專利名稱：植物血紅蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改變植物生長特性的方法，尤其是改變植物脅迫耐受性和產(chǎn)量的方 法。更特別地，本發(fā)明涉及通過改變植物血紅蛋白基因表達(dá)和/或通過改變植物血紅蛋白 的含量來改變植物對各種環(huán)境性脅迫的耐受性和提高種子產(chǎn)量。
背景技術(shù)：
由于數(shù)年來集中在選擇適應(yīng)特定環(huán)境的較高產(chǎn)量植物的育種活動(dòng)，農(nóng)業(yè)上可供利 用的作物的大多數(shù)品種目前已經(jīng)獲得。因此，雖然它們維持了高產(chǎn)量，但通常缺乏足夠的遺 傳變異性來適應(yīng)其它環(huán)境。此外，在它們的生命周期中，植物暴露于各種環(huán)境條件下，這樣 的環(huán)境條件會(huì)極大地影響發(fā)育，并且在不利時(shí)，還可能限制最終的產(chǎn)量。氣候和其它環(huán)境條 件導(dǎo)致了不同季節(jié)中所獲得的產(chǎn)物的總產(chǎn)量和質(zhì)量會(huì)發(fā)生變化。因此，農(nóng)業(yè)中主要的目的 是培育在數(shù)量和質(zhì)量方面具有提高穩(wěn)定性的品種。數(shù)量方面的生產(chǎn)穩(wěn)定性對于計(jì)劃是有利 的，且可以避免生產(chǎn)中的反常。在質(zhì)量方面，穩(wěn)定性有助于提高采收后的處理和農(nóng)業(yè)產(chǎn)品的 工業(yè)加工。通常將產(chǎn)量定義為來自農(nóng)作物的可測量產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)價(jià)值。這可以就數(shù)量和/或質(zhì)量 方面來定義。產(chǎn)量直接取決于各種因素，例如，器官的數(shù)量和大小、植物結(jié)構(gòu)(例如，枝條的 數(shù)量)、種子產(chǎn)量等。根的發(fā)育、營養(yǎng)吸收和脅迫耐受性也是影響產(chǎn)量的重要因素。影響一個(gè)或多個(gè)上述因素并因此提高作物產(chǎn)量的能力，在如作物強(qiáng)化、植物播種、 觀賞植物的生產(chǎn)、造林、園藝、林業(yè)、藻類或植物生產(chǎn)等領(lǐng)域中將具有許多應(yīng)用(例如用作 生物反應(yīng)器、用于生產(chǎn)物質(zhì)如藥物、抗體或疫苗，或用于有機(jī)廢物的生物轉(zhuǎn)化或在高產(chǎn)量藻 類和植物的情況中用作燃料)。數(shù)個(gè)參數(shù)確定著植物終產(chǎn)量，其中生長是主要因素。通常生長的提高和較高的產(chǎn) 量相關(guān)。尤其相關(guān)的是在不利條件下植物維持生長和繼續(xù)其發(fā)育進(jìn)程的能力。不利條件是 那些限制植物獲得其可能的最大產(chǎn)量的條件。由于植物無法響應(yīng)環(huán)境刺激而移動(dòng)，植物會(huì) 暴露于各種限制其性能的脅迫。非生物脅迫條件，如太陽能、水和營養(yǎng)物的短缺或超量，極 端熱和冷的溫度、污染(如重金屬污染)全部對植物生長具有主要的影響，并可以顯著降低 植物產(chǎn)量和生長。植物對非生物脅迫如干旱、溫度和滲透脅迫的反應(yīng)是相互緊密聯(lián)系的(Zhu等， Crit. Rev. Plant Sci. 16，253-277，1997)。通過一種類型的脅迫調(diào)控的許多基因也會(huì)對另 外兩種脅迫產(chǎn)生響應(yīng)。因此，賦予例如對滲透脅迫的耐受性的基因也會(huì)賦予對冷和干旱脅 迫的耐受性。此外，植物在其生命周期中可能暴露于多種脅迫下，例如干旱脅迫就經(jīng)常伴 隨高溫脅迫。植物從其環(huán)境中受到的最常見種類的脅迫是溫度脅迫。每個(gè)植物物種具有 其自己最佳的生長溫度，很大程度上其地理分布是由其可以存活于其中的溫度帶決定。最 近，已有呼吁關(guān)注預(yù)測在不久的將來將發(fā)生的根本的全球溫度改變對農(nóng)業(yè)可能產(chǎn)生的嚴(yán)重
5影響?，F(xiàn)正在努力尋找提高植物對非最佳溫度條件的適應(yīng)性的實(shí)踐方法。已經(jīng)應(yīng)用分子 育種方法來解決這些問題。例如，通過超表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子如SC0F-1或CBFl (Kim等，Plant J. 25，247-259，2001 Jaglo-Ottosen 等，Science 280，104-106，1998)；提高相容溶質(zhì)的含 量(Alia等，Plant Cell Environm. 21, 232-239,1998)；改變膜脂質(zhì)；和通過降低活性氧類 屬的影響，已經(jīng)在植物中獲得了基因工程化耐冷性。通過工程化表達(dá)熱休克蛋白、提高相容 溶質(zhì)的產(chǎn)量和通過改變膜脂質(zhì)，已經(jīng)獲得抵抗高溫的能力。然而，迄今為止沒有科學(xué)報(bào)道描 述植物2類非共生性血紅蛋白基因響應(yīng)于環(huán)境脅迫或植物血紅蛋白基因通常響應(yīng)溫度脅 迫的情況。干旱、鹽脅迫和高溫或低溫脅迫是農(nóng)業(yè)中的主要問題，因?yàn)檫@些不利環(huán)境因素妨 礙了植物最大程度地利用它們的遺傳潛能。這些脅迫實(shí)質(zhì)上影響了植物生理和代謝的每個(gè) 方面。脅迫通常涉及適應(yīng)性響應(yīng)，如根或其它器官的形態(tài)改變，以及發(fā)育改變，如生長的抑 制。通常，植物的響應(yīng)可以分為三類動(dòng)態(tài)平衡的維持，其包括離子動(dòng)態(tài)平衡和滲透動(dòng)態(tài)平 衡或滲透調(diào)節(jié)；有害化合物的解毒，例如在脅迫過程中產(chǎn)生的活性氧類或受損害蛋白質(zhì)的 解毒；和生長的恢復(fù)，即從生長抑制中和從脅迫過程中強(qiáng)加于細(xì)胞分裂和擴(kuò)展的影響中緩 解過來。通過基因工程在實(shí)現(xiàn)脅迫耐受性中已經(jīng)獲得進(jìn)展，這是通過操縱動(dòng)態(tài)平衡，例如 通過提高滲壓劑的濃度(Nuccio等，Curr. PlantBiol. 2，128-34，1999)，通過超表達(dá)Na+/H+ 逆向轉(zhuǎn)運(yùn)劑(antiporter)，(Apse 和 Blumwald，Curr. Opin. Biotechnol. 13，146-50,2002) 或通過超表達(dá)可能有助于維持膜或蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的LEA蛋白質(zhì)(Xu等，Plant Physio. 110， 49-257，1996)而實(shí)現(xiàn)的。對滲透信號(hào)途徑中的組分進(jìn)行加工也是獲得滲透脅迫耐受性的一 種有前景的途徑。然而，文獻(xiàn)中沒有報(bào)道過確定血紅蛋白基因在提高滲透脅迫耐受性中的 關(guān)鍵作用。血紅蛋白普遍發(fā)現(xiàn)存在于多種生物體內(nèi)(Vinogradov等，Comp. Biochem. Physio. 106，1-26,1993 ；Bolognesi 等，Prog. Biophys. Mol. Biol, 68, 29-68，1997)?？赡艹?了大麥以外，所有檢測的植物物種具有至少兩個(gè)血紅蛋白基因。已經(jīng)報(bào)道這些基因含有3 個(gè)保守內(nèi)含子，這是與動(dòng)物血紅蛋白相同的特征(Arredondo Peter等，Plant Physio. 118， 1121-1125,1998)?；谒鼈兊慕Y(jié)構(gòu)，以前將植物血紅蛋白分成兩組。第一組是共生血紅蛋 白(豆血紅蛋白)，包括大量存在于豆科植物固氮性根瘤的感染細(xì)胞中的血紅蛋白，但是也 可以在非豆科植物中發(fā)現(xiàn)。第二組包括非共生血紅蛋白，其是共生型血紅蛋白的祖先，并其 在植物界中分布更為廣泛。在更近的分類中(Hunt等，Plant Mol. Biol. 47，677-692，2001)，根據(jù)它們的氨基 酸序列，將血紅蛋白歸為1類和2類。沒有合適分類的血紅蛋白分配給O類，后來重命名為 3類(Wittenberg等，J. Biol. Chem. 277 =871-874, 2002)。因?yàn)榛诘氖且患?jí)氨基酸序列來 描述不同的類別，共生血紅蛋白和非共生血紅蛋白可以存在于1類或2類中，3類包括截短 的血紅蛋白。這三個(gè)類別中的成員不僅氨基酸序列不同，而且生化特性也不同。截短的血 紅蛋白是攜帶能夠結(jié)合氧的血紅素基團(tuán)的小蛋白。1類和2類血紅蛋白可以根據(jù)序列中某 些氨基酸的保守性而相互區(qū)分開來(參見Hunt等，2001，詳述1類和2類)。2類血紅蛋白 在位置B3和G3具有保守的脯氨酸殘基，它們的缺失可以導(dǎo)致1類血紅蛋白中B和G螺旋的 不同取向。序列中某些位置處的額外取代和電荷改變會(huì)導(dǎo)致這些螺旋堆積的進(jìn)一步改變。
共生血紅蛋白主要發(fā)現(xiàn)于豆科植物的根瘤中以及與細(xì)菌共生的非豆科植物中。在 植物中，已知共生血紅蛋白在氧運(yùn)輸中起作用，因此通過將氧提供給根瘤來刺激氮固定。這 可能是通過豆血紅蛋白對氧的高親和性以及對氧的快速解離常數(shù)而獲得的(Appleby，Sci. Prog. 76，365-398，1992)。豆血紅蛋白屬于多基因家族，通常得到翻譯后修飾。來自透明顫 菌(Vitreoscilla. sp.)的細(xì)菌血紅蛋白在其對氧的結(jié)合特性方面類似于豆血紅蛋白，由 于該特性，所述蛋白質(zhì)已經(jīng)用于促進(jìn)植物和微生物生長(US5，049，493 ；US5, 959，187)。透 明顫菌血紅蛋白的Kd為6000nM，而擬南芥(Arabidopsis) 2類血紅蛋白的Kd為130nM，低45 倍多。該高Kd使得透明顫菌血紅蛋白非常適于刺激氧運(yùn)輸和隨后的植物生長。因此，透明顫 菌血紅蛋白和植物非共生血紅蛋白是十分截然不同的(Bulow等，Trends Biotechnol. 17， 21-24,1999)。在用于促進(jìn)植物細(xì)胞培養(yǎng)基中氧轉(zhuǎn)移和用于植物再生上，透明顫菌血紅蛋 白的用途可以和牛血紅蛋白的用途相比擬(Azhakanandam等，EnzymeMicrob. Technol. 21， 572-577，1997)。另一方面，在一級(jí)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上，非共生血紅蛋白不同于豆血紅蛋白 (Arredondo-Peter等，1998)。此外，非共生植物血紅蛋白對氧具有非常高的親和性，締合常 數(shù)適中，而解離常數(shù)非常低(比共生血紅蛋白對氧的解離常數(shù)低約40倍(Arredondo-Peter 等，1998 ;Bulow 等，1999 ;Watts 等，Proc. Natl. Acad. Sci USA 98，10119-10124))。因此， 氧被穩(wěn)定地結(jié)合，在氧感知或氧運(yùn)輸中的作用是不太可能的(Arredondo-Peter等，1998)。 然而，關(guān)于非共生血紅蛋白在植物中的功能知道得很少。它們的生化特性看來不包括在氧 擴(kuò)散中的作用，但作為加氧酶的作用是有可能的(Hill, Can. J. Bot. 76，707-712，1998)。氧 的結(jié)合導(dǎo)致了可以影響相關(guān)聯(lián)的配體分子的構(gòu)象改變，由此引發(fā)特定的生理響應(yīng)(Goodman 和 Hargrove，J.Biol.Chem. 276，6834-6839，2001)。通過缺氧、提高蔗糖濃度(Trevaskis等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94， 12230-12234,1997)或通過硝酸鹽(Wang 等，Plant Cell 12，1491-1510，2000)可以誘導(dǎo) 1類血紅蛋白。它們也在發(fā)芽的種子和成熟植物的根中(Hunt等，2001)以及分化細(xì)胞中 (Ross等，Protopalsma218,125-133, 2001)表達(dá)。1類非共生血紅蛋白被低氧脅迫所誘導(dǎo) (Hunt等，2001)。Arabidopsis血紅蛋白1提高了擬南芥在缺氧脅迫下的存活，并促進(jìn)了早 期芽和根生長(Hunt 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99，17197-17202，2002)。改變植物生長 特性的1類血紅蛋白分子的用途主要集中在操縱植物中的氧含量。Tarczynski和Shen (US 6，372，961)提出使用玉米血紅蛋白來改變植物細(xì)胞中的氧濃度和刺激植物種子萌芽和幼 苗生長。同樣，大麥血紅蛋白的超表達(dá)顯示出可提高玉米細(xì)胞中的ATP含量并維持低氧脅 迫下的能量狀態(tài)(Guy等，WO 00/00597)。2類血紅蛋白的表達(dá)模式不同于1類血紅蛋白的，因?yàn)樗鼈兪窃谂咝纬珊头N子成 熟過程中表達(dá)的，在開口周圍(例如，氣孔的葉肉細(xì)胞內(nèi)，花柱頂端的周圍、蜜腺氣孔的周 圍)或在分枝點(diǎn)(例如，出芽系統(tǒng)(bolt system)，新興側(cè)根的周圍，花藥和細(xì)絲的連接處) (Hunt等，2001)。2類血紅蛋白的成員也對細(xì)胞分裂素有響應(yīng)(Hunt等，2001)。Harper等 (TO 02/16655)已經(jīng)顯示，在Arabidopsis中由冷、滲透和鹽水脅迫會(huì)誘導(dǎo)血紅蛋白2，以及 400多種其它的基因。然而，該2類血紅蛋白和提高的脅迫耐受性不相關(guān)。迄今為止，只描 述了少數(shù)2類血紅蛋白序列，其中包括來自擬南芥的GLB2以及從受脅迫幼苗中分離的來 自甜菜(Beta vulgaris)(基因庫登錄號(hào)BE590299)和來自葉子cDNA文庫(基因庫登錄號(hào)BQ586966)的兩個(gè) EST。發(fā)明詳述令人驚奇地，本發(fā)明者現(xiàn)在已經(jīng)證明植物2類非共生血紅蛋白可以用于提高植物 產(chǎn)量和用于提高非生物脅迫。因此，根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案，提供了改變植物特性的方法，該植物特性選 自以下的一個(gè)或多個(gè)提高的植物產(chǎn)量、提高的生物量或改變的植物細(xì)胞分裂，該方法包括 在植物中提高編碼植物2類非共生血紅蛋白的核酸序列的表達(dá)。優(yōu)選地，該提高的產(chǎn)量包 括提高的種子產(chǎn)量。術(shù)語“提高的產(chǎn)量”和“提高的生物量”包括相對于對應(yīng)野生型植物的生物量而言 植物中一個(gè)或多個(gè)部分的生物量的增加。該術(shù)語還包括種子產(chǎn)量的提高，其包括種子生物 量的提高(其可以表示為單個(gè)種子的重量或總的種子重量)和/或(飽滿)種子數(shù)量的提 高和/或種子大小的提高和/或種子體積的提高，每一項(xiàng)均相對于相應(yīng)的野生型植物而言。 種子大小和/或體積的提高還可以影響種子的組成。種子產(chǎn)量的提高可能是由于花數(shù)量和 /或大小的提高。產(chǎn)量的提高還可提高收獲指數(shù)(harvest index)，其表示為總生物量和可 采收部分如種子產(chǎn)量的比例。植物采收的部分可能在作物與作物之間有所不同，例如可以 是種子(在種植用于收獲種子的稻、高粱或玉米的情況中)；可以是地面上的生物量(在玉 米用作青貯飼料或甘蔗的情況中)，根(例如甜菜)，果實(shí)(例如，西紅柿)，棉花纖維或植物 中具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的任何其他部分。例如，本發(fā)明的方法可以用于就全部地面上的生物量和 能量含量而言提高稻和玉米的種子產(chǎn)量或提高青貯飼料玉米的產(chǎn)量。產(chǎn)量的提高還包括植 物在非脅迫條件下或在脅迫條件下比野生型植物更好的性能。脅迫條件包括任何類型的環(huán) 境脅迫以及生物和非生物脅迫。術(shù)語“改變的細(xì)胞分裂”包括細(xì)胞分裂的提高或降低或者異常細(xì)胞分裂/胞質(zhì)分 裂，改變的分裂面，改變的細(xì)胞極性，改變的細(xì)胞分化。改變的細(xì)胞分裂還可以引起改變的 細(xì)胞大小和細(xì)胞數(shù)量。植物中改變的細(xì)胞分裂可以進(jìn)一步導(dǎo)致該植物改變的生長。在此所用的術(shù)語“改變的植物生長”包括但不限于在植物生命周期中一個(gè)或多個(gè) 階段(包括萌芽)中植物一個(gè)或多個(gè)部分(包括種子)的生長速度加快，每一項(xiàng)均相對于 對應(yīng)的野生型植物而言。在植物生命周期的早期階段中提高的生長速度可以引起提高的優(yōu) 勢(和對應(yīng)的野生型植物相比較)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的特征，較快的生長速度發(fā)生在植物生 命周期的大部分階段中。生長速度的提高還可以改變植物采收的時(shí)間，使得有可能提早采 收。如果生長速度充分提高，那么甚至有可能進(jìn)一步播種相同植物物種的種子(例如，在一 個(gè)常規(guī)生長周期中播種和采收稻植物，并接著播種和采收進(jìn)一步的稻植物)或不同植物品 種種子(例如播種和采收稻米植物，接著，例如播種和可選地采收大豆、土豆或任何其他合 適的植物)，因此可提高每英畝的年生物質(zhì)產(chǎn)量(由于提高了生長和采收任何特定植物的 次數(shù)(一年內(nèi)))。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供了改變植物結(jié)構(gòu)的方法，該方法包括在植物中 提高編碼植物血紅蛋白、優(yōu)選非共生血紅蛋白、更優(yōu)選2類非共生血紅蛋白的核酸序列的 表達(dá)?！案淖兊慕Y(jié)構(gòu)”可能是由于細(xì)胞分裂的改變所致。在此所用的術(shù)語“結(jié)構(gòu)”包括植物 的外觀或形態(tài)，包括任何一種或多種結(jié)構(gòu)特征或結(jié)構(gòu)特征的組合。這樣的結(jié)構(gòu)特征包括植物任何細(xì)胞、組織或器官或者細(xì)胞、組織或器官群(包括根、葉、芽、莖、葉柄、毛狀體、花、花 序(對于單子葉植物和雙子葉植物)、圓錐花序、花瓣、柱頭、花柱、雄蕊、花粉、胚珠、種子、 胚、胚乳、種皮、糊粉、纖維、形成層、木質(zhì)層、心材、薄壁組織、通氣組織、篩管分子、韌皮部或 輸導(dǎo)組織等等)的形狀、大小、數(shù)量、位置、紋理、排列和模式。因此，改變的結(jié)構(gòu)包括植物改 變的生長的所有方面。有時(shí)，植物響應(yīng)特定條件如脅迫和病原體(例如，線蟲)而改變它們 的結(jié)構(gòu)。因此，在術(shù)語“結(jié)構(gòu)”的范圍內(nèi)，包括在脅迫條件下(不管生物或非生物的脅迫條 件下)改變的結(jié)構(gòu)。根據(jù)本發(fā)明的再一實(shí)施方案，提供了提高植物的脅迫耐受性優(yōu)選非生物脅迫耐受 性的方法，該方法包括在植物中提高編碼植物2類非共生血紅蛋白的核酸序列的表達(dá)。如在此所用的“提高的脅迫耐受性”包括，對于任何給定的脅迫，提高植物對該特 定脅迫的耐受性，而不管那些植物是否已經(jīng)具有一定程度的對該特定脅迫的耐受性，或者 是全新地對該植物提供對所述脅迫的耐受性。改變的脅迫耐受性優(yōu)選是對各種非生物脅 迫的改變的耐受性。通過存在于環(huán)境中的要素可導(dǎo)致非生物脅迫，其可以包括、但不限于 滲透脅迫、干旱、鹽、脫水、冷凍、熱、冷、水澇、受傷、機(jī)械脅迫、氧化性脅迫、臭氧、強(qiáng)光、重金 屬、營養(yǎng)缺失、有毒化學(xué)物質(zhì)及其組合。這些脅迫中的一些還可以因病原體(如病毒、細(xì)菌、 真菌、昆蟲或線蟲)感染而發(fā)生。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選特征，提高的非生物脅迫耐受性是提高 的對滲透脅迫的耐受性。在非生物脅迫是高溫脅迫的情況中，任何植物血紅蛋白可以用于提高脅迫耐受 性。因此，提供了提高植物高溫脅迫耐受性的方法，包括在植物中提高編碼植物血紅蛋白、 優(yōu)選非共生血紅蛋白、更優(yōu)選2類非共生血紅蛋白的核酸序列的表達(dá)。術(shù)語“高溫脅迫”指的是由高于給定植物最佳生長溫度的溫度而引起的脅迫條件。 術(shù)語“提高的耐受性”包括植物比相應(yīng)的野生型植物能更高程度地耐受任何給定脅迫的能 力。這可以通過植物相對于相應(yīng)野生型植物而言有提高的生長或存活率來表現(xiàn)。該術(shù)語還 包括脅迫階段后更快的生長和/或發(fā)育恢復(fù)。在某些應(yīng)用中，降低植物對特定類型脅迫的 耐受性可能也是有利的。因此改變的脅迫耐受性還包括降低植物對任何給定脅迫的耐受 性，即，使植物對任何給定脅迫更敏感。例如，這對于特定代謝物的生產(chǎn)可能是有利的。根據(jù)本發(fā)明方法的性能有利地導(dǎo)致植物具有改變的生長特征，包括提高的產(chǎn)量和 /或改變的細(xì)胞分裂和/或改變的結(jié)構(gòu)和/或提高的脅迫耐受性，尤其是提高的滲透脅迫耐 受性和/或高溫脅迫耐受性。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選特征，可用于本發(fā)明方法中的血紅蛋白是植物血紅蛋白，優(yōu)選 雙子葉植物的非共生血紅蛋白。進(jìn)一步優(yōu)選地，源自雙子葉植物的非共生血紅蛋白是非共 生2類血紅蛋白。根據(jù)Hunt等(2001)將血紅蛋白歸為1類或2類。有利地，可以使用雙子葉植物的2類非共生血紅蛋白來實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的用于改 變結(jié)構(gòu)或用于提高產(chǎn)量、生物量和/或細(xì)胞分裂的方法。優(yōu)選地，2類非共生血紅蛋白來自 十字花科的成員，如擬南芥，最優(yōu)選地，2類非共生血紅蛋白是由與SEQ ID NO 1、3或5中 任一序列基本上相似的序列編碼的，或者是與SEQ ID NO 2、4或6中任一序列基本上相似 的蛋白質(zhì)，或者是與SEQ ID NO 2具有至少65%序列同一性的同源植物2類非共生血紅蛋 白。有利地，當(dāng)待改變的植物特性是脅迫耐受性時(shí)，血紅蛋白可以是來自雙子葉植物的任何2類非共生血紅蛋白，但是優(yōu)選該2類非共生血紅蛋白是從十字花科分離出來的，更 優(yōu)選來自甜菜，最優(yōu)選該2類非共生血紅蛋白是由與SEQ ID NO 1基本上相似的核酸序列 編碼的，或是與SEQ ID NO 2基本上相似的蛋白質(zhì)，或是與SEQ ID NO 2具有至少65%序列 同一性的同源植物2類非共生血紅蛋白。編碼來自甜菜的完整非共生血紅蛋白的序列迄今仍是未知的。因此，根據(jù)本發(fā)明 的另一方面，提供了編碼植物2類非共生血紅蛋白的分離核酸序列，所述核酸序列選自(i)包含根據(jù)SEQ ID NO 1的序列或其互補(bǔ)序列的核酸序列；(ii)編碼蛋白質(zhì)的序列，該蛋白質(zhì)具有與SEQ ID NO 2所示氨基酸序列至少(以 遞增次序的優(yōu)選)79 %、80 %、85 %、90 %、95 %、96 %、97 %、98 %或99 %相同的氨基酸序 列；(iii)編碼包含SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸；(iv)根據(jù)(i)至(iii)中任一項(xiàng)的、由于遺傳密碼簡并性的結(jié)果而產(chǎn)生的核酸；(ν)作為(i)至(iv)中任一項(xiàng)的核酸的剪接變體的核酸；(vi)由于編碼SEQ ID NO 2所示的蛋白質(zhì)或(i)至(ν)中所定義的等位基因之間 的差并而有差別的核酸；和(vii)編碼根據(jù)⑴至(vi)中任一 DNA序列所編碼的蛋白質(zhì)的免疫活性和/或功 能性片段的核酸序列；和(viii)優(yōu)選在嚴(yán)格條件下和(i)至(vii)所定義序列相雜交的核酸序列，前提條件是(i)至(viii)中沒有一個(gè)包括基因庫登錄號(hào)BE590299或BQ586966 所示的序列。SEQ ID NO 1所示的核酸序列(也稱為克隆BvXero2)編碼來自甜菜的2類血紅 蛋白。有利地，還可以使用(i)至(viii)的核酸來實(shí)施本發(fā)明的方法。這些核酸包括編碼 SEQ ID NO 1所示序列編碼的蛋白質(zhì)的同系物、衍生物和功能片段的核酸。該術(shù)語還包括 SEQ ID NO 1的至少一部分；SEQ ID NO 1所示序列的互補(bǔ)序列；對應(yīng)于SEQ ID NOl所示序 列的RNA、DNA、cDNA或基因組DNA ；由于遺傳密碼的簡并性而產(chǎn)生的SEQ ID NO 1的變體； 該基因或蛋白質(zhì)的家族成員；SEQ ID NOl的等位變體；不同的剪接變體和由于一個(gè)或多個(gè) 插入序列而被中斷的SEQ ID NO 1變體。如在此所用的術(shù)語“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“DNA序列”或 “核酸分子”指的是任何長度的聚合形式的核苷酸，可以是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或 兩者的組合。這些術(shù)語進(jìn)一步包括雙鏈和單鏈DNA和RNA。這些術(shù)語還包括已知的核苷酸 修飾，如甲基化、環(huán)化和“加帽”以及用類似物如肌苷取代一個(gè)或多個(gè)天然核苷酸。該術(shù)語 還包括肽核酸(PNA)，這是其中主鏈?zhǔn)怯蒒-(2-氨乙基)_甘氨酸單元而不是糖所組成的擬 肽的DNA類似物。PNA模擬了 DNA的行為，并結(jié)合互補(bǔ)核酸鏈。PNA的中性主鏈導(dǎo)致與通常 可獲得的水平相比有更強(qiáng)的結(jié)合和更高的特異性。此外，已經(jīng)利用了 PNA獨(dú)特的化學(xué)、物理 和生物特性來生產(chǎn)強(qiáng)有力的生物分子工具、反義和反基因藥劑(antigene agent)、分子探 針和生物傳感器?！爸亟M"DNA分子意思是通過連接不同來源的DNA片段而產(chǎn)生的雜合DNA。 “異源”核苷酸序列是指不與啟動(dòng)子序列一起天然出現(xiàn)的序列。雖然該核苷酸序列相對于啟 動(dòng)子序列而言是異源的，其相對于植物宿主而言可以是同源的，或天然的，或異源的，或外 源的。
“編碼序列，，或“開放閱讀框”或“0RF”指的是，當(dāng)置于合適調(diào)控序列的控制下時(shí)， 即當(dāng)編碼序列或ORF以可表達(dá)形式存在時(shí)，可以轉(zhuǎn)錄成mRNA和/或翻譯成多肽的核苷酸序 列。編碼序列或ORF通過5’翻譯起始密碼子和3’翻譯終止密碼子來限定。編碼序列或 ORF可以包括RNA、mRNA、cDNA、重組核苷酸序列、合成制得的核苷酸序列或基因組DNA。可 以通過插入核酸序列來打斷編碼序列或0RF。編碼基本上相同、但從不同來源分離的蛋白質(zhì)的基因和編碼序列可以由實(shí)質(zhì)上有 差別的核酸序列所組成。同樣的，可以將有實(shí)質(zhì)性差別的核酸序列設(shè)計(jì)成表達(dá)基本上相同 的蛋白質(zhì)。這些核酸序列例如是所給基因的不同等位基因存在的結(jié)果，或者是遺傳密碼簡 并性或密碼子使用差別的結(jié)果。優(yōu)選密碼子用法的差異說明于http://WWW. kazusa. or. jp/ codon0等位變體進(jìn)一步定義為包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)以及小的插入/缺失多態(tài)性 (INDEL ；INDEL的大小通常小于IOObp)。SNP和INDEL形成大多數(shù)生物體中天然多態(tài)性株 系中的最大類型序列變體。另外地，或者可替換地，尤其是在常規(guī)育種方法中，如標(biāo)記輔助 的育種中，有時(shí)實(shí)踐通過誘變處理植物來將等位變化引入植物中。合適的誘變方法之一是 EMS誘變。然后通過例如PCR來鑒定等位變體。接著通過選擇步驟來選擇所述序列的優(yōu)越 等位變體，其將引起改變的生長特性。通常通過監(jiān)控含有所述序列(例如，SEQ IDNO 1)的 不同等位變體的植物的生長特性來進(jìn)行選擇?？梢栽跍厥一蛱锏刂羞M(jìn)行生長性能的監(jiān)控。 更多的可選步驟包括將其中鑒定出優(yōu)等等位變體的植物和另一植物雜交。例如這可以用來 獲得令人感興趣的表型特征的組合。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，在育種過程中可以利用能夠改變編碼血紅蛋白的核酸表 達(dá)的核苷酸序列。例如，在這樣的過程中，鑒定出和能夠改變植物中血紅蛋白活性的基因 (該基因可以是編碼血紅蛋白的基因或能夠影響血紅蛋白活性的另一基因)遺傳連鎖的 DNA標(biāo)記。然后將該DNA標(biāo)記用于育種過程中來選擇具有改變的生長特性的植物。目前可 以獲得許多鑒定SNP和/或INDEL的技術(shù)。“雜交”是其中基本上同源互補(bǔ)的核酸序列相互退火的過程。雜交過程可以全部在 溶液中發(fā)生，即，兩種互補(bǔ)性的核酸都在溶液中。依賴該過程的分子生物學(xué)方法工具包括聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR ；和所有基于此的方法)，扣除式雜交、隨機(jī)引物延伸、核酸酶Sl作圖、引 物延伸、逆轉(zhuǎn)錄、cDNA合成、RNA的差異展示和DNA序列測定。還可以將互補(bǔ)核酸之一固定 于基質(zhì)如磁珠、瓊脂糖珠或任何其他樹脂上來進(jìn)行雜交過程。依賴該過程的分子生物學(xué)方 法包括poly (A+)mRNA的分離。此外，可以將互補(bǔ)核酸之一固定于固體支持物如硝酸纖維素 膜上或者尼龍膜上或者例如通過光刻法固定于例如硅化玻璃支持物上(后者稱為核酸陣 列或微陣列或核酸芯片)來進(jìn)行雜交過程。依靠該過程的分子生物學(xué)方法包括RNA和DNA 凝膠印跡分析、克集落雜交、斑點(diǎn)雜交、原位雜交和微陣列雜交。為了使雜交發(fā)生，通常將核 酸分子熱或化學(xué)變性，以便將雙鏈融化成單鏈和/或從單鏈核酸中除去發(fā)夾結(jié)構(gòu)或其他二 級(jí)結(jié)構(gòu)。雜交的嚴(yán)格性受到如溫度、鹽濃度和雜交緩沖液組成這些條件的影響。雜交的高 嚴(yán)格性條件包括高溫和/或低鹽濃度(鹽包括NaCl和Na3-檸檬酸鹽)和/或在雜交緩沖 液中包含甲酰胺和/或降低雜交緩沖液中化合物如十二硫基磺酸鈉(SDS)的濃度和/或在 雜交緩沖液中除去如硫酸葡聚糖或聚乙二醇(促進(jìn)分子聚集)這樣的化合物。常規(guī)雜交條 件描述于例如(Sambrook等，2001)，但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可意識(shí)到，可以相對于已知或期 望的核酸序列同源性和/或長度而設(shè)計(jì)各種不同的雜交條件。足夠低的嚴(yán)格雜交條件尤其優(yōu)選用于分離和上文定義的本發(fā)明的DNA序列異源的核酸。引起異源性的要素包括如上所 述的等位性、遺傳密碼的簡并性優(yōu)選密碼子用法的不同。本發(fā)明還涉及在嚴(yán)格條件下和根據(jù)本發(fā)明的DNA序列雜交的DNA序列，前提條件 是雜交DNA序列不包括基因庫中登錄號(hào)BE590299或BQ586966所示的序列。還可以通過間插序列來打斷DNA序列。“間插序列”意思是打斷了含有本發(fā)明DNA 序列的編碼序列或打斷了含有本發(fā)明DNA序列的DNA序列可表達(dá)形式的任何核酸序列。除 去間插序列可恢復(fù)編碼序列或可表達(dá)形式。間插序列的實(shí)例包括內(nèi)含子、可移動(dòng)DNA序列 如轉(zhuǎn)座子和DNA標(biāo)記物如T-DNA?！翱梢苿?dòng)DNA序列”意指由于重組事件的結(jié)果而可以移動(dòng) 的任何DNA序列。術(shù)語“序列的片段”意指所述序列的截短形式。截短序列(核酸或蛋白質(zhì)序列)的 長度可以大范圍改變，其最大大小不是關(guān)鍵。通常，截短的氨基酸長度為約5至約60個(gè)氨 基酸。在“功能性片段”的情況中，最小大小是足以向該序列提供至少與該被截短的原始序 列相當(dāng)?shù)墓δ芎?或活性的足夠大小的序列。例如可通過質(zhì)譜或通過O2結(jié)合的動(dòng)力分析 而測定血紅蛋白的功能性(Arredondo-Peter等，1997)?！懊庖呋钚浴敝傅氖强贵w所識(shí)別(即可結(jié)合)的分子或其特異性片段，如特異性表 位或半抗原。例如使用Geyden等，Chem Biol.，3 (8)，679-688，1996中所述的肽掃描技術(shù) 可以測定特異性表位。功能片段還可包括含有對本發(fā)明蛋白質(zhì)特異的表位的那些片段。本發(fā)明還提供了分離的植物2類非共生血紅蛋白，該蛋白包括選自以下之一的多 肽a. SEQ ID NO 2 所示的多肽；b.具有與SEQ ID NO 2所示氨基酸序列至少(以遞增的次序優(yōu)選)79 %、80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%相同的氨基酸序列的多肽；c.由前述定義的核酸序列編碼的多肽；d. (a)至(C)中任一定義的蛋白質(zhì)的同系物、衍生物、免疫活性和/或功能性片段。有利地，根據(jù)上述a至d任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)可以用于本發(fā)明的方法中。與本發(fā)明的 蛋白質(zhì)基本上相似的蛋白質(zhì)包括SEQ ID NO 2的至少部分，SEQ ID NO 2的功能性片段、同 系物、衍生物、取代變體、缺失變體和插入變體，以及SEQ ID NO 2自身所示的蛋白質(zhì)。在此所用的術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“肽”、“多肽”或“寡肽”指的是任何長度的聚合形式的 氨基酸。這些術(shù)語還包括已知的氨基酸修飾，如二硫鍵形成、半胱氨酸化、氧化、谷胱甘肽 化、甲基化、乙酰化、法呢基化、生物素化、硬脂?；?、甲?；?、添加硫辛酸、磷酸化、硫酸化、 遍在蛋白化、肉豆蔻?；?、棕櫚?；?、香葉基化(geranylgeranylation)、環(huán)化(例如，形成 焦谷氨酸)、氧化、脫酰胺、脫水、糖基化(例如，戊糖、氨基己糖、N-乙酰氨基己糖、脫氧己 糖、己糖、唾液酸等)、?；头派湫詷?biāo)記(例如，使用125I、131I、35S、14C、32P、33P、3H)以及非天 然形式的氨基酸殘基，L-氨基酸殘基和D-氨基酸殘基。本發(fā)明蛋白質(zhì)的“同系物”是相對于稱它們?yōu)橥滴锏牡鞍踪|(zhì)而言含有氨基酸取 代、缺失和/或添加，但沒有改變其一個(gè)或多個(gè)功能特性，尤其是沒有降低所得產(chǎn)物的活性 的那些肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶。例如，蛋白質(zhì)的同系物將包括該蛋白質(zhì)的生物活性氨基 酸序列變體。為了生產(chǎn)這樣的同系物，存在于蛋白質(zhì)中的氨基酸可以由其他具有相似特性、 例如疏水性、親水性、疏水力矩(hyclrophobicmoment)、抗原性、形成或分裂α -螺旋結(jié)構(gòu)
12或折疊片結(jié)構(gòu)的傾向等等的氨基酸所取代。本發(fā)明蛋白質(zhì)的取代變體是那些除去了蛋白質(zhì)氨基酸序列中至少一個(gè)殘基并在 該位置插入不同殘基的變體。氨基酸取代通常是單殘基取代，但是也可以成群，這依對多肽 的功能限制而定；插入通常約為1-10個(gè)氨基酸殘基，缺失一般是約1-20個(gè)殘基。優(yōu)選地， 氨基酸取代包括保守氨基酸取代。本發(fā)明蛋白質(zhì)的插入氨基酸序列變體是將一個(gè)或多個(gè)氨基酸引入蛋白質(zhì)中預(yù)定 位點(diǎn)的那些變體。插入可以包括氨基端和/或羧基端融合以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸的內(nèi)部序 列插入。通常，氨基酸序列內(nèi)部的插入比氨基或羧基末端融合要小，例如約1至10個(gè)殘基的 數(shù)量級(jí)。氨基末端或羧基末端融合蛋白或肽的實(shí)例包括酵母雙雜交系統(tǒng)中所用的轉(zhuǎn)錄激活 子的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或激活結(jié)構(gòu)域、噬菌體外殼蛋白、(組氨酸)6_標(biāo)記物、谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶、 蛋白質(zhì)α、麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)、二氫葉酸還原酶、標(biāo)記·100表位(eetarfqpgyrs)、c-myc表位 (eqkliseedl) ,flag-表位(dykdddk)、IacZXMP (鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽)、ha 表位(ypydvpdya)、 蛋白質(zhì) c 表位(edqvdi^rlidgk)和 vsv 表位(ytdiemnrlgk)。本發(fā)明蛋白質(zhì)的缺失變體的特征是從該蛋白質(zhì)的氨基酸序列中除去了一個(gè)或多
個(gè)氨基酸。使用本領(lǐng)域公知的肽合成技術(shù)，如固相肽合成等等，或通過重組DNA操作，可以容 易地制得本發(fā)明蛋白質(zhì)的氨基酸變體。產(chǎn)生表現(xiàn)為取代、插入或缺失變體的變體蛋白質(zhì) 的DNA序列操作也是本領(lǐng)域公知的。例如，在具有已知序列的DNA的預(yù)定位置處制造取 代突變的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，如通過M13誘變，T7-Gen體外誘變試劑盒(USB， Cleveland, OH)，快速改變定點(diǎn)誘變試劑盒(Stratagene，San Diego, CA)、PCR介導(dǎo)的定點(diǎn) 誘變或其他定點(diǎn)誘變方案。操縱DNA序列來產(chǎn)生表現(xiàn)為取代、插入或缺失變體的變體蛋白 質(zhì)的另一可替換方案，包括靶向體內(nèi)基因修飾，其可以通過嵌合RNA/DNA寡核苷酸實(shí)現(xiàn)， 如(Palmgren，Trends Geneticsl3 (9)，348，1997 ；Yoon 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.， 93(5)2071-2076,1996)中所述的。本發(fā)明蛋白質(zhì)的“衍生物”是包含多肽中的至少約五個(gè)毗鄰氨基酸殘基、但是仍保 留蛋白質(zhì)的生物活性的那些肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶。與多肽的天然形式的氨基酸序列 相比較，“衍生物”可以進(jìn)一步包含另外的天然的、改變的糖基化的、?；幕蚍翘烊坏陌?基酸殘基?？商鎿Q地或另外地，與該多肽的天然形式的氨基酸序列相比較，衍生物可以包括 一個(gè)或多個(gè)非氨基酸取代，例如報(bào)告分子或其他配體，其共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合該氨基酸序列， 例如與其相結(jié)合以便于檢測的報(bào)告分子。尋找和鑒定血紅蛋白同系物的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。用于比較的 序列比對方法也是本領(lǐng)域公知的，這樣的方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。 BLAST算法計(jì)算百分比序列同一性，并進(jìn)行兩個(gè)序列之間相似性的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。進(jìn)行BLAST 分析的軟件可通過生物技術(shù)信息國家中心公開獲得。GAP使用Needleman和Wunsch (J. Mol. Biol. 48 =443-453,1970)的算法來尋求兩個(gè)完整序列之間匹配數(shù)最大化、而缺口數(shù)最小化 的比對。當(dāng)使用Needleman-Wunsch算法來測定兩個(gè)蛋白質(zhì)序列之間的百分比同一性時(shí)，全 長序列優(yōu)選和BL0SUM62矩陣結(jié)合使用，缺口開口罰分為10或11，缺口延伸罰分為0. 5或 1。存在于克隆BvXero2中的質(zhì)粒pYPGEXER02的cDNA插入片段含有860bp的cDNA(SEQ ID NO 1，命名為BvXER02)，其帶有456dp的開放閱讀框，編碼152個(gè)氨基酸的、 具有16.72kD預(yù)定分子量的多肽(SEQID NO 2)。該命名為Xero2的多肽包含對所有植物 血紅蛋白均保守的氨基酸殘基。這些包括血紅素結(jié)合所需的cdl苯丙氨酸、C2脯氨酸和F8 近端組氨酸殘基，以及涉及多種類型血紅蛋白中配體結(jié)合的E7遠(yuǎn)端組氨酸。該命名法依據(jù) 的是用于動(dòng)物血紅蛋白的三維結(jié)構(gòu)命名系統(tǒng)(Dickerson和Gels，Hemoglobin Structure, function, Evolution 禾口 Pathology, Benjiamin-Cumimings, Menlo Park, USA),其中螺方寵 用大寫字母表示，螺旋間結(jié)構(gòu)域(interhelical domain)用兩個(gè)小寫字母來表示。數(shù)字指 的是從N-端開始沿著結(jié)構(gòu)域的位置。BvXer02屬于GLB2組，描述為非共生植物血紅蛋白。 該組含有保守殘基 His (E7)、His(F7)和 Phe (cdl 1) (Hunt 等，2001 和 Trevaskis 等，1997)。 ARAth GLB2啟動(dòng)子的表達(dá)分析表明表達(dá)位于根、葉和花序中，在幼苗中可以通過細(xì)胞分裂 素處理來誘導(dǎo)，但不能通過脫落酸、2，4_二氯苯氧基醋酸、赤霉烯酸(giberellic acid)、苯 并(1，2，3)噻二唑-7-硫代羥酸S-甲基酯或茉莉酸甲基酯來誘導(dǎo)(Hunt等，2001)?？梢酝ㄟ^將如下所述的本發(fā)明的分離核酸分子或核酸構(gòu)建體引入宿主細(xì)胞，在允 許多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞并從培養(yǎng)物中收集所產(chǎn)生的多肽來生產(chǎn)該多肽。更有利地，本發(fā)明的方法適用于除了植物以外的生物體，例如，本發(fā)明適用于酵母 和細(xì)菌。給酵母提供對各種脅迫的耐受性的能力對于焙烤工業(yè)、釀造工業(yè)和其他工業(yè)可能 具有許多經(jīng)濟(jì)利益。對熱和滲透脅迫的耐受性特別具有經(jīng)濟(jì)利益。同樣，給細(xì)菌提供對各 種脅迫的耐受性的能力也是有利的。例如，具有提高的滲透和熱脅迫耐受性的細(xì)菌或酵母 尤其適于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，因?yàn)樗鼈冊试S使用更濃縮的營養(yǎng)培養(yǎng)基，更適應(yīng)對抗該發(fā)酵中 由代謝過程產(chǎn)生的熱。因此，本發(fā)明還提供了包含如上所述的核酸序列或核酸構(gòu)建體的宿 主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌、酵母、真菌、植物或動(dòng)物細(xì)胞。該分離的多肽還可以通過 化學(xué)合成來生產(chǎn)。有利地，可以通過化學(xué)方法來改變編碼血紅蛋白的核酸序列的表達(dá)和/或改變血 紅蛋白自身的活性，即通過外源性地應(yīng)用能夠改變血紅蛋白活性和/或能夠改變血紅蛋白 基因(其可以是內(nèi)源基因或引入植物的轉(zhuǎn)基因)表達(dá)的一種或多種化合物或元素來實(shí)現(xiàn)。 外源應(yīng)用可以包括用基因產(chǎn)物或其同系物、衍生物或活性片段和/或針對該基因產(chǎn)物的抗 體來接觸或給予細(xì)胞、組織、器官或生物體。這樣的抗體可以包括“plantibody”、單鏈抗體、 IgG抗體和重鏈camel抗體及其片段。還可以因降低直接或間接激活或滅活血紅蛋白的因 素的水平而改變編碼血紅蛋白的核酸序列的表達(dá)和/或改變血紅蛋白自身的活性。另外地 或可替換地，將相互作用性蛋白質(zhì)或基因產(chǎn)物的抑制劑或激活劑接觸或給予細(xì)胞、組織、器 官或生物體提供了另一外源方式來改變編碼血紅蛋白的核酸序列(其可以是內(nèi)源基因或 以轉(zhuǎn)基因存在)的表達(dá)和/或改變由該核酸序列編碼的血紅蛋白的活性。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了改變植物生長特性的方法，該方法包括外源 性地應(yīng)用能夠改變血紅蛋白基因的表達(dá)和/或能夠改變血紅蛋白活性的一種或多種化合 物或要素。另外地或可替換地，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，可以通過重組方法來改變編碼 血紅蛋白的核酸序列的表達(dá)和/或改變血紅蛋白自身的活性。這樣的重組方法可包括改變 核酸序列的表達(dá)和/或改變蛋白質(zhì)活性的直接和/或間接方法。例如，間接方法可包括將能夠改變所述蛋白質(zhì)(血紅蛋白)的活性和/或所述基因(編碼血紅蛋白的基因)的表達(dá)的核酸序列引入植物中。該血紅蛋白基因或血紅蛋白可 以是野生型的，即天然的或內(nèi)源性的核酸或多肽?；蛘撸梢允窃醋酝换蛄硪晃锓N的核 酸，該基因作為轉(zhuǎn)基因引入，例如通過轉(zhuǎn)化引入。該轉(zhuǎn)基因可以通過有意的人為操縱而從其 天然形式在組成和/或基因組環(huán)境上得到充分的修飾。改變血紅蛋白的活性和/或血紅蛋 白基因表達(dá)的間接方法還包括抑制或刺激驅(qū)動(dòng)天然基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)的調(diào)控基因。可以將 這樣的調(diào)控序列引入植物中。另一方面，一種直接的優(yōu)選方法包括將編碼血紅蛋白或其同系物、衍生物或活性 片段的核酸序列引入植物中?？衫缤ㄟ^轉(zhuǎn)化將核酸序列引入植物中。核酸序列可以來自 (直接或間接地(如果隨后修飾了))任何來源，條件是當(dāng)該序列在植物中表達(dá)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致血 紅蛋白核酸/基因表達(dá)的改變或血紅蛋白活性的改變?？梢詮奈⑸飦碓慈缂?xì)菌、酵母或 真菌，或從植物、藻類或動(dòng)物(包括人)來源中分離該核酸序列。該核酸可以通過有意的人 為操縱而由其天然形式在組成和/或基因組環(huán)境上得到充分的修飾。核酸序列優(yōu)選是同源 核酸序列，即從植物獲得的核酸序列，不管來自相同還是不同的植物物種。本發(fā)明另一實(shí)施方案中提供了包含本發(fā)明如上所述的核酸序列的核酸構(gòu)建體。該 核酸構(gòu)建體可以是表達(dá)載體，其中所述核酸序列可操作地連接了一個(gè)或多個(gè)允許該序列在 原核生物和/或真核生物宿主細(xì)胞中表達(dá)的控制序列。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了核酸構(gòu)建體，其中包含(i)如上定義的(i)至(Viii)中任一項(xiàng)的分離中核酸序列；和(ii) 一個(gè)或多個(gè)控制(i)中核酸序列表達(dá)的控制序列；和可選地(iii)轉(zhuǎn)錄終止序列。優(yōu)選地，上述核酸構(gòu)建體中的分離核酸序列(i)是SEQ ID NO 1所示的。為了在 細(xì)胞、組織或器官(優(yōu)選植物來源的)中實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的表達(dá)，可以將蛋白質(zhì)直接引入細(xì)胞 中，如通過顯微注射或彈道方式，或者，可以將編碼該蛋白質(zhì)的分離核酸分子以可表達(dá)形式 引入細(xì)胞、組織或器官中。優(yōu)選地，本發(fā)明的DNA序列包含編碼序列或開放閱讀框(ORF)，其 編碼如上所述的本發(fā)明多肽或其同系物或衍生物或其免疫活性片段?！拜d體”或“載體序列”意指可以通過轉(zhuǎn)化而引入生物體中且可以穩(wěn)定地保持于該 生物體中的DNA序列。在例如大腸桿菌、根癌土壤桿菌、啤酒酵母或粟酒裂殖酵母的培養(yǎng)物 中維持載體是可能的。其他載體如噬菌體和粘粒載體可以在細(xì)菌和/或病毒中維持和增 殖。載體序列通常包括一組由限制酶識(shí)別的獨(dú)特位點(diǎn)，即多克隆位點(diǎn)(MCS)，其中可以插入 一個(gè)或多個(gè)插入片段?！安迦肫巍币庵刚线M(jìn)載體中所包含的MCS中一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)內(nèi)的 DNA序列。“表達(dá)載體”構(gòu)成載體的亞群，其中包括能夠表達(dá)由插入片段所編碼的蛋白質(zhì)的 調(diào)控序列。表達(dá)載體是本領(lǐng)域已知的，能夠在生物體包括細(xì)菌(例如大腸桿菌)、真菌(例 如啤酒酵母、粟酒裂殖酵母、巴斯德畢赤酵母)、昆蟲細(xì)胞(例如桿狀病毒表達(dá)載體)、動(dòng)物 細(xì)胞(例如，COS或CHO細(xì)胞)和植物細(xì)胞(例如基于馬鈴薯病毒X的表達(dá)載體，參見例如 Vance等1988-W098/44097)中表達(dá)蛋白質(zhì)。本發(fā)明包括含有編碼本發(fā)明如上所述的蛋白質(zhì) 及其同系物、衍生物、功能和/或免疫活性片段的插入片段的任何載體或表達(dá)載體?！翱杀磉_(dá)形式”意思是分離核酸分子處于適于轉(zhuǎn)錄成mRNA和/或翻譯成蛋白質(zhì) 的形式，這種轉(zhuǎn)錄和/或翻譯可以是組成性的或由胞內(nèi)或胞外信號(hào)誘導(dǎo)的，如環(huán)境刺激 或脅迫(促細(xì)胞分裂劑、缺氧(anoxia)、低氧(hypoxia)、溫度、鹽、光、脫水等)或化合物如IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷)或如抗生素(四環(huán)素、氨芐青霉素、利福 平、卡那霉素)，激素(例如，赤霉素、植物生長素、細(xì)胞分裂素、糖皮質(zhì)激素、蕓苔類固醇 (brassinosteroid)、乙烯、脫落酸等)，激素類似物(碘乙酸(IAA)、2，4-D等)，金屬(鋅、 銅、鐵等)，或地塞米松，等等。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的，功能蛋白的表達(dá)可能還需要 一種或多種翻譯后修飾，如糖基化、磷酸化、去磷酸化，或者一種或多種蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相 互作用，等等。所有這樣的處理均包括在術(shù)語“可表達(dá)形式”的范圍內(nèi)。“表達(dá)”意思是在細(xì)胞自身中或在無細(xì)胞系統(tǒng)中生產(chǎn)蛋白質(zhì)或核苷酸序列。其包括 從編碼該產(chǎn)物的DNA轉(zhuǎn)錄成RNA產(chǎn)物，轉(zhuǎn)錄后修飾和/或翻譯成蛋白質(zhì)產(chǎn)物或多肽，以及可 能的翻譯后修飾。優(yōu)選地，蛋白質(zhì)在特定細(xì)胞、組織或器官中(優(yōu)選植物來源的)的表達(dá)是 通過在細(xì)胞、組織或器官中引入編碼該蛋白質(zhì)的分離核酸分子并使其表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的，所述 分離的核酸分子例如是cDNA分子、基因組基因、合成寡核苷酸分子、mRNA分子或開放閱讀 框，其中將核酸分子放置于與合適的調(diào)控序列(包括啟動(dòng)子，優(yōu)選植物可表達(dá)的啟動(dòng)子，和 可選地終止子序列)可操作的連接方式中?！罢{(diào)控序列”指的是控制DNA序列，其對于影響與其連接的編碼序列的表達(dá)和由這 些編碼序列形成的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的穩(wěn)定性是必需的。該控制序列的特性根據(jù)宿主生物體而不 同。在原核生物中，控制序列通常包括啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和終止子。在真核生物中， 控制序列通常包括啟動(dòng)子、終止子和增強(qiáng)子或沉默子。術(shù)語“控制序列”指的是最起碼包 括表達(dá)所需要的所有組分，還可以包括另外的有利組分，其決定特定基因在什么時(shí)候、在哪 里、以多少量表達(dá)，以及影響轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性。提及“啟動(dòng)子”對應(yīng)取其最寬的范圍，并包括 源自典型真核生物基因組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，包括TATA盒，其是準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)所需要 的，可以具有或不具有CCAAT盒序列和另外的調(diào)控序列(即上游激活序列、增強(qiáng)子和沉默 子)，其響應(yīng)于發(fā)育和/或外部刺激或者以組織特異性方式改變基因表達(dá)。如在此所用的，術(shù)語“衍生自，，或“來源于”指的是起源于所指定物種的特定整體 或整體組，但是不必需是從該指定來源直接獲得的。在此調(diào)控序列還指下述組中的任何類型啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子、內(nèi)含子序列、 3’ UTR和/或5’ UTR片段、蛋白質(zhì)和/或RNA穩(wěn)定元件。術(shù)語“啟動(dòng)子”還包括典型原核生 物基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，在該情況中可以包括-35盒序列和/或-10盒轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。術(shù) 語“啟動(dòng)子”還用來描述合成或融合分子或衍生物，其能給予、激活或增強(qiáng)核酸分子在細(xì)胞、 組織或器官中的表達(dá)。啟動(dòng)子可以含有另外的一個(gè)或多個(gè)特定調(diào)控序列的拷貝，以進(jìn)一步 增強(qiáng)和其可操作連接的核酸分子的表達(dá)和/或來改變其空間表達(dá)和/或時(shí)間表達(dá)。這樣的 調(diào)控序列可以置于異源啟動(dòng)子序列鄰近處，以驅(qū)動(dòng)核酸分子響應(yīng)于外部刺激而表達(dá)或使核 酸分子在特定細(xì)胞、組織或器官如分生組織、葉、根、胚、花、種子或果實(shí)中表達(dá)。在本發(fā)明的范圍中，啟動(dòng)子優(yōu)選是植物可表達(dá)的啟動(dòng)子序列。然而，在非植物細(xì)胞 如細(xì)菌、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞中也起作用或僅在其中起作用的啟動(dòng)子并不排除 于本發(fā)明之外，例如本發(fā)明的方法可用于改變酵母的脅迫耐受性?！爸参锟杀磉_(dá)”意思是啟 動(dòng)子序列，包括其中添加的或其中含有的任何另外的調(diào)控序列，至少能夠誘導(dǎo)、賦予、激活 或增強(qiáng)在植物細(xì)胞、組織或器官中的表達(dá)，優(yōu)選在單子葉植物或雙子葉植物細(xì)胞、組織或器 官中的表達(dá)。本發(fā)明范圍內(nèi)，“受調(diào)控的啟動(dòng)子”或“可調(diào)控的啟動(dòng)子序列”是能夠在植物 特定細(xì)胞、組織或器官，或者細(xì)胞、組織或器官群中向結(jié)構(gòu)基因提供表達(dá)的啟動(dòng)子，可選地是在特定條件下賦予表達(dá)，然而，其通常并不在所有條件下、在整個(gè)植物中均賦予表達(dá)。因 此，可調(diào)控的啟動(dòng)子序列可以是在植物內(nèi)的特定位置，或者在一組特定條件下在整株植物 中，如經(jīng)化合物或其它誘導(dǎo)劑(elicitor)誘導(dǎo)基因表達(dá)后，能夠驅(qū)動(dòng)與之可操作連接的基 因發(fā)生表達(dá)的啟動(dòng)子序列?？捎糜诒景l(fā)明實(shí)施中的可調(diào)控啟動(dòng)子賦予了植物內(nèi)特定位置處和/或植物特定 發(fā)育階段的表達(dá)，其可以是組成型地或誘導(dǎo)后。這樣的啟動(dòng)子范圍內(nèi)包括細(xì)胞特異性啟 動(dòng)子序列、組織特異性啟動(dòng)子序列、器官特異性啟動(dòng)子序列、細(xì)胞周期特異性基因啟動(dòng)子序 列、可誘導(dǎo)啟動(dòng)子序列和已被修飾而能夠任一時(shí)間在植物特定部分中提供表達(dá)的組成型啟 動(dòng)子序列，所述修飾例如是將組成型啟動(dòng)子整合入可轉(zhuǎn)座遺傳元件(Ac、DS、Spm、En或其它 轉(zhuǎn)座子)中。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到，“可誘導(dǎo)這樣的啟動(dòng)子”是這樣的啟動(dòng)子，其轉(zhuǎn)錄 活性響應(yīng)于發(fā)育性、化學(xué)、環(huán)境或物理刺激而得到提高或被誘導(dǎo)。同樣，本領(lǐng)域技術(shù)人員將 理解，“組成型啟動(dòng)子”是在生物體、尤其是植物的大部分生長和發(fā)育階段，但不必在全部階 段，具有轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。相反，術(shù)語“普遍存在的啟動(dòng)子”指的是在生物體、尤其是植物 的大多數(shù)部位，但不必在所有部位上，具有轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子。術(shù)語“細(xì)胞特異性”指的是表達(dá)主要發(fā)生在特定細(xì)胞或細(xì)胞類型中(尤其是植物 來源的)，但不必僅僅在該細(xì)胞或細(xì)胞類型中。同樣，術(shù)語“組織特異性”應(yīng)理解為表達(dá)主要 發(fā)生在特定組織或組織類型中(尤其是植物來源的)，但不必僅僅在該組織或組織類型中。 同樣，術(shù)語“器官特異性”指的是表達(dá)主要發(fā)生在特定器官，尤其是植物來源的特定器官，但 不必僅僅在該器官中?？梢酝ㄟ^加入源自一個(gè)或多個(gè)組織特異性啟動(dòng)子或組織特異性可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的 核苷酸序列來修飾可在整個(gè)植物中誘導(dǎo)表達(dá)的組成型啟動(dòng)子，以對其賦予組織特異性。例 如，可以通過加入玉米Adhl啟動(dòng)子序列來修飾CaMV 35S啟動(dòng)子，以對其賦予無氧調(diào)控 的根特異性表達(dá)模式(Ellis等，1987)。另一實(shí)例包括通過將CaMV35S啟動(dòng)子與玉米富 含甘氨酸的蛋白質(zhì)GRP3基因的元件來賦予根特異性或根大量基因表達(dá)(Feix和Wulff 2000-W00015662)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地從公眾可獲得或容易獲得的來源中選擇 合適的啟動(dòng)子序列，用于調(diào)控上述多肽的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子，例如G0S2或CaMV35S，或通過環(huán)境刺 激可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，或種子特異性啟動(dòng)子。將核酸分子置于啟動(dòng)子序列的調(diào)節(jié)控制下或與啟動(dòng)子序列可操作連接意思是核 酸分子的放置方式能使其表達(dá)受到啟動(dòng)子序列的控制。通常將啟動(dòng)子放置在它所調(diào)控的核 酸分子的上游，或在5’ -端，并在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的2kb內(nèi)，但并非必須如此。在異源啟動(dòng)子 /結(jié)構(gòu)基因組合的構(gòu)建中，通常優(yōu)選將啟動(dòng)子放置于這樣的位置其距離基因轉(zhuǎn)錄起始位 點(diǎn)的距離大致與該啟動(dòng)子和控制其天然環(huán)境下所控制的基因(從其衍生出啟動(dòng)子的基因) 之間的距離相同。正如本領(lǐng)域已知的，可以容許該距離有一些變化而不失去啟動(dòng)子的功能。 同樣地，調(diào)控序列元件相對于待置于其控制下的異源基因的優(yōu)選位置由該元件在其天然環(huán) 境(即從其衍生出所述基因)下的位置來確定。再者，正如本領(lǐng)域已知的，該距離也可以有 一些變化?！翱刹僮鬟B接”指的是并列排列方式，其中所述的組分處于使它們以其確定的方式 發(fā)揮功能的關(guān)系中?！翱刹僮鞯剡B接”了編碼序列的控制序列是以這樣的方式連接的使得在該控制序列相容的條件下獲得編碼序列的表達(dá)。當(dāng)控制序列是啟動(dòng)子時(shí)，對本領(lǐng)域技術(shù) 人員顯而易見的是使用雙鏈核酸。術(shù)語“終止子”指的是轉(zhuǎn)錄單位末端的DNA序列，其發(fā)出終止轉(zhuǎn)錄的信號(hào)。終止子 是含有聚腺苷酸化信號(hào)的3’ -非翻譯DNA序列，其有助于將聚腺苷酸序列添加至一級(jí)轉(zhuǎn)錄 物的3’-端。源自病毒、酵母、霉菌、細(xì)菌、昆蟲、鳥類、哺乳動(dòng)物和植物的在細(xì)胞中有活性的 終止子是已知的并描述于文獻(xiàn)中。它們可以從細(xì)菌、真菌、病毒、動(dòng)物和/或植物中分離。特別適用于本發(fā)明基因構(gòu)建體中的終止子實(shí)例包括根癌土壤桿菌胭脂堿合酶 (NOS)基因終止子、根癌土壤桿菌章魚堿合酶(OCS)基因終止子序列、花椰菜花葉病毒 (CaMV) 35S基因終止子序列、Oryzasativa ADP-葡萄糖焦磷酸化酶終止子序列(t3’ Bt2)、 玉米玉米蛋白基因終止子序列、rbcs-lA基因終止子和rbcs-3A基因終止子序列，等等。本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可以進(jìn)一步包括復(fù)制起點(diǎn)，當(dāng)所述核酸構(gòu)建體需要在細(xì)胞中 作為游離體基因元件(例如，質(zhì)粒或粘粒分子)來維持時(shí)，它對于在特定細(xì)胞類型例如細(xì)菌 細(xì)胞中的維持和/或復(fù)制是必需的。優(yōu)選的復(fù)制起點(diǎn)包括，但不限于，Π-ori和colE復(fù)制 起點(diǎn)。核酸構(gòu)建體可以任選地包括選擇標(biāo)記基因。如在此所用的，術(shù)語“選擇標(biāo)記基因” 包括向其中發(fā)生表達(dá)的細(xì)胞提供表型的任何基因，它的表達(dá)可以有助于鑒定和/或選擇出 被本發(fā)明的構(gòu)建體或其衍生物轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。合適的標(biāo)記可以選自給予抗生素或除草 劑抗性的標(biāo)記。因此，含有重組DNA的細(xì)胞能夠在會(huì)殺滅未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的抗生素或除草劑的 濃度存在下存活。選擇標(biāo)記基因的實(shí)例包括bar基因，其提供了對除草劑Basta的抗性； nptll基因，其賦予對抗生素卡那霉素和新霉素的抗性；氨芐青霉素抗性(Ampr)、四環(huán)素抗 性基因(Tcr)，賦予潮霉素抗性的hpt基因，膦絲菌素抗性基因，氯霉素轉(zhuǎn)乙酰酶(CAT)基 因，潮霉素抗性基因?？梢晿?biāo)記，如綠熒光蛋白(GFP)，β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因和螢 光酶基因等等也可以用作選擇標(biāo)記?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的重組DNA技術(shù)來構(gòu)建用于根據(jù)本發(fā)明方法中的 重組DNA構(gòu)建體。可以將基因構(gòu)建體插入載體中，所述載體可以是商業(yè)化的，適于轉(zhuǎn)化進(jìn)宿 主細(xì)胞，優(yōu)選植物細(xì)胞，并適于在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中表達(dá)目的基因。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的特征，編碼血紅蛋白的核酸序列在植物中得到超表達(dá)。獲得基 因或基因產(chǎn)物的增強(qiáng)或提高表達(dá)的方法是本領(lǐng)域公知的，包括例如通過強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的超 表達(dá)，使用轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子或翻譯增強(qiáng)子。另一方面，該核酸序列的下調(diào)也可以引起改變的植物生長特性。通過以有義或反 義方向表達(dá)編碼血紅蛋白的核酸序列，可以獲得生長特性有所改變的植物。下調(diào)的技術(shù)是 本領(lǐng)域公知的。如在此所用的表達(dá)的“基因沉默”或“下調(diào)”指的是降低基因表達(dá)的水平和 /或活性基因產(chǎn)物的含量和/或基因產(chǎn)物活性的水平?？赏ㄟ^例如以有義方向(如果期望 獲得共抑制)添加編碼序列或其部分來獲得這樣的表達(dá)降低。旨在實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)沉默的核酸構(gòu)建體(基因構(gòu)建體)可以含有編碼血紅蛋白的核 酸序列，例如SEQ ID NO 1自身所示序列(或其一個(gè)或多個(gè)部分)，其相對于啟動(dòng)子序列而 言處于有義和/或反義方向。在本發(fā)明的方法中可以采用處于同向或倒置重復(fù)形式的內(nèi)源 基因至少一部分的有義或反義拷貝。還可以通過將SEQ ID NO 1所示核苷酸序列反義形式 的至少部分引入植物中來改變植物的特征。應(yīng)該比較清楚的是部分核酸就可以獲得所期望的結(jié)果。同源反義基因相比于異源反義基因而言更為優(yōu)選，同源基因是植物基因，優(yōu)選來 自相同植物品種的植物基因，而異源基因來自非植物物種。另一下調(diào)基因表達(dá)或基因沉默的方法包括使用核酶，例如Atkins等 (W094/00012)、Lenee 等 1995 (W095/03404)、Lutziger 等 2000 (W000/00619)、Prinsen 等 1997(W097/3865)和 Scott 等 1997 (W097/38116)中所述的。還可以通過插入誘變(例如，T-DNA插入或轉(zhuǎn)座子插入)，或通過基因沉默策略，包 括RNA介導(dǎo)的沉默，來獲得基因沉默，如Angell和Baulcombe 1998 (W098/36083)、Lowe等 1998(W098/53083)、Lederer 等 1999 (W099/15682)或 Wang 等 1999 (W099/53050)等等所述 的。如果在內(nèi)源基因上存在突變，則還可以降低與SEQ ID NO 1、3或5基本上相似的內(nèi)源 基因的表達(dá)，或降低所編碼蛋白質(zhì)的活性。此外，本發(fā)明還涉及生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法，該轉(zhuǎn)基因植物與野生型植物相比具 有改變的生長特性，該方法包括以下步驟(i)將本發(fā)明的編碼血紅蛋白的核酸序列引入植物或植物細(xì)胞中；和(ii)在促進(jìn)再生和/或成熟植物生長的條件下培養(yǎng)該植物或植物細(xì)胞。術(shù)語“植物細(xì)胞”包括源自任何植物的任何細(xì)胞并以單個(gè)細(xì)胞、細(xì)胞群或愈傷組織 存在于培養(yǎng)物中。植物細(xì)胞還可以是培養(yǎng)物中或在自然狀態(tài)下生長的發(fā)育中或成熟植物中 的任何細(xì)胞。有利地，本發(fā)明的方法適用于任何植物?！爸参铩卑ㄋ袑儆赩iridiplantae的 植物物種。本發(fā)明適用于任何植物，尤其是單子葉植物和雙子葉植物，包括飼料(fodder or forage)作物、觀賞植物、糧食作物、樹或灌木，其選自以下組中金合歡屬、槭屬、獼猴 桃屬、七葉樹屬、新西蘭貝殼杉、合歡(Albizia amara)、三色桫欏(Alsophilatricolor)、 須芒草屬、落花生屬、檳榔、Astelia fragrans、鷹嘴紫云英(Astragalus cicer)、 Baikiaea pluri juga、樺屬、蕓苔屬、木欖(Bruguiera gymnorrhiza) 、Burkea africana、 Butea frondosa、Cadaba farinosa、朱櫻花(Calliandra spp. ) 茶樹、美人蕉、辣椒、肉桂(Cassica spp. ) 、 Centroema pubescens、木瓜屬、中國肉桂(Cinnamomum cassia)、小果、咖啡樹、
Colophospermum mopane、 Coronillia、沙枸子(Cotoneaster serotina) 、
山楂、甜瓜、柏木、Cyathea dealbata、 (Cryptomeria japonica)、香茅
屬、Cynthea dealbata> |m Dalbergia monetaria> DavalIiadivaricata> Desmodium spp.、Dicksonia squarosa> Diheteropogonamplectens> Dioclea spp.、Dolichos spp.、 Dorycnium rectum、Echinochloa pyramidal is > Ehrartia spp.、Eleusine coracana> Eragrestis、刺桐、按樹、Euclea schimperi>Eulalia villosa、養(yǎng)麥、Feijoa sellowiana、 草莓、千斤拔、Freycinetia banksii、Geranium thunbergii、銀杏、Glycine javanica、丁 香(Gliricidiaspp.)、陸地棉、銀樣(Grevillea spp.) >Guibourtia coleosperma、黃苗、牛 鞭草(Hemarthia altissima)、黃茅(Heteropogoncontortus)、大麥、紅茍茅(Hyparrhenia rufa)、小 連 翅、Hypertheliadissoluta、Indigo incarnata、鸞 尾、Leptarrhena pyrolifolia、古月枝子(Lespediza spp.)、萵苣(Lettuca spp.)、銀合歡、Loudetiasimplex、 Lotonus bainesii>(Lotus spp· )、Macrotylomaaxillare、H、L、胃 ε 、 水杉、大蕉、Nicotianum spp.、驢食草、Ornithopus spp.、禾S屬、Peltophorum africanum、ifllS ^fL M > Persea gratissima> ^^^M^^riiM^ Phoenix canariensis> Phormium cookianum、石楠、白云杉、松屬、豌豆、新西蘭羅漢松(Podocarpus totara)、Pogonar thria fleckii> Pogonarthriasquarrosa> M> /R Bf ftW (Prosopis cineraria) > 花 Jft 豐公(Pseudotsuga menziesii) > Pterolobium stellatum、西 羊梨、f樂(Quercus spp. )、Rhaphiolepsis umbellata、Phopalostylis sapida、Rhus natalensis、Ribes grossularia> Ribes spp.、束Ij 槐、屬、；S鉤子、^JP、Schyzachyrium sanguineum、金豐公 (Sciadopitysverticillata)、；!匕美紅杉(Sequoia sempervirens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、！梁、疲菜、Sporobolus fimbriatus>Stiburus alopecuroides>StyIosanthos humi 1 i s、葫蘆茶、落羽杉、阿拉伯黃背草(Themeda triandra)、三葉草屬、小麥屬、異葉 ^k (Tsuga heterophylla) > Mto M> MsLM^ffatsoniapyramidata>ΞΕ
米、莧菜、朝鮮薊、蘆筍、椰菜、芽甘藍(lán)、卷心菜、Canola、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、綠葉羽衣甘 藍(lán)(Collardgreens)、亞麻、羽衣甘藍(lán)、扁豆、油籽油菜、秋葵、洋蔥、馬鈴薯、稻、大豆、草 (Straw)、甜菜、甘蔗、向日葵、西紅柿、南瓜和茶等等，或者上述具體提及的任何植物的種子 或上述任一物種的組織、細(xì)胞或器官培養(yǎng)物。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的特征，所述植物是作物，包 括大豆、向日葵、Canola、苜蓿、油籽油菜或棉花。進(jìn)一步優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的植物是單子 葉植物，包括Poaceae的成員，如甘蔗，最優(yōu)選植物是谷類，如稻、玉米、小麥、小米、大麥和 高粱、燕麥。本發(fā)明清楚地?cái)U(kuò)展至可通過在此所述的任一方法獲得的任何植物細(xì)胞或植物，并 擴(kuò)展至其所有植物部分和繁殖體。本發(fā)明包括具有上述改變特性的任何植物細(xì)胞、植物部 分或植物，所述改變的特性包括提高的產(chǎn)量、提高的生物量、提高的細(xì)胞分裂、提高的滲透 脅迫耐受性和/或改變的結(jié)構(gòu)，所述植物細(xì)胞、植物部分或植物中編碼植物2類非共生血紅 蛋白的核酸序列的表達(dá)提高和/或植物2類非共生血紅蛋白的活性改變。本發(fā)明還包括具 有提高的高溫脅迫耐受性的任何植物細(xì)胞、植物部分或植物，所述任何植物細(xì)胞、植物部分 或植物中編碼植物血紅蛋白的核酸序列的表達(dá)提高。本發(fā)明還包括這類植物的轉(zhuǎn)基因可 采收部分或繁殖體，其中所述可采收部分選自種子、葉、花、果實(shí)、莖培養(yǎng)物、根莖、塊莖和鱗 莖。術(shù)語“植物”進(jìn)一步包括懸浮培養(yǎng)物、胚、分生組織部分、愈傷組織、葉、種子、根、芽、配 子體、孢子體、花粉和小孢子。本發(fā)明進(jìn)一步擴(kuò)展至包括通過上述任一方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞、組織、器官 或整個(gè)植物的轉(zhuǎn)基因祖先或后代，僅有的要求是后代呈現(xiàn)出與通過根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的 那些親本相同的基因型和/或表型特征。可使用任何已知方法將核酸分子或含有它的核酸構(gòu)建體引入細(xì)胞來轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化 細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的方法可以從單個(gè)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞再生出完整生物體?？梢杂帽景l(fā) 明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化能夠隨后克隆繁殖(不管通過器官發(fā)生或是胚胎發(fā)生)、并從其再生 出整個(gè)植物的植物組織。特定組織的選擇將根據(jù)可獲得的并最適于待轉(zhuǎn)化的特定物種的克 隆繁殖系統(tǒng)而改變。示范性組織目標(biāo)物包括葉盤、花粉、胚、子葉、下胚軸、大配子體、愈傷組 織、已有的分生組織(例如，頂端分生組織、腋芽和根分生組織)和誘導(dǎo)的分生組織(例如， 子葉分生組織和下胚軸分生組織)。優(yōu)選通過轉(zhuǎn)化將目的基因引入植物。在此涉及的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”包括將外源多核苷 酸轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞中，而不考慮所用的轉(zhuǎn)移方法。可以將多核苷酸瞬時(shí)或穩(wěn)定地引入宿主細(xì)胞中，并且可維持非整合狀態(tài)，例如作為質(zhì)粒，或者，可以整合入宿主基因組中。然后以本 領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方式使用所得到的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞來再生轉(zhuǎn)化植物。植物物種的轉(zhuǎn)化目 前是非常常規(guī)的技術(shù)。轉(zhuǎn)化方法包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、提高游離DAN攝取的化學(xué)品、將DNA直接注 射進(jìn)植物中、顆粒槍轟擊、使用各種病毒或花粉轉(zhuǎn)化以及顯微注射。方法可以選自用于原 生質(zhì)體的鈣 / 聚乙二醇方法(Krens，F(xiàn). A.等，1882，Nature 296,72-74 ；Negrutiu I 等， 1987，PlantMol. Biol. 8，363-373)；原生質(zhì)體電穿孔(Shillito R. D.等，1985Bio/Technol 3,1099-1102)；顯微注射進(jìn)植物材料中(Crossway A.等，1986，Mol. Gen. Genet 202， 179-185)；包被了 DNA 或 RNA 的顆粒轟擊(Klein Τ. Μ.等，1987，Nature 327，70)，用病毒 (非整合型)感染等等。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的方法是土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(An等，EMB0J.， 4,277-284,1985 ；Dodds, Plant genetic engineering,1985 ；Herrera-EstrelIa φ, EMBO J.，2，987-995，1983 ；Herrera-EstrelIa 等，Nature, 303, 209-213,1983)，包括“花浸染 (flower dip)” 轉(zhuǎn)化方法(Bechtold 和 Pelletier，MethodsMol. Biol.，82，259-266，1998 ； Trieu 等，Plant J.，22 (6)，531-541，2000)。根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法，可以從轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞再生出整個(gè)植物?？梢杂帽景l(fā)明 的基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)化能夠隨后克隆繁殖的植物組織(不管通過器官形成或胚胎形成)從其再 生整個(gè)植物。特定組織的選擇根據(jù)可獲得的并最適于待轉(zhuǎn)化特定物種的克隆繁殖系統(tǒng)而改 變。示范性的組織目標(biāo)物包括葉盤、花粉、胚、子葉、下胚軸、大配子體、愈傷組織、已有的分 生組織(例如，頂端分生組織、腋芽和根分生組織)和誘導(dǎo)的分生組織(例如，子葉分生組 織和下胚軸分生組織)。在此所用的術(shù)語“器官形成”意思是芽和根從分生組織中心循序發(fā) 育的過程。在此所用的術(shù)語“胚胎形成”意思是芽和根以一致的方式(不是循序地)一起 發(fā)育的過程，無論是從體細(xì)胞還是從配子開始。通常在轉(zhuǎn)化后，選擇存在一個(gè)或多個(gè)由植物可表達(dá)基因編碼的標(biāo)記的植物細(xì)胞或 細(xì)胞群，所述植物可表達(dá)基因是和目的基因共轉(zhuǎn)移的，接著將轉(zhuǎn)化材料再生成整個(gè)植物。例 如使用DNA印跡分析來評價(jià)推定的轉(zhuǎn)化植物中目的基因的存在，拷貝數(shù)和/或基因組組織。 可替換地或另外地，可以使用RNA印跡和/或蛋白質(zhì)印跡來分析新引入的DNA的表達(dá)水平， 兩種技術(shù)都是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的?？梢酝ㄟ^各種方式來繁殖所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物，如通過克隆繁殖或傳統(tǒng)的育種技 術(shù)。例如，第一代(或Tl)轉(zhuǎn)化植物可以自交而獲得純合的第二代(或T2)轉(zhuǎn)化子，再通過 傳統(tǒng)育種技術(shù)進(jìn)一步繁殖T2植物。所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化生物體可以是各種形式。例如，它們可以是轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞 的嵌合體；克隆轉(zhuǎn)化子(例如，所有細(xì)胞均轉(zhuǎn)化成含有表達(dá)盒)；轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化組織的嫁接 體(例如，植物中，將轉(zhuǎn)化過的根砧木嫁接至未轉(zhuǎn)化接穗上)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及植物非共生血紅蛋白或編碼植物非共生血紅蛋白的核酸序列 用于改變植物特性的用途。尤其是，本發(fā)明還涉及編碼植物2類非共生血紅蛋白的核酸序列用于提高植物產(chǎn) 量、生物量或細(xì)胞分裂中的一種或多種的用途。優(yōu)選地，提高的產(chǎn)量至少包括提高的種子產(chǎn)量。本發(fā)明進(jìn)一步涉及編碼植物2類非共生血紅蛋白的核酸序列用于變植物結(jié)構(gòu)的用途。優(yōu)選地，用于提高植物產(chǎn)量、生物量或細(xì)胞分裂中的一種或多種或者用于改變植 物結(jié)構(gòu)的編碼植物2類非共生血紅蛋白的核酸序列是從雙子葉植物分離的，優(yōu)選來自十字 花科，更優(yōu)選來自擬南芥，最優(yōu)選該分離的核酸如SEQ ID NO 3所示。本發(fā)明還涉及編碼植物2類非共生血紅蛋白的核酸序列用于提高植物非生物脅 迫耐受性的用途。優(yōu)選該非生物脅迫是滲透脅迫。本發(fā)明還涉及編碼植物血紅蛋白的核酸 序列用于提高植物高溫耐受性的用途，優(yōu)選所述植物血紅蛋白是非共生血紅蛋白，更優(yōu)選 為2類非共生血紅蛋白。優(yōu)選地，用來提高滲透脅迫耐受性或用來提高高溫脅迫耐受性的編碼植物2類非 共生血紅蛋白的核酸序列是從雙子葉植物分離的，優(yōu)選來自十字花科，更優(yōu)選來自甜菜，最 優(yōu)選該分離的核酸與SEQ ID NOl基本上相似。此外，本發(fā)明還涉及編碼血紅蛋白的核酸序列和血紅蛋白自身用于改變細(xì)菌或酵 母的脅迫耐受性的用途。本發(fā)明進(jìn)一步還擴(kuò)展至編碼根據(jù)本發(fā)明的血紅蛋白及其同系物、 衍生物和活性片段的核酸序列以及血紅蛋白自身及其同系物、衍生物和活性片段在治療或 診斷組合物中的用途。本發(fā)明還擴(kuò)展至編碼本發(fā)明的植物2類非共生血紅蛋白及其同系 物、衍生物和活性片段的核酸序列以及血紅蛋白自身及其同系物、衍生物和活性片段在調(diào) 控O2或其他化合物如NO含量中的用途。在這方面，調(diào)控本發(fā)明的植物2類非共生血紅蛋 白的含量還可以用來改變生物體中已有的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。因此，本發(fā)明還提供了編碼本發(fā) 明的植物2類非共生血紅蛋白的核酸序列和/或血紅蛋白自身在改變信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的用 途。這些用途也包括于本發(fā)明中。此前所述的核酸序列(及其部分和能夠與其雜交的序列)和此前所述的氨基酸序 列(及其同系物、衍生物和活性片段)可以用來改變植物的生長特性，如前所述。因此這些 序列可以用作生長調(diào)節(jié)劑，如除草劑或生長刺激劑。本發(fā)明還提供了含有上述任一氨基酸 序列所示的蛋白質(zhì)或其同系物、衍生物或活性片段的組合物，其可用作生長調(diào)節(jié)劑。附圖描述

圖1 顯示了來自擬南芥(at)、甘藍(lán)型油菜(Brassica napus，bn)、糖甜菜(Beta vulgaris，bv)、陸地棉(Gossypium hirsutum，gh)、番爺(Lycopersicon esculentum，le)、 烏天麻(Casuarinaglauca，eg)的血紅蛋白序列之間的同源性的累積和消除樹狀圖。圖2 :BvXero2基因賦予酵母對滲透脅迫和高溫的耐受性。上排表示野生型酵母， 下排是用BvXero2轉(zhuǎn)化的酵母菌株。從左至右YPD上的對照，37°C生長2和3天后，在1. 7M 山梨糖醇上生長4天后。圖3 用BvXero2作為探針對基因組甜菜DNA進(jìn)行Southern印跡。所用的酶是 BamHI、HindIII和EcoRI。右邊所示的是Ikb標(biāo)記。圖4 用BvXero2作為探針的RNA印跡。用250mM NaCl處理甜菜植物后的不同時(shí) 間點(diǎn)(小時(shí))。α 3-微管蛋白用作對照。圖5 用BvXero2作為探針的RNA印跡。用100 μ M ABA處理甜菜植物后的不同時(shí) 間點(diǎn)(小時(shí))。α 3-微管蛋白用作對照。圖6 進(jìn)入克隆(entry clone) p55的圖示，在AttLl和AttL2位點(diǎn)內(nèi)含有CDS2591， 用于在PD0NR201主鏈中Gateway 克隆。⑶S2591是擬南芥非共生血紅蛋白Hb2的內(nèi)部代碼。該載體還含有細(xì)菌卡那霉素抗性盒和細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)。圖7 用于在植物中在P35S和T-玉米蛋白-T_rbcS-δ GA雙終止子序列控制下表 達(dá)⑶S2591的二元載體。⑶S2591是擬南芥非共生血紅蛋白Hb2的內(nèi)部代碼。該載體含有 源自Ti質(zhì)粒的T-DNA，其由左邊界(LB重復(fù)，LB Ti C58)和右邊界(RB重復(fù)，RB Ti C58) 所確定。從左邊界至右邊界，該T-DNA含有用于轉(zhuǎn)化植物抗生素選擇的可選擇標(biāo)記盒；用 于轉(zhuǎn)化植物的視覺篩選的可篩選標(biāo)記盒；“組成型啟動(dòng)子-⑶S2591-玉米蛋白和rbcs- δ GA 雙終止子”。該載體還含有來自PBR322的用于細(xì)菌復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)以及可用壯觀霉素和鏈 霉素進(jìn)行細(xì)菌選擇的選擇標(biāo)記(Spe/SmeR)。圖8 花結(jié)(rosette)面積。轉(zhuǎn)基因和對照非轉(zhuǎn)基因植物的平均花結(jié)面積以任意 單位表示，在21至45dpi之間有4個(gè)時(shí)間點(diǎn)。顯示了標(biāo)準(zhǔn)誤差直方圖。圖9 從脅迫(150mM NaCl)中恢復(fù)5周后的轉(zhuǎn)基因植物(左邊2個(gè)植物)和非轉(zhuǎn) 基因?qū)φ罩参?右邊2個(gè)植物)。在54dpi作圖。圖10 序列表。
實(shí)施例現(xiàn)在將參照以下實(shí)施例來描述本發(fā)明，這些實(shí)施例僅僅是為了說明。除非在實(shí)施例中另外指出，所有重組DNA技術(shù)根據(jù)如Sambrook等(1989)或 Ausubel等(2000)卷1和2所述的方案進(jìn)行。用于植物分子操作的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法描述于 R. D. D. Croy (1983)中。實(shí)施例1 通過鹽脅迫誘導(dǎo)的甜菜cDNA文庫的構(gòu)建將甜菜種子(Beta vulgaris cv. Dita)播種于含有沙子和蛭石(1 Iw/ w)混合物的罐中。將植物在溫室條件下生長(20°C 8h，25°C 16h，補(bǔ)充光照來模擬最 小12h的光周期)。定期用營養(yǎng)液灌溉植物，該營養(yǎng)液含有2. 4g/l Ca(NO3)2 ·4Η20， Ig/1KN03, lg/lMgS04 · 7H20, 0. 3g/l KH2PO4, 5. 6mg/l Fequelate (Kelantren, Bayer)， 1. lmg/lZnS04 · 7H20, 3. 3mg/l MnO4 · H2O, 0. 3mg/l CuSO4 · 5H20，3. 8mg/l H3BO3,0. 18mg/ 1 (NH4)6Mo7 · 4H20。為了構(gòu)建cDNA文庫，在采收前一天用200mMNaCl灌溉3周大的植物。用cDNA合成試劑盒(Stratagene)進(jìn)行定向cDNA合成，其中使用從鹽處理過 的甜菜植物的葉子制得的poly (A)+RNA。將cDNA連接進(jìn)噬菌體APG15載體中，并使用 Gigapack III Gold Packaging Extract (Stratagene)包裝。該噬菌體帶有可切除的表 達(dá)質(zhì)粒pYPGE15(URA3作為選擇標(biāo)記)，可以直接用于大腸桿菌和酵母互補(bǔ)(Brimelli和 Pall, Yeast，9，1309-1318，1993)。用 cre-lox 重組酶系統(tǒng)從 λ PG15 收集質(zhì)粒 cDNA 文庫 (Brunelli 和 Pall, Yeast,9,1309-1318，1993)。實(shí)施例2 滲透脅迫耐受性篩選試驗(yàn)的建立所用的酵母菌株是二倍體菌株W303/W303(canl_100，his 3-11、15，leu2_3、 112，trpl-1，ura3-l, GAL+)及其二倍體突變株，缺乏磷酸甘油脫氫酶(gpdl)，命名 為JM164，它是從兩個(gè)單倍體gpdl突變菌株(YRA111(W303-1A gpd: :TRP1 mat a)和 YRAl 14(W303-lAgpdl::TRPl mat α))構(gòu)建的。使用二倍體菌株，因?yàn)檫@樣可以避免分離 出可能提供滲透脅迫耐受性的隱性染色體突變株。將菌株生長于YPD培養(yǎng)基上(2%葡萄 糖，2%蛋白胨和酵母提取物)或在SD培養(yǎng)基上(2%葡萄糖，0.7%無氨基酸的酵母氮
23堿(Difco)，50mM MES [2-(N-嗎啉代)乙烷磺酸]，用Tris (Tris (羥甲基)氨基甲烷)調(diào)節(jié) 至pH5. 5，以及所需的氨基酸，嘌呤和嘧啶堿基)。第一步，在YPD和SD兩種培養(yǎng)基上，比較gpdl突變菌株(JM164)和野生型二倍體 菌株對山梨糖醇的敏感度。為此，使酵母菌株在1. 3M至1. 8M不同山梨糖醇濃度的YPD或 SD培養(yǎng)基上28°C生長4天。山梨糖醇濃度為1. 7M時(shí)，觀察到gpdl突變株和野生型之間有 明顯的生長差異。gpdl突變株比野生型更敏感。第二步，測定用于轉(zhuǎn)化的最佳條件，以優(yōu)化在轉(zhuǎn)化反應(yīng)中所用的細(xì)胞量和文庫質(zhì) 粒量。在300ml的YPD中接種30 μ 1 JM164細(xì)胞的飽和預(yù)培養(yǎng)物。將該培養(yǎng)物生長過夜直 至獲得OD66tl ^ 0. 8。將酵母細(xì)胞在2000rpm離心，用水洗滌，然后用AcLiTE溶液(0. IM乙 酸鋰，IOmMTris-HCl pH7. 6和ImM EDTA (乙二胺四乙酸二鈉鹽))洗滌。將細(xì)胞沉淀重懸于 2ml AcLiTE溶液中，并在30°C振蕩培養(yǎng)15分鐘。培養(yǎng)后，加入200μ1 ssDNA(10mg/ml)。 然后將溶液分成IlOyl等份，將其放置于Eppendorf管中，加入200ng cDNA文庫。接著 使用Gietz等描述的方法通過熱休克轉(zhuǎn)化。簡短地說，將500 μ 1 PEG-AcLiTE溶液(含有 40% w/w PEG (聚乙二醇)4000的AcLiTE溶液)加入每個(gè)等份中。振蕩后，將等份試樣在 30°C培養(yǎng)30分鐘，在42°C培養(yǎng)20分鐘。然后收集細(xì)胞并重懸浮于200 μ 1的IM山梨糖醇 中。將兩個(gè)等份試樣涂布于含有SD的Hem。皮氏培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基中具有除色氨酸(用 于gdpl突變的標(biāo)記)和尿嘧啶(用于質(zhì)粒的標(biāo)記)外的全部所需的補(bǔ)充劑。為了對轉(zhuǎn)化 效率進(jìn)行定量，從原始細(xì)胞沉淀中分離出四個(gè)55 μ 1等份，并用0、10、50和IOOng cDNA文 庫接種。然后實(shí)施相同的轉(zhuǎn)化方案，最后將細(xì)胞重懸浮于ΙΟΟμ 1山梨糖醇中并涂布于含有 相同SD溶液的7αιιΦ皮氏培養(yǎng)皿上。JM164菌株的平均轉(zhuǎn)化效率為每ng cDNA文庫約20 個(gè)轉(zhuǎn)化子。實(shí)施例3 =Xero基因的分離轉(zhuǎn)化三天后，已經(jīng)形成了集落。在無菌水中收集集落，并通過對不同稀釋度涂布平 板來定量細(xì)胞的數(shù)量。將收集后獲得的細(xì)胞懸浮液濃縮約10倍，并涂布于含有1. 7M山梨 糖醇的YPD培養(yǎng)基或SD培養(yǎng)基上。將平板在28°C培養(yǎng)，并選擇出四天后能生長的集落。在 選擇培養(yǎng)基上再檢測第一輪中分離出的集落的耐受性，丟棄那些沒有提供顯著耐受性的集 落。從保留的集落中，通過在基本培養(yǎng)基中選擇來除去質(zhì)粒。這可以通過獲得每個(gè)菌株在 液體YPD培養(yǎng)基中穩(wěn)定期的培養(yǎng)物來進(jìn)行。將這些培養(yǎng)物涂布于YPD培養(yǎng)基中，兩天后挑 選集落并在不含尿嘧啶和色氨酸的YPD和SD中重復(fù)；選擇那些能在YPD中生長、但是不能 在SD-URA-TRP中生長的克隆，將它們的耐受性和原始的含有質(zhì)粒的菌株相比較。最后確認(rèn) 時(shí)，從能夠通過上述控制的克隆中收集質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化進(jìn)JM164菌株中，并再次選擇那些能提供 耐受性的克隆。獲得的結(jié)果總結(jié)于表1中表 1 將再次證實(shí)的陽性克隆測序，它們編碼三個(gè)不同的基因，命名為Xerol至Xero3。 Xero2編碼2類血紅蛋白。與其它植物2類血紅蛋白的序列比對顯示于圖1中。實(shí)施例4 :Xero2在酵母中提供了對滲透脅迫以及對高溫脅迫的耐受性將系列稀釋的JM164 pYPGEXero2和JM164 pYPGE (對照)涂布于含有1. 7M山梨 糖醇的YPD培養(yǎng)基上，并在2和4天后測試滲透耐受性。具有Xero2的酵母克隆具有強(qiáng)烈的山梨糖醇耐受性表型，該表型是可再現(xiàn)的山 梨糖醇濃度為1. 7M時(shí)，對照酵母細(xì)胞根本不生長，而超表達(dá)Xero2的酵母細(xì)胞確實(shí)能生長 (圖 2)。強(qiáng)烈表型的確定基于點(diǎn)滴測試實(shí)驗(yàn)。制得飽和培養(yǎng)物的數(shù)個(gè)稀釋度(1 10、 1 IOOU 1000)，將它們生長于選擇培養(yǎng)基(含有1.7M山梨糖醇的YPD)上。“強(qiáng)烈表 型”是在所有測試的稀釋度中均能夠良好生長的那些克隆。“非強(qiáng)烈表型”意思是沒有在所 有稀釋度中均生長的克隆。表達(dá)空質(zhì)粒的對照細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基上根本不生長。用相同的方式，將JM164 pYPGEXER02和JM164 pYPGE涂布于YPD培養(yǎng)基上并在 37°C培養(yǎng)2和3天。JM164 pYPGEXER02克隆對升高的溫度顯示出的耐受性比野生型高(圖 2)。還試驗(yàn)了對其它毒性化合物如鋰、鈉、過氧化氫、甲萘醌和叔_ 丁基過氧化氫 (tBOOH)的耐受性，但是沒有任何顯著結(jié)果。實(shí)施例5 =DNA印跡分析揭示了甜菜中有多個(gè)同工型為了證實(shí)BvXero2在甜菜基因組中的存在和估算該植物物種中編碼血紅蛋白 的基因的數(shù)量，進(jìn)行了 DNA印跡分析。從3周大的甜菜葉子中制得基因組DNA(Rogers SO 禾口 Bendich AJ, Extraction of totalcellular DNA from plants, algae and fungi(Eds)Plant molecularbiology manual, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Netherlands, 1994)。用 EcoRI、HindIII 或 BamHI 消化 5 μ g DNA,在 0. 8%瓊脂糖凝膠中 電泳，并印跡到尼龍濾膜(Hybond N+, AmershamLife Science)上。用32P-標(biāo)記的探針雜 交該濾膜，所述探針對應(yīng)于pYPGEhemo上的878bp的EcoRl-Xhol消化片段，其跨越整個(gè) cDNA。在高嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交和洗滌(650C ) (Church GM和Gilbert W.，PNAS USA 81 1991-1995，1984)。所有電泳道中均存在數(shù)個(gè)雜交片段，并且與用來消化基因組DNA的限制 性內(nèi)切酶無關(guān)，這表明在甜菜中存在至少兩種可與整個(gè)cDNA雜交的BvXero2同工型(圖3)。該878bp探針可以進(jìn)一步用來檢測和分離BvXer02的其它同工型。實(shí)施例6 在甜菜中通過NaCl和ABA誘導(dǎo)BvXero2為了證實(shí)BvXero2參與甜菜植物對鹽脅迫的響應(yīng)，使用RNA印跡分析來分析因 暴露于NaCl不同時(shí)間產(chǎn)生響應(yīng)而引起的BvXero2 mRNA累積。從對照中以及從250mM Na+或100 μ M ABA處理過的甜菜葉中分離總RNA,如Davis等所述的(Basic methods in MolecularBiology. Elsevier. Amsterdam pp. 143-1461986)。將 30 μ g 總 RNA 在含有 2. 2% 甲醛的瓊脂糖凝膠上分離，并印跡到尼龍濾膜(HybondN，Amersham Life Science)上。 使用上述的探針進(jìn)行雜交。BvXero2特異性探針顯示了只有一個(gè)條帶對應(yīng)于BvXero2 cDNA的大小(0. 45kb)。 在65°C，用4XSSC緩沖液(0.6M NaCl, 0. 06M檸檬酸三鈉，用HCl調(diào)節(jié)至pH = 7)和0.1% SDS將濾膜洗滌兩次5分鐘，并用0.4XSSC、0. SDS洗滌兩次5分鐘。用含有擬南芥 α 3-微管蛋白基因的 1. 9 EcoRI 片段(Ludwig 等，Characterization of the α -tubulin gene family of Arabidopsis thaliana PNAS USA84 :5833_5837 1987)再雜交該相同的 濾膜。如圖4所示，BvXero2 mRNA隨著NaCl處理的時(shí)間而累積，并在8小時(shí)時(shí)達(dá)到最大。 和對照植物相比提高約10倍。在NaCl誘導(dǎo)后至少直至24小時(shí)還維持該高含量。值得一 提的是也從經(jīng)NaCl處理24小時(shí)后的植物中獲得了用于尋找涉及脅迫耐受性的基因的甜菜 cDNA文庫。還觀察到了 ABA處理3小時(shí)后BvXero2的誘導(dǎo)(圖5)。甚至在可能是由于時(shí) 間或光誘導(dǎo)引起的背景含量巨大改變的情況下還觀察到了這種提高。對照泳道在三小時(shí)時(shí) 提高約2倍，但是6小時(shí)后BvXer02幾乎消失，而經(jīng)ABA處理過的泳道仍然顯示出顯著的信 號(hào)。實(shí)施例7 用AtHb2 (CDS2591)轉(zhuǎn)化擬南芥CDS2591 的克隆使用擬南芥幼苗cDNA文庫(Invitrogen，Paisley, UK)作為模板，通過PCR擴(kuò)增 ⑶S2591的核酸。將從幼苗提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄后，將cDNA克隆進(jìn)pCMV Sport 6. O中。該 文庫平均插入物的大小為1.5kb，克隆的原始數(shù)量為1.59X 107cfu。原始滴度被測定為 9. 6 X 105CfU/ml，第一次擴(kuò)增后變?yōu)? X 10ncfu/ml。利用質(zhì)粒提取后，將200ng模板用于 50 μ 1 PCR混合物中。利用包括用于Gateway重組的AttB位點(diǎn)的引物prm6122 (SEQ ID NO 8)和prm5458(SEQ IN NO 7)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用Hifi Taq DNA聚合酶在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn) 行PCR。還使用標(biāo)準(zhǔn)方法擴(kuò)增并純化了 503bp的PCR片段。然后進(jìn)行Gateway方法的第一 步，即BP反應(yīng)，在該過程中PCR片段在體內(nèi)和pDONR質(zhì)粒重組，從而產(chǎn)生“進(jìn)入克隆”(根據(jù) Gateway術(shù)語)p55 (圖6)。質(zhì)粒pD0NR201從Invitrogen作為Ga t eway 技術(shù)的一部分購 得。用p35 S-CDS2591盒轉(zhuǎn)化的載體構(gòu)建隨后將進(jìn)入克隆p56與pl978(用于Arabidopsis轉(zhuǎn)化的目標(biāo)載體)一起用于LR 反應(yīng)中。該載體在T-DNA邊界中含有如下成分作為功能性元件植物選擇基因；GFP表達(dá)盒； 和Gateway盒，旨在與已經(jīng)克隆進(jìn)進(jìn)入克隆中的目的序列進(jìn)行LR體內(nèi)重組。用于組成型表 達(dá)的p35 S啟動(dòng)子定位于該Gateway盒的上游。LR重組步驟后，可將所得到的表達(dá)載體p56(圖7)轉(zhuǎn)化進(jìn)土壤桿菌 (Agrobacterium)菌株 C58C1RIF PMP90 中，并隨后轉(zhuǎn)化進(jìn) Arabidopsis 植物中。
用p35 S-CDS2591 轉(zhuǎn)化 Arabidopsis親本棺物的播種和牛長對于親本植物，將約12mg野生型擬南芥(生態(tài)型，哥倫比亞)種子懸浮于27. 5ml 0.2%瓊脂溶液中。將種子在4°C培養(yǎng)2至3天，然后播種。在以下標(biāo)準(zhǔn)條件下使植物發(fā)芽 白天22°C，晚上18°C，65-70%相對濕度，12小時(shí)光周期，每2或3天用水灌溉15分鐘。然 后將產(chǎn)生的幼苗轉(zhuǎn)移至直徑為5. 5cm的罐中，其中含有1比3比例的沙子和泥炭。然后在 上述相同的標(biāo)準(zhǔn)條件下使植物進(jìn)一步生長。土壤桿菌的牛長條件和制備將帶有輔助質(zhì)粒pMP90的土壤桿菌菌株C58C1RIF在含有Iml無抗生素LB (Luria Broth)的50ml塑料管中培養(yǎng)，該質(zhì)粒含有載體p56。將培養(yǎng)物在28°C振蕩8_9h。此后，將 IOml無抗生素的LB加入塑料管中，然后在28°C振蕩過夜。在約2. 0的光密度(0D_)時(shí)， 將40ml 10%蔗糖和0. 05% Silwet L-77 (聚環(huán)氧烷修飾的七甲基三硅氧烷(84% )和烯丙 氧基聚乙二醇甲基醚(16%)的混合物，OSI Specialties Inc)加入培養(yǎng)物中。用⑶7659 標(biāo)記如此獲得的土壤桿菌培養(yǎng)物，用于轉(zhuǎn)化已生長的植物。當(dāng)每個(gè)母本植物具有一個(gè)7-lOcm高的花序時(shí)，將花序倒置于土壤桿菌培養(yǎng)物中， 并柔和攪拌2-3秒中。每個(gè)轉(zhuǎn)化使用2株植物。然后將植物恢復(fù)至如上所述的正常生長條 件。種子收集在將花浸入土壤桿菌培養(yǎng)物中5周后，停止?jié)补嘀参?。?0小時(shí)的光周期在25°C 培養(yǎng)植物。一周后，采收種子并放入種子干燥機(jī)中一周。然后清潔種子并收集于15ml塑料 管中。將種子存儲(chǔ)于4°C直至進(jìn)一步的處理。在鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥p35 S-⑶S2591植物的生長性能從首次轉(zhuǎn)化的擬南芥植物中收集種子(在此稱為TO種子)，用于評價(jià)在脅迫下的 生長性能。將轉(zhuǎn)基因Tl植物與相同母本植物的分離非轉(zhuǎn)基因零合植物(在此命名為對照植 物)相比較。摻入植物中的視覺標(biāo)記用來鑒別轉(zhuǎn)基因種子和對照種子。為此目的，在藍(lán)光下 檢測干種子，以確定轉(zhuǎn)基因種子的存在。將80粒明亮熒光種子(表達(dá)了轉(zhuǎn)基因)和相同量 的非熒光種子(沒有表達(dá)轉(zhuǎn)基因)在4°C浸入0.2%瓊脂中，并使其在沙子和泥炭(1 3) 的土壤混合物中發(fā)芽。15個(gè)浸液后天數(shù)(days post imbibtion, dpi)時(shí)，選擇一組14株 單獨(dú)的轉(zhuǎn)基因植物和12株對照植物，所有都處于相似的發(fā)育階段，用于進(jìn)一步分析，并轉(zhuǎn) 栽至直徑為6. 5cm罐中的土壤中。將植物生長于溫室條件下(白天22°C，晚上18°C，60% 相對濕度，20小時(shí)光周期，用水地下灌溉)。在幼苗21dpi時(shí)，通過澆灌150mM NaCl，在1周 時(shí)間段內(nèi)應(yīng)用3次鹽處理，然后使用自來水澆灌使植物恢復(fù)。使用數(shù)碼相機(jī)從不同角度每 周拍攝植物，拍攝4周。分析圖像(記錄每張照片對應(yīng)于植物組織的像素?cái)?shù)量)，并使用合 適的軟件來測量植物大小(植物面積和高度)。MM應(yīng)用的鹽脅迫影響了轉(zhuǎn)基因植物和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参飪烧叩纳L。轉(zhuǎn)基因植物顯 示出更好地從脅迫下恢復(fù)生長，這可以從圖8中看出。轉(zhuǎn)基因植物顯示出較高的生長速度， 因此，從脅迫處理中恢復(fù)四周后，轉(zhuǎn)基因植物的花結(jié)比對照植物的大20% (圖2)。然而，最 強(qiáng)烈的效果是在花序結(jié)構(gòu)發(fā)育中觀察到的。非轉(zhuǎn)基因植物的花序結(jié)構(gòu)差，分枝非常少，而轉(zhuǎn)
27基因植物能夠進(jìn)一步發(fā)育它們的花序，產(chǎn)生更多分枝、更多花、更多長角果并且可能更多種 子(圖9)。兩個(gè)參數(shù)反映了花序的發(fā)育，1)花序高度，即花結(jié)水平向上至檢測花序結(jié)構(gòu)最 高部分2條水平線之間的距離，和2)花序面積，即數(shù)碼圖像中高于花結(jié)水平上的所有植物 結(jié)構(gòu)的表面。從這兩個(gè)參數(shù)獲得的值反映出轉(zhuǎn)基因植物中花序結(jié)構(gòu)發(fā)育得更好，并揭示了 花序高度有超過于40%的差異，總花序面積有超過60%的差異(表2)。表2鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)基因植物的生長性能以任意單位表示花結(jié)面積、花序高度和花序面積。以百分比表示的數(shù)值指的是轉(zhuǎn) 基因植物(TR)相對于分離的非轉(zhuǎn)基因(NT)植物之間的差異，將非轉(zhuǎn)基因植物的值作為 100。在45dpi時(shí)進(jìn)行測量。T-檢驗(yàn)項(xiàng)顯示了使用Student’ s t_檢驗(yàn)獲得的ρ-值。 實(shí)施例8 用植物非共生血紅蛋白編碼序列轉(zhuǎn)化的稻植株的生長性能(i)血紅蛋白基因的克隆有關(guān)擬南芥血紅蛋白基因2(AtHB2，⑶S2591)和甜菜血紅蛋白基因⑶S2767的分 離描述于之前的實(shí)施例中。對于CDS2767(Xero2)，將含有相應(yīng)核酸序列的質(zhì)粒(如前所述)用作PCR的底物。 擴(kuò)增中使用針對每個(gè)血紅蛋白基因的特異性引物，它們被詳細(xì)列于表3中。除了特異性序 列，正向引物還含有g(shù)atewayAttBl位點(diǎn)，反向引物還含有Gateway重組系統(tǒng)的AttB2位點(diǎn)。表3引物列表 使用Hifi Taq DNA聚合酶在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行PCR。使用標(biāo)準(zhǔn)方法分離和純化對 應(yīng)于⑶S的特異性PCR片段(表4)。然后進(jìn)行Gateway方法的第一步，即BP反應(yīng)，在該過 程中PCR片段在體內(nèi)與PD0NR201質(zhì)粒重組，產(chǎn)生“進(jìn)入克隆”(該命名根據(jù)的是Gateway術(shù) 語)。所用的基因及其對應(yīng)的進(jìn)入克隆列于表4中。表4克隆進(jìn)稻的血紅蛋白基因列表 因此，每個(gè)進(jìn)入克隆載體在AttLl和AttL2位點(diǎn)內(nèi)含有相應(yīng)的⑶S，用于在 PD0NR201主鏈內(nèi)進(jìn)行Gateway 克隆。載體還含有細(xì)菌卡那霉素抗性盒和細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)。(ii)用于稻轉(zhuǎn)化的載體構(gòu)建列于表4中的進(jìn)入克隆隨后與用于稻轉(zhuǎn)化的目的載體(destination vector) (gateway命名法)一起用于LR反應(yīng)中。該載體在T-DNA邊界內(nèi)含有如下成分作為功能性 元件植物選擇標(biāo)記；可篩選標(biāo)記和旨在與已克隆到進(jìn)入克隆內(nèi)的目的序列進(jìn)行LR體內(nèi)重 組的Gateway盒。將植物啟動(dòng)子定位于該Gateway盒的上游。所用目的載體的描述列于表 5中。表5目的載體 LR重組步驟后，可將所得到的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)土壤桿菌菌株LBA4404中，并隨后 轉(zhuǎn)化進(jìn)稻植物中，因?yàn)楸硎鲚d體是二元載體，可以用于在稻中在特定啟動(dòng)子控制下表達(dá)不 同的⑶S。這些載體含有源自Ti質(zhì)粒的T-DNA，由左邊界(LB重復(fù)，LB Ti C58)和右邊界 (RB重復(fù)，RB Ti C58)所確定。從左邊界至右邊界，該T-DNA含有用于選擇轉(zhuǎn)化植物的選 擇標(biāo)記盒；用于可視化篩選轉(zhuǎn)化植物的可篩選標(biāo)記盒；感興趣的特定植物啟動(dòng)子-CDS與玉米蛋白和rbcs-δ GA雙終止子盒。該載體還含有來自pBR322的用于細(xì)菌復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn) 以及用于使用壯觀霉素和鏈霉素進(jìn)行細(xì)菌選擇的選擇標(biāo)記(Spe/SmeR)。所產(chǎn)生的表達(dá)載體 和相應(yīng)的目的基因描述于表6中。將所有構(gòu)建體(1至8)設(shè)計(jì)成用于超表達(dá)。表6植物轉(zhuǎn)化載體 (iii)用植物轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化稻將表6中所列的T-DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)稻中。將水稻(oryza sativa)日本栽培品種Nipponbare的成熟干種子脫殼。將種子在 70%乙醇中孵育1分鐘，接著在0. 2% HgCl2中孵育30分鐘，并用無菌蒸餾水洗滌6次15 分鐘，由此進(jìn)行滅菌。然后將無菌種子在含有2，4-D的培養(yǎng)基(愈傷組織培養(yǎng)基)上發(fā)芽。 黑暗培養(yǎng)4周后，切下胚胎發(fā)生的源自盾蓋的愈傷組織，并在相同培養(yǎng)基上繁殖。兩周后， 在相同培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)另外2周來增殖或繁殖愈傷組織。在共培養(yǎng)3天前，在新鮮培養(yǎng) 基上傳代培養(yǎng)胚胎發(fā)生的愈傷組織片來促進(jìn)細(xì)胞分裂活性。帶有二元載體的土壤桿菌菌株 LBA4404(構(gòu)建體1至8，表6)用于共培養(yǎng)。將土壤桿菌菌株在含有合適抗生素的AB培養(yǎng) 基上28°C培養(yǎng)3天。然后收集細(xì)菌并以0D_約為1懸浮于液體共培養(yǎng)基中。將懸浮液轉(zhuǎn) 移至皮氏培養(yǎng)皿中，并將愈傷組織浸入懸浮液中15分鐘。接著，將愈傷組織在濾紙上吸干， 轉(zhuǎn)移至固體共培養(yǎng)基上，并在黑暗中25°C培養(yǎng)3天。此后，將共培養(yǎng)的愈傷組織在含有2， 4-D的培養(yǎng)基上黑暗中28°C生長4周，培養(yǎng)基中存在合適濃度的選擇劑。在該時(shí)間段中，快 速生長的抗性愈傷組織島得到發(fā)育。將該材料轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基中并在光下培養(yǎng)時(shí)，胚胎 生成性潛能得到釋放，并在接下來的四至五周內(nèi)發(fā)芽。切下愈傷組織上的芽并在含有植物 生長素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)2至3周，并從該培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移至土壤中。將硬化的芽在溫室中高 濕度下和短期內(nèi)生長。最后，在移植三至五月后收集種子。該方法以高于50%的比例產(chǎn)生 了單基因座轉(zhuǎn)化子(Aldemita 和 Hodges，Plantal99，612-617，1996 ；Chan 等，Plant Mol. Biol. 22 (3)，491-506，1993 ；Hiei 等，Plant J. 6 (2)，271-282，1994)。(iv)轉(zhuǎn)基因稻植物的評價(jià)產(chǎn)生了約15至20株獨(dú)立的TO稻轉(zhuǎn)化子。將首次轉(zhuǎn)化子從組織培養(yǎng)室轉(zhuǎn)移至溫 室中，以便生長并采收Tl種子。通常，保留5-10個(gè)事件，其中Tl后代中存在/缺失轉(zhuǎn)基因 的分離比為3 1。對于這些事件中的每個(gè)，通過監(jiān)控可篩選標(biāo)記的表達(dá)來選擇約10個(gè)含 有轉(zhuǎn)基因(雜合體和純合體)的Tl幼苗和約10個(gè)缺失轉(zhuǎn)基因(零合子)的Tl幼苗。棺物牛長測量
將所選擇的Tl植物(約10株具有轉(zhuǎn)基因和約10株不具有轉(zhuǎn)基因)轉(zhuǎn)移至溫室。 每個(gè)植物接受獨(dú)特的條形碼標(biāo)記，清楚地將表型數(shù)據(jù)和對應(yīng)的植物相聯(lián)系。使所選擇的 Tl植物在以下環(huán)境條件下生長于直徑IOcm罐中的土壤上11. 5小時(shí)的光周期，日光強(qiáng)度 30，OOOlux或更強(qiáng)，日間溫度28°C或更高，夜間溫度22°C，相對濕度60-70%。將轉(zhuǎn)基因植物 和對應(yīng)的零合子以隨機(jī)位置并排種植。從播種的階段至成熟階段，每株植物數(shù)次通過數(shù)字 成像室并成像。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對每株植物從至少6個(gè)不同角度取其數(shù)字圖像(2048X1536 像素，16百萬色)。并且，對約10株所選擇的帶有轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物中的每株照相，還給 所選擇的不含有轉(zhuǎn)基因的植物中的每株照相。以下所述參數(shù)中的一個(gè)或多個(gè)可以從所有植 物的所有數(shù)字圖像中使用圖像分析軟件以自動(dòng)化方式導(dǎo)出。(a)地面上棺物的面積通過計(jì)算和背景相區(qū)別的地面上植物部分的像素總量來測定植物的地面上面積。 對在相同時(shí)間點(diǎn)從不同角度拍攝的照片取平均值，并通過校準(zhǔn)轉(zhuǎn)化成以mm2表示的物理表 面值。實(shí)驗(yàn)顯示了該方式測量的地面上植物面積和地面上植物部分的生物量相關(guān)。(b)棺物高度通過測量罐的上端邊緣和對應(yīng)于地面上植物部分的最上端像素的水平線之間的 距離來測定植物高度。對在相同時(shí)間點(diǎn)以不同角度攝取的照片取平均值，并通過校準(zhǔn)而轉(zhuǎn) 化成以mm表示的物理距離。實(shí)驗(yàn)顯示出該方式測量的植物高度和用尺子人工測量的植物 高度相關(guān)。(C)分蘗的數(shù)量在采收植物時(shí)對主要分蘗進(jìn)行人工計(jì)數(shù)。在高于罐邊緣3cm處切斷分蘗。然后在 切割面計(jì)數(shù)。一起在同一葉鞘中的分蘗作為一個(gè)分蘗計(jì)數(shù)。(d)主圓錐花序的數(shù)量對最高的圓錐花序和垂直比對時(shí)與最高圓錐花序重疊的全部圓錐花序進(jìn)行人工 計(jì)數(shù)，并視作為主圓錐花序。(e)次圓錐花序的數(shù)量對在采收主圓錐花序后植物上保留的圓錐花序的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，并視作為次圓錐 花序。(f)生長曲線對每周測量的植物面積建立模型，獲得每個(gè)植物的生長曲線，以植物面積(mm2)隨 著時(shí)間(天)的值來作圖。從該生長曲線可以計(jì)算以下的參數(shù)(r)A42A42是如生長曲線模型所預(yù)測的播種42天后的植物面積。(h) TmidTmid是植物生長并達(dá)到50%最大植物面積時(shí)所需的時(shí)間。Tmid是從生長曲線模 型預(yù)測出來的。⑴ T90T90是植物生長并達(dá)到90%最大植物面積時(shí)所需的時(shí)間。T90是從生長曲線模型 預(yù)測出來的。種子相關(guān)參數(shù)的測量倌
收集成熟的主圓錐花序、裝袋、作條形碼標(biāo)記，然后在37°C烤爐中干燥3天。然后 將圓錐花序脫粒并收集和計(jì)數(shù)所有種子。使用鼓風(fēng)裝置將空的外殼與飽滿外殼分開。丟棄 空的外殼，然后再次計(jì)數(shù)剩余的部分。在分析天平上對飽滿外殼稱重。該方法得到了一系 列如下所述的種子相關(guān)參數(shù)。(a)每株棺物的種子總量通過計(jì)數(shù)從植物采收的外殼數(shù)量來測量每株植株的種子總數(shù)。(b)飽滿種子的數(shù)量通過對分離步驟后剩余的飽滿外殼計(jì)數(shù)來測定飽滿種子的數(shù)量。(C)每株棺物的種子總產(chǎn)量通過將從植物采收的飽滿外殼稱重來測量種子總產(chǎn)量。(d)棺物的收獲指數(shù)本發(fā)明的收獲指數(shù)(harvest index)定義為種子總產(chǎn)量和地面上面積(mm2)之間 的比例，再乘以倍數(shù)106。(e)棺物的千仁重量(Thousand Kernel ffeight, TKff)該參數(shù)是從計(jì)數(shù)的飽滿種子的數(shù)量和它們的總重外推出來的。(f)總面積 Emergence Prop.是指植物達(dá)到其最大總面積30%時(shí)的時(shí)間。(r)總面積循環(huán)時(shí)間是指當(dāng)植物達(dá)到其最大總面積90%時(shí)的時(shí)間。(ν)統(tǒng)計(jì)分析t_檢驗(yàn)和F-檢驗(yàn)利用雙因子ANOVA (變量分析)作統(tǒng)計(jì)模型，用于植物表型特征的全面評價(jià)。對在 本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)化的所有事件的所有植物上測量的所有參數(shù)都進(jìn)行F檢驗(yàn)。進(jìn)行F檢驗(yàn)來 檢測該基因?qū)λ修D(zhuǎn)化事件的效果，以及驗(yàn)證基因的整體效果，在此命名為“總體基因效果 (globalgene effect)”。如果F檢驗(yàn)的值顯示出數(shù)據(jù)比較顯著，則可確定存在“基因”效果， 意味著不僅僅該基因的存在或位置導(dǎo)致表型的差異。對于F檢驗(yàn)，真實(shí)總體基因效果的顯 著性閾值設(shè)定為5%概率水平。為了檢測事件中基因的效果，即品系特異性效果，在每個(gè)事件中進(jìn)行t-檢驗(yàn)，其 中使用來自轉(zhuǎn)基因植物和相應(yīng)的無效植物(ruillplant)的數(shù)據(jù)。“無效植物”或“無效分離” 是指用和轉(zhuǎn)基因植物相同的方式處理的、但是其中轉(zhuǎn)基因已經(jīng)發(fā)生分離的植物。無效植物 還可以描述為純合陰性轉(zhuǎn)化子。t-檢驗(yàn)顯著性的閾值設(shè)定為10%概率水平。在5個(gè)轉(zhuǎn)化 事件的一個(gè)群體中，一些事件可以低于或高于該t-檢驗(yàn)閾值。這是基于如下假設(shè)即基因 可能僅在基因組中特定位置具有效果，且該位置依賴性效果的發(fā)生并非不同尋常。在此還 將這種基因效果命名為“基因的品系效果”。通過比較t值和t分布或者通過比較F值和F分布來獲得P值。該P(yáng)值表示無效 假設(shè)(無效假設(shè)是“不存在轉(zhuǎn)基因效果”)正確的概率。(vi)特定生長條件如之前所述，植物的生長在溫室中進(jìn)行，可在最佳條件或次佳(sub-optimal)條 件下。在最佳條件下，用含有N P K 20 20 20的最終電導(dǎo)性EC= LlmS的營養(yǎng) 液定期澆灌植物。
使用兩種次佳條件1-鹽脅迫用NaCl補(bǔ)充營養(yǎng)液至15mM。從播種后3周直至采收時(shí)將鹽溶液應(yīng)用于植物，2-干旱脅迫使植物生長，并以對生長最佳的頻率澆灌，使得沒有灌溉過量或不足的信號(hào)可見， 直至抽穗期。當(dāng)針對特定構(gòu)建體的對照非轉(zhuǎn)基因植物中的大約50%達(dá)到了抽穗期末，并且 在分蘗階段開始形成圓錐花序時(shí)(V9階段的末期至RO階段，如Coimce等2000定義的)，對 屬于特定構(gòu)建體的所有植物(轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因)進(jìn)行澆灌，直至罐中含有60%RWC(相對 水含量)，然后停止?jié)补嗨?，直至RWC跌落至20% (大多數(shù)對照植物顯示卷曲指數(shù)(rolling index)為4)。然后恢復(fù)澆灌到正常的最佳頻率。從農(nóng)藝學(xué)觀點(diǎn)看，在溫室中測量的生物量或種子參數(shù)顯示出值提高的轉(zhuǎn)基因植物 選擇用來在田間條件下進(jìn)一步測試。
權(quán)利要求
改變選自下述中的一種或多種植物特性的方法植物提高的產(chǎn)量、提高的生物量、改變的結(jié)構(gòu)或改變的細(xì)胞分裂，該方法包括在植物中提高編碼植物2類非共生血紅蛋白的核酸序列的表達(dá)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述提高的產(chǎn)量包括提高的種子產(chǎn)量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述編碼植物2類非共生血紅蛋白的核酸是來自 雙子葉植物的分離的核酸，優(yōu)選來自十字花科，更優(yōu)選來自擬南芥，最優(yōu)選該分離的核酸編 碼根據(jù)SEQ ID NO 4的蛋白質(zhì)，或是SEQ ID NO 3所示的。
4.提高植物的非生物脅迫耐受性的方法，包括在植物中提高編碼植物2類非共生血紅 蛋白的核酸序列的表達(dá)。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述非生物脅迫是滲透脅迫。
6.提高植物的高溫脅迫耐受性的方法，包括在植物中提高編碼植物血紅蛋白、優(yōu)選非 共生血紅蛋白、更優(yōu)選2類非共生血紅蛋白的核酸序列的表達(dá)。
7.權(quán)利要求4至6中任一項(xiàng)的方法，其中所述編碼植物2類非共生血紅蛋白的核酸序 列是從雙子葉植物、優(yōu)選從十字花科、更優(yōu)選從甜菜中分離的，最優(yōu)選該分離的核酸編碼根 據(jù)SEQ ID NO 2的蛋白質(zhì)，或是SEQ ID NO 1所示的。
8.通過權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的方法可獲得的植物。
9.編碼植物2類非共生血紅蛋白的分離的核酸，其選自(i)包括根據(jù)SEQ ID NO 1的序列或其互補(bǔ)序列的核酸序列；( )編碼蛋白質(zhì)的核酸序列，該蛋白質(zhì)具有與SEQ ID NO 2所示氨基酸序列至少(以 遞增次序的優(yōu)選)79 %、80 %、85 %、90 %、95 %、96 %、97 %、98 %或99 %相同的氨基酸序 列；(iii)編碼包含SEQID NO 2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸序列；(iv)根據(jù)(i)至(iii)中任一項(xiàng)的、由于遺傳密碼而為簡并性的核酸序列；(ν)作為(i)至(iv)中任一核酸的剪接變體的核酸序列；(vi)由于編碼SEQID NO 2所示的等位基因或(i)至(ν)中所定義的序列之間的差異 而有不同的核酸序列；(vii)編碼由(i)至(vi)中任一DNA序列所編碼的蛋白質(zhì)的免疫學(xué)活性和/或功能片 段的核酸序列；和(viii)在嚴(yán)格條件下和(i)至(vii)中所定義的任一序列雜交的核酸序列，前提條件是(i)至(viii)中沒有一個(gè)包括GenBank登錄號(hào)BE 590299或BQ 586966 所示的序列。
10.分離的植物2類非共生血紅蛋白，其中包括選自以下之一的多肽(i)SEQID NO 2所示的多肽；(ii)具有與SEQID NO 2所示氨基酸序列至少(以遞增次序優(yōu)選)79%、80%、85%、 90%、95%、96%、97%、98%和99%相同的氨基酸序列的多肽；(iii)由權(quán)利要求9的核酸編碼的多肽；(iv)(i)至(iii)中任一定義的蛋白質(zhì)的同系物、衍生物、免疫學(xué)活性和/或功能性片段。
11.一種核酸構(gòu)建體，其中包含(i)根據(jù)權(quán)利要求9的分離的核酸序列；( )控制(i)的核酸序列表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)控制序列；以及可選地(iii)轉(zhuǎn)錄終止子序列。
12.權(quán)利要求11的構(gòu)建體，其中所述的分離的核酸序列如SEQIDNO 1所示。
13.含有根據(jù)權(quán)利要求9的核酸或者根據(jù)權(quán)利要求11或12的構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，其中 所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌、酵母、真菌、植物或動(dòng)物細(xì)胞。
14.產(chǎn)生具有改變的生長特性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括以下步驟(i)將權(quán)利要求9的核酸序列引入植物或植物細(xì)胞中；( )在促進(jìn)再生和/或成熟植物生長的條件下培養(yǎng)所述植物或植物細(xì)胞。
15.具有提高的產(chǎn)量、提高的生物量、提高的細(xì)胞分裂、提高的滲透脅迫耐受性和改變 的結(jié)構(gòu)中至少一種特征的植物細(xì)胞、植物部分或植物，其中所述植物細(xì)胞、植物部分或植物 中編碼植物2類非共生血紅蛋白的核酸序列的表達(dá)提高。
16.具有提高的高溫脅迫耐受性的植物細(xì)胞、植物部分或植物，其中所述植物細(xì)胞、植 物部分或植物中編碼植物血紅蛋白的核酸序列的表達(dá)提高。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是作物，其選自大豆、向日葵、 canola、苜蓿、油籽油菜或棉花，優(yōu)選其中所述植物是單子葉植物，如甘蔗，最優(yōu)選谷類，如 稻、玉米、小麥、小米、大麥、高粱、燕麥。
18.根據(jù)權(quán)利要求15至17中任一項(xiàng)的植物的轉(zhuǎn)基因后代、轉(zhuǎn)基因可采收部分或繁殖 體，其中所述可采收部分選自種子、葉、花、果實(shí)、莖培養(yǎng)物、根莖、塊莖和鱗莖。
19.編碼植物2類非共生血紅蛋白的核酸序列用于提高植物產(chǎn)量、生物量或細(xì)胞分裂 中的一種或多種和/或改變植物結(jié)構(gòu)的用途。
20.權(quán)利要求19的用途，其中所述提高的產(chǎn)量包括種子產(chǎn)量。
21.根據(jù)權(quán)利要求19或20的用途，其中所述編碼植物2類非共生血紅蛋白的核酸序列 是從雙子葉植物、優(yōu)選從十字花科、更優(yōu)選從擬南芥中分離的，最優(yōu)選所述分離的核酸是如 SEQ ID NO 3所示的。
22.編碼植物2類非共生血紅蛋白的核酸序列用于提高植物的非生物脅迫耐受性的用途。
23.權(quán)利要求22的用途，其中所述的非生物脅迫是滲透脅迫。
24.權(quán)利要求22或23的用途，其中所述編碼植物2類非共生血紅蛋白的核酸序列是 從雙子葉植物、優(yōu)選從十字花科、更優(yōu)選從甜菜中分離的，最優(yōu)選該分離的核酸是如SEQ ID NO 1所示的。
25.編碼植物血紅蛋白的核酸序列用于提高植物的高溫耐受性的用途，優(yōu)選所述的植 物血紅蛋白是非共生血紅蛋白，更優(yōu)選2類非共生血紅蛋白。
26.權(quán)利要求25的用途，其中所述編碼植物2類非共生血紅蛋白的核酸序列是從雙子 葉植物、優(yōu)選從十字花科、更優(yōu)選從甜菜中分離的，最優(yōu)選該分離的核酸是如SEQ ID NO 1 所示的。
27.血紅蛋白或編碼血紅蛋白的核酸序列用于改變酵母的脅迫耐受性的用途。
28.根據(jù)權(quán)利要求9的核酸序列和/或根據(jù)權(quán)利要求10的氨基酸序列在治療性或診斷 性組合物中的用途。
29.根據(jù)權(quán)利要求9的核酸序列和/或根據(jù)權(quán)利要求10的氨基酸序列在調(diào)控O2或其 它化合物的水平中的用途。
30.根據(jù)權(quán)利要求9的核酸序列和/或根據(jù)權(quán)利要求10的氨基酸序列在改變信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 途徑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明總體涉及改善在正常和在脅迫條件下、更特別在滲透脅迫下和/或極端溫度下植物生長的方法，該方法包括改變植物中植物血紅蛋白基因表達(dá)和/或改變植物血紅蛋白的含量。本發(fā)明進(jìn)一步涉及提高植物產(chǎn)量的方法，包括改變植物中植物基因表達(dá)和/或改變植物血紅蛋白含量。本發(fā)明還涉及編碼賦予該改變生長和脅迫耐受性的血紅蛋白的核酸。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101880670SQ20101016298
公開日2010年11月10日 申請日期2004年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月1日
發(fā)明者A·I·桑莫里內(nèi)羅, J·M·米萊薩洛爾特, R·塞拉諾薩洛姆 申請人:作物培植股份有限公司