專利名稱：一種乙肝核酸疫苗、其制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程DNA疫苗領(lǐng)域，具體地說是一種具有治療性作用的乙型肝炎核酸疫苗，本發(fā)明還涉及該疫苗作為治療乙肝的藥物制劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒是一種具有很強傳染性的病毒，全球目前約有3億5千萬人口感染乙型肝炎病毒，每年大約有1百萬感染者死于乙型肝炎及由乙型肝炎誘發(fā)的肝硬化，肝壞死和肝癌。乙型肝炎可以分為急性及慢性兩種，95％左右急性乙肝患者可以通過治療而痊愈；5％左右轉(zhuǎn)變成慢性乙型肝炎。絕大多數(shù)的慢性乙肝患者成為終生病毒攜帶者。
中國是世界上罹患慢性乙肝最嚴(yán)重的國家。全國乙肝病毒表面抗原(HBsAg)攜帶率平均10％(表面抗原攜帶者約1億人)。全國人群乙型肝炎感染率高達(dá)60％(約有6億多人已被乙肝病毒感染過)。若不及時有效地清除乙型肝炎病毒(HBV)，約25％的乙肝病毒攜帶者會發(fā)展為肝硬化，5-10％的患者會演變成肝癌。目前人們對乙型病毒性肝炎主要采取預(yù)防手段，即接種乙型肝炎疫苗進(jìn)行預(yù)防。預(yù)防疫苗主要用于從未感染過的機體，因此天然結(jié)構(gòu)的病毒蛋白可直接作為疫苗抗原。但是已經(jīng)開發(fā)出應(yīng)用的乙型肝炎病毒疫苗，雖然能對HBV感染起到良好的預(yù)防作用，但對感染HBV的機體，卻難以發(fā)揮治療和清除病毒的作用。主要原因在于機體對乙肝病毒產(chǎn)生了特異性免疫耐受，免疫系統(tǒng)不能有效地清除病毒。對乙型肝炎的病毒攜帶者和感染者，尤其是慢性乙肝病毒肝炎這樣的的患者，目前，得到世界公認(rèn)的有效治療慢性乙型肝炎的藥物有兩種一種是α-干擾素，另一種是核酸的類似物拉米夫啶。雖然這兩種抗病毒藥物在臨床上均有一定的降低病毒水平的作用，但是同時具有不可忽視的缺點毒性高，而且副作用大。另外，α-干擾素需要長期皮下或肌肉注射；拉米夫啶僅對1/3左右的慢性乙肝病人有效。停藥后，患者病毒水平回升是以上兩種藥物的共同缺點。兩種藥物之所以有以上缺點是因為藥物本身僅僅抑制了病毒復(fù)制，卻不能徹底清除被病毒感染的細(xì)胞，因而會出現(xiàn)停藥后，病毒水平回升的現(xiàn)象。因此，開發(fā)一種安全、有效地治療慢性乙肝的疫苗對人類的健康具有很重要的意義。
目前臨床上應(yīng)用的乙肝疫苗主要有以下幾種1.血源性乙肝疫苗。血源疫苗曾在全世界范圍內(nèi)廣泛使用多年，但它畢竟是用乙型肝炎攜帶者的血漿來制備的，從理論上講其安全性并不能達(dá)到100％的標(biāo)準(zhǔn)，而且攜帶者血漿的來源受到限制，對乙肝疫苗的產(chǎn)量和成本都會造成潛在的問題。同時，這種疫苗僅能作為預(yù)防疫苗，對已感染病毒的機體不能起到治療作用。
2.基因工程亞單位疫苗。利用真核細(xì)胞做短期或長期的乙型肝炎表面抗原的表達(dá)來生產(chǎn)HBV疫苗是一種可行的途徑。酵母是一種單細(xì)胞真核生物，常用來制備基因工程亞單位疫苗。用酵母制備的重組DNA乙型肝炎表面抗原代表了疫苗的第二次革命。臨床試驗證明基因工程乙肝表面抗原是安全和有效的，在中國也已經(jīng)用它取代了以前使用的乙肝血源疫苗。盡管它含酵母蛋白不超過1％，但對其產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)的擔(dān)憂尚未完全排除。同時，這種亞單位疫苗也只是作為預(yù)防疫苗。
3.人工合成多肽乙型肝炎亞單位疫苗。有文獻(xiàn)報道可以根據(jù)乙型肝炎表面抗原的序列來合成具免疫原性的短肽。但一般來說，這些短肽的免疫原性都很有限，不能導(dǎo)致免疫記憶。這些微弱的免疫反應(yīng)可能與缺乏T細(xì)胞抗原表位有關(guān)。
4.乙型肝炎DNA疫苗。DNA疫苗是近年來迅猛發(fā)展的一門新技術(shù)。它是指將含有編碼外原性蛋白基因的真核表達(dá)質(zhì)粒DNA直接接種機體后，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源蛋白，以激發(fā)機體產(chǎn)生特異性細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答的一種新型的免疫策略，具有易于構(gòu)建、制備簡單及穩(wěn)定性好等優(yōu)點，同時能誘發(fā)機體持久的特異性細(xì)胞及體液免疫應(yīng)答，可兼做預(yù)防和治療性疫苗。在Nature，1992，356152-154中，Tang DC等人公開了DNA疫苗技術(shù)。1993年Davis等人把含HBV表面抗原(HBsAg)編碼基因的表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)肌肉免疫小鼠，成功地誘發(fā)了針對HBsAg的細(xì)胞與體液免疫(Davis HLet al，Vaccine，1996，14910-915)。之后基因疫苗治療乙型肝炎成為人們爭相研究的熱點。Mancini M等將HBV DNA疫苗免疫HBV轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)現(xiàn)，小鼠對HBV的免疫耐受狀態(tài)得以逆轉(zhuǎn)，產(chǎn)生了HBsAg抗體，清除了血液中游離的病毒顆粒，肝內(nèi)HBV的復(fù)制也得以抑制，進(jìn)一步表明DNA疫苗有可能成為乙型肝炎防治的新手段(Proc Natl Acad Sci USA，1996，9312496-12501)。
目前文獻(xiàn)所報道的以激活免疫系統(tǒng)為基礎(chǔ)的乙肝疫苗都集中于選用HBV包膜蛋白，HBV核心抗原或HBV多聚酶抗原全蛋白，或單個T細(xì)胞抗原決定簇多肽片段，這些制劑雖然對動物模型或急性乙肝患者顯示出一定的療效，但對慢性乙型肝炎患者沒有明顯的療效。如何打破機體慢性感染所形成的免疫耐受狀態(tài)，是抗HBV治療研究的重要課題。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是為了克服目前乙肝疫苗的缺點，提供一種具有強細(xì)胞免疫原性可以作為治療用的、不易產(chǎn)生HBV感染免疫耐受、使用安全的疫苗；同時，本發(fā)明還提供一種制備簡單、易于構(gòu)建、穩(wěn)定性好的乙肝疫苗的制備方法，本發(fā)明還涉及這種乙肝疫苗作為治療乙肝的藥物制劑的應(yīng)用。
抗原表位是抗原誘生特異性免疫應(yīng)答的最小的結(jié)構(gòu)和功能單位，包括B細(xì)胞抗原表位、T輔助細(xì)胞表位和殺傷性T細(xì)胞表位。由于不同類型免疫應(yīng)答的下調(diào)、缺乏及紊亂是許多疾病的病因，因此以抗原表位為基礎(chǔ)的疫苗設(shè)計日益受到重視。在表位水平上對抗原性的認(rèn)識已促成這樣一種趨勢基于抗原分子的免疫干預(yù)手段已不再停留于病原體或天然抗原整體分子水平而開始向表位水平過度。以表位為基礎(chǔ)的疫苗包括多肽疫苗和以表位為基礎(chǔ)的基因疫苗及多表位疫苗等。其中以多表位為基礎(chǔ)的基因疫苗最富有潛力。
本發(fā)明正是以多表位基因疫苗的方式入手，構(gòu)建HBV基因疫苗。本發(fā)明首先篩選T細(xì)胞抗原決定簇和B細(xì)胞抗原決定簇，已知HBV基因中的Pre-S1區(qū)和S基因分別編碼Pre-S1抗原、Pre-S2抗原和S抗原，組合HBV包膜三種蛋白，此三種抗原均含有誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗HBV中和抗體的抗原決定簇，由于Pre-S1抗原、Pre-S2抗原在HBV與肝細(xì)胞相應(yīng)受體的粘附中起重要作用，而且在自然感染狀態(tài)下，抗Pre-S2抗體的產(chǎn)生早于抗S抗體，可能與病毒清除密切相關(guān)，因此本發(fā)明選取編碼Pre-S2抗原決定簇的基因序列插入到表達(dá)載體上；另外，HBcAg與殺傷性T細(xì)胞之間有緊密的關(guān)系，本發(fā)明在構(gòu)建HBV核酸疫苗時，也將編碼HBcAg T細(xì)胞抗原決定簇插入到同一個重組表達(dá)載體上；因此本發(fā)明在構(gòu)建HBV核酸疫苗時，將編碼T和B細(xì)胞抗原決定簇的序列和Pre-S2序列插入到同一個重組表達(dá)載體上，同時誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性體液免疫和殺傷性T細(xì)胞激活介導(dǎo)的細(xì)胞免疫。
本發(fā)明的構(gòu)建核酸疫苗的真核表達(dá)質(zhì)粒載體采用藥學(xué)上可以接受的真核質(zhì)粒載體，可以選用本技術(shù)領(lǐng)域的通用載體，包括但不限于pVAX1(美國Invitrogene公司生產(chǎn))，也可以采用其它真核表達(dá)質(zhì)粒載體pIRESIneo，pCDNA3、pCI、pCMV；本發(fā)明還可以加入佐劑，如陽離子脂質(zhì)體，白細(xì)胞介素IL-12，GM-CSF，γ-干擾素等，也可以不加佐劑。所述的藥物組合物可以通過常規(guī)的免疫途徑應(yīng)用于人類，從而引發(fā)免疫應(yīng)答。所述應(yīng)用途徑包括但不限于肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射、靜脈注射、基因槍轟擊和鼻粘膜滴注等。
在確定了抗原決定簇以后，進(jìn)一步確定將抗原決定簇組合后的含有T細(xì)胞抗原決定簇和B細(xì)胞抗原決定簇的氨基酸順序，進(jìn)一步設(shè)計出相應(yīng)的核苷酸片段，并用化學(xué)合成方法合成后，用T4 DNA連接酶(美國NEB公司生產(chǎn))連接，拼接得到重組目的基因片段；用限制性內(nèi)切酶EcoRI和AlfII消化(美國NEB公司生產(chǎn))真核表達(dá)質(zhì)粒，消化產(chǎn)物與拼接產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并純化，將兩種純化的產(chǎn)物用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒。其具體步驟為1)選取多個抗原決定簇，設(shè)計出多價抗原決定簇多肽；2)用化學(xué)合成法合成單鏈寡核苷酸片段，和T4DNA連接酶連接，得到重組目的基因片段；3)用限制性內(nèi)切酶消化質(zhì)粒載體，消化產(chǎn)物與重組目的基因片段用連接酶連接；4)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，用發(fā)酵培養(yǎng)的方法，生產(chǎn)出含有DNA疫苗的工程菌；5)用商業(yè)化的層析柱通過親和層析的方法，分離純化4)中的細(xì)菌裂解液，得到濃縮的質(zhì)粒。
本發(fā)明的基因疫苗可以有效地誘導(dǎo)HBV特異性殺傷性T細(xì)胞的產(chǎn)生，因此可作為慢性乙型肝炎治療性DNA疫苗，用于打破HBV感染的免疫耐受，對慢性乙型肝炎進(jìn)行治療。通過本發(fā)明后續(xù)的實施例表明，用本發(fā)明構(gòu)建的基因疫苗免疫HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生了小鼠T細(xì)胞，能特異性的識別并清除帶有HBV多肽以及被乙肝表面蛋白DNA轉(zhuǎn)化的靶細(xì)胞。本發(fā)明的實施例還表明HBV核酸疫苗能特異性誘導(dǎo)IFN-γ的分泌。
以下將結(jié)合附圖和實施例詳細(xì)說明本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)說明的是，實施例是對本發(fā)明的技術(shù)方案的進(jìn)一步說明，但并不表明本發(fā)明僅限于這些實施例。

圖1是本發(fā)明乙肝核酸疫苗的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是本發(fā)明的pUV-3質(zhì)粒的酶切電泳圖和插入片斷測序圖，其中圖左為經(jīng)酶切后的電泳圖，P1、P2為DNA疫苗的亞克隆，M1、M2為DNA標(biāo)準(zhǔn)；圖右為插入片段的核苷酸序列分析；圖3殺傷性T細(xì)胞抗原決定簇的免疫原性分析，其中T2+HBV-C18為核心抗原決定簇C18組，T2+HBV-S371為表面抗原決定簇S371組(實施例2的實驗組)，T2+Control peptide為非特異性多肽對照組。結(jié)果顯示當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比值分別為10∶1，30∶1和100∶1時，實驗組即T2+HBV-C18組和T2+HBV-S371組與對照組相比，具有明顯的殺傷效應(yīng)。
圖4是本發(fā)明的HBV核酸疫苗誘導(dǎo)的針對S371表位的特異性殺傷性T細(xì)胞特異性清除含HBV多肽的靶細(xì)胞的結(jié)果。其中M1為用低濃度的碳氧熒光標(biāo)記物CFSE標(biāo)記的細(xì)胞，M2為加入了S371多肽的用高濃度的CFSE標(biāo)記的細(xì)胞，C-Mice為對照組的小鼠、I-Mice為免疫組的小鼠(實施例2的實驗組)，結(jié)果說明核酸疫苗誘導(dǎo)的特異性殺傷性T細(xì)胞特異性清除含HBV多肽的靶細(xì)胞。
圖5是本發(fā)明的HBV核酸疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞在體內(nèi)特異性識別HBV-表面蛋白DNA轉(zhuǎn)化細(xì)胞的結(jié)果，其中MEM+pGFP為對照組轉(zhuǎn)化細(xì)胞，MEM+pHBV-GFP為HBV表面蛋白DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(實施例2的實驗組)，結(jié)果說明核酸疫苗誘導(dǎo)的殺傷性T細(xì)胞特異性清除HBV表面蛋白轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
圖6是本發(fā)明的HBV核酸疫苗特異性誘導(dǎo)IFN-γ(γ-干擾素)的分泌的示意圖，圖中，C-peptide為對照多肽組，HBV-S371為乙肝疫苗S371多肽組(實施例2的實驗組)，結(jié)果顯示乙肝疫苗S371多肽組能特異性的誘導(dǎo)IFN-γ的分泌，而對照多肽組卻不能。
具體實施方式實施例1 T細(xì)胞抗原決定簇和B細(xì)胞抗原決定簇的篩選本發(fā)明是基于表位的疫苗設(shè)計(英文譯名為EPITOPE-BASED VACCINE DESIGN，EBVD)。首先篩選靶抗原，通過高分辨率的免疫識別研究獲得表位圖譜。以多種殺傷性T細(xì)胞實驗進(jìn)行功能篩選，選取具有較強免疫原性的一組表位的組合。輔以一定的旁側(cè)順序連接這些表位以保證在真核細(xì)胞中能加工分解成有效的多肽片段。通過化學(xué)合成的方法得到該分子。
本發(fā)明選用的抗原決定簇為Pre-S2 B細(xì)胞抗原決定簇S26-Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe(SEQ ID NO.2)殺傷性T細(xì)胞抗原決定簇1、核心抗原HBcAg殺傷性T細(xì)胞抗原決定簇C18-Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val(SEQ ID NO.3)2、表面抗原HBsAg殺傷性T細(xì)胞抗原決定簇①S183-Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile(SEQ ID NO.4)②S177-Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu(SEQ ID NO.5)③S348-Gly Lue Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser(SEQ ID NO.6)④S371-Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu(SEQ ID NO.7)以上抗原決定簇通過動物實驗表明，具有很強的免疫原性，設(shè)計的多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO.8，根據(jù)多肽的氨基酸序列，設(shè)計出其核苷酸序列為SEQ IDNO.9。
實施例2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建本實施例的構(gòu)建核酸疫苗的真核表達(dá)質(zhì)粒載體pVAX1購自于美國Invitrogene公司。本發(fā)明采用RT-PCR、酶切、連接、轉(zhuǎn)化和序列測定等分子生物學(xué)實驗方法，參考美國薩姆布魯克著《分子克隆》第二版。
1.目的基因的制備1)用化學(xué)合成法合成單鏈寡核苷酸片段，其序列為S1.
TTAAGCCACCATGGATAAGGCCAAGTTCGTGGCTGCCTGGACCCTGAAGGCTGCCGCTTTCCTGS2.
CCTAGCGATTTCTTTCCTAGCGTGAAGATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTATTAAAGTTCTTGTTGACAAG
S3.
AATCCTCACAATAAACTCAAACAATCCAGATTGGGACTTCAGAGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGS4.
ACAAGAATCCTCACAATACCGCAGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCATTATAAGAATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTTATTATTGA1.
AGCGGCAGCCTTCAGGGTCCAGGCAGCCACGAACTTGGCCTTATCCATGGTGGCA2.
AACAAGAACTTTAATAGAGGTAAAAAGGGACTCAAGATCTTCACGCTAGGAAAGAAATCGCTAGGCAGGAAA3.
AAAAACCCCGCCTGTAACACTCTGAAGTCCCAATCTGGATTGTTTGAGTTTATTGTGAGGATTCTTGTCA4.
AATTCATAATAGAGGTAAAAAGGGACTCAAGATTCTTATAACTGAAAGCCAAACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAACTGCGGTTATTGTGAGGATTCTTGTCAACAAG2)將上述四對兩條互補的寡核苷酸(S1+A1，S2+A2，S3+A3和S4+A4)按常規(guī)方法分別退火。然后將四種純化后的退火產(chǎn)物用T4 DNA連接酶(美國NEB公司產(chǎn)品)進(jìn)行連接，得到重組目的基因片段。
DNA連接反應(yīng)的組分包括退火后的DNA片段 14ul5×DNA連接酶緩沖液 4ulT4 DNA連接酶2ul混勻后，置37℃水浴1.5h(小時)，然后加入無水乙醇50ul(微升)，置-70℃中過夜，以最大離心力為12000g(重力加速度)離心15min(分鐘)，取沉淀，再加入預(yù)冷的70％乙醇200μl，混勻，同上法離心，取沉淀懸浮于20μl pH8.0的TE(10mmo/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0))緩沖液中。
2.真核表達(dá)質(zhì)粒載體pVAX1用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和AlfII消化(美國NEB公司產(chǎn)品)，消化產(chǎn)物與拼接產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并純化。然后將兩種純化的產(chǎn)物用T4 DNA連接酶(美國NEB公司產(chǎn)品)進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒。
DNA連接反應(yīng)的組分包括pVAX1/EcoRI+AlfII 1ul拼接產(chǎn)物 7ul10×DNA連接酶緩沖液 1ulT4 DNA連接酶 1ul3.重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及鑒定CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，具體實施方案為先將宿主菌加入5mlLB培養(yǎng)液(含1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％氯化鈉，pH7.0)中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.4時，4℃ 5000rpm(轉(zhuǎn)每分)離心，收集宿主菌；用40ml冰預(yù)制的100mmol/L(毫摩爾/升)的CaCl2溶液重懸，冰浴30分鐘；再以5000rpm的轉(zhuǎn)速4℃下離心，收集宿主菌；用1-2ml冰預(yù)冷的100mmol/L的CaCl2溶液重懸，制成感受態(tài)細(xì)胞備用。取200μl感受態(tài)細(xì)胞與2μl連接產(chǎn)物混勻后，冰浴30分鐘，42℃熱處理45秒，冰浴2分鐘，加入800μl的LB培養(yǎng)液，于37℃培養(yǎng)1小時，取200μl轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)12-16小時，篩選獲得重組質(zhì)粒pUV-3所在的細(xì)菌克隆。將該菌株擴增后，用經(jīng)典的堿裂解法抽提純化，可獲得重組質(zhì)粒pUV-3。對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和插入片段進(jìn)行序列分析，結(jié)果顯示經(jīng)純化后的DNA疫苗為3.2k左右大小，經(jīng)EcoRI和AlfII雙酶切后，為0.3及2.9k大小的兩條帶；測序結(jié)果與設(shè)計要求完全符合，表明PUV-3質(zhì)粒構(gòu)建成功(見圖2)。其DNA序列為SEQ ID NO.1。
4.發(fā)酵培養(yǎng)含有慢性乙型肝炎治療性DNA疫苗的工程菌用接種環(huán)將待培養(yǎng)細(xì)菌劃至含有卡那霉素的LB瓊脂平板上，于37℃培養(yǎng)過夜。從固體培養(yǎng)基中挑取單菌接種于5ml含有卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，于37℃空氣搖床中震蕩培養(yǎng)(250r/min)過夜；次日，將400ml含有卡那霉素的LB培養(yǎng)液放入2L的三角燒瓶中，加入1.2ml上述過夜菌，于37℃震蕩培養(yǎng)5-8h后作為種子液接種于發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入微量元素的溶液，發(fā)酵溫度37℃，pH值7.0，控制溶氧不低于30％，菌體OD值上升至平臺期后停止發(fā)酵(12-16h)。收獲培養(yǎng)液，離心收集菌體。
5.純化分離得到慢性乙型肝炎治療性DNA疫苗用Amersham Biosciences公司的PlasmidSelect進(jìn)行純化。堿裂解破菌后，先用Sepharose6 FF層析柱去除RNA，更換緩沖液。再用PlasimdSelect特異吸附超螺旋DNA(ccc).PlasimdSelect是一種以Sepharose 6FF為基架的凝膠，在Sepharose 6FF上共價結(jié)合2硫基嘧啶。這種凝膠在2M硫酸銨條件下，特異結(jié)合ccc，不與oc結(jié)合。從而提高ccc的純度。第三步采用Source 30Q層析柱去除內(nèi)毒素以及濃縮質(zhì)粒。
將經(jīng)濃縮的質(zhì)粒經(jīng)1×PBS(磷酸緩沖液)加工成注射用質(zhì)粒。
實施例3 抗原決定簇的免疫原性分析(見圖3)將S371多肽與C18多肽溶于PBS緩沖液中，使其濃度為1mg/ml。用加入0.5mg/ml聚肌胞作為佐劑的多肽免疫HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠三次，8-10周齡，每次50μg，隔兩周一次，末次注射后十天取小鼠脾細(xì)胞，通過體外4小時鉻釋放殺傷性實驗測定其免疫原性。實驗結(jié)果證實S371多肽組和C18多肽組免疫的小鼠T細(xì)胞能特異性的識別并殺傷帶有相應(yīng)多肽的靶細(xì)胞，而對照組多肽卻不能(見圖3)。
實施例4 核酸疫苗的免疫原性分析(見圖4和圖5)將實施例1的重組質(zhì)粒免疫HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠三次，8-10周齡，每次50μg，，隔兩周一次，末次注射后十天取小鼠脾細(xì)胞，通過酶標(biāo)分析檢測，體外4小時鉻釋放實驗和體內(nèi)CFSE(碳氧熒光)標(biāo)記殺傷性實驗測定其核酸疫苗的免疫原性。試驗結(jié)果證實核酸疫苗免疫的小鼠T細(xì)胞能特異性的識別并清除帶有HBV多肽以及被乙肝表面蛋白DNA轉(zhuǎn)化的靶細(xì)胞。將重組質(zhì)粒p-UV3免疫HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠，14天后取其脾細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞因子釋放實驗測定發(fā)現(xiàn)p-UV3能特意性的誘導(dǎo)IFN-γ的分泌(見圖6)。
實施例5 乙肝核酸疫苗的體外表達(dá)用高度特異性和靈敏性的實驗檢測轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒DNA的細(xì)胞在mRNA水平的表達(dá)，即用RT-PCR實驗定量轉(zhuǎn)染至HEK 293T細(xì)胞的質(zhì)粒DNA中的mRNA以測定質(zhì)粒DNA的表達(dá)產(chǎn)物。
先用轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)純化的PUV-3質(zhì)粒樣品至HEK 293T細(xì)胞中(ATCC)，48小時后停止轉(zhuǎn)染，收獲細(xì)胞。細(xì)胞溶解產(chǎn)物用Qiagen’s Oligotex mini-kit分離純化mRNA。用Superscript III反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)轉(zhuǎn)錄得到mRNA樣品。取10μg總RNA，于50μl體積中作反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄引物01ig-dT12-18.5μg/ml，dNTP 500mM，10,000U/ml M-MLV，37℃1小時，75℃15分鐘滅活翻轉(zhuǎn)錄酶，取1μl轉(zhuǎn)錄得到的cDNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作模板在50μl的體積中作PCR。引物序列如下上游引物(RT 5’)CGTTTAAACTTAAGCCAC和ATGGATAAGGCCAAGTTC下游引物(RT3’)AGAGGTAAAAAGGGACTCPCR反應(yīng)體系DEPC水39μl，10XPCR緩沖液條件5μl，MgCl21μl(50mM)，dNTP 10mM，1μl，上下游引物各1μl，taq DNA聚合酶1μl，共50μlPCR反應(yīng)條件cDNA 1μl 94℃-2min預(yù)變性，94℃-15sec；57℃-30sec；72℃-30sec循環(huán)31次；72℃-5min退火；4℃存放。
取10μl反應(yīng)樣品做電泳鑒定。
表1.多價抗原決定簇的乙肝核酸疫苗的轉(zhuǎn)然細(xì)胞的體外表達(dá)
以上結(jié)果表明，我們設(shè)計和構(gòu)建的核酸疫苗能有效地誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。由于疫苗含有B細(xì)胞抗原決定簇，該疫苗可產(chǎn)生中和性抗體，誘導(dǎo)一定的體液免疫。因此，它在臨床有重要的潛在應(yīng)用價值。
本發(fā)明的乙肝基因疫苗，具有以下特點1.以肌肉注射、皮內(nèi)注射等途徑接種核酸疫苗，是方便的免疫方法，能誘生抗HBV多個抗原的T細(xì)胞免疫應(yīng)答和中和抗體。
2.以合成的融合基因為基礎(chǔ)，再進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎?、改造，能對不同病程階段的乙型肝炎患者進(jìn)行針對性免疫治療。
3.以上免疫方法在預(yù)防HBV感染方面能超過目前的重組乙型肝炎疫苗，克服部分人群對重組乙型肝炎疫苗的無反應(yīng)和低反應(yīng)性，在這些人群有極大的應(yīng)用價值。
4.將HBV抗原融合基因進(jìn)行原核或真核表達(dá)，將純化的重組抗原作為重組疫苗，其免疫保護(hù)作用將超過目前已經(jīng)使用的重組乙型肝炎疫苗并能在慢性乙型肝炎患者誘導(dǎo)強的T細(xì)胞免疫應(yīng)答。
5.以在淋巴結(jié)附近注射的途徑接種核酸疫苗，是一種很有效的免疫方法，能高效地誘生抗HBV多個抗原的T細(xì)胞免疫應(yīng)答中和抗體本發(fā)明的乙肝核酸疫苗，可以用于制備乙肝預(yù)防、治療乙肝疫苗的制劑。如可以用于制備治療慢性乙型肝炎疫苗的制劑。
<110>珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司<120>一種乙肝核酸疫苗、其制備方法及其應(yīng)用<160>9<170>PatentIn Version 3.1<210>1<211>2955<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>
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<400>Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu15<210>8<211>94<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc-feature<400>
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<221>misc-feature<400>
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1.一種乙肝核酸疫苗，為采用藥學(xué)上可以接受的真核表達(dá)質(zhì)粒載體，選用編碼多個抗原決定簇的基因序列，構(gòu)建的多表位基因疫苗，其特征在于選用的抗原決定簇是SEQ ID NO.2～7。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乙肝核酸疫苗，其特征在于所說的編碼多個抗原決定簇的基因序列為SEQ ID NO.9。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乙肝核酸疫苗，其特征在于所說的真核表達(dá)質(zhì)粒載體為pVAX1，構(gòu)建的核酸疫苗為pUV-3，其基因序列為SEQ ID NO.1。
4.根據(jù)利要求1所述的乙肝核酸疫苗的制備方法，包括以下步驟1)選取多個抗原決定簇，設(shè)計出多價抗原決定簇多肽；2)用化學(xué)合成法合成單鏈寡核苷酸片段，和T4DNA連接酶連接，得到重組目的基因片段；3)用限制性內(nèi)切酶消化質(zhì)粒載體，消化產(chǎn)物與重組目的基因片段用連接酶連接；4)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，用發(fā)酵培養(yǎng)的方法，生產(chǎn)出含有DNA疫苗的工程菌；5)用商業(yè)化的層析柱通過親和層析的方法，分離純化4)中的細(xì)菌裂解液，得到濃縮的質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙肝核酸疫苗用于制備治療乙肝疫苗的制劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的乙肝核酸疫苗用于制備治療乙肝疫苗的制劑，其特征在于該疫苗用于制備治療慢性乙肝疫苗制劑。
全文摘要
一種乙肝核酸疫苗、其制備方法及其應(yīng)用，采用藥學(xué)上可以接受的真核表達(dá)質(zhì)粒載體，選用編碼多個T細(xì)胞抗原決定簇和B細(xì)胞抗原決定簇的基因序列，構(gòu)建多表位基因疫苗。本發(fā)明的乙肝核酸疫苗可用于制備預(yù)防、治療乙肝疫苗的制劑。
文檔編號A61K48/00GK1686565SQ200510033869
公開日2005年10月26日 申請日期2005年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月31日
發(fā)明者鄔世娟, 彭韙, 肖擁軍, 郭妍 申請人:珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司