPBLA的區(qū)域和含有濃度相對匱乏的RPBLA的區(qū)域?？梢栽谔囟芏冉缑嫣幨占衅谕诤系鞍椎腞PBLA。此方法使得能夠以超過約80%的純度回收超過約90%的表達的重組融合蛋白。本發(fā)明的另一方面涉及了從優(yōu)選澄清的勻漿中通過一級密度墊層分離RPBLA的方法。這時，將優(yōu)選澄清的勻漿上樣到特定的密度墊層上使得內(nèi)源污染化合物通不過密度墊層且被離心分離，使得密實RPBLA通過墊層且能夠被收集。形成勻漿的前述的不同密度區(qū)，以提供含有濃度相對提高的RPBLA的區(qū)域(墊層之下的區(qū)域)和含有濃度相對匱乏的RPBLA的區(qū)域(墊層之上的區(qū)域)。因此，重組蛋白體樣組裝體的密度高于所述墊層的密度。在另一實施方案中，在沒有蔗糖或其它加入的提供密度的溶質存在下直接離心分離優(yōu)選澄清的勻漿。并且，所述離心能夠形成勻漿的不同密度的區(qū)域，以提供含有濃度相對提高的RPBLA的區(qū)域(沉淀)和含有濃度相對匱乏的RPBLA的區(qū)域(上清液)。此后RPBLA能夠被分離，以提供RPBLA的純化并且由此提供純化蛋白。本發(fā)明提供回收在RPBLA中表達的重組肽或蛋白的方法，RPBLA為在轉化宿主細胞中形成的細胞器。此處的宿主細胞是真核細胞，例如高等植物的細胞、酵母和真菌、諸如培養(yǎng)的哺乳動物細胞等動物細胞、來自轉基因動物的細胞、動物卵細胞等等以及藻類細胞。這些細胞可以是新鮮的，例如從培養(yǎng)基或諸如植物葉子或動物等活生物體直接得到的，或者可以是干燥的。重組蛋白體樣組裝體具有預定的密度，該密度在不同的融合蛋白中可能不同，但是對于將要分離的特定融合蛋白是已知的。該RPBLA的預定密度通常大于勻漿中存在的基本上所有內(nèi)源宿主細胞蛋白的密度，并且通常為約1.1g/ml至約1.35g/ml。新RPBLA的高密度是由于重組融合蛋白通常具有組裝為多體和積蓄的能力。在真核細胞中表達涉及的RPBLA，并且該RPBLA如上所述地通常被它們的密度所表征。當在高等植物細胞和動物細胞中表達時，RPBLA的形狀通常為球狀，直徑約為l微米(M)并且有包圍的膜。融合蛋白根據(jù)它們的密度被分開，所述密度趨向于大于轉染細胞中存在的任何其它蛋白的密度。通常通過使用離心機來進行根據(jù)密度的該分離，因為其在全世界的生化實驗室中普遍存在。示例性的可商購離心機是BeckmanCoulterAvantiTM型號J-25,此后在本文中用于單一墊層離心和直接離心。BeckmanCoulterOptima型號XL-100K超離心機(轉子SW41Ti)被用于梯度研究。經(jīng)常在加入的提供差異密度溶質的存在下進行離心，所述溶質例如諸如氯化銫的鹽或諸如蔗糖的糖?；旌蟿驖{和提供差異密度的溶質以形成勻漿-溶質混合物。在一特定實施方案中，重組融合蛋白包含結合到感興趣的(目的)產(chǎn)物(例如肽或蛋白)的肽連接的蛋白體誘導序列(PBIS),或者所述重組融合蛋白優(yōu)選由上述蛋白體誘導序列組成。PBIS是介導蛋白進入和/或在RPBLA中積蓄的蛋白或氨基酸序列。說明性地，PBIS的非限制性例子包括貝i藏蛋白或修飾的貝i藏蛋白，例如谷醇溶蛋白或修飾的谷醇溶蛋白或谷醇溶蛋白結構域。Shewryetal.，2002j.Exp.Bot.53(570):947-958綜述了谷醇溶蛋白。7-玉米醇溶蛋白是玉米貯藏蛋白，下文顯示了其DNA和氨基酸殘基序列，其為四種玉米谷醇溶蛋白之一且占玉米胚乳中總蛋白的10-15%。如同其它谷類谷醇溶蛋白，a-玉米醇溶蛋白和/3-玉米醇溶蛋白是在位于粗糙ER的細胞質側的膜結合多核糖體中生物合成的，在內(nèi)腔中組裝且然后被隔離到ER衍生的PB中(Hermanetal.，1999PlantCell11:601-613;Ludevidetal"1984PlantMol.Biol.3:277-234;Torrentetal.，1986PlantMol.Biol.7:93-403)。7-玉米醇溶蛋白由四個特征結構域組成i)具有19個氨基酸的肽信號，ii)含有8個6肽單元PPPVHL(SEQIDNO:1)的重復結構域(53aa),iii)ProX結構域，其中脯氨酸殘基與其它氨基酸交替(29aa)，以及iv)疏水的富含半胱氨酸的C-末端結構域(lllaa)。7-玉米醇溶蛋白在ER-衍生的蛋白體(PB)在中組裝的能力不限于種子。實際上，當7-玉米醇溶蛋白基因在轉基因擬南芥植林中組成型表達時，該貯藏蛋白積蓄在葉肉細胞的ER-衍生重組PB中(Gelietal.，1994尸/""ZCe〃6:1911-1922)。通過尋找負責7-玉米醇溶蛋白向ER-衍生PB中沉積的信號(谷醇溶蛋白沒有KDEL信號)，已經(jīng)證明了包含串連重復結構域的富含脯氨酸的N-末端結構域對于ER保留是必需的，并且C-末端結構域涉及PB形成。然而，這些結構域促進PB組裝的機理依然未知。既然只有在種子中蛋白體的稱謂才是合適的，那么在其它植物器官和非高等植物中產(chǎn)生的類似結構通常被稱為重組蛋白體樣組裝體(RPBLA)。下表顯示了示例性的其它有用的谷醇溶蛋白型序列以及它們的GenBank號。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>其它有用的序列是通過如Altschuletal.，1997M/cto'c^cz'A及m.25:3389-3402所述對所有無重復GenBankCDS翻譯+PDB+SwissProt+PIR+PRF(不包括環(huán)境樣品)數(shù)據(jù)庫進行BLAST檢索得到的，所述檢索使用的查詢例如SEQIDNO:2(RX3蛋白序列)、SEQIDNO:3(a-玉米醇溶蛋白蛋白序列)、SEQIDNO:4(大米谷醇溶蛋白蛋白序列)。示例性的修飾的谷醇溶蛋白包括(a)信號肽序列，(b)蛋白7-玉米醇溶蛋白的重復結構域6肽PPPVHL(SEQIDNO:l)的一個或多個拷貝的序列，以及(c)7-玉米醇溶蛋白的全部或部分ProX結構域的序列。示例性的修飾谷醇溶蛋白包括下文稱為R3、RX3和P4的多肽，其DNA和氨基酸殘基序列也在下文顯示。特別優(yōu)選的谷醇溶蛋白包括7>開的申請WO2004003207中描述的7-玉米醇溶蛋白及其組成部分，大米rP13蛋白和玉米a-玉米醇溶蛋白的22kDa的N-末端片段。y玉米醇溶蛋白(27kD)、大米和a-玉米醇溶蛋白的DNA和氨基酸殘基序列在以下顯示SEQIDNO:5(DNA序列)和SEQIDNO:6(蛋白序列)；SEQIDNO:7(RX3DNA序列)和SEQIDNO:8(蛋白序列)；SEQIDNO:9(R3DNA序歹寸)和SEQIDNO:10(蛋白序列)；SEQIDNO:11(P4DNA序列)和SEQIDNO12(蛋白序列)；SEQIDNO:13(X10DNA序列)和SEQIDNO:14(蛋白序列)。rP13-(蛋白序歹'JSEQIDNO:15和DNA序列SEQIDNO:16)，與克隆-(GenBankABO16504)同源的13kD的大米谷醇溶蛋白，Shaetal.,1996所Wec/mo/.所oc/亂60(2):335-337;Wenetal"1993尸/aWPAjwo/.101(3):1115-1116;Kawagoeetal.，2005PlantCell17(4):1141-1153;Mullinsetal.,2004/.爿gnc。FooJCAem.52(8):2242畫2246;Mitsukawaetal"19995zVwcl5/otec/mo/.5z》c/^附.63(11):1851-1858。22aZt(蛋白序列SEQIDNO:17和DNA序列SEQIDNO:18),22kD的玉米a-玉米醇溶蛋白的N-末端片段-(GenBankV01475),Kimetal.，2002P/朋ZCW/14(3):655-672;Wooetal.，2001尸/a^Ce〃13(10):2297隱2317;Matsushimaetal.，1997腸c/nm.歷o/7一.勿a1339(1):14-22;Thompsonetal.，1992尸/a"ZMo/.18(4):827-833。目的蛋白的例子包括具有治療、營養(yǎng)或工業(yè)用途的任何蛋白，例如單克隆抗體(如IgG、IgM、IgA等的mAbs)及其片段、用于疫苗的抗原(人免疫缺陷病毒，HIV;乙型肝炎前表面抗原、表面抗原和核心抗原、胃腸炎冠狀病毒等等)、激素(降鈣素、生長激素等)、蛋白酶抑制劑、抗生素、膠原、人乳鐵蛋白、細胞因子、工業(yè)酶(水解酶、糖苷酶、氧化-還原酶等等)。提供了示例性目的蛋白的示例性DNA和氨基酸殘基序列(蛋白序列SEQIDNO:19和DNA序列SEQIDNO:20)鮭魚降釣素GenbankBAC57417hEGF-(蛋白序列SEQIDNO:21和DNA序列SEQIDNO:22)基于GenBankAAF85790構建，無信號肽hGH-基于P01241構建，無信號肽(蛋白序列SEQIDNO:23和DNA序列，使用植物偏愛密碼子SEQIDNO:24和使用天然密碼子SEQIDNO:25)。在另一實施方案中，除PBIS和目的產(chǎn)物的序列之外，重組任何蛋白還包含間隔氨基酸序列。該間隔氨基酸序列可以是能夠被酶或化學方法切割的氨基酸序列，或是不可切割的氨基酸序列。在特定實施方案中，間隔氨基酸序列被置于所述PBIS和目的產(chǎn)物之間。示例性氨基酸序列可以被蛋白酶切割，所述蛋白酶例如腸激酶、Arg-C內(nèi)切蛋白酶、Glu-C內(nèi)切蛋白酶、Lys-C內(nèi)切蛋白酶、Xa因子等等。或者，編碼氨基酸序列可以被化學試劑特異切割，例如，在蛋氨酸殘基處切割的溴化氰。在其它實施方案中，用于轉化目的的核酸序列如同在共同轉讓的專利申請WO2004003207所公開的，包括位于PBIS和目的多肽之間的可切割氨基酸殘基序列。此外，在另一實施方案中，所述核酸序列如同專利申請WO2004003207所/>開的，^f旦是缺失編碼可切割氨基酸序列的核酸序列。在優(yōu)選實施方案中，依照包含用核酸轉化宿主細月包系統(tǒng)的方法來制備融合蛋白，所述宿主細胞系統(tǒng)例如動物、動物細胞培養(yǎng)物、植物、植物細胞培養(yǎng)物、真菌或藻類，所述核酸包含(i)同框中可操作地連接的編碼PBIS的第一核酸，(ii)包含編碼目的產(chǎn)物的核苷酸序列的第二核酸序列；也就是，編碼PBIS的核酸序列與編碼目的多肽的序列化學結合，使得兩個多肽均按其正確的閱讀框表達。經(jīng)過表達，得到的融合蛋白以高密度重組蛋白體樣組裝體在轉化宿主系統(tǒng)中積蓄。在一實施方案中，第一核酸序列(i)的3'末端與第二核酸序列(ii)的5'末端連接(結合)。在另一實施方案中，第一核酸序列(i)的5'末端與第二核酸序列(ii)的3'末端連接(結合)。在另一實施方案中，PBIS包含貯藏蛋白或修飾的貯藏蛋白，其片段或修飾的片段。在另一特定實施方案中，依照包含用核酸轉化宿主細胞系統(tǒng)的方法來制備融合蛋白，所述宿主細胞系統(tǒng)例如動物、動物細胞培養(yǎng)物、植物、植物細胞培養(yǎng)物、真菌或藻類，所述核酸除前述的核酸序列(i)和(ii)之外還包含同框編碼間隔氨基酸序列的核酸序列(iii)。如前所述，該間隔氨基酸序列可以是被酶或化學方法切割的或不能切割的氨基酸序列。在一特定實施方案中，核酸序列(iii)被置于所述核酸序列(i)和(ii)之間，例如，第三核酸序列(iii)的3'末端與第二核酸序列(ii)的5'末端連接。另一實施方案中，第三核酸序列(iii)的5'末端與第二核酸序列(ii)的3'末端連接。如本文中所用，術語植物宿主細胞包括植物，包括單子葉植物和雙子葉植物，并且，具體地，谷物(例如，玉米、大米、燕麥等等)、豆類(例如大豆等等)、十字花科植物(例如，擬南芥、油菜等等)和茄科植物(例如，馬鈴薯、番茄、煙草等等)。植物宿主系統(tǒng)還包括植物細胞。植物細胞包括懸浮培養(yǎng)物、胚、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、根、芽、配子體、孢子體、花粉、種子和小孢子。植物宿主細胞可以處于不同的成熟階段且能夠在液體或固體培養(yǎng)基中、或者在花盆中的土壤或適合培養(yǎng)基中、在溫室中或田間生長。植物宿主細胞系統(tǒng)中的表達可以是瞬時的或永久的。植物宿主細胞系統(tǒng)還指這些植物的任何克隆、種子、自交或雜交后代、有性或無性地產(chǎn)生的繁殖體，以及這些中任何一個的后代，例如插條或種子。<吏用農(nóng)桿菌(JgTO6ac&n'wmm附e/a"'ews)轉化植物細月包通常最好在雙子葉植物中進行。單子葉植物通常最容易被稱為原生質體的直接基因傳遞所轉化。直接基因傳遞通常通過電穿孔法、聚乙二醇介導的傳遞或通過用攜帶有所需DNA的微粒轟擊細胞來進行。這些轉染方法為本領域公知且無需在此進一步討論。還應當注意到至少大米和玉米可以被農(nóng)桿菌(^gra^"e〃'"m)轉化。從轉染細胞和原生質體再生完整植物的方法以及從植物組織中獲得希望蛋白的技術也為本領域公知。還參見，美國專利第5,618,988號和第5,679,880號及其中的引用文獻。涉及的方法還包括重組融合蛋白的回收和穩(wěn)定化。因此，例如，從分級密度梯度或一級密度墊層收集的RPBLA被懸浮在含有還原劑的緩沖溶液中并離心。棄去沉淀并且根據(jù)需要進一步純化從上清液回收的重組蛋白，所述純化例如通過標準層析方法。無需更多的細節(jié)，相信本領域技術人員能夠通過使用上文的描述和下文的實施例來實踐本發(fā)明的全部內(nèi)容。因此，下文的優(yōu)選特定實施例應被理解為僅僅是示例說明性的，并且不以任何方式限制其它的7^開內(nèi)容。實驗操作實施例k構建用于植物轉化的質粒jjj忠-里TOn^ftT義本々/tl1優(yōu)化其密碼子^_用以在#_物中表達<沐以最通過化學寡核苷酸合成得到編碼T20的36個氨基酸的cDNA序列的第一條鏈，并且向該序列的5'末端加入對應Xa因子特異切割位點和酶限制位點的序列。通過聚丙烯酰胺變性凝膠來純化此合成的構建體(SEQIDNO:26)。通過使用特異T20引物的PCR得到雙鏈cDNA,該引物含有用于進一步克隆的限制位點。引物-.V20正向(SEQIDNO:27)V20反向(SEQIDNO:28)通過引物重疊延伸PCR方法得到編碼活性hEGF的53個氨基酸的合成基因，該方法使用4個約60個堿基的寡核苷酸，有20個堿基的重疊。合成的hEGFcDNA包括對應Xa因子特異切割位點的5'接頭序列。通過聚丙烯酰胺變性凝膠純化所述寡核苷酸。EGF1(SEQIDNO:29)EGF2(SEQIDNO:30)EGF3(SEQIDNO:31)EGF4(SEQIDNO:32)通過引物重疊延伸PCR方法得到編碼活性hGH的191個氨基酸的合成基因，該方法使用15個約60個堿基的寡核苷酸，有20個堿基的重疊。合成的hGHcDNA包括對應腸激酶特異切割位點的5，接頭序列。通過聚丙烯酰胺變性凝膠純化所述寡核苷酸。hGHl(SEQIDNO:33)hGH2(SEQIDNO:34)hGH3(SEQIDNO:35)hGH4(SEQIDNO:36)hGH5(SEQIDNO:37)hGH6(SEQIDNO:38)hGH7(SEQIDNO:39)hGH8(SEQIDNO:40)hGH9(SEQIDNO:41)hGH10(SEQIDNO:42)hGHll(SEQIDNO:43)hGH12(SEQIDNO:44)hGH13(SEQIDNO:45)hGH14(SEQIDNO:46)hGH15(SEQIDNO:47)從瓊脂糖凝膠(Amersham)純化合成的T20和hEGFcDNA并且克隆到pGEM載體中(Promega)。含有BspHI和Ncol的粘性末端的RX3cDNA片段(編碼7-玉米醇溶蛋白的N-末端結構域)被插入到事先用Ncol消化的載體pCKGFPS65C中(Reicheletal.,199693:5888-5893)(如專利申請WO2004003207中所述)。編碼T20和EGF的序列被同框融合到RX3序歹'J中。通過用GFP編碼序列代替T20和EGF合成基因制備構建體RX3-T20和RX3-EGF。被命名為pCRX3T20和pCRX3EGF的得到的構建體含有例如增強的35S啟動子(SEDIDNO:l)的指導蛋白轉錄的核酸序列，例如煙草蝕刻病毒(TEV)的翻譯增強子，T20和EGF編碼序列基因以及來自花椰菜花葉病毒(CaMV)的3'聚腺苷酸化序列。通過將ffindlII/HindlII表達盒插入到雙元載體pBinl9(Bevan,1984池c/".c爿c/A7e廳n:/j12:8711-8721)中最終得到有效的植物轉化載體pl9RX3T20和pl9RX3EGF。編碼hGH的cDNA^皮融合到RX3N-末端7_玉米醇溶蛋白編碼序列中(專利WO2004003207)并且插入到含有增強的CaMV35S啟動子和3，ocs終止子的pUC18衍生質粒中。來自pUC18衍生質粒的表達盒被命名為pUC18RX3hGH，其含有相應的RX3-hGH序列，將其引入到pBinl9二元載體(Bevan,1984A^wc/"'ci&sea7r/i12:8711-8721)中。分別/人玉米W64A和Senia大米品種的cDNA文庫通過RT-PCR擴增編碼22kD的a-玉米醇溶蛋白(22aZ)和13kD的大米谷醇溶蛋白(rP13)的cDNA。PCR反應中使用的寡核苷酸是22aZ-5'(SEQIDNO:48)22aZ-3'(SEQIDNO:49)Ricel3Prol-5'(SEQIDNO:50)Ricel3Prol-3'(SEQIDNO:51)相應的PCR片段被克隆到pCRII載體(Invitrogen)中，測序并且克隆到含有增強的CaMV35S啟動子，TEV序列和3，ocs終止子的pUC18載體中。用Sail和Ncol消化pCRII-rP13，并且克隆到用相同的酶消化的pUC18RX3Ct、pUC18RX3hGH和pUC18RX3EGF質粒中以分別得到pUC18rP13Ct、pUC18rP13hGH和pUC18rP13EGF。用Sall/Ncol消化pCRII-22aZ并且克隆到用相同的酶消化的pUC18RX3Ct和pUC18RX3EGF質粒中以分別得到pUC1822aZtCt和pUC1822aZ伍GF。還使用Sall/Rcal消化pCRII-22aZ并且克隆到用Sall/Ncol消化的pUC18RX3hGH質粒中以得到克隆pUC1822aZhGH。最后，通過HindlII/EcoRI將所有這些pUC18書f生載體克隆到pCambia5300中。實施例2:構建用于動物和酵母細胞轉化的質粒動物細月包對應成熟降鈣素序列(Ct，WO2004003207)和EGF序列的合成基因以及編碼hGH的cDNA被融合到RX3N-末端7-玉米醇溶蛋白編碼序列(專利WO2004003207)中，并被引入載體pUC18。將含有相應融合蛋白RX3-Ct、RX3-EGF和RX3-hGH序列、來自pUC18書亍生質粒pUC18RX3Ct、pUC18RX3EGF和pUC18RX3hGH的SalI-BamHI限制酶切片#殳引入用XhoI-BamHI限制酶切的載體pcDNA3.1-(Invitrogen)中。在得到的被命名為p3.1RX3CT、p3.1RX3EGF和p3.1RX3hGH的構建體中，融合蛋白序列處于CMV啟動子和pABGH終止子下。酵母細胞將含有相應融合蛋白RX3-EGF和RX3-hGH序列、來自上述pUC18衍生質粒的Sail(平末端化的)-BamHI限制酶切片段引入用EcoRI(平末端化的)-BamHI限制酶切的載體pYX243(R&DSystems)中。在得到的被分別命名為c117和c118的構建體中，所述融合蛋白序列處于可誘導的GAL啟動子下。實施例3:宿主轉化酵母通過LiAc方法(Itoetal.1983,丄5ac&n'o/.153:163-168)使用質粒牙勾建體c117和c118專爭4b酉良酒酵母(5"accA(3ro附y(tǒng)c^ce/^v&z'fle)才朱/ew么并且在Leu-平板上挑選轉化體。通過在含有半乳糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉化體進行表達分析。植物材料煙草(A7co"a加to^cwmvarWisconsin)植抹被種植在24-26。C的有16小時光周期的體外生長箱中。成體植抹被種植在溫室中，溫度為18-28°C，濕度保持在55%至65%，平均光周期為16小時。從種子種植用于農(nóng)桿菌滲入(Vaqueroetal.,1999iVoc.A^7仏爿caAt/5^96(20):11128-11133;Kapilaetal.,1997122:101-108)方法的小植抹，在上述的體外條件下生長4-6周。煙草穩(wěn)定轉化雙元載體凈皮轉入農(nóng)桿菌(j./1/me/ac/ew)才朱LBA4404中。如Draper和Hamil1988.In:PlantGeneticTransformationandGeneExpression.ALaboratoryManual(才直物遺傳轉化和基因表達。實-驗手冊)(Eds.Draper,J.，Scott,R.，Armitage，P.andWalden，R.)，BlackwellScientificPublications所述轉化煙草(7Wco"a"ato^ccwm，W38)葉盤。在含有200mg/L卡那霉素的培養(yǎng)基中挑選再生的植林并轉移到溫室中。栽培具有最高轉基因產(chǎn)物水平的轉基因煙草植林以得到Tl和T2代。通過免疫印跡4企測重組蛋白水平。通過Bradford測定定量乂人煙草葉提取的總蛋白，在15%SDS-PAGE上分離并且^f吏用MiniTrans-BlotElectrophoreticTransferCell(BioRad)將其轉移到硝化纖維素膜上。將膜與7-玉米醇溶蛋白抗血清(l/7000稀釋)(Ludevidetal.1985,尸/朋ZSc&wce41:41-48)—起孵育，然后與結合有辣根過氧化物酶的抗體(1/10000稀釋，AmershamPharmacia)—起孵育。通過增強的化學發(fā)光(ECLWestern印跡系統(tǒng)，AmershamPharmacia)檢測免疫反應性條帶。煙草農(nóng)桿菌滲入在24-26。C的有16小時光周期的體外生長箱中從種子種植用于農(nóng)桿菌滲入方法的小植林。在補充有卡那霉素(50mg/l)和利福平(100mg/l)的LB培養(yǎng)基(胰胨10g/1、酵母提取物5g/1、NaCl10g/l)上、在28°C下利用振蕩器(250rpm)培養(yǎng)含有希望構建體的農(nóng)桿菌(v4.,wme/ac!'e""株LB4404過夜(約18小時)。然后將農(nóng)桿菌接種到也補充有卡那霉素(50mg/l)和利福平(100mg/l)的30mlLB培養(yǎng)基中。在28。C下培養(yǎng)過夜(約18小時)后，在3000xg離心IO分鐘收集農(nóng)桿菌細胞，并且重新懸浮在10ml液體MS培養(yǎng)基中，該MS培養(yǎng)基含有MES(SigmaChemical)4.9g/1和蔗糖30g/l且pH5.8。將細菌培養(yǎng)物調整為終OD6。。為0.1用于農(nóng)桿菌滲入。然后，向細胞培養(yǎng)物中補充終濃度為0.2mM的乙酰丁香酮并且在28°C下孵育90分鐘。關于農(nóng)桿菌滲入，將所述小植林完全浸入懸浮物中并施加真空(100KPa)5-6秒。移除懸浮物并且在24-26°C、16小時光周期的生長箱中放置4天?；厥招≈擦植牧喜⑶彝ㄟ^使用抗7-玉米醇溶蛋白的抗體的免疫印跡分析總蛋白提取物。動物細力包轉化通過基于lipofectamine(脂質轉染胺試劑)的轉染方法(Invitrogen)將構建體p3.1RX3.EGF和p3.1RX3.hGH引入293T、Cosl或CHO的培養(yǎng)哺乳動物細胞。將使用質粒pECFP-Nl(Clontech)轉染的細胞用作對照，該質粒含有增強藍色熒光修飾GFP的基因序列。實施例4:從煙草葉中提取蛋白質新鮮植物材料在液氮中研磨植物材料(濕或干的煙草葉或小植林)并且用提取緩沖液T勻漿，該提取緩沖液T含有Tris-HC150mMpH8、200mM二硫蘇糖醇(DTT)和蛋白酶抑制劑[10jnM抑酶肽、1piM胃酶抑制劑、100/iM亮抑蛋白酶肽、100jtiM苯曱基磺酰氟(PMSF)和100/xME64(SigmaChemical)]。將勻漿在4。C下在lOOOOxg離心30分鐘以除去不溶物質。使用Bradford蛋白質測定(BioRad)定量總可溶蛋白(TSP)。干煙草葉和蛋白質提取將成體轉基因煙草葉子和野生型煙草葉子在37°C房間中在濾紙上干燥2周。2周后，切割葉子并將其在室溫下貯藏5個月。使用和新鮮材料一樣的方法提取干燥材料的總可溶蛋白并且通過Western印跡分析。實施例5:RPBLA制備勻漿在0°C下使用研缽和桿在PBP提取緩沖液中研磨新鮮和干燥的轉基因煙草葉子以及農(nóng)桿菌滲入的煙草小植株(瞬時轉化)，該PBP提取緩沖液含有Tris100mMpH8、KC150mM、MgCl26mM、EDTA10mM并補充有10。/。的蔗糖和蛋白酶抑制劑(PMSF、亮抑蛋白酶肽、抑酶肽、E-64)。使用帶有小轉子(直徑7.5mm)的polytron(IKAT25Basic,24,000rpm)在冰上進一步研磨該勻漿，每次3-4秒，約10次。過濾通的纟且織和細月包。實施例6:來自動物細胞的蛋白通過刮取從培養(yǎng)板上回收轉染的細胞，并且將它們懸浮在勻漿B介質中(10mMTris-HClpH8.0、0.9%NaCl、5mMEDTA以及蛋白酶抑制劑)。將懸浮物吸入配有23號(gauge)針頭的5ml注射器中并推出約30次。通過相差顯微鏡監(jiān)測細胞破裂。如同在煙草葉子勻漿中所描述的，將勻漿上樣到分級蔗糖梯度并離心。通過Western印跡分析瞬時轉染細胞中融合蛋白的積蓄，該Western印跡使用由，玉米醇溶蛋白產(chǎn)生的，玉米醇溶蛋白抗體。轉染后48小時后，使用緩沖液A(100mMTris-HClpH8.0、150mMNaCl、5mMEDTA、0.5%SDS、0.5%TritonX-100、2%2-巰基乙醇和蛋白酶抑制劑)提取總可溶細胞蛋白。沉淀等份的細胞蜉育培養(yǎng)基并保存在-20。C。通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離從等量的轉染細胞和培養(yǎng)基中提取的蛋白質，并且轉移到硝化纖維素片上用于免疫檢測。實施例7:通過不連續(xù)梯度的分離將勻漿在4。C下在50xg離心5分鐘以得到澄清提取物。關于不連續(xù)蔗糖梯度，將此澄清的勻漿(上清液)置于分級梯度上，該分級梯度由2.5ml的蔗糖PBP緩沖液溶液組成，其中蔗糖濃度為20%-30%-42%-56%(w/w)或42Q/。-49%-56%-65%(w/w),并且在4。C下、在吊桶式轉子(SW41Ti)中、在80，000xg不間斷離心120分鐘(BeckmanCoulterOptimaXL-100K超離心機)。收集上清液、界面和沉淀部分。用15。/。TCA沉淀等量的上清液、體的免疫印跡進行分析。通過使用7-玉米醇溶蛋白抗體的Western印跡4企測蛋白RX3-EGF、RX3-T20、RX3-Ct和RX3-INF。^吏用才艮據(jù)Morrisseyetal"1981^mz/.5Zoc/^w.117:307-310的4艮染分沖斤電;永凝月交以評價PB中重組蛋白對污染蛋白的富集。實施例8:通過一級墊層的分離在4°C下，將如上所述制備的勻漿在8ml的42%(w/w)蔗糖墊層(1.18g/cm"上在24，000g離心120分鐘?；厥丈锨逡?、界面和沉淀部分。RPBLA沉積在墊層的底部。關于蛋白質分析，在15。/。TCA中沉淀這些部分的等量樣品并且在15%SDS-PAGE上分離樣品并用銀染分析。通過使用7-玉米醇溶蛋白抗體的免疫印跡才全測PB部分中存在的重組蛋白。實施例9:從分離的RPBLA中回收重組蛋白在PBP緩沖液中洗涂從分級蔗糖梯度的42%-56%(w/w)界面分離的RPBLA或通過蔗糖的42%(w/w)的密度墊層分離的RPBLA，并且通過在16000xg短暫離心5分鐘來回收所述RPBLA。將積蓄在RPBLA中的重組蛋白溶于1體積的含有12.5mM硼酸鈉pH8、0.1%SDS和2%2-巰基乙醇的SB緩沖液中。在37。C孵育該溶液過夜(約18小時)。在室溫下將一份樣品在16000xg離心10分鐘，并且通過SDS-PAGE和Western印跡分析上清液和沉淀以評價完全蛋白溶解。實施例10:來自轉染酵母細胞的蛋白沉淀表達重組融合蛋白的釀酒酵母(S.ce^v/w'ae)。沉淀等份的相應孵育培養(yǎng)基且存放在-20。C以待分析。細胞沉淀物也被冷凍并且在解凍后，通過使用玻璃珠和培養(yǎng)基Y(50mMHCl-TrispH8.0、150mMNaCl、5mMEDTA、200mMDTT和蛋白酶抑制劑)的標準方法破碎細胞。通過SDS-PAGE和免疫印跡分析等量的細胞和培養(yǎng)基，所述免疫印跡使用抗重組表達蛋白的特異抗體。用來從轉化酵母細胞中分離細胞器的破裂方法基于Zinseretal.，1995&a^，11:493-536中描述的球漿體的溫和溶解。沉淀30mL的培養(yǎng)的轉化酵母細胞(D0600約0.5)，用1M山梨糖醇洗滌并且懸浮在1mL的含有100單位/ml酶解酶的球漿體化緩沖液(lM山梨糖醇、50mM磷酸鉀pH7.5、14mM2-巰基乙醇)中。在30°C下進行20-30分鐘并偶爾溫和攪動來使球漿體形成。在1000g沉積6分鐘后，用不含2-巰基乙醇的球漿體化緩沖液洗滌球漿體，并重新懸浮在0.5mL的水冷卻的溶解i爰沖液(0.3M山梨糖醇、10mM三乙醇胺、1mMEDTA和蛋白酶抑制劑)中。在冰上放置20分鐘并偶爾溫和攪動后，溶胞產(chǎn)物被調整為1.0M山梨糖醇的終濃度。如同煙草葉勻漿中所述，將溶胞產(chǎn)物上樣到分級蔗糖梯度上并離心。通過SDS-PAGE和免疫印跡分析部分。結果實施例A:通過密度梯度從轉基因植物營養(yǎng)組織分離(純化)RPBLA通過農(nóng)斥干菌(Jgro6a"en'ww,w附e/ac,e""^l夸編石馬y玉米醇溶蛋白書亍生的融合蛋白RX3-EGF和RX3-T20的基因引入煙草植抹。通過免疫印跡分析轉化的植抹以確定具有較高重組蛋白表達的那些植抹。圖2A顯示RX3EGF和RX3T20蛋白的模式。應當注意到兩種重組蛋白看來均在所有的轉基因林中正確積蓄。主要的較低條帶對應融合蛋白的單體形式，較高條帶對應雙體。融合蛋白通常以多聚體積蓄，并且在免疫印跡中檢測到的單體和寡聚體的含量依賴于二硫鍵還原水平。將煙草葉提取物上樣到密度分級梯度上并且通過免疫印跡分析重組蛋白在不同部分中的積蓄(圖2B)。圖2B顯示的結果表明RX3-EGF出現(xiàn)在對應密實RPBLA的部分中。大部分細胞器顯示高于1.2632的密度(F56，泳道6)并且它們中的相當一部分顯示高于1.3163g/cm3的密度(F65，泳道7)。RX3-T20融合蛋白存在于49%-56%蔗糖界面中(泳道12),表明含有RX3-T20的RPBLA具有高于1.2241g/cm3的密度、它們中相當一部分的密度大于1.2632并且顯著比例具有大于1.2632的密度(泳道13)。這些在煙草葉中形成的新RPBLA顯示天然玉米蛋白體的密度范圍(Ludevidetal.，1984P/awfAfo/.丑z'o/.3:227隱234;Lendingetal"1989P/朋fCe〃1:101l-1023)或者更高。應當注意到RX3-T20PB比RX3-EGFPB的密度要低(略低)，這歸因于目的蛋白的某些特定特征。因此，盡管RPBLA積蓄重組融合蛋白具有比通常存在于可溶細胞部分高的密度，與RX3結構域融合的蛋白的特征能夠確定這種密度的變化。估計超過90%的兩種重組蛋白是在密實RPBLA部分和沉淀中回收的(參見圖2B)。因此，通過密度分離RPBLA看來是純化(濃縮)融合蛋白的有用系統(tǒng)。為了評Y介通過RPBLA分離的重組蛋白RX3-EGF的純化，通過4艮染分析不同密度部分(圖2C)。如從銀染中可見，超過90%的煙草內(nèi)源蛋白位于梯度的可溶部分(S)和界面部分(F422和F49)，在這些部分中，RX3-EGF蛋白不存在或幾乎無法檢測到(參見圖2B)。因此，通過選擇一個或兩個梯度部分(F56和F65)可以棄去可溶蛋白和在較低密度細胞器中存在的大量蛋白。關于融合蛋白在RPBLA部分(F56和F65)中的純化程度，估計RX3-EGF代表在含有PBLS的部分中檢測到的蛋白的約80%。此結果表明，使用RPBLA分離方法，能夠僅在純化的一個步驟中實現(xiàn)融合蛋白的主要富集。實施例B:,人分離自干燥才A物組織的RPBLA中回收重組蛋白分子農(nóng)場中的重要一點是存在貯藏植物生物質的簡單方法。在此情況下，千燥能夠提供減少貯藏體積和保存產(chǎn)品的方便方法。盡管如此，干燥經(jīng)常促進目的蛋白的降解。使用干貯植物分離含有重組蛋白的RPBLA對于工業(yè)目的有4艮大意義。如上所述的積蓄RX3-EGF和RX3-T20融合蛋白的轉化煙草葉被如上所述地干燥。干燥貯藏5個月后，分析重組蛋白的穩(wěn)定性。通過免疫印跡分析從等量的濕(新鮮)(W，泳道1)和干燥(D,泳道2)葉組織中提取的蛋白(圖2D)。如圖中所示，RX3-EGF在干貯的轉化植物中穩(wěn)定，在濕和干植物中回收的量相似(比較泳道W和D)。通過免疫印跡分析來自干葉的勻漿的融合蛋白(RX3EGF和RX3T20)在分級密度梯度中的分布(圖2D,泳道3-7)。有趣地，兩種融合蛋白均主要在密度高于1.1868g/cm3(F42部分)和1.2632g/cm3(F56部分)的密實結構中回收。因此，能夠從干燥組織中通過分離RPBLA純化重組蛋白，由此說明轉基因植物的收集和重組蛋白的提取和純化能夠在時間上獨立。與這些結果一致，7-玉米醇溶蛋白也在大米種子中的RPBLA中積蓄。實施例C:通過從瞬時轉化煙草小植抹中分離RPBLA來回收重組蛋魚瞬時表達系統(tǒng)能夠作為在短時期內(nèi)測試重組蛋白積蓄行為的方便工具。因此，重組蛋白RX3-EGF和RX3-T20也在通過農(nóng)桿菌滲入的瞬時轉化煙草小植抹中表達和積蓄。對來自轉化小植林的蛋白提取物進行免疫印跡分析(圖3A)顯示在穩(wěn)定轉化植物中觀察到的特征復合體電泳模式(比較圖3A，泳道4和圖2A，泳道4)，表明使用此種轉化方法所述融合蛋白正確組裝。還在瞬時轉化煙草中分析了較高分子量的融合蛋白RX3-hGH的表達(圖3A，泳道4)。在密度梯度上進行亞細胞分級分離后，融合蛋白RX3-T20和RX3-hGH均在對應RPBLA部分的密實部分中回收(圖3B，泳道4，5和9，10)，所述部分的密度高于1.1868g/cm3(F42)和1.2632g/cm3(F56)。因此瞬時表達能夠被用于在短時期內(nèi)測試含有期望重組蛋白的PB的特定密度性質。實施例D:通過低速和中速離心回收重組蛋白為了簡化用來通過密實重組蛋白體樣組裝體純化重組蛋白的操作，進行兩種另外的替代方法i)只將澄清的勻漿離心通過單一密度的蔗糖墊層(圖4A,圖4B)和ii)將澄清的勻漿簡單地在低速離心下離心(即1000-2500xg離心10分鐘)。與前述結果一致，RX3-EGF和RX3-T20均以高收率(超過90%)在離心通過1.1868g/cm3蔗糖墊層后得到的沉淀中回收(圖4A,泳道4和6)。此外，如能夠在圖4B的銀染凝膠中觀察到的，RX3-EGF蛋白的純化非常高，而在相應的沉淀中幾乎不能;^企測到雜質煙草內(nèi)源蛋白(泳道4)。與分級密度梯度相比，此方法的主要優(yōu)點在于其容易規(guī)模化以用于工業(yè)生產(chǎn)重組蛋白。應當理解，為了最優(yōu)化重組蛋白的回收和純化，可以在每一情況中調節(jié)墊層密度以及其它特性，例如其粘度和滲量。此外，還使用低速離心(LSC)濃縮和純化含有融合蛋白的蛋白體樣結構(圖4C，LSC)。結果表明，在1000xg離心10分鐘后，在沉淀中回收了幾乎所有的RX3-EGF融合蛋白(圖4C，泳道2)。但是對此沉淀中的蛋白進行染色顯示與離心通過1.1868g/cmS蔗糖墊層得到的相比，融合蛋白的純度不是很高(圖4C,比較泳道3和7)。然后，使用含有5%TritonX-100的緩沖液洗滌通過^氐速離心得到的第一沉淀。洗滌后，在12,000xg離心樣品5分鐘，有趣的是，大量Pl沉淀中存在的污染蛋白在洗滌和離心后被除去，并且新沉淀(P2，圖4C,泳道9)含有高度富集的RX3-EGF蛋白。注意到泳道9中蛋白的含量以及模式與經(jīng)含有TritonX-100的緩沖液洗滌沉淀后得到的類似，該沉淀是離心通過蔗糖墊層后得到的(圖4C,泳道5)。所述低速離心的可選方法基于含有融合蛋白的結構的高密度并且可以在規(guī)?；盀槊恳荒繕藘?yōu)化離心條件。實施例E:通過分離來自轉染動物細胞的RPBLA回收重組蛋白進行了研究以確定貯藏蛋白衍生融合蛋白是否在轉染動物細胞中也誘導密實重組PB樣組裝體的形成。使用分級密度梯度分析來自勻漿的轉染哺乳動物細胞的細胞器的亞細胞分布。使用編碼三種不同融合蛋白的cDNA轉染三種不同的細胞培養(yǎng)類型，所述三種不同融合蛋白為RX3-Ct、RX3-EGF和RX3-hGH，所述三種細胞培養(yǎng)物類型為293T(來自人)、Cosl(來自猴)和CHO(來自倉鼠)。使用pECFP-Nl(Clontech)轉染的Cosl細胞作為對照。如前所述收集梯度部分并通過免疫印跡分析(Fig.5A)。使用y玉米醇溶蛋白抗血清檢測在轉染細胞中表達的重組RX3衍生蛋白。使用兔中產(chǎn)生的抗-GFP抗血清檢測不同收集部分中的對照ECGP。如預期的，可溶ECGP蛋白在上清液部分中回收(S,圖5A,泳道2),并且在顆粒狀細胞部分沉淀的界面和沉淀部分中未4全測到該蛋白的痕跡。相反，RX3CT、RX3EGF和RX3hGH主要存在于密實部分F30、F42和F56中(圖5A)，表明能夠從這些密實部分(密度為1.1270g/cm3至1.2632g/cm"中回收7-玉米醇溶蛋白衍生融合蛋白。這些結果與通過免疫細胞化學得到的結果一致，其中融合蛋白位于ER和直徑約1至約1.4微米的重組蛋白體樣組裝體中。從來自RX3-Ct和RX3-hGH轉染細胞的梯度的可溶部分中回收了顯著量的重組蛋白。這可能是由于勻漿期間過度的細胞破裂，使得ER中含有的尚未組裝的融合蛋白變得可溶。還使用來自表達RX3-EGF的CHO細胞的勻漿分析低速離心(LSC圖5B)。如圖5B所示，大量融合蛋白被從2500xg沉淀中回收(泳道2)，證實在動物細胞中融合蛋白積蓄在密實蛋白體樣結構中，能夠通過基于密度的方法回收。實施例F:通過密度梯度從轉化酵母中回收重組蛋白還通過分級密度梯度分析含有融合蛋白的密實結構在轉化酵母中的形成。使用標準操作通過酵母轉化載體將編碼RX3-EGF和RX3-hGH融合蛋白的cDNA引入釀酒酵母(Sac/mram;;ceyce^v^'"e)。為分離細胞器使用的破碎方法基于方法部分中描述的球漿體的溫和溶解。將溶胞產(chǎn)物上樣到分級蔗糖梯度上并如哺乳動物細胞或煙草葉勻漿中所述的離心。通過SDS-PAGE和免疫印跡分析各部分。圖6顯示了分級分離結果，可以看到大部分RX3-EGF和RX3-hGH蛋白位于梯度的界面F30中(圖6,泳道4)。該部分含有密度在1.1270g/cn^和1.1868g/cm3之間的亞細胞結構。在上清液和F20部分中未枱r測到顯著量的融合蛋白，表明融合蛋白在酵母細胞中組裝。有可能酵母細胞的較小尺寸(最大3微米)只允許小RPBLA的形成，其密度小于在植物和動物細胞中觀察到的那些。在任何情況下，都能夠通過離心將它們從大多數(shù)其它細胞蛋白中分離并純化。實施例G:通過密度梯度從不同貯藏蛋白區(qū)域中回收融合蛋白7-玉米醇溶蛋白衍生融合蛋白通過其密度性質的純化可以延伸到衍生自其它貯藏蛋白的融合蛋白。此處我們顯示衍生自大米13kD谷醇溶蛋白(rP13)和衍生自22kDa-玉米醇溶蛋白(22aZt)的融合蛋白如何在分級蔗糖梯度中對應RPBLA的密實部分中積蓄(圖7)。選擇大米13kD谷醇溶蛋白(rP13)和22kDa-玉米醇溶蛋白[全長^2aZ)或N-末端結構域(22aZt)]是因為它們之間以及與RX3結構域之間缺乏同源性。出乎意料的是，兩種貯藏蛋白均產(chǎn)生高密度RPBLA，當使用分級密度梯度時，該RPBLA在較高密度界面中被回收(圖7A)。降鈣素序列與rP13和22aZt同框融合并處于CaMV35S啟動子的控制之下，將其引入農(nóng)桿菌(v4gro^cten'w附^me/ac/e"s)。瞬時轉化煙草小植抹并且對葉的勻漿實施分級密度梯度。使用SDS-PAGE和免疫印跡分析收集的部分，該免疫印跡使用在兔中產(chǎn)生的抗降釣素抗血清。如圖7A所示(泳道4-5和9-10),較大量的rP13Ct和22aZtCt融合蛋白位于F42和F56部分中，表明了密度大于1.1868g/cm3的重組PB樣組裝體的存在，該組裝體可以被分離用于融合蛋白純化。所述結果還表明含有融合蛋白的重組PB樣組裝體的密度可以根據(jù)包括在融合中的貯藏蛋白而變化。Y吏用與大米谷醇溶蛋白融合的hGH(rP13-hGH)和與全長a-玉米醇溶蛋白融合的hGH(22aZ-hGH)進行農(nóng)桿菌滲入研究。再一次，觀察到大部分RPBLA存在于F42和F56部分中(圖7A,泳道4-5和9-10)，但有趣的是，這一次在上清液和低密度界面中還觀察到一些未組裝融合蛋白(泳道1-2和6-7)。hGH對rP13和22aZ的部分可溶化作用可以解釋此效果。通過農(nóng)4干菌04groZ)flc^〃'M附^/we/oscz'e""孝l^匕產(chǎn)生表達融合蛋白rP13-EGF和22aZ-EGF的轉基因煙草植株。通過使用抗EGF抗體的免疫印跡確定最好的表達體，并且使用這些細胞抹與用相同構建體農(nóng)桿菌滲入的煙草小植抹進行比較分析。如圖7所示(圖7A，泳道4和9;圖7B,泳道3)，在所有的情況下，RPBLA均在獨特界面(F12)中被回收，表明RPBLA的密度非常大且均一?？v觀全部結果，清楚顯示谷醇溶蛋白能夠誘導高密度RPBLA,甚至當它們與其它蛋白融合時。這是出乎意料的結果，主要是當它們之間幾乎沒有觀察到同源性時。此外，有一些數(shù)據(jù)表明谷醇溶蛋白相互作用以穩(wěn)定蛋白體，并且當單獨在營養(yǎng)組織中表達時，它們中的某些不穩(wěn)定，例如a-玉米醇溶蛋白(Colemanetal.，1996尸/aWCe〃8:2335-2345)。實施例H:從分離的PBLS中提取重組蛋白已經(jīng)證明分離密實重組PB樣組裝體是從轉基因生物體中以高收率和高純化水平回收重組蛋白的有利方法。此處顯示能夠從該^藏細胞器中提取這些重組蛋白。盡管重組PBLA可以直接用于某些應用(即口服疫苗制備)，在某些其它情況下，對純化重組蛋白的處理可能是必需的。在37。C下在含有還原劑的緩沖液(含有四硼酸鈉12.5mMpH8、0.1%SDS和2。/c)2-巰基乙醇的SB緩沖液；處理)中孵育PB部分過夜后(約18小時)，RX3-EGF和RX3-T20蛋白^皮穩(wěn)定。如圖8中對應RX3-EGF的泳道1-4和對應RX3-T20的泳道6-7中所示，兩種提取蛋白均以它們的可溶形式被回收(S)。之后，根據(jù)它們的應用，可以進一步純化所述提取蛋白或作為部分純化提取物使用。以參考的方式引入本文中引用的每一篇專利或文獻。冠詞"a"或"an"的使用意圖包括一個或多個。前文的描述和實施例意圖作為示例性的且不應理解為限制。在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)還可能有其它變化，并且這些變化對本領域技術人員是顯而易見的。權利要求1.純化在宿主細胞中以重組蛋白體樣組裝體(RPBLA)表達的重組融合蛋白的方法，其包括步驟(a)提供以重組蛋白體樣組裝體表達融合蛋白的轉化宿主細胞的水性勻漿，所述RPBLA具有預定密度；(b)形成所述勻漿的不同密度的區(qū)域，以提供含有濃度相對提高的RPBLA的區(qū)域和含有濃度相對匱乏的RPBLA的區(qū)域；以及(c)從含有濃度相對提高的RPBLA的區(qū)域中分離RPBLA匱乏的區(qū)域，由此純化所述融合蛋白。2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述RPBLA的預定密度大于勻漿中存在的基本上所有內(nèi)源宿主細胞蛋白的密度。3.根據(jù)權利要求l-2所述的方法，其中所述融合蛋白含有兩個連接在一起的序列，其中一個序列是蛋白體誘導序列而另一個是目的產(chǎn)物的序列。4.根據(jù)權利要求1-3所述的方法，其所述勻漿的不同密度區(qū)域是通過在提供不同密度的溶質存在下離心所述勻漿來提供的。5.根據(jù)權利要求l-4所述的方法，其中所述不同密度區(qū)域是通過密度梯度來提供的。6.根據(jù)權利要求1-5所述的方法，其中所述不同密度區(qū)域是通過密度墊層來提供的，所述密度墊層的密度小于所述RPBLA的密度。7.根據(jù)權利要求1-3所述的方法，其中所述不同密度區(qū)域是通過低速離心勻漿后得到的上清液和沉淀來提供的。8.根據(jù)權利要求l-7所述的方法，其中所述宿主細胞是高等植物細胞。9.根據(jù)權利要求l-7所述的方法，其中所述宿主細胞是真菌細胞。10.根據(jù)權利要求9所述的方法，其中所述真菌宿主細胞是酵母細胞。11.根據(jù)權利要求1-7所述的方法，其中所述宿主細胞是藻類細胞。12.根據(jù)權利要求1-7所述的方法，其中所述宿主細胞是動物細胞。13.根據(jù)權利要求12所述的方法，其中所述動物宿主細胞是哺乳動物細胞。14.根據(jù)權利要求1-13所述的方法，其中所述融合蛋白還包括位于蛋白體誘導序列和目的產(chǎn)物的序列之間的接頭序列。15.根據(jù)權利要求l-14所述的方法，其中所述蛋白體誘導序列包含谷醇溶蛋白或修飾的谷醇溶蛋白。16.根據(jù)權利要求15所述的方法，其中所述谷醇溶蛋白序列是7-玉米醇溶蛋白、ce-玉米醇溶蛋白或大米谷醇溶蛋白。17.根據(jù)權利要求1-16所述的方法，其中所述RPBLA的密度為約1.1g/ml至約1.35g/ml。18.根據(jù)權利要求l-17所述的方法，其中所述勻漿是從新鮮生物質制備的。19.根據(jù)權利要求l-17所述的方法，其中所述勻漿是從干燥生物質制備的。20.才艮據(jù)權利要求1-19所述的方法，其包括回收RPBLA的附加步驟。全文摘要公開了純化重組融合蛋白的方法，所述蛋白在宿主細胞中作為重組蛋白體樣組裝體(RPBLA)表達，在所述方法中提供以具有預定密度的RPBLA表達融合蛋白的轉化宿主細胞的水性勻漿。形成所述勻漿的不同密度的區(qū)域，以提供含有濃度相對提高的RPBLA的區(qū)域和含有濃度相對匱乏的RPBLA的區(qū)域。從RPBLA濃度相對提高的區(qū)域中分離RPBLA匱乏的區(qū)域，從而純化所述融合蛋白。然后可以根據(jù)需要收集所述RPBLA濃度相對提高的區(qū)域。文檔編號A23J1/14GK101103114SQ200580047033公開日2008年1月9日申請日期2005年11月29日優(yōu)先權日2004年11月29日發(fā)明者巴勃羅·馬薩阿瓦爾魯納,布蘭卡·洛姆帕特羅約,瑪加麗塔·托倫特克格拉斯,米利亞姆·巴斯蒂達維爾基里,馬里亞·多洛雷斯·路德維德穆西卡申請人:Era生物技術有限公司