專利名稱：：用于調(diào)節(jié)細胞凋亡途徑的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)細胞凋亡途徑的方法和組合物。特別是，本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)癌細胞中的編程性細胞死亡的方法和組合物。本發(fā)明進一步涉及用于鑒定調(diào)節(jié)細胞凋亡途徑的藥物的方法和組合物。
背景技術(shù)：
：術(shù)語癌癥共同意指幾乎影響身體每一部位的IOO種以上的不同疾病。在整個生命過程中，體內(nèi)的健康細胞以受控方式分裂、生長并且自我更新。當(dāng)指導(dǎo)這種細胞分裂的基因發(fā)生機能障礙時，癌癥發(fā)生并且細胞開始以失控的方式繁殖和生長。這些異常細胞塊或團被稱作腫瘤。并非所有的腫瘤均為癌性的。良性腫瘤，諸如痣停止生長并且不會擴散至身體的其他部位。而癌性的或惡性的腫瘤持續(xù)生長，從而擠出健康細胞，干擾身體功能并且從身體組織中汲取營養(yǎng)物。惡性胂瘤可以通過稱作轉(zhuǎn)移的過程擴散至身體的其他部位。根據(jù)肺瘤的不同，來自原始腫瘤的細胞脫落，通過血液或淋巴管或在胸、腹或骨盆內(nèi)移動并且最終在體內(nèi)的其它部位形成新的腫瘤。認為僅5-10%的癌癥為遺傳性的。在其它時候，導(dǎo)致該疾病的遺傳突變是由其它因素引起的。最常見的癌癥與吸煙、日曬和飲食有關(guān)。綜合年齡、家族史和總體健康情況的這些因素促成了個體癌癥的風(fēng)險率。目前對癌癥的治療包括藥物療法(化療)、放射和激素療法。盡管新療法已經(jīng)改善了癌癥存活率，但是改善的療法，特別是那些靶向癌細胞而非健康細胞的療法仍然是需要的。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)細胞凋亡途徑的方法和組合物。特別是，本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)癌細胞中的編程性細胞死亡的方法和組合物。本發(fā)明進一步涉及用于鑒定調(diào)節(jié)細胞凋亡途徑的藥物的方法和組合物。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明提供了一種方法，該方法包括提供細胞，其中該細胞缺乏功能性線粒體p53;和遞送細胞內(nèi)的外源性p53,其中p53包含使p53定向于細胞的線粒體的序列。在某些實施方案中，外源性p53至少90%與SEQEDN0:3相同。在其它實施方案中，外源性p53具有SEQIDNO:3的核酸序列。在某些實施方案中，外源性p53可操作地與線粒體靶向分子連接。在某些實施方案中，外源性p53可操作地與Bcl2線粒體靶向序列(例如SEQIDNO:4)連接。在其它實施方案中，外源性p53可操作地與BclXL線粒體靶向序列(例如SEQIDN0:5)連接。在某些實施方案中，外源性p53和線粒體靶向分子在一種載體(例如包含SEQIDN0:1的核酸序列)中。在某些實施方案中，遞送包括將該載體遞送至細胞中。在某些實施方案中，該載體編碼具有SEQIDN0:2的氨基酸序列的融合蛋白。在某些實施方案中，遞送導(dǎo)致細胞的編程性細胞死亡。在某些實施方案中，該方法進一步包括將第二種外源性p53遞送至所述細胞的核中。在某些實施方案中，所述的第二種外源性p53包含在笫二種載體中，該栽體包含使第二種外源性p53定向于細胞核的第二種序列。在某些實施方案中，所述的細胞是在宿主動物(例如非人的哺乳動物或人)中的。在某些實施方案中，所述的宿主動物被診斷為患有癌癥并且所述的細胞為癌細胞。在某些優(yōu)選的實施方案中，遞送導(dǎo)致癌細胞的編程性細胞死亡。在其它實施方案中，所述的宿主動物被診斷為患有自身免疫性疾病。在某些另外的實施方案中，所述的方法進一步包括將測試化合物遞送至宿主動物中的步驟。在其它實施方案中，所述的細胞是在體外的。在某些實施方案中，該方法進一步包括將測試化合物遞送至細胞中的步驟。本發(fā)明進一步提供了包含核酸的組合物，所述的核酸包含可操作地與編碼線粒體耙向蛋白的基因連接的外源性p53基因。在某些實施方案中，外源性p53至少90%與SEQIDN0:3相同。在其它實施方案中，外源性p53具有SEQIDN0:3的核酸序列。在某些實施方案中，外源性p53可操作地與Bcl2線粒體靶向序列(例如SEQIDNO:4)連接。在其它實施方案中，外源性p53可操作地與BclXL線粒體靶向序列(例如SEQIDNO:5)連接。在某些實施方案中，所述的核酸具有SEQIDNO:1的序列。在某些實施方案中，所述的核酸編碼具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的融合蛋白。在另外的實施方案中，本發(fā)明提供了編碼所述核酸序列的載體。在某些實施方案中，本發(fā)明進一步提供了笫二種載體，其中第二種載體包含第二種外源性p53和使第二種p53靶向至細胞核中的序列。在其它實施方案中，本發(fā)明提供了試劑盒，其包含所述的栽體和使用該載體誘導(dǎo)細胞中的編程性細胞死亡的用法說明書。附圖l表示對可植入EnmycB-淋巴瘤模型的概述。附圖2表示對用于隨后體內(nèi)研究的淋巴瘤分離物的表征。附圖2a表示從Enmyc轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生的B-淋巴瘤分離物的各種天然存在的基因型。附圖2b表示通過載體遞送達到的線粒體靶向的p53蛋白水平與生理應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)的水平相似。附圖2c表示通過免疫印跡檢測的NIH3T3細胞中的核和線粒體耗向的p53的逆轉(zhuǎn)錄病毒驅(qū)動的表達。附圖2d表示如通過轉(zhuǎn)導(dǎo)后36小時FACS分析由共表達的GFP標記所確定的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。附圖3表示初生小鼠胚胎成纖維細胞中線粒體靶向的p53的功能性表征.附圖3a表示線粒體p53促進MEF中的編程性細胞死亡。附圖3b表示線粒體靶向的p53蛋白缺乏轉(zhuǎn)錄活性。附圖4表示體外p53棵淋巴瘤細胞中線粒體靶向的p53的功能性表征。附圖4a和4b表示線粒體靶向的53抑制培養(yǎng)物中的生長。附圖4c表示線粒體靶向的p53蛋白缺乏轉(zhuǎn)錄活性。附圖5表示線粒體靶向的p53殺傷體內(nèi)的淋巴瘤細胞。附圖5表示在第28天時收獲的重建的淋巴瘤中殘余GFP表達的FACS分析的有代表性的實例。附圖6表示通過使其C-末端與人細胞色素b5的ER前導(dǎo)序列融合使p53靶向至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。附圖7表示與栽體轉(zhuǎn)導(dǎo)的p53棵淋巴瘤細胞相比，表達線粒體乾向的p53的細胞對BclXs同種型的表達水平顯著增加，這些同種型為變剪接^物。''fl'"附圖8表示稀有異常肺瘤的表征，其中表達p53CTM或核p53的病毒未能殺傷肺瘤細胞。附圖9表示p53CTB的核酸序列(SEQIDN0:1)。粗體字形式的字母相當(dāng)于BclXL-驅(qū)動的序列。附圖10表示p53CTB的氨基酸(SEQIDNO:2)和核苷酸(SEQIDNO:IO)序列。附圖ll表示表l。附圖12表示表2。附圖13表示人p53的氨基酸序列(SEQIDNO:6);人BclXL的氨基酸序列(SEQIDNO:7);和人Bcl2的氨基酸序列(SEQIDNO:8)。附圖14表示人p53的核酸序列(SEQIDNO:3);人BclXL的核酸序列(SEQIDNO:5);和人Bcl2的核酸序列(SEQIDNO:4)。附圖15表示表3。定義為了有利于理解本發(fā)明，將許多術(shù)語和措詞定義如下本文所用的術(shù)語"受試者"意指任何動物(例如哺乳動物)，包括，但不限于人、非人的靈長類、嚙齒動物等，其將作為特定治療的接受者。一般而言，術(shù)語"受試者"和"患者"在本文中就人受試者而言可以互換使用。本文所用的術(shù)語"被診斷為癌癥的受試者"意指經(jīng)檢測并且發(fā)現(xiàn)具有癌細胞的受試者?？梢允褂萌魏魏线m的方法診斷癌癥，包括，但不限于活組織檢查、x射線、血液檢驗和本發(fā)明的診斷方法。本文所用的術(shù)語"檢測存活力的下降"意指培養(yǎng)物中活細胞的數(shù)量減少。在優(yōu)選的實施方案中，這種減少是因誘導(dǎo)群體中的某些或所有細胞的程序性細胞死亡(例如，編程性細胞死亡)所致。本文所用的術(shù)語"誘導(dǎo)細胞死亡"意指誘導(dǎo)程序性細胞死亡(例如，編程性細胞死亡)的分子(例如，本發(fā)明的p53粑向載體、測試化合物或藥物)。本文所用的術(shù)語"癌癥的病期"意指對癌癥發(fā)展水平的定性或定量評價。用于確定癌癥的病期的標準包括，但不限于胂瘤的大小、胂瘤是否已經(jīng)擴散至身體的其他部位和癌癥已經(jīng)擴散到何處(例如，在身體的同一器官或區(qū)域內(nèi)還是擴散至另一器官中)。本文所用的術(shù)語"非人的動物"意指所有的非人動物，包括，但不限于脊推動物，諸如嚙齒動物、非人的靈長類、綿羊科動物、?？苿游?、反芻動物、兔類動物、豬科動物、山羊科動物、馬科動物、犬科動物、貓科動物、鳥類等。本文所用的術(shù)語"基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)"意指將包含核酸序列的組合物遞送至細胞或組織中的任何手段。例如，基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)包括，但不限于載體(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒和其它基于核酸的遞送系統(tǒng))、棵核酸的顯微注射、基于聚合物的遞送系統(tǒng)(例如基于脂質(zhì)體和基于金屬顆粒的系統(tǒng))、生物射彈注射等。本文所用的術(shù)語"病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)"意指包含病毒元件(例如完整病毒、修飾病毒和病毒成分，諸如核酸或蛋白質(zhì))以有利于將樣品遞送至所需細胞或組織中的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。本文所用的術(shù)語"腺病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)"意指包含屬于腺病毒科的完整或修飾病毒的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。本文所用的術(shù)語"位點特異性重組靶序列"意指提供對重組因子和發(fā)生重組的位置的識別序列的核酸序列。本文所用的術(shù)語"核酸分子"意指任何包含核酸的分子，包括，但不限于DNA或RNA。該術(shù)語包括序列，這些序列包括DNA和RNA的任何已知的堿基類似物，包括，但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-幾基-N6-甲基腺苷、氮丙啶基胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-(羧基羥曱基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氫尿嗜啶、肌苷、N6-異戊烯腺嘌呤、1-曱基腺嘌呤、l-甲基假尿嘧啶、1-曱基鳥嘌呤、l-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-曱基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、P-D-甘露糖基辮苷、5'-甲氧羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-羥基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羥基乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧咬、辮苷、2-硫胞嘧咬、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嗜啶、5-曱基尿嘧咬、N-尿嘧啶-5-羥基乙酸曱酯、尿嘧啶-5-羥基乙酸、假尿嘧咬、辮苷、嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。術(shù)語"基因"意指包含產(chǎn)生多肽、前體或RNA(例如rRNA、tRNA)所必需的編碼序列的核酸(例如DNA)序列。多肽可以由全長編碼序列或由該編碼序列的任何部分編碼，只要全長或片段的所需活性或功能特性(例如酶促活性、配體結(jié)合、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫原性等)得以保持。該術(shù)語還包括結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)和鄰近于5'和3'末端上的編碼區(qū)的序列，該序列與每一端分別相距約1kb或lkb以上使得所述基因相當(dāng)于全長mRNA的長度。位于編碼區(qū)的5'并且存在于mRNA上的序列被稱作5'非翻譯序列。位于編碼區(qū)的3'或下游并且存在于mRNA上的序列被稱作3'非翻譯序列。術(shù)語"基因"包括cDNA和基因的基因組形式?；虻幕蚪M形式或克隆包含被稱作"內(nèi)含子"或"間插區(qū)"或"間插序列"的非編碼序列中斷的編碼區(qū)。內(nèi)含子為轉(zhuǎn)錄成核RNA(hnRNA)的基因的區(qū)段；內(nèi)含子可以包含調(diào)節(jié)元件，諸如增強子。從核或初級轉(zhuǎn)錄物中除去或"剪接掉"內(nèi)含子；內(nèi)含子因此不存在于信使RNA(mRNA)轉(zhuǎn)錄物中。mRNA在翻譯過程中起作用以便規(guī)定新生多肽中的氨基酸序列或順序。本文所用的術(shù)語"異源基因"意指并非在其天然環(huán)境中的基因。例如，異源基因包括導(dǎo)入另一物種中的來自一個物種的基因。異源基因還包括以某種方式(例如突變、以多拷貝加入、與非天然調(diào)節(jié)序列連接等)改變的生物體固有的基因。異源基因不同于內(nèi)源基因的方面在于異源基因序列一般與DNA序列連接，當(dāng)然未發(fā)現(xiàn)這些DNA序列與染色體中的基因序列相關(guān)聯(lián)或與在自然界未發(fā)現(xiàn)的染色體的部分(例如在基因不能正常表達的基因座上表達的基因)相關(guān)聯(lián)。本文所用的術(shù)語"轉(zhuǎn)基因"意指整合入生物體(例如非人動物)的基因組并且在有性生殖過程中傳遞給生物體的子代的異源基因。本文所用的術(shù)語"轉(zhuǎn)基因生物體"意指具有整合入其基因組并且在有性生殖過程中傳遞給其子代的轉(zhuǎn)基因的生物體(例如非人動物)。本文所用的術(shù)語"基因表達"意指將在基因中編碼的遺傳信息通過基因的"轉(zhuǎn)錄"(即，通過RNA聚合酶的酶促作用)轉(zhuǎn)化成RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)并且對編碼蛋白質(zhì)的基因而言，通過mRNA的"翻譯"轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì)的過程。可以在該過程的許多階段上調(diào)節(jié)基因表達，"增量調(diào)節(jié)"或"活化"意指增加基因表達產(chǎn)物(即RM或蛋白質(zhì))產(chǎn)生的調(diào)節(jié)，而"減量調(diào)節(jié)"或"阻抑"意指減少產(chǎn)生的調(diào)節(jié)。增量調(diào)節(jié)或減量調(diào)節(jié)中所涉及的分子(例如轉(zhuǎn)錄因子)通常被分別稱作"激活物"和"阻抑物"。除包含內(nèi)含子外，基因的基因組形式還可以包括位于存在于RNA轉(zhuǎn)錄物上的序列的5'和3'末端上的序列。這些序列被稱作'，側(cè)翼"序列或區(qū)(這些側(cè)翼序列位于存在于mRNA轉(zhuǎn)錄物上的非翻譯序列的5'或3'端)。5'側(cè)翼區(qū)可以包含調(diào)節(jié)序列，諸如控制或影響基因轉(zhuǎn)錄的啟動子和增強子。3'側(cè)翼區(qū)可以包含指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄終止、轉(zhuǎn)錄后切割和聚腺苷酸化的序列。術(shù)語"野生型"意指分離自天然存在來源的基因或基因產(chǎn)物。野生型基因為最經(jīng)常地在群體中觀察到的基因并且因此為任意設(shè)計的該基因的"正常"或"野生型"形式。相反，術(shù)語"修飾的"或"突變體"意指在與野生型基因或基因產(chǎn)物相比時展示出序列和/或功能特性的改變(即，改變的特征)的基因或基因產(chǎn)物。注意可以分離天然存在的突變體；通過下列事實鑒定它們，即它們與野生型基因或基因產(chǎn)物相比具有改變的特征(包括改變的核酸序列)。本文所用的術(shù)語"編碼…的核酸分子"、"編碼…的DNA序列"和"編碼…的DNA"意指沿脫氧核糖核酸鏈的脫氧核糖核苷酸的順序或序列。DM序列因此編碼氨基酸序列。本文所用的術(shù)語"具有編碼基因的核苷酸序列的寡核苷酸"和"具有編碼基因的核苷酸序列的多核苷酸"意指包含基因的編碼區(qū)的核酸序列，或換句話說為編碼基因產(chǎn)物的核酸序列，該編碼區(qū)可以存在于cDNA、基因組DNA或RNA形式中。當(dāng)存在于DNA形式中時，寡核苷酸或多核苷酸可以為單鏈(即有義鏈)或雙鏈的。如果需要可以將合適的控制元件，諸如增強子/啟動子、剪接點、聚腺苷酸化信號等放置在極接近于基因編碼區(qū)之處以允許適當(dāng)啟動初級RNA轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄和/或正確加工。或者，用于本發(fā)明的表達載體中的編碼區(qū)可以包含內(nèi)源性增強子/啟動子、剪接點、間插序列、聚腺苷酸化信號等或內(nèi)源性和外源性控制元件的組合。本文所用的術(shù)語"寡核苷酸"意指長度較短的單鏈多核苷酸鏈，寡核苷酸長度一般小于200個殘基(例如15-100個)，然而，本文所用的術(shù)語還意欲包括較長的多核苷酸鏈。寡核苷酸通常根據(jù)其長度來命名。例如，24個殘基的寡核苷酸被稱作"24-聚體"。寡核苷酸可以通過自我雜交或通過與其它多核苷酸雜交形成二級和三級結(jié)構(gòu)。這類結(jié)構(gòu)可以包括，但不限于雙鏈體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、十字形結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)角和三鏈體。本文所用的術(shù)語"互補"或"互補性"用于指根據(jù)堿基配對法則而關(guān)聯(lián)的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如，就"A-G-T"序列而言，與序列"T-C-A"互補?；パa性可以為"部分的"，其中僅核酸堿基中的某些按照堿基配對法則配對?；蛟诤怂嶂g可以存在"完全"或"全部"互補性。核酸鏈之間互補性的程度對核酸鏈之間雜交的效率和強度具有顯著效應(yīng)。這一點在擴增反應(yīng)以及取決于核酸之間結(jié)合的檢測方法中具有特別的重要性。術(shù)語，'同源性"意指互補性的程度?？梢源嬖诓糠滞葱曰蛲耆葱?即同一性)。部分互補序列為因與"基本上同源的"耙核酸雜交而至少部分地抑制完全互補核酸分子的核酸分子。可以使用在低嚴格條件下的雜交試驗(DNA或RNA印跡、溶液雜交等)檢驗對完全互補序列與靶序列雜交的抑制作用。基本上同源的序列或探針竟爭和抑制在低嚴格條件下完全同源性的核酸分子與靶的結(jié)合(即雜交)。這并不意味著低嚴格條件能夠允許非特異性結(jié)合；低嚴格條件要求兩條序列彼此的結(jié)合為特異性(即選擇性)相互作用?？梢酝ㄟ^使用基本上非互補(例如低于約30%同一性)的第二種靶檢測不存在非特異性結(jié)合；在不存在非特異性結(jié)合的情況下，探針不會與第二種非互補靶雜交。當(dāng)用于指雙鏈核酸序列，諸如cDNA或基因組克隆時，術(shù)語"基本上同源的"意指如上所述可以在低嚴格條件下與雙鏈核酸序列的任一條鏈或兩條鏈雜交的任何探針。基因可以產(chǎn)生通過初級RNA轉(zhuǎn)錄物的差別剪接生成的多樣RNA種類。為相同基因的剪接變體的cDNA包含序列同一性或完全同源性的區(qū)(代表兩種cDNA上存在相同外顯子或相同外顯子的一部分)和完全非同一性的區(qū)(例如，代表cDNA1上存在外顯子"A",而其中cDNA2包含外顯子"B")。因為這兩種cDNA均包含序列同一性區(qū)，所以它們均可以與來源于包含在兩種cDNA上發(fā)現(xiàn)的序列的完整基因或該基因的部分的探針雜交；這兩種剪接變體因此與這種探針和彼此基本上同源。當(dāng)用于指單鏈核酸序列時，術(shù)語"基本上同源的"意指如上所述可以在低嚴格條件下與單鏈核酸序列雜交(即為其互補物)的任何探針。本文所用的術(shù)語"雜交"用于指互補核酸的配對。雜交和雜交強度(即核酸之間結(jié)合的強度)受諸如核酸之間互補性的程度、所涉及的條件的嚴格性、形成的雜種的Tm和核酸內(nèi)G:C之比這類因素影響。在其結(jié)構(gòu)內(nèi)包含互補核酸配對的單分子被認為是"自我雜交的"。本文所用的術(shù)語"Tm"用于指"解鏈溫度"。解鏈溫度為雙鏈核酸分子群變成半數(shù)解離成單鏈的溫度。用于計算核酸的Tm的等式為本領(lǐng)域眾所周知的。正如標準參考書中所示，可以通過下列等式計算Tm的簡單估計值Tm-81.5+0.41(%G+C),此時核酸在1MNaCl的水溶液中(例如，參見Anderson和Young,QuantitativeFilterHybridization,inNucleicAcidHybridization[1985])。其它參考書中包括考慮到結(jié)構(gòu)和序列特征來計算Tm的更為復(fù)雜的計算。本文所用的術(shù)語"嚴格性"用于指溫度、離子強度和其它化合物，諸如有機溶劑存在的條件，在此條件下進行核酸雜交。在"低嚴格條件"下，所關(guān)注的核酸序列與其精確的互補物、具有單堿基錯配的序列、密切相關(guān)的序列(例如具有90%或90%以上同源性的序列)和僅具有部分同源性的序列(例如具有50-90%同源性的序列)雜交。在"中等嚴格條件"下，所關(guān)注的核酸序列僅與其精確的互補物、具有單堿基錯配的序列和密切相關(guān)的序列(例如90%或90%以上同源性)雜交。在"高嚴格條件"下，所關(guān)注的核酸序列僅與其精確的互補物和(取決于諸如溫度這類條件)具有單堿基錯配的序列雜交。換句話說，在高嚴格條件下，可以升高溫度以便排除與具有單堿基錯配的序列雜交。"高嚴格條件"在用于指核酸雜交時包括與下列等同的條件在421C下在由5XSSPE(43.8g/1NaCl，6.9g/1NaH2P04'H20和1.85g/1EDTA，用Na0H將pH調(diào)節(jié)至7.4)、0.5%SDS、5XDenhardt試劑和100jng/ml變性鮭精DNA組成的溶液中結(jié)合或雜交，隨后在42TC下在包含0.IXSSPE、1.0%SDS的溶液中洗滌，此時使用約500個核苷酸長度的探針。"中等嚴格條件"在用于指核酸雜交時包括與下列等同的條件在42r下在由5XSSPE(43.8g/1NaCl，6.9g/1NaH2P04.H20和1.85g/1EDTA，用NaOH將pH調(diào)節(jié)至7.4)、0.5%SDS、5XDenhardt試劑和100pg/ml變性鮭精DNA組成的溶液中結(jié)合或雜交，隨后在42匸下在包含l.OXSSPE、1.0%SDS的溶液中洗滌，此時使用約500個核苷酸長度的探針。"低嚴格條件"包括與下列等同的條件在421C下在由5XSSPE(43.8g/1NaCl，6.9g/1NaH2P04H20和1.85g/1EDTA，用NaOH將pH調(diào)節(jié)至7.4)、0.1%SDS、5XDenhardt試劑[每500ml50XDenhardt試劑包含5gFicoll(Type400，Pharamcia)、5gBSA(級分V;Sigma)]和lOOjlig/ml變性鮭精DNA組成的溶液中結(jié)合或雜交，隨后在42C下在包含5XSSPE、0.1%SDS的溶液中洗滌，此時使用約500個核苷酸長度的探針。本領(lǐng)域中眾所周知可以使用包括低嚴格條件的大量等同條件；需要考慮到如下因素，諸如探針的長度和性質(zhì)(DNA、RNA、堿基組成)和靶的性質(zhì)(DNA、RNA、堿基組成、存在于溶液中或是固定的等)和鹽的濃度以及其它成分(例如存在或不存在曱酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇}并且可以改變雜交溶液以便產(chǎn)生不同于，但相當(dāng)于上述條件的低嚴格雜交條件。此外，本領(lǐng)域中已知促進在高嚴格條件下雜交的條件(例如，提高雜交和/或洗滌步驟的溫度、在雜交溶液中使用甲酰胺等)(參見上文對"嚴格性"的定義)。本文所用的術(shù)語"限制性內(nèi)切核酸酶"和"限制酶"意指細菌酶，其中每一種切割特異性核苷酸序列上或與之接近的雙鏈DNA。本文所用的術(shù)語"以可操作的組合方式"、"以可操作的順序'，和"可操作地連接"意指以產(chǎn)生能夠指導(dǎo)指定基因轉(zhuǎn)錄和/或所需蛋白質(zhì)分子合成的核酸分子這樣的方式連接核酸序列。該術(shù)語還意指以產(chǎn)生功能性蛋白質(zhì)這樣的方式連接氨基酸序列。術(shù)語"分離的"在用于指核酸時，如在"分離的寡核普酸"或"分離的多核苷酸"的情況中，意指由一般在其天然來源中相關(guān)的至少一種成分或污染物鑒定的并且與之分離的核酸序列。分離的核酸以與天然發(fā)現(xiàn)它不同的形式或在不同的環(huán)境中存在。相反，非分離的核酸是在其天然存在的狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)的核酸，諸如DNA和RNA。例如，在與相鄰基因鄰近的宿主細胞染色體上發(fā)現(xiàn)了指定DNA序列(例如基因)；在該細胞中發(fā)現(xiàn)了RNA序列，諸如編碼特異性蛋白質(zhì)的特異性mRNA序列，其為與編碼眾多蛋白質(zhì)的大量其它mRNA的混合物。然而，作為實例，編碼指定蛋白質(zhì)的分離的核酸包括這類在一般表達指定蛋白質(zhì)的細胞中的核酸，其中核酸在不同于天然細胞的位置的染色體中，或者位于與天然發(fā)現(xiàn)的核酸不同的核酸序列的側(cè)翼。分離的核酸、寡核苷酸或多核苷酸可以以單鏈或雙鏈形式存在。當(dāng)要將分離的核酸、寡核苷酸或多核苷酸用于表達蛋白質(zhì)時，寡核苷酸或多核苷酸應(yīng)包含最低限度的有義或編碼鏈(即寡核苷酸或多核苷酸可以為單鏈的)，但可以包含有義和反義鏈(即寡核苷酸或多核苷酸可以為雙鏈的)。本文所用的術(shù)語"純化的"或"用于純化"意指從樣品中除去成分(例如污染物)。例如，通過除去污染的非免疫球蛋白蛋白質(zhì)純化抗體；還可以通過除去不與靶分子結(jié)合的免疫球蛋白純化它們。除去非免疫球蛋白蛋白質(zhì)和/或除去不與靶分子結(jié)合的免疫球蛋白導(dǎo)致樣品中耙-反應(yīng)性免疫球蛋白百分比的增加。在另一個實例中，在細菌宿主細胞中表達重組多肽類并且通過除去宿主細胞蛋白質(zhì)純化該多肽類；重組多肽類的百分比由此在樣品中增加。"氨基酸序列"和術(shù)語，諸如"多肽"或"蛋白質(zhì)"并不意味著將氨基酸序列限于與所述蛋白質(zhì)分子相關(guān)的完整天然氨基酸序列。本文所用的術(shù)語"天然蛋白質(zhì)"表示蛋白質(zhì)不含由載體序列編碼的氨基酸殘基；即，天然蛋白質(zhì)僅包含那些其在自然界出現(xiàn)的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的氨基酸.可以通過重組手段生產(chǎn)天然蛋白質(zhì)或可以從天然存在的來源中分離它。本文所用的術(shù)語"部分"在指蛋白質(zhì)時(如在"指定蛋白質(zhì)的一部分"的情況中)意指該蛋白質(zhì)的片段。這些片段可以為4個氨基酸殘基到完整氨基酸序列減去1個氨基酸的大小。術(shù)語"DNA印跡"意指在瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠上分析DNA以便根據(jù)大小對DNA進行分級分離，隨后從凝膠上將DNA轉(zhuǎn)移至固相支持體，諸如硝化纖維素或尼龍膜上。然后用標記的探針探測固定化DNA以便檢測與所用探針互補的DNA種類?？梢栽陔娪厩笆褂孟拗泼盖懈頓NA。在電泳后，在轉(zhuǎn)移至固相支持體之前或過程中可以使DNA部分脫噤呤和變性。DNA印跡為分子生物學(xué)家的標準工具(J.Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,NY，pp9.31-9.58[1989])。本文所用的術(shù)語"載體"用于指將DNA片段從一種細胞轉(zhuǎn)移至另一種細胞的核酸分子。術(shù)語"栽體(vehicle)"有時與"載體(vector)"互換使用。載體通常來源于質(zhì)粒、噬菌體或植物或動物病毒。本文所用的術(shù)語"表達載體"意指包含所需編碼序列和適當(dāng)核酸序列的重組DNA分子，所述的編碼序列和核酸序列是表達特定宿主生物體中可操作地連接的編碼序列所必需的。對于在原核細胞中表達所必需的核酸序列通常包括啟動子、操縱子(任選的)和核糖體結(jié)合位點，通常還有其它序列。已知真核細胞使用啟動子、增強子以及終止和聚腺苷酸化信號。術(shù)語"超表達(overexpression)"和"超表達(overexpressing)"和語法上的同義詞用于指mRNA的水平時表示比在對照或非轉(zhuǎn)基因動物的指定組織中觀察到的高約3倍(或3倍以上)的表達水平。使用任何本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的許多技術(shù)，包括，但不限于RNA印跡分析來測定mRNA的水平。在RNA印跡上包括適當(dāng)?shù)膶φ找员銠z驗從所分析的每一組織中加載的RNA的量的差異(例如，存在于每一樣品中的28SrRNA，即以基本上相同的量存在于所有組織中的豐富RNA轉(zhuǎn)錄物的量可以用作使在RNA印跡上觀察到的mRNA-特異性信號規(guī)格化或標準化的手段)。對存在于大小與正確剪接的轉(zhuǎn)基因RNA相當(dāng)?shù)膸е械膍RNA的量進行定量；在對轉(zhuǎn)基因mRNA的表達進行定量時不考慮與轉(zhuǎn)基因探針雜交的其它次要種類的RNA。本文所用的術(shù)語"轉(zhuǎn)染"意指將外源性DNA導(dǎo)入真核細胞。可以通過本領(lǐng)域中已知的各種方法進行轉(zhuǎn)染，包括磷酸鈣-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、聚凝胺介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、脂質(zhì)體融合、脂轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染和生物射彈。術(shù)語"磷酸鈣共沉淀"意指用于將核酸導(dǎo)入細胞的技術(shù)。當(dāng)核酸作為磷酸鉤-核酸共沉淀物存在時，細胞對核酸的攝取增強。Graham和vanderEb的最早技術(shù)(Graham和vanderEb，Virol.，52:456[1973])已經(jīng)被幾個小組進行了改進以便優(yōu)化用于特定類型細胞的條件。本領(lǐng)域中眾所周知這些大量的改進。術(shù)語"穩(wěn)定轉(zhuǎn)染"或"穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的"意指將外源性DNA導(dǎo)入和整合入轉(zhuǎn)染細胞的基因組中。術(shù)語"穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子"意指已經(jīng)將外源性DNA穩(wěn)定整合入基因組DNA中的細胞。術(shù)語"瞬時轉(zhuǎn)染"或"瞬時轉(zhuǎn)染的"意指將外源性DNA導(dǎo)入細胞，其中外源性DNA沒有整合入轉(zhuǎn)染細胞的基因組中。外源性DNA繼續(xù)存在于轉(zhuǎn)染細胞的核中數(shù)天。在此期間，對外源性DNA進行調(diào)節(jié)控制，這些調(diào)控可以操縱內(nèi)源性基因在染色體中的表達。術(shù)語"瞬時轉(zhuǎn)染子"意指已經(jīng)攝取了外源性DNA，但尚未能整合這種DNA的細胞。本文所用的術(shù)語"選擇標記"意指編碼酶促活性的基因的應(yīng)用，所述的活性提祺在缺乏另外為必需營養(yǎng)物的培養(yǎng)基中生長的能力(例如酵母細胞中的HIS3基因)；此外，選擇標記可以對表達選擇標記的細胞提供抗生素或藥物抗性。選擇標記可以為"顯性的"；顯性選擇標記編碼可以在任何真核細胞系中檢測的酶促活性。顯性選擇標記的實例包括提供在哺乳動物細胞中對藥物G418的抗性的細菌氨基糖苷3'磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(也稱作neo基因)、提供對抗生素潮霉素的抗性的細菌潮霉素G磷酸轉(zhuǎn)移酶(hyg)基因和提供在有麥考酚酸存在下生長的能力的細菌黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因(也稱作gpt基因)。其它選擇標記并非為顯性的，因為它們必須與缺乏相關(guān)酶活性的細胞系一起使用。非顯性選擇標記的實例包括與tk—細胞系一起使用的胸苷激酶(tk)基因、與缺乏CAD的細胞一起使用的CAD基因和與hprf細胞系一起使用的哺乳動物次黃噪呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(hprt)基因。選擇標記在哺乳動物細胞系中的應(yīng)用的綜述提供在Sambrook，J.等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(1989)pp.16.9-16.15中。本文所用的術(shù)語"細胞培養(yǎng)物"意指細胞的任何體外培養(yǎng)物。在該術(shù)語中包括傳代細胞系(例如具有無限增殖表型)、初級細胞培養(yǎng)物、轉(zhuǎn)化細胞系、有限細胞系(例如非轉(zhuǎn)化細胞)和在體外維持的任何其它細胞群。本文所用的術(shù)語"真核生物"意指可區(qū)別于"原核生物"的生物。意圖是該術(shù)語包括所有含有表現(xiàn)出真核生物常見特征的細胞的生物，諸如存在由核膜包圍的真正的核，其中存在染色體；存在膜被的細胞器；和在真核生物體中通常觀察到的其它特征。因此，該術(shù)語包括，但不限于諸如真菌、原生動物和動物(例如人)這類生物。本文所用的術(shù)語"體外"意指人工環(huán)境和在人工環(huán)境中發(fā)生的過程或反應(yīng)。體外環(huán)境可以由試管和細胞培養(yǎng)物組成，但不限于它們。術(shù)語"體內(nèi)"意指自然環(huán)境(例如動物或細胞)和在自然環(huán)境中發(fā)生的過程或反應(yīng)。術(shù)語"測試化合物"和"候選化合物"意指為用于治療或預(yù)防疾病、病、病癥或身體機能障礙(例如癌癥)的候選物的任何化學(xué)個體、藥品、藥物等。測試化合物包括已知的和潛在的治療化合物?？梢酝ㄟ^使用本發(fā)明的篩選方法篩選確定測試化合物為治療性的。本文所用的術(shù)語"樣品"以其最廣泛的含義使用。在一種含義中，它旨在包括獲自任何來源的樣本或培養(yǎng)物以及生物和環(huán)境樣品。生物樣品可以獲自動物(包括人)并且包括液體、固體、組織和氣體。生物樣品包括血'夜制品，諸如血漿、血清等。環(huán)境樣品包括環(huán)境材料，諸如表面物質(zhì)、土壤、水、晶體和工業(yè)樣品。然而，這類實例不應(yīng)被解釋為限制適用于本發(fā)明的樣品類型.發(fā)明詳述p53介導(dǎo)的腫瘤抑制主要根據(jù)其細胞凋亡活性確定.廢除p53介導(dǎo)的編程性細胞死亡為人腫瘤中的主要缺陷。這使得p53死亡途徑的功能性恢復(fù)成為'通用'癌癥策略的首要治療靶，具有獲得巨大的臨床成果的潛力。在本發(fā)明研發(fā)過程中進行的實驗證實利用最短已知的p53死亡信號傳導(dǎo)線路，例如不依賴于直接轉(zhuǎn)錄的線粒體p53死亡程序具有治療效用。到本發(fā)明為止，研究工作集中在恢復(fù)轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的p53編程性細胞死亡。一種研究途徑試圖鑒定在結(jié)構(gòu)上拯救腫瘤衍生的p53突變蛋白的小分子。兩種原型化合物CP-31398和PRIMA-1可以恢復(fù)基于細胞的體外測定中的轉(zhuǎn)錄p5功能并且減緩棵鼠中肺瘤異種移植物的腫瘤生長。然而，其作用機制尚不清楚(Foster等，1999.Science286:2507-2510;Bykov等，2002.NatMed8:282-288)且其在天然小鼠癌癥模型中和在癌癥患者中的體內(nèi)功效未經(jīng)測試。另一個研究范圍集中在通過基因療法提供常規(guī)野生型p53(Moll，2000.Newp53-basedstrategiesforcancertherapy.EatonPublishing,Natick，MA.439-455pp.),在美國和歐洲進行的使用胂瘤內(nèi)注射攜帶常規(guī)核野生型p53的腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒栽體的幾項I和II期臨床研究最初確實證實了這些試劑為充分可耐受的并且表現(xiàn)出有限的抗肺瘤活性(Moll,supra;Zeimet等，2003.LancetOncol.4:415-422;Nemunaitis等，2000.JClin.Oncol.18:609-622;Kuball等，2002.JClinOncol.20:957-965;Vecil和Lang，2003.JNeuro.Oncol.65:237-246)。然而，近期最大的野生型p53基因療法試驗的失敗強烈表明，盡管其方法合理，但是腫瘤細胞阻礙了目的在于恢復(fù)轉(zhuǎn)錄p53死亡功能的治療方式(Zeimet等，文獻同上)。在這種國際隨機化的n/III期臨床試驗中，對具有p53突變的卵巢癌患者與標準化療聯(lián)合腹膜內(nèi)給予腺病毒AdSCMV-wtp53。然而，在首次臨時分析后終止了本研究，因為未能顯示出治療有益性(Zeimet等，文獻同上)，兩種原因可以解釋這種失敗.wtp53和小分子途徑的共同之處在于它們依賴于肺瘤細胞對p53靶基因轉(zhuǎn)錄活化作出反應(yīng)的保留的能力。然而，許多人類癌癥因其導(dǎo)致廣泛異常的基因沉默模式的基因組的總體外遺傳失調(diào)而失去了這種先決條件(Herman和Bay1in,2003.NEng.JMed349:2042-2054)。此外，wtp53作為轉(zhuǎn)錄因子起通過其C-末端四聚化結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的同型四聚體的作用。這一事實使得異位wtp53蛋白易受內(nèi)源性p53突變體的所謂的顯性負調(diào)控抑制的攻擊，所述的內(nèi)源性p53突變體以極高水平在癌組織中天然表達。約50%的人癌表達非野生型p53蛋白的突變體。對異位wtp53蛋白的非顯性負調(diào)控干涉的附加攻擊來源于也時常在人癌中超表達的p63和p73的5N同種型(Concin等，Moll.2004.CancerRes64:2449-2460;MollMM，SladeN.2004.MolCancerRes2:371-386;Moll等，2001.BiochimBiophysActa1552:47-59)。p53-依賴性編程性細胞死亡主要利用內(nèi)源線粒體途徑(Schuler和Green.2001.BiochemSocTrans29:684-688)。編程性細胞死亡依賴于蛋白質(zhì)和不需要新基因轉(zhuǎn)錄的DNA降解酶的預(yù)先裝配型死亡系統(tǒng)。實際上，可以引發(fā)編程性細胞死亡并且使其在無核的細胞質(zhì)中進行至其生化終點(Jacobson等，EmboJ13:1899-1910;Martin等，1996.JBiolChem271-28753-28756;Schulze-Osthoff等，1994.JCellBiol.127:15-20)。在本發(fā)明的研發(fā)過程中進行的實驗證實了正常和肺瘤細胞中應(yīng)激粒體中，其中宿主釋放激活細胞編程性細胞死亡的因子(Marchenko等，Moll.2000.JBiolChem.275:16202-16212;Sansome等，Moll.2001.FEBSLett.488:110-115.Mihara等，Moll.2003.MolecularCell,11:577-790。這一生物學(xué)事實在本發(fā)明中得以利用，它表明p53的轉(zhuǎn)錄恢復(fù)(在細胞核中發(fā)生)對體內(nèi)胂瘤殺傷而言并非必要。而是通過利用由線粒體引發(fā)的不依賴于直接和快速轉(zhuǎn)錄的細胞洞亡p53程序?qū)崿F(xiàn)腫瘤細胞退化。線粒體p53利用其DM-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(該結(jié)構(gòu)域?qū)ζ滢D(zhuǎn)錄作用而言也是重要的)抑制位于線粒體外膜上的抗細胞凋亡性Bclx1/Bcl2蛋白和誘導(dǎo)能夠隨后釋放細胞色素C的BAK寡聚化(Mihara等，2003.MethodsMolBiol234:203)。核磁共振研究證實了p53上的BclXI相互作用表面包括用于接觸DNA的相同區(qū)(Petros等，2004.FEBSLetters28073:1-4)。然而，與轉(zhuǎn)錄活性p53相反，線粒體p53無需四聚化，因為其C-末端結(jié)構(gòu)域是完全不必要的.本發(fā)明并不限于特定的機理。實際上，理解機理對實施本發(fā)明而言并非必要。但是，值得關(guān)注的是這一機理提供另一個優(yōu)勢的方面在于線粒體乾向的p53可以避免受到內(nèi)源性突變p53蛋白和在腫瘤中超表達的5Np63/p73同種型的顯性負調(diào)控抑制。共同地，其不依賴于轉(zhuǎn)錄性和避免顯性負調(diào)控干涉的潛能提供了一種治療方式。在本發(fā)明的研發(fā)過程中進行的實驗證實了P53CTB嚴格靶向至線粒體。p53CTM首先靶向至線粒體，其中某些另外靶向至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。未觀察到可檢測的靶向至核或其它細胞器。線粒體靶向的p53缺乏轉(zhuǎn)錄活性并且不依賴于反式激活、反式阻抑并且不依賴于外遺傳沉默，而這種情況在人癌中極為常見并且可能對需要DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄作用的任何試劑而言造成嚴重障礙。在本發(fā)明的研發(fā)過程中進行的進一步實驗證實了線粒體靶向的p53促進體外初級淋巴瘤細胞中的編程性細胞死亡。進一步的實驗證實了線粒體靶向的p53在用于人伯基特淋巴瘤的充分表征的小鼠模型中殺傷體內(nèi)初級淋巴瘤細胞(該模型受c-Myc癌基因驅(qū)動并且攜帶ARF/p53腫瘤阻抑軸中的失活突變)。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)編程性細胞死亡(例如在癌細胞中)和由此治療諸如癌癥和自身免疫性疾病這類特征在于細胞凋亡途徑缺陷的疾病的方法。本發(fā)明進一步提供了鑒別改變(例如拯救)突變線粒體p53的化合物的方法。I.細胞凋亡誘導(dǎo)療法在某些實施方案中，本發(fā)明提供了癌癥療法。在某些優(yōu)選的實施方案中，療法使p53靶向至線粒體。然而，本發(fā)明并不限于治療癌癥。本發(fā)明的方法和組合物適用于治療特征在于細胞凋亡途徑缺陷的任何疾病，包括，但不限于癌癥和自身免疫性疾病。在某些實施方案中，療法為遺傳療法。在其它實施方案中，療法為小分子療法.A.遺傳療法在某些實施方案中，本發(fā)明提供了用于改變細胞凋亡途徑的遺傳療法。本發(fā)明關(guān)注任何遺傳操作在用于使p53表達耙向至線粒體中的應(yīng)用(例如在癌細胞中的應(yīng)用)。在優(yōu)選的實施方案中，p53作為與線粒體靶向序列融合的融合蛋白遞送。本發(fā)明并不限于特定的線粒體把向序列。實際上，關(guān)注各種線粒體靶向序列，包括，但不限于BclXl蛋白和Bcl2蛋白。在某些優(yōu)選的實施方案中，BclXI為靶向序列。在特別優(yōu)選的實施方案中，使用由SEQIDN0s:1和2描述的p53CTB栽體?？梢允褂萌魏魏线m的方法進行核酸構(gòu)建體至體外或體內(nèi)細胞的遞送。合適的方法為將核酸構(gòu)建體導(dǎo)入細胞以使所需事件(例如在線粒體中p53蛋白的表達)發(fā)生的方法?？梢酝ㄟ^任何不同的方法將攜帶遺傳信息的分子導(dǎo)入細胞，包括，但不限于定向注射棵DNA寡聚體，使用載有所述構(gòu)建體的金粒子轟擊和使用例如脂質(zhì)體、生物聚合物等的大分子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。優(yōu)選的方法使用來源于病毒的基因遞送栽體，包括，但不限于腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒和腺伴隨病毒。代表性的方法在下文中更詳細地描述。1.腺病毒栽體在某些實施方案中，腺病毒載體用于將p53遞送至線粒體。自我繁殖的腺病毒(Ad)栽體已經(jīng)廣泛用于將外源性基因遞送至大量不同的體外和體內(nèi)細胞類型。"自我繁殖病毒"為那些可以通過將單段DNA(重組病毒基因組)轉(zhuǎn)染入單包裝細胞系以便產(chǎn)生感染性病毒的病毒；自我繁殖病毒無需使用輔助病毒進行繁殖。就許多載體而言，腺病毒載體對它們能夠遞送至細胞中的異源核酸的量具有限制。例如，腺病毒的容量約為8-10kb，腺伴隨病毒的容量約為4.8kb，而慢病毒的容量約為8.9kb,在致力于解決與第一代Ad載體相關(guān)的病毒復(fù)制問題的過程中，已經(jīng)研發(fā)了所謂的"第二代"Ad載體。第二代Ad載體缺失Ad基因組的早期區(qū)(E2A、E2B和E4)。高度修飾的笫二代Ad載體在大規(guī)模載體制備過程中不太可能產(chǎn)生可復(fù)制病毒，并且Ad基因組復(fù)制的完全占據(jù)應(yīng)消除晚期基因復(fù)制。對晚期病毒蛋白的宿主免疫應(yīng)答由此減少[參見Amalfitano等，J.Virol.72:926-933(1998)]。從Ad基因組中消除E2A、E2B和E4基因還可提供增加的克隆能力。例如，從Ad基因組中缺失這些基因中的兩種或多種能夠通過Ad載體遞送全長或cDNA基因[Kumar-Singh等，Hum.Mol.Genet.，5:913(1996)]。"內(nèi)部受損的"或依賴輔助病毒的Ad載體包含指導(dǎo)腺病毒復(fù)制和包裝的順式作用DNA序列，但不含病毒編碼序列[參見Fisher等，Virology217:11-22(1996)和Kochanek等，Proc.Nat.Acad.ScLUSA93:5731-5736(1996)]。內(nèi)部受損的載體為通過在有提供所有轉(zhuǎn)運中的必需病毒蛋白的輔助病毒存在下復(fù)制產(chǎn)生的缺陷型病毒。由于內(nèi)部受損的載體不含任何病毒基因，所以病毒蛋白的表達是不可能的。近期的研發(fā)已經(jīng)發(fā)展了內(nèi)部受損的載體產(chǎn)生的領(lǐng)域[參見Hardy等，J.Virol.71:1842-1849(1997)和Hartigan-0'Conner等，J.Virol.73:7835-7841(1999)]。內(nèi)部受損的Ad栽體能夠最大限度地容納達約37kb的外源性DNA，然而，28-30kb更為典型。例如，內(nèi)部受損的Ad載體可以容納全長基因或cDNA,而且可以容納表達盒或效應(yīng)物蛋白。2.慢病毒栽體基于人或貓慢病毒的載體已經(jīng)顯示為另一種用于基因療法應(yīng)用的載體?；诼《镜妮d體感染不分裂的細胞作為其正常生活周期的組成部分并且通過在表達病毒蛋白的細胞系中能夠包裝的載體構(gòu)建體的表達產(chǎn)生。慢病毒顆粒的小尺寸限制了它們能夠攜帶達約10kb的外源性DNA的量。3.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將逆轉(zhuǎn)錄病毒(逆轉(zhuǎn)錄病毒科)分成三組泡沫病毒(例如人泡沫病毒)；慢病毒(例如人免疫缺陷病毒和綿羊髄鞘脫落病毒)和瘤病毒(例如MLV、勞斯肉瘤病毒)。逆轉(zhuǎn)錄病毒為感染動物細胞的有包膜的(即被源自宿主細胞的脂雙層膜包圍的)單鏈RNA病毒。當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細胞時，其RNA基因組被轉(zhuǎn)化成雙鏈線性DNA形式(即它被逆轉(zhuǎn)錄)。隨后這種病毒的DNA形式作為原病毒被整合入宿主細胞基因組。原病毒用作產(chǎn)生附加病毒基因組和病毒mRNA的模板。包含兩拷貝的基因組RNA的成熟病毒顆粒從受感染細胞的表面萌芽。病毒顆粒包含基因組RNA、逆錄酶和病毒殼體(包含病毒gag基因產(chǎn)物)內(nèi)部的其它po/基因產(chǎn)物，其被來源于包含病毒包膜糖蛋白(也稱作膜締合性蛋白)的宿主細胞的脂雙層膜包圍。大量逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組結(jié)構(gòu)為本領(lǐng)域眾所周知的并且這使逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組得到適應(yīng)以便產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒栽體。攜帶所關(guān)注基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的生產(chǎn)一般以兩步驟完成。首先，將所關(guān)注的基因插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，所述載體包含有效表達所關(guān)注基因所必需的序列(包括可以由病毒長末端重復(fù)序列[LTR]或由內(nèi)部啟動子/增強子和相關(guān)剪接信號提供的啟動子和/或增強子元件)、將病毒RNA有效包裝入感染性病毒體所需的序列(例如包裝信號[Psi]、tRNA引物結(jié)合位點[-PBS]、逆轉(zhuǎn)錄所需的3'調(diào)節(jié)序列[+PBS]和病毒LTR)。LTR包含病毒基因組RNA、逆錄酶和整合酶功能的關(guān)聯(lián)所需的序列和參與指導(dǎo)在病毒顆粒中待包裝的基因組RNA的表達的序列。為了安全，許多重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體缺乏病毒復(fù)制所必需的基因的功能拷貝(這些必需基因缺失或功能失效)；認為所得病毒為復(fù)制缺陷型的。其次，在構(gòu)建重組栽體后，將栽體DNA導(dǎo)入包裝細胞系。包裝細胞系提供了將病毒基因組RNA包裝入具有所需宿主范圍的病毒顆粒的轉(zhuǎn)運中所需的病毒蛋白(即病毒編碼的gag、pol和env蛋白)。宿主范圍部分受到病毒顆粒表面上表達的包膜基因產(chǎn)物類型的控制。包裝細胞系可以表達親嗜性、雙嗜性或異嗜性包膜基因產(chǎn)物?；蛘?，包裝細胞系可能缺乏編碼病毒包膜(env)蛋白的序列。在這種情況下，包裝細胞系將病毒基因組包裝入缺乏膜締合性蛋白(例如env蛋白)的顆粒，為了產(chǎn)生包含允許病毒進入細胞的膜締合性蛋白的病毒顆粒，用編碼膜締合性蛋白(例如皰疹性口腔炎病毒[VSV]的G蛋白)的序列轉(zhuǎn)染包含逆轉(zhuǎn)錄病毒序列的包裝細胞系。轉(zhuǎn)染的包裝細胞系隨后產(chǎn)生包含由轉(zhuǎn)染的包裝細胞系表達的膜締合性蛋白的病毒顆粒；認為這些病毒顆粒為假型病毒顆粒，這些病毒顆粒包含來源于一種病毒的病毒基因組RNA，所述病毒被另一種病毒的包膜蛋白包殼。最常用的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體來源于雙嗜性莫洛尼鼠白血病毒(MoMLV)(Miller和Baltimore,Mol.Cell.Biol.，6:2895[1986])。MoMLV系統(tǒng)具有幾個優(yōu)點1)這種特異性逆轉(zhuǎn)錄病毒可以感染許多不同細胞類型；2)可利用建立的包裝細胞系生產(chǎn)重組MoMLV病毒顆粒；和3)轉(zhuǎn)移的基因被持久地整合入靶細胞染色體。建立的MoMLV載體系統(tǒng)包含含有小部分逆轉(zhuǎn)錄病毒序列(病毒的長末端重復(fù)序列或"LTR"和包裝或"psi"信號)的DNA載體和包裝細胞系。將待轉(zhuǎn)移的基因插入該DNA載體。存在于該DM載體上的病毒序列提供將載體RM插入或包裝入病毒顆粒和表達插入的基因所必需的信號。包裝細胞系提供了顆粒裝配所需的病毒蛋白(Markowitz等，J.Virol.，62:1120[1988])。盡管存在這些優(yōu)點，但是基于MoMLV的現(xiàn)存逆轉(zhuǎn)錄病毒載體受到幾個內(nèi)在問題的限制l)它們無法感染不分裂的細胞(Miller等，Mol.Cell.Biol.，10:4239[1992]);2)它們產(chǎn)生低滴度的重組病毒(Miller和Rosman，BioTechn.,7:980[1989];和Miller,Nature357:455[1992]);和3)它們以低效率感染某些細胞類型(例如人淋巴細胞)(Adams等，Pro"Natl.Acad,Sci.USA89:8981[1992])。與基于MoMLV的栽體相關(guān)的低滴度至少部分歸因于病毒編碼的包膜蛋白的不穩(wěn)定性。通過物理方法(例如超速離心和超濾)濃縮逆轉(zhuǎn)錄病毒原液導(dǎo)致感染性病毒嚴重損失。已經(jīng)通過使用包含VSV的G蛋白作為膜締合性蛋白的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體克服了由基于MoMLV的載體所致的低滴度和對某些細胞類型感染無效的缺陷.不同于結(jié)合特異性細胞表面蛋白受體以便進入細胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白，VSVG蛋白與質(zhì)膜的磷脂成分發(fā)生相互作用(Mastromarino等，J.Gen.Virol.，68:2359[1977])。因為VSV進入細胞不依賴于特異性蛋白受體的存在，所以VSV具有極其廣泛的宿主范圍。具有VSVG蛋白的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒栽體具有改變的VSV宿主范圍特征(即，它們可以感染幾乎所有種類的脊推動物、無脊推動物和昆蟲細胞)。重要的是，可以在不顯著喪失感染性的情況下通過超速離心將VSVG-假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體濃縮2000倍或2000倍以上(Burns等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:8033[1993])。VSVG蛋白還被用于基于人免疫缺陷病毒(HIV)的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Naldini等，Science272:263[1996])。因此，VSVG蛋白可以用于產(chǎn)生多種假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體并且不限于基于MoMLV的載體。4.載體的遞送可以按照各種方式對受試者給予栽體。例如，在本發(fā)明的某些實施方案中，使用直接注射給予載體至腫瘤或與腫瘤相關(guān)的組織中。在其它實施方案中，給予通過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進行(例如，參見PCT公開99/02685，將該文獻完整地引入本文作為參考)。腺病毒載體的典型劑量水平優(yōu)選為108-10"加入到灌注液中的載體顆粒。B.聯(lián)合療法本發(fā)明并不限于表達線粒體p53。在某些實施方案中，本發(fā)明考慮聯(lián)合療法。例如，在某些實施方案中，核p53和線粒體p53二者均被用于癌癥療法(例如遺傳療法)。這類聯(lián)合療法具有殺傷攜帶p53錯義突變的癌細胞的用途。本發(fā)明并不限于特定的機理。實際上，理解這一機理對實施本發(fā)明而言并不是必要的。盡管如此，但是值得關(guān)注的是線粒體與核p53的組合在誘導(dǎo)癌細胞的編程性細胞死亡中提供了協(xié)同作用。在其它實施方案中，提供了本發(fā)明的組合物與現(xiàn)存療法的組合。在某些實施方案中，提供了本發(fā)明的化合物與已知癌癥化療劑的組合。本發(fā)明并不限于特定的化療劑。打算將不同種類的抗腫瘤(例如抗癌)藥用于本發(fā)明的某些實施方案中。適用于本發(fā)明的抗癌藥包括，但不限于誘導(dǎo)編程性細胞死亡的活性劑；抑制腺苷脫氨酶功能、抑制嘧啶生物合成、抑制嘌呤環(huán)生物合成、抑制核苷酸互變、抑制核糖核苷酸還原酶、抑制胸苷一磷酸(TMP)合成、抑制二氫葉酸還原、抑制DNA合成、與DNA形成加合物、損傷DNA、抑制DNA修復(fù)、插入DNA、使天冬酰胺脫去氨基、抑制RNA合成、抑制蛋白質(zhì)合成或穩(wěn)定性、抑制微管合成或功能等的活性劑。在某些實施方案中，適用于本發(fā)明的組合物和方法的典型抗癌藥包括，但不限于1)生物堿類，包括微管抑制劑(例如長春新堿、長春堿和長春地辛等)、微管穩(wěn)定劑(例如紫杉醇(TAX0L)和多西他賽等)和染色質(zhì)功能抑制劑，包括拓樸異構(gòu)酶抑制劑，諸如表鬼臼毒素(例如依托泊普(VP-16)和替尼泊苷(VM-26)等)，和乾向拓樸異構(gòu)酶I的活性劑(例如喜樹堿和isirinotecan(CPT-ll)等);2)共價DNA-結(jié)合劑(烷基化劑)，包括氮芥(例如metchlorethamine、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺(ifosphamide)和白消安(MYLERAN)等)；亞硝基脲類(例如卡莫司汀、洛莫司汀和司莫司汀等)，和其它烷基化劑(例如達卡巴嗪、羥甲基蜜胺、塞替派和絲裂霉素等)；3)非共價DNA-結(jié)合劑(抗腫瘤抗生素)，包括核酸抑制劑(例如，更生毒素(放線菌素D)等)；蒽環(huán)類抗生素(例如柔紅霉素(道諾霉素和紅變霉素)、多柔比星(阿霉素)和伊達比星(去曱氧柔紅霉素)等)；蒽二酮類(例如蒽環(huán)類抗生素類似物，諸如米托蒽醌等)、博來霉素(BLENOXANE)等和普卡霉素(光輝霉素)等；4)抗代謝物，包括抗葉酸劑(例如氨甲蝶呤、葡萄糖酸鐵(F0LEX)和氨甲蝶呤鈉(MEXATE)等)；嘌呤抗代謝物(例如6-巰基嘌呤(6-MP、PURINETHOL)、6-硫代鳥嘌呤(6-TG)、硫唑噪呤、阿昔洛韋、更昔洛韋、氯脫氧腺苷、2-氯脫氧腺苷(CdA)和2'-脫氧考福霉素(噴司他丁)等)；嘧咬拮抗劑(例如氟嘧啶(例如5-氟尿嗜啶(ADRUCIL)、5-氟脫氧尿嘧啶(FdUrd)(氟脲嘧啶脫氧核苷))等)和阿糖胞苷類(例如CYTOSAR(ara-C)和氟達拉濱等)；5)酶，包括L-天冬酰胺酶和羥基脲等；6)激素，包括糖皮質(zhì)類固醇、抗雌激素藥(例如他莫昔芬等)、非類固醇抗雄激素藥(例如氟他胺等)和芳香酶抑制劑(例如阿那曲唑(ARIMIDEX)等)；7)鉑化合物(例如順鉑和卡鉑等)；8)與抗癌藥、毒素和/或放射性核素等綴合的單克隆抗體；9)生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物(例如干擾素(例如IFN-ot等)和白細胞介素(例如IL-2等)等)；10)過繼免疫治療；11)造血生長因子；12)誘導(dǎo)腫瘤細胞分化的活性劑(例如全反式視黃酸等)；13)基因治療技術(shù)；14)反義治療技術(shù)；15)腫瘤疫苗；16)對準胂瘤轉(zhuǎn)移灶的療法(例如巴馬司他等)；17)血管發(fā)生抑制劑；18)蛋白體抑制劑(例如VELCADE);19)乙?；?或甲基化抑制劑(例如HDAC抑制劑)；20)NFicB調(diào)節(jié)劑；21)細胞周期調(diào)節(jié)抑制劑(例如CDK抑制劑)；22)p53蛋白功能調(diào)節(jié)劑；和23)電離輻射。常規(guī)用于癌癥治療情況中的任何溶瘤劑都可用于本發(fā)明的組合物和方法中。例如，美國食品與藥品管理局保存了批準在美國使用的溶瘤劑的處方集。U.S.F.D.A.的國際對應(yīng)機構(gòu)保存了類似的處方集。表4中提供了批準在美國使用的典型抗癌藥的表單。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠認識到所有美國批準的化療劑上所需的"產(chǎn)品標簽"均描述了對典型藥劑批準的適應(yīng)癥、給藥信息、毒性數(shù)據(jù)等。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>c.小分子藥物在某些實施方案中，本發(fā)明提供了通過再活化(例如重折疊)突變線粒體p53減輕或消除癌癥的藥物(例如小分子藥物)。在某些實施方案中，使用本文所述的藥物篩選(例如下文的部分II中所述)鑒定小分子藥物。D.藥物組合物本發(fā)明進一步提供了藥物組合物(例如包含上述的治療化合物)?？梢愿鶕?jù)是需要局部治療還是全身治療和所治療的區(qū)域的不同以許多方式給予本發(fā)明的藥物組合物，給藥可以為局部的(包括眼部和對粘膜，包括陰道和直腸遞送)、肺部的(例如通過吸入或吹入粉末或氣霧劑，包括通過噴霧器；氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、表皮和透皮)、口服或非腸道的。非腸道給藥包括靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射或輸注；或顱內(nèi)，例如鞘內(nèi)或心室內(nèi)給藥。用于局部給藥的藥物組合物和制劑可以包括透皮貼劑、軟骨劑、洗劑、霜劑、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉末。常規(guī)的藥物載體、水性、粉末或油性基質(zhì)、增稠劑等可能是必要的或需要的。用于口服給藥的組合物和制劑包括粉末或顆粒、在水或非水性介質(zhì)中的懸浮液或溶液、膠嚢、小藥嚢或片劑?？赡苄枰龀韯?、矯味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑。用于非腸道、鞘內(nèi)或心室內(nèi)給藥的組合物和制劑可以包括無菌水溶液，其還可以包含緩沖劑、稀釋劑和其它合適的添加劑，諸如，但不限于滲透促進劑、載體化合物和其它藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明的藥物組合物包括，但不限于溶液、乳液和包含脂質(zhì)體的制劑。可以由包括，但不限于預(yù)形成的液體、自乳化固體和自乳化半固體的各種成分生成這些組合物?？梢园凑罩扑幑I(yè)中眾所周知的常規(guī)技術(shù)制備本發(fā)明的藥物制劑，可以將其便利地制成單位劑型。這類技術(shù)包括使活性組分與藥用栽體或賦形劑組合的步驟。一般而言，通過均勻和緊密混合活性組分與液體載體或細碎的固體載體或它們兩者，且然后如果必要使產(chǎn)物成形來制備制劑?？梢詫⒈景l(fā)明的組合物配制成任何許多可能的劑型，諸如，但不限于片劑、膠囊、液體糖漿劑、軟膠囊、栓劑和灌腸劑。還可以將本發(fā)明的組合物配制成在水性、非水性或混合介質(zhì)中的栓劑。水懸浮液可以進一步包含增加該懸浮液粘度的物質(zhì)，包括，例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖。該懸浮液還可以包含穩(wěn)定劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，可以將藥物組合物配制成泡沫和以泡沫形式使用。藥物泡沫包括諸如，但不限于乳液、微乳液、霜劑、膠凍劑和脂質(zhì)體這類制劑.盡管在性質(zhì)上基本上類似，但是這些制劑在終產(chǎn)物的成分和稠度方面可以改變，還可以將促進寡核苷酸在細胞水平上攝取的活性劑加入到本發(fā)明的藥物和其它組合物中。例如，陽離子脂質(zhì)，諸如lipofectin(美國專利US5，705，188)、陽離子甘油衍生物和聚陽離子分子，諸如聚賴氨酸(W097/30731)也可以促進寡核苷酸的細胞攝取。本發(fā)明的組合物還可以另外包含通常在藥物組合物中存在的其它輔助成分。因此，例如，組合物可以包含附加的相容性藥物活性物質(zhì)，諸如，例如止癢劑、收斂劑、局麻劑或消炎劑或可以包含用于物理配制本發(fā)明組合物的各種劑型的附加物質(zhì)，諸如染料、矯味劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑和穩(wěn)定劑。然而，這類物質(zhì)在添加時不應(yīng)過度地干擾本發(fā)明組合物成分的生物活性?？梢詫χ苿┻M行滅菌，并且如果需要，將其與助劑混合，例如，所述助劑為潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、影響滲透壓的鹽、緩沖劑、著色劑、矯味劑和/或芳香物質(zhì)等，它們不會與制劑中的藥物活性劑發(fā)生有害相互作用。本發(fā)明的某些實施方案提供了包含下列成分的藥物組合物(a)本發(fā)明的一種或多種化合物；和(b)通過非反義機理起作用的一種或多種其它化療劑。這類化療劑的實例包括，但不限于抗癌藥，諸如柔紅霉素、放線菌素D、多柔比星、博來霉素、絲裂霉素、氮芥、苯丁酸氮芥、美法侖、環(huán)磷酰胺、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥噪呤、阿糖胞苷(CA)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟脫氧尿苷(5-FUdR)、氨甲蝶呤(MTX)、秋水仙堿、長春新堿、長春堿、依托泊苷、替尼泊苷、順柏和己烯雌酚(DES),還可以在本發(fā)明的組合物中聯(lián)合使用消炎藥，包括，但不限于非類固醇消炎藥和皮質(zhì)類固醇和抗病毒藥，包括，但不限于利巴韋林、阿糖腺苷、阿昔洛韋和更昔洛韋。其它非反義化療劑也屬于本發(fā)明的范圍。可以共同或依次使用兩種或多種聯(lián)用的化合物。給藥取決于所治療的疾病狀態(tài)的嚴重程度和反應(yīng)性，其中治療過程持續(xù)幾天至幾個月或直到治愈或?qū)崿F(xiàn)減輕疾病狀態(tài)為止.可以根據(jù)患者身體中的藥物蓄積測量值計算最佳給藥時間安排。給藥的醫(yī)生易于確定最佳劑量、給藥方法和重復(fù)頻率。最佳劑量可以根據(jù)各個寡核苷酸的相對效能而改變并且一般可以基于發(fā)現(xiàn)在體外或體內(nèi)動物模型中有效的ECs。值或基于本文所述的實施例來估計。一般而言，劑量在0.01jig-100g/kg體重，并且可以每天、每周、每個月或每年給藥一次或多次。治療的醫(yī)生可以基于測定的藥物在體液或組織中的保留時間和濃度估計給藥的重復(fù)頻率。在成功治療后，可能需要對受試者進行維持療法以便預(yù)防疾病狀態(tài)的復(fù)發(fā)，其中以維持劑量給予寡核苷酸，即O.Oljag-100g/kg體重，每天給藥一次或多次至每隔20年一次。II.藥物篩選在某些實施方案中，本發(fā)明提供了藥物篩選試驗(例如用于篩選抗癌藥)。在某些實施方案中，本發(fā)明的篩選方法使用了本文所述的p53線粒體靶向載體。例如，在某些實施方案中，本發(fā)明提供了篩選使功能失活的突變線粒體p53蛋白質(zhì)重折疊的化合物的方法。在其它實施方案中，本發(fā)明提供了篩選有利于正常p53靶向至線粒體或增強線粒體中正常p53表達的化合物的藥物篩選方法。在某些實施方案中，候選化合物為小分子。A.p53表達試驗在一種篩選方法中，針對候選化合物改變(例如增加)線粒體上野生型p53表達的能力來評價該化合物，該評價通過使化合物接觸細胞且然后測定候選化合物對線粒體p53表達的效應(yīng)來進行。在某些實施方案中，通過檢測細胞表達的線粒體p53mRM的水平來測定候選化合物對p53的線粒體表達的效應(yīng)。可以通過任何合適的方法，包括，但不限于本文披露的那些方法檢測mRM表達。在某些實施方案中，通過RNA印跡分析檢測RNA。RNA印跡分析包括分離RNA和與互補標記的探針雜交。用于RNA印跡分析的方法為本領(lǐng)域眾所周知的。在其它實施方案中，通過特異性結(jié)構(gòu)的酶促切割檢測RNA表達(INVADER測定法，ThirdWaveTechnologies;例如，參見美國專利US5,846,717;US6,090,543;US6,001,567;US5,985,557;和US5,994,069;將這些文獻各自引入本文作為參考)。INVADER測定法通過使用切割經(jīng)與重疊寡核苷酸探針雜交形成的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特異性酶檢測特異性核酸(例如RNA)序列。在另外的實施方案中，通過與寡核苷酸探針雜交檢測RNA(或相應(yīng)的cDNA)?？梢岳檬褂糜糜陔s交和檢測的各種技術(shù)的各種雜交試驗。例如，在某些實施方案中，使用TaqMan試驗(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA;例如，參見美國專利US5，962，233和US5，538，848，將這些文獻各自引入本文作為參考)。在PCR反應(yīng)過程中進行該試驗。TaqMan試驗利用了AMPLITAQGOLDDNA聚合酶的5'-3'外切核酸酶活性。在PCR反應(yīng)中包括由具有5'-報道染料(例如熒光染料)和3'-猝滅染料的寡核苷酸組成的探針。在PCR過程中，如果探針與它的靶結(jié)合，AMPLITAQGOLD聚合酶的5'-3'溶核活性則切割在報道染料與猝滅染料之間的探針。報道染料與猝滅染料的分離導(dǎo)致熒光增加。信號隨著每一PCR循環(huán)累加并且可以使用熒光計監(jiān)測。在其它實施方案中，將逆錄酶PCR(RT-PCR)用于檢測RNA的表達。在RT-PCR中，使用逆錄酶使RNA酶促轉(zhuǎn)化成互補DNA或"cDNA"。然后將cDNA用作PCR反應(yīng)的模板?？梢酝ㄟ^任何合適的方法檢測PCR產(chǎn)物，所述方法包括，但不限于凝膠電泳和使用DNA特異性染色劑染色或與標記探針雜交。在某些實施方案中，使用應(yīng)用美國專利US5,639,606、US5，643，765和US5,876,978(將這些文獻各自引入本文作為參考)中所述的竟爭性模板方法的標準化混合物的定量逆錄酶PCT。在其它實施方案中，通過測定線粒體p53多肽表達水平檢測候選化合物的效果?？梢允褂萌魏魏线m的方法，包括，但不限于本文披露的那些方法測定多肽的表達水平。在某些實施方案中，通過結(jié)合對蛋白質(zhì)具有特異性的抗體檢測蛋白質(zhì)。本發(fā)明并不限于特定的抗體?？梢允褂锰禺愋詸z測線粒體p53的任何抗體(單克隆或多克隆的)。用于產(chǎn)生抗體的方法如下所述。通過本領(lǐng)域中公知的技術(shù)檢測抗體結(jié)合。例如，在某些實施方案中，使用合適的技術(shù)檢測抗體結(jié)合，所述的技術(shù)包括，但不限于放射性免疫測定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、"夾心式"免疫測定、免疫放射測定、凝膠擴散沉淀反應(yīng)、免疫擴散測定、原位免疫測定(例如使用膠體金、酶或放射性同位素標記)、蛋白質(zhì)印跡、沉淀反應(yīng)、凝集試驗(例如凝膠凝集試驗、血細胞聚集試驗等)、互體結(jié)合試驗、免疫熒光試驗、蛋白質(zhì)A測定和免疫電泳測定。在其它實施方案中，將免疫組織化學(xué)用于檢測抗體結(jié)合。在一個實施方案中，通過檢測初次抗體上的標記來檢測抗體結(jié)合。在另一個實施方案中，通過檢測二次抗體或試劑與初次抗體的結(jié)合來檢測初次抗體。在另一個實施方案中，標記二次抗體。用于檢測免疫測定中的結(jié)合的許多方法為本領(lǐng)域公知的并且屬于本發(fā)明的范圍。在某些實施方案中，使用自動化檢測試驗。用于免疫測定自動化的方法包括，但不限于美國專利US5,885,530、US4，981，785、US6，159，750和US5，358，691中所述的那些方法，將這些文獻各自引入本文作為參考。在某些實施方案中，分析和顯示結(jié)果也是自動化的。例如，在某些實施方案中，使用基于存在或不存在一系列相當(dāng)于癌癥標記的蛋白質(zhì)生成診斷和/或預(yù)后的軟件。在其它實施方案中，使用美國專利US5，599，677和US5,672，480中所述的免疫測定，將這些文獻各自引入本文作為參考。在其它實施方案中，通過免疫組織化學(xué)檢測蛋白質(zhì)。如上所述，在某些實施方案中，本發(fā)明提供了篩選使功能失活的突變線粒體p53蛋白質(zhì)重折疊的化合物的方法。正如通過下述實驗所示，攜帶突變p53的腫瘤細胞與其異常升高的(突變)p53蛋白質(zhì)的總細胞水平成正比，在線粒體上具有組成性存在的突變p53，但是它是功能失活的(Mihara等，Mol.Cell,2003)。因此，在某些實施方案中，Mihara的論文中所述的細胞色素c釋放試驗提供了快速的藥物篩選，其用于鑒定使突變p53重折疊的小分子化合物，按照這類方式使得它們恢復(fù)線粒體的生物功能。B.細胞試驗與正常細胞或具有野生型p53的癌細胞相反，具有突變p53基因的人癌細胞以組成型方式在線粒體上表達高水平的突變p53蛋白質(zhì)。然而，測試的8種源自不同腫瘤的p53突變體中的所有8種在線粒體上均不是功能失活的。在某些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了鑒定突變線粒體p53的小分子激活物的方法。在某些實施方案中，使用具有突變p53的細胞系(例如癌細胞系)并且監(jiān)測p53的線粒體功能和編程性細胞死亡。本發(fā)明也不限于特定的測試化合物。在某些實施方案中，使用已知用于拯救有利于轉(zhuǎn)錄功能的突變p53的前導(dǎo)化合物(例如包括，但不限于CP-31398和PRIMA-I)。然而，本發(fā)明并不限于使用CP-31398和PRIMA-I。生成測試化合物的各種商品來源和方法為本領(lǐng)域公知的?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中公知的組合文庫方法中的許多途徑之任一種獲得本發(fā)明的測試化合物，包括生物文庫；類肽文庫(具有肽類官能度，但具有新的非肽骨架的分子的文庫，它們耐受酶促降解，而仍然保持生物活性；例如，參見Zuckennann等，J.Med.Chem.37:2678-85[1994]);空間可尋址平行固相或溶液相文庫；需要解旋的合成文庫法；'一珠一化合物'文庫法；和使用親和色鐠選擇的合成文庫法。優(yōu)選將生物文庫和類肽文庫途徑與肽文庫聯(lián)用，而其它的四種途徑適用于肽、非肽寡聚體或化合物的小分子文庫(Lam(1997)AnticancerDrugDes.12:145)。用于合成分子文庫的方法的實例可以在本領(lǐng)域中，例如在下列文獻中查找到DeWitt等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6909[1993];Erb等，Proc.Nad.Acad.Sci.USA91:11422[1994];Zucke簡nn等，J.Med.Chem.37:2678[1994];Cho等，Science261:1303[1993];Carrell等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33.2059[1994];Carell等，Angew.Chem,Int.Ed.Engl.33:2061[1994];和Gallop等，J.Med.Chem.37:1233[1994]?？梢栽谌芤褐?例如Houghten，Biotechniques13:412—421[1992])或在珠粒(Lam，Nature354:82-84[1991])、芯片(Fodor，Nature364:555-556[1993])、細菌或孢子(美國專利US5,223,409;引入本文作為參考)、質(zhì)粒(Cull等，Proc.Nad.Acad.Sci.USA89:18651869[1992])或噬菌體(Scott和Smith,Science249:386-390[1990];DeviinScience249:404-406[1990];Cwirla等，Proc.Natl.Acad.Sci.87:6378—6382[1990];Felici，J.Mol.Biol.222:301[1991])上呈現(xiàn)化合物的文庫。C.體內(nèi)試驗在其它實施方案中，在藥物篩選應(yīng)用中使用動物模型(例如癌癥模型)。代表性動物描述在實驗部分中(例如淋巴瘤模型)。在某些實施方案中，在癌癥動物模型中測試p53靶向載體。在其它實施方案中，在動物模型中測試小分子(例如上述那些)。III.抗體本發(fā)明提供了分離的抗p53的抗體。例如，這些抗體可用于本文所述的藥物篩選方法中。針對本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗體可以為任何的單克隆或多克隆抗體，只要它能夠識別所述的蛋白質(zhì).可以通過使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)作為抗原按照常規(guī)的抗體或抗血清制備方法生產(chǎn)抗體。本發(fā)明關(guān)注單克隆和多克隆抗體的應(yīng)用。任何合適的方法都可以用于產(chǎn)生用于本發(fā)明方法和組合物中的抗體，包括，但不限于本文所披露的那些方法。例如，就單克隆抗體的制備而言，將蛋白質(zhì)本身或與合適的栽體或稀釋劑一起在允許產(chǎn)生抗體的條件下給予動物(例如哺乳動物)。為了提高抗體產(chǎn)生能力，可以給予完全或不完全弗氏佐劑。一般而言，每隔2周-6周將蛋白質(zhì)給予一次，總體上，約2次-約10次。適用于這類方法的動物包括，但不限于靈長類、兔、狗、豚鼠、小鼠、大鼠、綿羊、山羊等。為了制備產(chǎn)生單克隆抗體的細胞，選擇已經(jīng)確認了抗體滴度的單個動物(例如小鼠)，并且在最終免疫接種后2天-5天，釆集其脾或淋巴結(jié)并且使其中包含的產(chǎn)生抗體的細胞與骨髓瘤細胞融合以便制備所需的單克隆抗體產(chǎn)生雜交瘤。例如，可以通過使如下文中所述的標記蛋白與抗血清反應(yīng)且然后測定與抗體結(jié)合的標記物質(zhì)的活性對抗血清中的抗體滴度進行測定?？梢园凑找阎椒ǎ鏚oehler和Milstein所述的方法(Nature256:495[1975])進行細胞融合。例如，作為融合促進劑，使用聚乙二醇(PEG)或仙臺病毒(HVJ)，優(yōu)選PEG。骨髄瘤細胞的實例包括NS-I、P3U1、SP2/0、AP-I等?？贵w產(chǎn)生細胞(脾細胞)的數(shù)量和將要使用的骨髄瘤細胞的數(shù)量之比優(yōu)選為約1:1-約20:1。優(yōu)選加入約10%-約80%濃度的PEG(優(yōu)選PEG1000-PEG6000)?？梢酝ㄟ^在約2or;-約4on，優(yōu)選約30x:-約37t:下將兩種細胞的混合物孵育約1分鐘-10分鐘有效地進行細胞融合。各種方法可以用于篩選產(chǎn)生抗體(例如抗p53)的雜交瘤。例如，將雜交瘤上清液加入到直接或與載體一起吸附抗體的固相(例如微量培養(yǎng)板)中且然后加入抗免疫球蛋白抗體(如果將小鼠細胞用于細胞融合，那么使用抗小鼠免疫球蛋白抗體)或用放射性物質(zhì)或酶標記的蛋白質(zhì)A以便檢測針對結(jié)合到固相上的該蛋白質(zhì)的單克隆抗體。或者，將雜交瘤上清液加入到吸附抗免疫球蛋白抗體或蛋白質(zhì)A的固相中且然后加入用放射性物質(zhì)或酶標記的該蛋白質(zhì)以便檢測針對結(jié)合到固相上的該蛋白質(zhì)的單克隆抗體?？梢园凑杖魏喂姆椒ɑ蚱涓倪M方法對單克隆抗體進行篩選。一般而言，使用加入了HAT(次黃噪呤、氨基蝶呤、胸苷)的動物細胞培養(yǎng)基?？梢允褂萌魏我环N選擇和生長培養(yǎng)基，只要雜交瘤能夠生長。例如，可以使用包含1%-20%，優(yōu)選10%-20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基；包含1%-10%胎牛血清的GIT培養(yǎng)基；用于培養(yǎng)雜交瘤的不含血清的培養(yǎng)基(SFM-lOl，NissuiSeiyaku)等。一般而言，培養(yǎng)在201C-401C，優(yōu)選371C下和在約5%0)2氣體環(huán)境中進行約5天-3周，優(yōu)選l周-2周?？梢园凑张c上述關(guān)于抗血清中的抗-蛋白質(zhì)抗體滴度相同的方法測定雜交瘤培養(yǎng)物上清液中的抗體滴度?？梢园凑张c常規(guī)多克隆抗體的分離和純化相同的方法對單克隆抗體(例如抗p53)進行分離和純化，諸如免疫球蛋白的分離和純化，例如鹽析、醇沉淀、等電點沉淀、電泳、使用離子交換劑(例如DEAE)吸附和解吸附、超速離心、凝膠過濾或特異性純化方法，其中使用活性吸附劑，諸如抗原結(jié)合固相、蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G專門收集抗體并且拆開結(jié)合以便獲得抗體?？梢酝ㄟ^任何公知的方法或這些方法的改進方法制備多克隆抗體，包括從患者中獲得抗體。例如，制備免疫原(針對蛋白質(zhì)的抗原)和載體蛋白的復(fù)合物并且按照與對于上述單克隆抗體制備所述相同的方法用該復(fù)合物免疫接種動物。從免疫接種的動物中回收包含其抗體的物質(zhì)并且分離和純化該抗體。就欲用于免疫接種動物的免疫原和載體蛋白的復(fù)合物而言，可以使用任何一種載體蛋白和任何混合比例的載體和半抗原，只要有效產(chǎn)生在載體上交聯(lián)并且用于免疫接種的針對該半抗原的抗體。例如，可以使牛血清白蛋白、牛環(huán)狀球蛋白、鑰孔蜮血藍蛋白等與半抗原按照每l份半抗原約0.l份至約20份，優(yōu)選約l份至約5份的重量比偶聯(lián)。此外，可以將各種縮合劑用于偶聯(lián)半抗原與載體。例如戊二醛、碳化二亞胺、馬來酰亞胺活化酯、包含巰基或二硫代吡啶基的活化酯試劑等可用于本發(fā)明。對允許抗體產(chǎn)生的動物的某一部位單獨給予或與合適的栽體或稀釋劑一起給予縮合產(chǎn)物。為了提高抗體產(chǎn)生能力，可以給予完全或不完全弗氏佐劑。一般而言，每隔2周-6周將蛋白質(zhì)給予一次，總計約3次-約10次。.從通過上述方法免疫接種的動物的血液、腹水等中回收多克隆抗體?？梢园凑张c上述關(guān)于雜交瘤培養(yǎng)物上清液所述相同的方法測定抗血清中的抗體滴度?？梢园凑张c對于上述單克隆抗體所述相同的免疫球蛋白分離和純化方法對抗體進行分離和純化。本文中用作免疫原的蛋白質(zhì)不限于任何特定類型的免疫原。例如，P53蛋白質(zhì)(進一步包括具有部分改變的核苷酸序列的基因)可以用作免疫原。此外，可以使用該蛋白質(zhì)的片段?？梢酝ㄟ^任何方法，包括，但不限于表達基因片段、蛋白質(zhì)的酶促加工、化學(xué)合成等獲得片段。在某些實施方案中，使抗體(例如單克隆抗體)人源化。這類人源化抗體特別可用于下述的癌癥免疫療法。改變?nèi)嗽椿贵w以便使其對人的免疫原性較低，例如通過構(gòu)建嵌合抗體，其中使小鼠抗原結(jié)合可變區(qū)與人恒定區(qū)偶聯(lián)。人源化抗體一般為人抗體，其中某些CDR殘基和可能某些FR殘基被來自嚙齒動物抗'體中類似位點的殘基取代。用于使抗體人源化的方法為本領(lǐng)域眾所周知的并且包括，但不限于下列文獻中披露的那些方法美國專利US6,054,297、US4,816,567、US6,180,377、US5,871,907、US5，585，089和US6，180，370，將這些文獻各自引入本文作為參考。實驗提供下列實施例以便證實和進一步舉例說明本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案和方面，但并不用來限制本發(fā)明的范圍。在下列實驗披露部分中，使用下列縮寫N(正常)；M(摩爾)；mM(毫摩爾)；jaM(微摩爾)；mol(摩爾)；mmol(毫摩爾)；nmol(微摩爾)；nmol(納摩爾)；pmol(皮摩爾)；g(克)；mg(毫克)；Mg(微克)；ng(納克)；1或L(升)；ml(毫升)；jn1(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；jjm(微米)；nm(納米)；和"C(攝氏度)。實施例1線粒體乾向P53本實施例描述了p53在體外和體內(nèi)的線粒體乾向。A.材料和方法逆掙求病毒種建沐。通過克隆與MSCV多接頭下游的殺稻瘋菌素S-脫氨酶融合的綠色熒光蛋白構(gòu)建復(fù)制缺陷型小鼠干細胞病毒MSCV/CMV-GFPBla。通過單獨的CMV啟動子驅(qū)動GFPBla，因為盡管進行了p53表達，但是通過內(nèi)部核糖體進入位點由p53-驅(qū)動LTR啟動子驅(qū)動它的嘗試并未成功。在EcoRI/NotI位點上將下列cDNA亞克隆入該載體中人野生型p53(Nuclp53);在其C-末端分別與BclXL(p53CTB)或Bcl2(p53CTM)跨膜結(jié)構(gòu)域p53或與細胞色素b5的ER前導(dǎo)序列(p53ER)和不含p53的分離的BclXL的跨膜結(jié)構(gòu)域融合的野生型p53。在PhoenixE細胞中產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒原液(Petrenko等，MolCellBiol23:5540-5555)。沐S;t模型。使Emmyc轉(zhuǎn)基因小鼠(C57BL/6-TgMyc)與p53+/"J、鼠或INK4aMRF+/-小鼠雜交并且通過PCR對幼仔進行基因分型(Jacks等，1994.Curr.Biol.4:1-7),在90%的p53+l-和ARF+I-動物中，淋巴瘤存在30-50天(Schmitt等，1999.GenesDev13:2670-2677)并且80%的腫瘤已經(jīng)喪失了其保留的野生型p53或INK4a/ARF等位基因。將這些淋巴瘤植入正常同基因小鼠中，在該小鼠中它們充分再現(xiàn)其生物行為(Schmitt等，文獻同上)。從具有腫瘤的供體淋巴結(jié)中采集淋巴瘤。通過FACS將細胞免疫分型為Thy12-、B220+和IgM-(前B細胞)或IgM+(成熟B細胞淋巴瘤)。將原發(fā)性腫瘤細胞培養(yǎng)3天以便消除正常細胞混雜。再基因分型證實了在所有分離物中保留的等位基因喪失，從而產(chǎn)生了p53-/-ARF+Z+或p53+/+ARF-/-淋巴瘤。使用來源于6只小鼠的獨立的分離物。將細胞懸浮液在絲裂霉素抑制的NIH3T3飼養(yǎng)器(feeder)上鋪板并且使其在45%Iscove培養(yǎng)基、45%Dulbecco培養(yǎng)基、100/。FBS中生長，此后進行spinocculation(Schmitt等，2000.Nat.Med.6:1029-1035)。由14.5d胚胎(C57BL/6)制備小鼠胚胎成纖維細胞(MEF),p53-/-MEF來源于Trp53tmlTyj突變小鼠。將MEF和NIH3T3維持在DME培養(yǎng)基+10%FBS中。通過在等數(shù)量的飼養(yǎng)器上按照一式三份進行等數(shù)量鋪板測定感染的淋巴瘤細胞的體外生長，其中每天通過Coulter計數(shù)器和FACS對非貼壁細胞進行計數(shù)。為了進行集落形成試驗，用表達逆轉(zhuǎn)錄病毒的E1A感染MEF(Petrenko等，文獻同上)，隨后在36小時后用空病毒、p53CTM或p53CTB病毒感染。在殺稻痙菌素中對細胞選擇2天并且使用H-RasV12轉(zhuǎn)導(dǎo)(Petrenko等，文獻同上)。在16天后，對姬姆薩染色的轉(zhuǎn)化灶計數(shù)。為了進行體外編程性細胞死亡研究，最初將樣品調(diào)整至65%的GFP陽性細胞。就淋巴瘤細胞而言，在無額外DNA損傷的情況下在轉(zhuǎn)導(dǎo)后36小時進行T冊EL(Roche,Nutley，NewJersey),就MEF而言，轉(zhuǎn)導(dǎo)E1A致敏的細胞，然后用殺稻瘟菌素選擇2天以便獲得100%GFP陽性并且保持細胞未經(jīng)處理或用阿霉素(O.34pM)處理細胞6或12小時，蛋^質(zhì)^t這。用對下列具有特異性的抗體對完整細胞切割物(50-70jjg)進行免疫印跡p53(小鼠特異性CM-5,載體，Burlingame，California)(人特異性D0-1Calbiochem，Darmstadt,Germany);p21(SXM30，Pharmingen，SanDiego,California),PUMAot、P(AbCamCambridge,Massachusetts);pl9ARF(Ab80-50，AbCam);p21(F5)，MDM2(SMP14),BclXL/xs(S18)，E1A(135-5)和PCNA(均獲自SantaCruzBiotechn.，SantaCruz,California)。名^炎^.使淋巴瘤細胞在載玻片上進行細胞旋轉(zhuǎn)；使3T3細胞生長在8-孔腔式載玻片中。將細胞在4%低聚甲醛中固定20分鐘并且用PBS/0.5%Tween20透化處理5分鐘。在10%正常山羊血清中封閉載玻片，隨后與CM-1(1:500;人特異性p53，載體)和細胞色素c(1:200;克隆2G8)或mthsp70(1:25;ABRAffinityBioreagentsGolden,Colorado)—起孵育2小時以便檢測線粒體。就p53ER而言，使用D0-1檢測p53并且使用抗-鉀網(wǎng)織蛋白(ABR)檢測ER。將抗小鼠IgG和抗兔IgG用于對照。將載玻片在Cy5-和TRITC-綴合的二次抗體中孵育1小時。在共聚焦激光顯微鏡(ZEISSLSM510)下觀測細胞。借助于免疫過氧化物酶用D0-1染色胂瘤切片。謬/^老爭;^1^如結(jié)果中所討論的使用應(yīng)用40:60，75:25和90:10的GFP陽性比例的三種不同方案。將FACS分選的細胞培養(yǎng)3天，此后進行注射以便驗證無菌性。將在100jLilPBS中的lxl()S個淋巴瘤細胞注入同基因非轉(zhuǎn)基因受體小鼠的尾靜脈。26-30天后，動物在頸部和/或腹股溝、腋窩和腹膜后區(qū)出現(xiàn)可觸及的淋巴瘤。偶爾觀察到結(jié)外淋巴瘤。從每一受體中，收集所有腫瘤并且進行FACS分析以便確定殘留GFP陽性。為了驗證組織病理學(xué)，處理每一腫瘤以便進行H&E。在所觀察的腫瘤內(nèi)部或周圍不存在炎性淋巴細胞性浸潤。同樣，不存在正常組織成分，包括脈管結(jié)構(gòu)和基質(zhì)的損傷。為了進行體內(nèi)編程性細胞死亡試驗，固定淋巴瘤并且通過TUNEL與Hoechst復(fù)染染色?；蛘?，將2xl(^個轉(zhuǎn)導(dǎo)的淋巴瘤細胞經(jīng)皮下注入正常同基因小鼠并且在2，4，8和12天后處死動物。采集注射部位并且處理以便進行TUNEL/H&E和使用D0-1的p53免疫過氧化物酶染色。B.結(jié)果^于琳力砑^:付jje^沐s潛為、岸參和逆脊求病毒w4在。Enmyc轉(zhuǎn)基因小鼠超表達其B細胞譜系中的c-myc癌基因并且在4-6個月齡內(nèi)發(fā)生前B和B細胞淋巴瘤(Harris等，1988J.Exp.Med.167:353-371)。這種沿用已久的可植入腫瘤模型具有許多優(yōu)點(附圖1)。此外，可以在離體環(huán)境下通過逆轉(zhuǎn)錄病毒基因轉(zhuǎn)移將測試基因有效導(dǎo)入分離的原發(fā)性淋巴瘤細胞并且注入正常同基因受體小鼠的尾靜脈以便進行淋巴瘤重建。腫瘤形成和攻擊性取決于不起作用的p53途徑(Schmitt等，1999，GenesDev13:2670-2677;Schmitt等，2000NatMed6:1029-1035;Eischen等，2001，MolCellBiol21:7653—7662;Eischen等，2001，MolCellBiol21:5063—5070;Eischen等，1999，GenesDev13:2658-2669;Jacobs等，1999，GenesDev.13:2678-2690)。肺瘤編程性細胞死亡通過線粒體途徑發(fā)生，因為并非在這些淋巴瘤中超表達的Bcl2在強制性超表達時產(chǎn)生多抗藥性(Schmitt等，2000，文獻同上)。p53的喪失等同于INK4a/ARF，即p53的正上游調(diào)控子的喪失，并且這兩種情況均大大加速了c-myc淋巴瘤生成(Schmitt等，1999，文獻同上)。與親代腫瘤相比，p53-和ARF-棵淋巴瘤均為高度擴散性的并且具有嚴重細胞凋亡缺陷和對化療的顯著抗性(Schmitt等，1999，文獻同上)。4種獨立的p53-/-ARF+/+和兩種ARF-/-p53+/+B淋巴瘤分離自p53+/-和ARF+/-E|imyc小鼠(附圖2a)。使用表達GFP的鼠干細胞病毒和常規(guī)p53(核p53)或2種形式的線粒體乾向p53通過與BclXL(p53CTB)或Bcl2(p53CTM)的跨膜結(jié)構(gòu)域融合轉(zhuǎn)導(dǎo)分離物。對照病毒缺乏p53插入片段(附圖2a)。對所有構(gòu)建體而言，感染效率約為40%(附圖2d)。在pW棵和ARF棵淋巴瘤中和在NIH3T3細胞中，p53CTM和p53CTB的表達水平等同于正常照射的胸腺細胞的生理應(yīng)激誘導(dǎo)的p53水平(附圖2b左側(cè))。核p53的水平稍低于靶向p53CTM(附圖2b右側(cè)和附圖2c)。/)"CT5和；Jjn^乾力！游在琳。定位研究證實了p53CTB獨占地定位于所有測試細胞類型中的線粒體，這與天然BclXL的排他性線粒體定位一致(Kaufmann等，2003，JCellBiol160:53-64)。p53CTM表現(xiàn)出主要的線粒體定位(Mihara等，2003，MolCell.11:577-590)，加上某些次要的定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)，這與天然Bcl2的定位一致(Kaufmann等，2003，文獻同上)。為了排除p53CTM的ER-定位部分有助于編程性細胞死亡，通過用細胞色素b5的ER前導(dǎo)序列置換Bc12結(jié)構(gòu)域使p53靶向至ER。p53ER在p53棵H1299和SaOS-2細胞中缺乏任何細胞凋亡能力，這表明p53CTM的細胞凋亡能力完全因其線粒體作用所致(附圖6)。為了進一步排除單獨的短線粒體靶向肽(來源于BclXL)可能在異位表達時誘導(dǎo)淋巴瘤細胞死亡，構(gòu)建了僅包含人BclXL的跨膜結(jié)構(gòu)域LSRKGQERFNRWFLTGMTVAGVVLLGSLFSRK*(SEQIDNO:9)作為插入片段的逆轉(zhuǎn)錄病毒。然而，感染了這種病毒的p53棵淋巴瘤細胞未能經(jīng)歷任何編程性細胞死亡。4'在伴乾々炎迷琳斧初效淋S扇勿^f時薦資遂勿龍^亡。首先分析了p53CTB和p53CTM在體外對初級小鼠胚胎成纖維細胞和淋巴瘤分離物的細胞凋亡能力。通過E1A使野生型p53棵和ARF棵MEF對細胞死亡預(yù)先致敏。在使用阿霉素處理6和12小時后，線粒體p53CTB和p"CTM蛋白質(zhì)比單獨的載體在所有三種基因型中使編程性細胞死亡增加了約2倍(附圖3a)。線粒體p53抑制了EU和癌基因H-RasV12對MEF的轉(zhuǎn)化。與空病毒相比，在有p53CTB或p53CTM存在下使轉(zhuǎn)化病灶的數(shù)量減少了幾乎50%。更重要的是，p53CTM和p53CTB抑制了初級pS3棵淋巴瘤細胞的生長，從而導(dǎo)致在5天后比載體在細胞數(shù)量上減少4倍(附圖4a)。同樣，在生長竟爭性試驗中，p53CTM-和核p53-感染的淋巴瘤細胞數(shù)量在10-25天內(nèi)顯著下降，而空病毒感染的細胞僅略有下降(附圖4b)。如通過TUNEL試驗所示，表達p53CTM和p53CTB的淋巴瘤細胞的體外喪失是因p53誘導(dǎo)的編程性細胞死亡所致，因為在無額外DNA損傷的情況下，其表達使自發(fā)性編程性細胞死亡2倍于空病毒。4'在沐論/^凝乏^求承絲，在所有測試的細胞，包括p53-/-和ARF-/-淋巴瘤細胞、所有3種基因型的MEF、NIH3T3和H1299細胞的核中均未能檢測到p53CTB和p53CTM。為了排除這些蛋白質(zhì)的殘留轉(zhuǎn)錄活性，分析了其誘導(dǎo)細胞凋亡和受阻種類的內(nèi)源性靶基因的能力。p"CTM和pS3CTB甚至在DNA損傷劑阿霉素的存在下也未能誘導(dǎo)p53棵MEF中的PUMA、Bid或p21Wafl(附圖3b)。p53CTM和p53CTB在p53棵淋巴瘤細胞中也缺乏殘留轉(zhuǎn)錄活性，如通過PUMA、Bax、p21Wafl和MDM2所示(附圖4c)。與空病毒相比，p53CTM轉(zhuǎn)導(dǎo)的淋巴瘤增加了其BclXs同種型的水平，所述的BclXs同種型即缺乏內(nèi)部BH1/BH2結(jié)構(gòu)域的Bel-X基因的先期細胞凋亡可變剪接產(chǎn)物(Lindenboim等，2001，CellDeathDiffer8:933-942;Boise等，L.H.，1993，Cell74:597-608)(附圖7)。這些數(shù)據(jù)共同證實p53CTB/CTM的細胞凋亡效能是因其在線粒體上的直接作用所致，而并非因隱性轉(zhuǎn)錄依賴性p53功能所致。錄在體乾南殺資沐力初焱淋S膚勿^為了評價線粒體靶向p53對體內(nèi)腫瘤細胞編程性細胞死亡和腫瘤負荷的影響，將轉(zhuǎn)導(dǎo)的淋巴瘤細胞注入同基因正常受體的尾靜脈，其中在26-30天內(nèi)它們再次產(chǎn)生結(jié)淋巴瘤并且有時產(chǎn)生結(jié)外淋巴瘤。因此，快速重建的淋巴瘤僅因存在和不存在p53蛋白質(zhì)而不同(Schmitt等，2000，文獻同上)。在p53棵淋巴瘤的情況中，這種模型提供了作為細胞P53唯一來源的線粒體p53是否具有有效的體內(nèi)腫瘤殺傷作用而導(dǎo)致腫瘤在天然部位退化的定量量度。小鼠和人p53在體內(nèi)是功能上可互換的，因為在小鼠基因骨架內(nèi)包含人p53DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的基因敲入小鼠具有未改變的p53功能(Luo等，2001，Oncogene20:320-328)。使用3種不同的方案，進行作為轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞與親代細胞之間的體內(nèi)竟爭的所有實驗。在第一種方案中，將在36小時時證實了GFP陽性的40%的新鮮轉(zhuǎn)導(dǎo)的p53棵淋巴瘤細胞(附圖2d)與60%GFP陰性的親代淋巴瘤細胞混合并且立即注入受體(lxl(^個細胞/小鼠)。4周后，對每一受體收集重建的胂瘤并且通過FACS確定其殘留GFP陽性(表I(附圖11中所示))。注射了40W空病毒-GFP的18只小鼠產(chǎn)生了30.8%+/-18%的殘留GFP陽性腫瘤，從而反映出載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞在血流中存活并且按比例有助于淋巴瘤重建的能力。接受404p53CTM-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞的14只小鼠產(chǎn)生了僅具有2.8+/-2.4%殘留GFP陽性細胞的腫瘤。p53CTM組的各個腫瘤GFP+得分分別為0%,0%,0%，0%，0%，0%,0%,0%，0%，0%，0.6%,1.5%，3.5°/。和34。/U與空病毒組相比P〈0.0005)(附圖5)。當(dāng)除去了具有34%GFP陽性的非典型動物時(因為分析表明它表達了功能失活的p53)(參見附圖8),p53CTM組降至0.4+/-1.0%GFP陽性(與載體組相比P〈0.0001)。同樣，注射了40%表達p53CTB-GFP的細胞的4只小鼠產(chǎn)生了沒有檢測到的殘留綠色細胞的腫瘤(各個GFP得分為0%，0%，0%和0%)(附圖5)。因此，82%的重建肺瘤完全(14/17小鼠)且18%幾乎完全(3/17小鼠)不存在表達線粒體靶向p53的腫瘤細胞，而胂瘤是由存活的親代細胞組成的。注射了40M表達核p53的細胞的12只對照小鼠各自因肺瘤重建過程中有效的p53介導(dǎo)的編程性細胞死亡也產(chǎn)生了04的殘留GFP陽性。這共同表明了表達作為其p53唯一來源的線粒體p53的淋巴瘤細胞可以在體內(nèi)發(fā)生顯著肺瘤退化，這與使用異位核p53實現(xiàn)的退化幾乎同樣有效。隨后的使用較高比例的轉(zhuǎn)導(dǎo)的淋巴瘤細胞與親代淋巴瘤細胞的竟爭方案證實了線粒體靶向p53的體內(nèi)殺傷能力。在注射前對轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞進行藥物選擇或FACS分選以便獲得高于通過單獨轉(zhuǎn)導(dǎo)可獲得的百分比。在75:25方案中，首先在殺稻瘟菌素中預(yù)選擇轉(zhuǎn)導(dǎo)的p53棵細胞4-IO天(表I(附圖11中所示))。這快速消除了具有高p53表達的細胞并且富集了具有低表達的能夠在培養(yǎng)物中存活較長時間的細胞。一旦在體內(nèi)，這些細胞就很可能接受引發(fā)其編程性細胞死亡的附加生理應(yīng)激信號。將75%轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞和25%親代細胞的混合物注入正常受體。注射了75W栽體-GFP細胞的3只小鼠產(chǎn)生了具有44.3%+/-3%GFP陽性的腫瘤，這反映出這些細胞有助于淋巴瘤的能力降低但仍然很強。相反，注射了75%p53CTM-GFP細胞混合物的11只小鼠產(chǎn)生了僅含1.1+/-0.1%殘留GFP陽性的胂瘤(與空病毒相比P<0.0005)，從而證實了在40:60方案中所觀察到的p53CTM結(jié)果。注射了75%核p53-GFP細胞的陽性對照動物產(chǎn)生了12%殘留GFP陽性。然而，進一步的分析表明該腫瘤因逆轉(zhuǎn)錄病毒p53區(qū)的重排而選擇性喪失了p53表達，這解釋了相對高數(shù)量的存活GFP陽性細胞(附圖8)。附圖8表示罕見異常腫瘤的表征，其中表達p53CTM或核p53的病毒未能殺傷腫瘤細胞。注射了包含404p53CTM感染的細胞的p53棵淋巴瘤細胞的小鼠(n-13)產(chǎn)生了平均僅具有0.4+/-1.0%殘留GFP陽性細胞的腫瘤(表I，附圖ll)。(a)然而，單個額外腫瘤例外，因為它僅表現(xiàn)出最小限度降至34%GFP陽性。對來自重建腫瘤的p53CTM的全長測序排除了已經(jīng)在體內(nèi)進行了選擇突變。對原始注射的和重建的腫瘤細胞的免疫印跡分析揭示出在該腫瘤中的p53蛋白質(zhì)已經(jīng)經(jīng)歷了使人聯(lián)想到遍在化的異常翻譯后修飾。較高分子量p53帶的緊密梯存在于新鮮收集的重建腫瘤切割物中(泳道4，9)，其表達在培養(yǎng)物中是穩(wěn)定的(泳道5，10)。這種p53也是自發(fā)穩(wěn)定化的。這種回收的胂瘤細胞在培養(yǎng)物中在3天內(nèi)使其GFP得分從34%增加至99%。最初注射的細胞幾乎排他性表達未修飾的p53(泳道2,7)。盡管p53穩(wěn)定化(泳道4，5)，但是MDM2和Arf蛋白質(zhì)水平仍保持不變。本發(fā)明并不限于特定的機理。實際上，理解機理對實施本發(fā)明而言并非必要。但是值得關(guān)注的是p53蛋白質(zhì)在這種腫瘤中與其不起作用的細胞凋亡功能共同表現(xiàn)出功能性失活。注射了包含40%核p53感染的細胞的p53棵淋巴瘤細胞的小鼠(n-12)產(chǎn)生了具有(^殘留GFP陽性的腫瘤，這是因p53介導(dǎo)的這些細胞的編程性細胞死亡所致。(b)l只注射了75%核p53感染的細胞的動物產(chǎn)生了具有12%殘留GFP陽性的腫瘤。免疫印跡分析顯示出在這種腫瘤中核p53表達完全喪失，從而表明這種肺瘤已經(jīng)經(jīng)歷了其逆轉(zhuǎn)錄病毒p53序列的重排。在第三種方案中，依據(jù)GFP對感染后48小時其峰值表達時的轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞進行FACS分選至>99%純度。將分選的細胞與親代細胞以90:10之比混合并且立刻注入受體。注射了90W載體-GFP感染的細胞的14只對照小鼠產(chǎn)生了具有70+/-10%GFP陽性的腫瘤，而注射了90%pS3CTM轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞的7只小鼠產(chǎn)生了平均僅具有14+/-14%殘留GFP陽性的腫瘤(表I(附圖11中所示))。p53CTM組中的減少再次非常顯著(與空病毒相比P<0.0005)。注入pS3CTM組的轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞均來源于單個分離物(#3)。然而，重建的胂瘤分成2個亞組。來自4只動物的腫瘤表現(xiàn)出預(yù)計的表達p53CTM的細胞的顯著減少，其中殘留GFP得分為2%,2%，3.5%和5%。然而，3只小鼠僅表現(xiàn)出中度減少，其中得分分別為26%,28°/。和36%GFP陽性。本發(fā)明并不限于特定的機理。實際上，理解機理對實施本發(fā)明而言并非必要。但是值得關(guān)注的是對這種雙峰分布的一種可能的解釋是親代分離物#3為遺傳異質(zhì)性的并且包含在供體內(nèi)淋巴瘤生成過程中已經(jīng)獲得附加的細胞凋亡性突變的克隆亞群。這后一種克隆在具有相對高GFP得分的3只動物中可能已變?yōu)殡S機顯性的，但在具有低得分的4只動物中并非如此?？傊@些數(shù)據(jù)證實作為細胞p53唯一來源的線粒體靶向p53在天然胂瘤部位上具有體內(nèi)腫瘤殺傷作用。此外，這種殺傷作用無需附加的放療劑或化療劑。盡管存在野生型p53基因，但是ARF棵淋巴瘤表現(xiàn)出對致癌性失調(diào)的p53活性的強烈喪失(Schmitt等，1999，文獻同上；Eischen等，文獻同上)。為了測試靶向p53是否在體內(nèi)也殺傷這些細胞，將兩個獨立的ARF棵腫瘤分離物用于竟爭性40/60方案(附圖2b和表II(附圖12中所示)。一般而言，與p53棵淋巴瘤細胞相比，在ARF棵淋巴瘤細胞中發(fā)現(xiàn)了對自發(fā)和p53誘導(dǎo)的細胞死亡的更高的敏感性。注射了4094空病毒感染的細胞混合物的小鼠(n-14)產(chǎn)生了具有18+/-13%GFP陽性的重建肺瘤。相反，注射了40%表達p53CTM的細胞混合物的小鼠(n-12)產(chǎn)生了僅具有0.2+/-0.4%殘留GFP陽性的腫瘤(P-O.0001),同樣，注射了40i表達p53CTB的細胞混合物的小鼠(n-ll)產(chǎn)生了僅具有0.4+/-0.7%殘留GFP陽性的胂瘤(P=0.0001)。p53CTB和p53CTM比率與注射了核p53的陽性對照小鼠(n-l3)相同(0.6%+/-0.6%殘留GFP陽性)。因此，如同在p53棵淋巴瘤中的情況，表達線粒體把向p53的ARF棵淋巴瘤表現(xiàn)出顯著的體內(nèi)退化。此外，在這些細胞中，線粒體程序可以在功能上取代不起作用的內(nèi)源性p53程序。作為由線粒體靶向p53介導(dǎo)的腫瘤細胞殺傷特異性的另一種對照標準，表3(附圖15中所示)顯示出1)與核或線粒體野生型p53相反，天然存在的突變p53不能殺傷淋巴瘤細胞，而能夠使其在體內(nèi)擴充。還顯示出2)具有人形式的核或線粒體野生型p53的小鼠胂瘤細胞的殺傷是特異性的而不是因非特異性免疫排斥所致。將以上說明書中提及的所有出版物和專利引入本文作為參考。在不脫離本發(fā)明范圍和實質(zhì)的情況下對本發(fā)明所述的方法和系統(tǒng)的各種改進和改變對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。盡管已經(jīng)結(jié)合具體的優(yōu)選實施方案描述了本發(fā)明，但是應(yīng)理解所請求保護的本發(fā)明不應(yīng)不適當(dāng)?shù)叵抻谶@類具體的實施方案。實際上，對相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言顯而易見的對所述的實施本發(fā)明的方式的各種改變均屬于下列權(quán)利要求的范圍。權(quán)利要求1.一種方法，包括:a)提供細胞，其中所述的細胞缺乏功能性線粒體p53；和b)將外源性p53遞送至所述細胞中，其中所述的p53包含使所述p53定向于所述細胞的線粒體的序列。2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的外源性p53至少90°乂與SEQID冊3相同。3.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的外源性p53具有SEQIDN0:3的核酸序列。4.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的外源性p53可操作地與線粒體靶向分子連接。5.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的外源性p53可操作地與Bc12線粒體靶向序列連接。6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的Bcl2線粒體靶向序列具有SEQIDNO:4的核酸序列。7.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的外源性p53可操作地與BclXL線粒體靶向序列連接。8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的BclXL線粒體靶向序列具有SEQIDNO:5的核酸序列。9.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的外源性p53和所述的線粒體靶向分子在一種栽體中。10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的遞送包括將所述的載體遞送至所述的細胞中。11.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的載體包含SEQIDNO:1的核酸序列。12.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的栽體編碼具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的融合蛋白。13.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的遞送導(dǎo)致所述細胞的編程性細胞死亡。14.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的細胞是宿主動物中的。15.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的宿主動物為非人哺乳動物。16.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的宿主動物為人。17.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的宿主動物被診斷為患有癌癥并且所述的細胞為癌細胞。18.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的遞送導(dǎo)致所述癌細胞的編程性細胞死亡。19.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的宿主動物被診斷為患有自身免疫性疾病。20.權(quán)利要求1所述的方法，進一步包括將第二種外源性p53遞送至所述細胞的核中。21.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的第二種外源性p53包含在第二種載體中，并且其中所述的第二種載體包含使所述第二種外源性p53定向于所述細胞的核的第二種序列。22.權(quán)利要求14所述的方法，進一步包括將測試化合物遞送至所述宿主動物中的步驟。23.權(quán)利要求l所述的方法，其中所述的細胞是體外的。24.權(quán)利要求23所述的方法，進一步包括將測試化合物遞送至所述細胞的步驟。25.—種載體，包含與編碼線粒體靶向蛋白的基因可操作地連接的外源性p53基因。26.—種組合物，包含核酸，該核酸包含與編碼線粒體把向蛋白的基因可操作地連接的外源性p53基因。全文摘要本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)細胞凋亡途徑的方法和組合物。特別是，本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)癌細胞中的編程性細胞死亡的方法和組合物。本發(fā)明進一步涉及用于鑒定調(diào)節(jié)細胞凋亡途徑的藥物的方法和組合物。文檔編號C12N15/09GK101389758SQ200580047139公開日2009年3月18日申請日期2005年12月9日優(yōu)先權(quán)日2004年12月10日發(fā)明者U·摩爾申請人:紐約州立大學(xué)研究基金會