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預(yù)防和治療pcv-2病毒的肽核酸及其制劑的制作方法

文檔序號(hào):3512663閱讀:530來源:國(guó)知局
專利名稱:預(yù)防和治療pcv-2病毒的肽核酸及其制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種預(yù)防和治療PCV-2病毒的肽核酸及其制劑。
背景技術(shù)
豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus, PCV)是由德國(guó)學(xué)者Tischer I等1974年首次由多株連續(xù)傳代的豬腎細(xì)胞系(PK-15)中分離得到,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,該病毒可以持續(xù)感染PK-15細(xì)胞,但不引起細(xì)胞病變,該病毒于1982年獲得命名。根據(jù)圓環(huán)病毒的致病性和核酸序列的不同,將PCV劃分為兩個(gè)型=PCV-1和PCV-2。目前認(rèn)為PCV-1不會(huì)引起疾病。豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)感染是近20年來發(fā)現(xiàn)的豬的一種新疾病,該病已經(jīng)在世界范圍內(nèi)廣泛流行,對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害日益被人們重視。PCV-2可造成豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合癥(Post-weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)、皮炎和腎病綜合癥(Porcinedermatitisand nephropathy syndrome, PDNS)、繁殖障石尋(Reproductive failure)>A2型先天性震顫(Congenital tremors)、豬呼吸道病復(fù)合征(Porcine respiratorydisease complex, PRDC)以及豬增生性壞死性間質(zhì)性肺炎(Porcine proliferative andnecrotizing pneumonias)等疾病。1991年Clark E G首次報(bào)道在加拿大豬場(chǎng)發(fā)生斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭征(Post-weaning multisystemic wating syndrome, PMWS),此后該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行,給養(yǎng)豬業(yè)帶來極大危害,尤其是引起發(fā)病豬群免疫抑制而倍受人們關(guān)注。我國(guó)由郎洪武等于2001年首次報(bào)道,從北京、河北的疑似PMWS的發(fā)病豬群中分離到PCV-2,王忠田等在對(duì)北 京、天津、廣東、深圳、山東、山西等地12個(gè)規(guī)?;B(yǎng)豬場(chǎng)進(jìn)行圓環(huán)病毒流行病學(xué)調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn),11個(gè)豬場(chǎng)有PMWS的發(fā)生,表明PCV-2的感染已在我國(guó)規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)普遍存在。PCV-2感染能造成豬的生長(zhǎng)緩慢,飼料報(bào)酬降低,同時(shí)侵害豬的免疫系統(tǒng),導(dǎo)致機(jī)體的免疫力下降,引起其他疾病的大爆發(fā),給世界各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成了嚴(yán)重威脅和巨大的經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)過各國(guó)研究人員幾十年的共同努力,基本清楚了 PCV-2的生物學(xué)特性、流行病學(xué)、感染的危害,但對(duì)其致病機(jī)制尚不清楚,同時(shí)如何防治PCV-2和研制PCV-2疫苗的成為當(dāng)前獸醫(yī)科研人員的研究熱點(diǎn)。PCV的分布極為廣泛,一般認(rèn)為,PCV的唯一宿主是豬。病豬和帶毒(隱性感染)豬是主要傳染源。病毒存在于感染豬的呼吸道、肺、脾和淋巴結(jié)中,主要從鼻液和糞便等廢物中排出病毒,感染公豬的精液被認(rèn)為是一種潛在的PCV-2病毒來源。PCV-2 —年四季均可發(fā)生,既可接觸感染、空氣傳播,也可經(jīng)胎盤垂直感染和通過口腔、呼吸道、鼻液、糞便等途徑水平傳播而感染不同年齡的豬群。育肥豬多表現(xiàn)為陰性感染,不表現(xiàn)臨床癥狀。少數(shù)懷孕母豬感染PCV后,可經(jīng)胎盤垂直感染給仔豬,造成仔豬先天性震顫或斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征。PCV常與PPV或豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)混合感染,造成許多附加癥狀,使疾病的診斷更趨于復(fù)雜化和多樣化。年齡在5 12周的仔豬感染后多表現(xiàn)為PMWS, 一般于斷奶后2 3天或I周開始發(fā)病,發(fā)病率20 % 60 %,病死率5 % 35 %。到目前為止,PCV-2引起各類疾病的發(fā)病機(jī)理尚不完全清楚,但許多研究證據(jù)表明,豬感染PCV-2可導(dǎo)致機(jī)體的免疫抑制,影響豬的免疫功能。PCV-2感染總是與淋巴器官的粒細(xì)胞炎性浸潤(rùn)有關(guān)。PCV-2感染豬體后在豬體內(nèi)增殖,導(dǎo)致感染豬發(fā)生一系列臨床和組織病理學(xué)變化,主要存在于淋巴組織、肺、肝和腎等組織器官中,使淋巴組織(淋巴結(jié)、胸腺、扁桃體和脾)、肺、肝和腎出現(xiàn)以細(xì)胞浸潤(rùn)為主要特征的炎性病理變化和淋巴細(xì)胞萎縮。McNeilly等(1996)通過研究PCV感染豬肺泡巨噬細(xì)胞體外免疫功能的影響,發(fā)現(xiàn)對(duì)FC和補(bǔ)體受體或者吞噬作用沒有影響。在感染4d后對(duì)MHC-1類抗原有上調(diào)作用,8d后降低了細(xì)胞對(duì)MHC-2類抗原的表達(dá)。Darwich等將豬血液樣品用抗凝劑作用后,再用植物血凝素(PHA)和超抗原葡萄球菌腸毒素B (SEB)作用,PCV-2感染豬形成炎癥反應(yīng)能力受損和細(xì)胞因子合成下降,即PCV-2感染豬淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞激活途徑存在缺陷。圓環(huán)病毒可以誘導(dǎo)淋巴系統(tǒng)中的B細(xì)胞凋亡,使患豬處于免疫抑制狀態(tài),這是導(dǎo)致混合感染和繼發(fā)感染的主導(dǎo)因素。Joagnin等認(rèn)為PCV-2的感染對(duì)免疫系統(tǒng)的效應(yīng)來講似乎是一把雙刃劍:一方面,PCV-2與其他病毒(如PRRSV和PPV)同時(shí)實(shí)驗(yàn)感染時(shí),這些病毒可以刺激和活化免疫系統(tǒng),增加了混合感染豬體內(nèi)的PCV-2的增殖;另一方面,嚴(yán)重的淋巴組織病損,包括淋巴細(xì)胞缺失和這些組織中免疫細(xì)胞亞群的其他變化,是嚴(yán)重發(fā)病豬的規(guī)律性特征,因此,PCV-2感染豬對(duì)其它免疫原不能產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答成為本病致病機(jī)制的重要原因。Krakowka等對(duì)I日齡患病豬進(jìn)行了試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)所有PCV-2和PPV混合感染豬都出現(xiàn)了 PMWS癥狀,在巨噬細(xì)胞中可檢測(cè)到PCV-2抗原,而PCV-2單獨(dú)感染豬不能復(fù)制出PMWS癥狀。PCV作為圓環(huán)病毒屬的代表種,無囊膜,單股環(huán)狀DNA,病毒粒子直徑為17 20nm,呈二十面體對(duì)稱。病毒粒子由衣殼蛋白和核酸組成,是迄今為止發(fā)現(xiàn)的一種最小的動(dòng)物病毒。在分類地位上屬圓環(huán)病毒科(Circoviridae)、圓環(huán)病毒屬(Circovirus)。PCV-1與PCV-2在核苷酸序列上約有76%的同源性。PCV-1基因組為1759bp,PCV-2基因組為1768bp或1767bp。PCV-1有7個(gè)ORFs,均編碼大于5ku的蛋白質(zhì)。PCV-2通常含有11個(gè)ORFs,預(yù)計(jì)分別編碼1.Sku 35.SKu的蛋白質(zhì),各閱讀框大小相差懸殊,且大部分ORF都有部分重疊,其中 0RF1、0RF5、0RF7 和 ORFlO 在正義鏈,0RF2、0RF3、0RF4、0RF6、0RF8、0RF9 和 ORFll位于負(fù)義鏈,這些基因表現(xiàn)為重疊基因,充分利用了病毒有限的遺傳物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn),病毒基因組由2個(gè)相對(duì)排列的ORF和其間的基因間隔組成,其中較大的ORFl經(jīng)病毒正向DNA轉(zhuǎn)錄,為Rep基因,有945個(gè)堿基,編碼314個(gè)氨基酸,大小為35.6ku,編碼病毒復(fù)制酶相關(guān)蛋白(Itep);較小的0RF2經(jīng)病毒DNA互補(bǔ)鏈轉(zhuǎn)錄,為Cap基因,含有705個(gè)堿基,編碼234個(gè)氨基酸,編碼大小約27.9ku的主要結(jié)構(gòu)蛋白或衣殼蛋白。該結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成病毒的核衣殼,其抗原性具有型特異性。PCV相同基因型不同毒株之間序列同源性大于90%,不同基因型毒株之間同源性為68% 79%。Rep蛋白由病毒的正向鏈轉(zhuǎn)錄而成的,是PCV基因中最大的閱讀框(ORFl)編碼而成,它編碼的復(fù)制酶蛋白在所有的圓環(huán)病毒中高度保守。Rep基因分別編碼R印(312個(gè)氨基酸,35.6ku)和R印’(168個(gè)氨基酸,19.2ku)。Rep蛋白和R印’蛋白是PCV病毒復(fù)制所必需的,Rep蛋白單獨(dú)不能啟動(dòng)病毒復(fù)制,必須與R印’蛋白共同作用才能啟動(dòng)PCV的復(fù)制。系統(tǒng)發(fā)生結(jié)果表明,圓環(huán)病毒Rep蛋白可能是通過在微粒病毒的Rep蛋白和小RNA病毒樣編碼的RNA結(jié)合蛋白或原核生物的螺旋酶重組作用而產(chǎn)生。PCV-2的Rep基因位于第51 995位核苷酸,含有945個(gè)堿基,編碼315個(gè)氨基酸,編碼病毒的復(fù)制相關(guān)蛋白R(shí)印。Rep 185位 211位氨基酸區(qū)域內(nèi)存在PCV-1和PCV-2共有表位。 PCV-1與PCV-2相比較,R印蛋白相對(duì)比較保守,氨基酸序列同源性達(dá)86 %,這也是兩種血清型PCV病毒產(chǎn)生抗原交叉性的主要原因所在。PCV-1R印蛋白僅有一個(gè)糖基化位點(diǎn),位于20 22aa(NpS) ;PCV2R印蛋白則含有 3 個(gè)糖基化位點(diǎn),23 25aa (NPS),256 258aa (NQT)及 286 288aa (NAT)。Rep 蛋白具有與典型滾環(huán)復(fù)制(RCR)相關(guān)的3個(gè)保守基序以及結(jié)合dNTps的P環(huán)(P-1oop)結(jié)構(gòu)(序列為G-GKs),這些結(jié)構(gòu)對(duì)于維持Rep蛋白的功能至關(guān)重要,突變或缺失均會(huì)影響病毒的復(fù)制,這也進(jìn)一步證明PCV病毒DNA進(jìn)行滾環(huán)式復(fù)制。 Cap蛋白即0RF2,分子量為27.8ku,位于DNA互補(bǔ)鏈上,編碼病毒衣殼蛋白,位于細(xì)胞核中,其N端富含精氨酸和堿性氨基酸,編碼234個(gè)氨基酸。該基因可能是在病毒感染細(xì)胞后由宿主所編碼的各種蛋白酶的參與下催化合成的中間產(chǎn)物,所編碼的蛋白是PCV-2囊膜的主要成分,目前對(duì)0RF2的研究已經(jīng)成為PCV-2研究的熱點(diǎn)。PCV-2與PCV-1的0RF2相似,其起始密碼子位于第1033位核苷酸或第1034位核苷酸,PCV-1和PCV-2的Cap基因都只有一個(gè)糖基化位點(diǎn),分別位于PCV-2Cap蛋白的143_145aa(NYS)及PCV-1的102-104aa(NYS)。Cap基因轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)位于第1238個(gè)核苷酸,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可連接ORFl的外顯子,第737位核苷酸為接翻譯的起始位點(diǎn)。Rep基因的啟動(dòng)子精確定位于第1353 1168位核苷酸,沒有發(fā)現(xiàn)PCV編碼蛋白對(duì)Cap基因轉(zhuǎn)錄具有調(diào)控作用。0RF2有702個(gè)堿基,分析PCV-1和PCV-2高免血清與病毒Cap蛋白的結(jié)合部位,結(jié)果表明PCV-1和PCV_2Cap蛋白169 183位氨基酸片段,能與PCV-1和PCV-2高免血清發(fā)生特異性結(jié)合;PCV_2Cap蛋白65 87位,113 139位和193 207位氨基酸片段,僅與PCV-2高免血清發(fā)生特異性結(jié)合,而與PCV-1高免血清不發(fā)生反應(yīng),兩種血清型的Cap蛋白雖然有共同的抗原決定簇,但沒有抗原交叉性。Cap蛋白169 183位氨基酸區(qū)域內(nèi),存在PCV-1和PCV-2共有表位;PCV2Cap蛋白65 87位,113 139位和193 207位氨基酸區(qū)域內(nèi),存在3個(gè)或3個(gè)以上PCV-2型特異性表位。Cap基因可能是造成病毒遺傳特性發(fā)生根本性改變的惟一基因,因而推測(cè)其與病毒致病性密切相關(guān),通過改變病毒的宿主嗜性及病毒蛋白與細(xì)胞蛋白因子的相互作用機(jī)制,而使病毒獲得不同的致病性。由于Cap蛋白具有以上特性,使其成為在分子水平上診斷PCV-2的最佳抗原,同時(shí)它在PCV-2血清學(xué)研究中發(fā)揮巨大的作用,成為PCV-2研究的熱點(diǎn)。反義核酸(antisense nucleic acid)是一段與祀基因(mRNA或DNA)的某段序列互補(bǔ)的天然存在或人工合成的核苷酸序列,反義核酸通過堿基配對(duì)方式特異性的與病毒靶基因結(jié)合形成雜交分子,從而在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá),或誘導(dǎo)RNase H識(shí)別并切割mRNA,進(jìn)而使其功能喪失。反義核酸包括反義RNA (antisense RNA)和反義DNA (antisense DNA),具有合成方便、序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、容易修飾、選擇性高、親和力強(qiáng)等特點(diǎn)。反義核酸作為一種新的抗病毒、抗腫瘤藥物,掀起了一場(chǎng)藥理學(xué)領(lǐng)域的革命,即新的藥物受體mRNA通過新受體結(jié)合方式(Watson-Crick雜交)、引發(fā)新的藥物受體結(jié)合后反應(yīng):(I)RNase H介導(dǎo)的祀RNA的降解;(2)抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后的加工和翻譯等。可以說反義寡核苷酸(ODNs)療法比傳統(tǒng)的藥物治療手段有更高的特異性。從二十世紀(jì)70年代末到現(xiàn)在,在這三十年的時(shí)間中,反義核酸藥物已走出實(shí)驗(yàn)室,進(jìn)入了實(shí)際臨床應(yīng)用。特別是第一個(gè)反義核酸藥物Fomivirsen通過FDA批準(zhǔn)上市后,人們對(duì)反義療法尤為關(guān)注。反義核酸作用原理基于堿基配對(duì)原則,可通過與靶RNA進(jìn)行堿基配對(duì)結(jié)合的方式參與對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控。其作用方式可能有:①反義RNA與病毒mRNA結(jié)合形成互補(bǔ)雙鏈阻斷核糖體與病毒mRNA的結(jié)合,從而抑制了病毒mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的過程。②反義DNA能與祀基因形成一種三鏈核酸(triple helix nucleic acid),它通過作用于控制基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄子、增強(qiáng)子和啟動(dòng)子區(qū),對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控。③反義核酸與病毒mRNA的結(jié)合可阻擋mRNA向細(xì)胞質(zhì)的運(yùn)輸。④反義核酸與病毒mRNA結(jié)合后使得mRNA更加易被核酸酶識(shí)別降解,從而大大縮短mRNA的半衰期。上述四種作用途徑都可表現(xiàn)為對(duì)病毒基因表達(dá)的抑制或調(diào)控,且這種調(diào)控是高度特異性的。反義核酸是通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的原理來識(shí)別所打靶的基因,從理論來分析,研究人員以動(dòng)物細(xì)胞為例,其染色體大約有幾十億對(duì)堿基,如果4個(gè)堿基(A、G、C和T)的數(shù)目大致相同,并在整個(gè)基因中隨機(jī)分布,那么按照統(tǒng)計(jì)學(xué)原理,大于17個(gè)堿基的反義核酸與非靶基因雜交的可能性不大,所以長(zhǎng)度超過17個(gè)堿基的反義核酸分子與靶基因的結(jié)合可以說是唯一的,從而使反義核酸具有高度的特異性。研究表明,在細(xì)胞內(nèi)部一個(gè)拷貝的基因會(huì)產(chǎn)生200-300條mRNA,翻譯出10萬個(gè)具有生物活性的蛋白質(zhì)分子。傳統(tǒng)藥物主要作用于有生物功能的蛋白分子的某結(jié)構(gòu)域上的幾個(gè)作用位點(diǎn),事實(shí)上蛋白的結(jié)構(gòu)是非常復(fù)雜的,且在生物體內(nèi),活性蛋白的空間結(jié)構(gòu)又是千變?nèi)f化的,以傳統(tǒng)藥物有限的幾種作用位點(diǎn)來控制靶分子的動(dòng)態(tài)的和整體的功能很難達(dá)到理想的效果,因而不難看出傳統(tǒng)藥物的局限性。由mRNA可翻譯出幾十到幾百個(gè)蛋白,反義核酸在mRNA水平對(duì)靶基因直接進(jìn)行調(diào)控,這個(gè)步驟相當(dāng)于將傳統(tǒng)藥物作用放大了數(shù)十到數(shù)百倍,可見反義核酸的調(diào)控是極其經(jīng)濟(jì)合理的。毒理學(xué)研究表明,反義核酸在體內(nèi)具有很低的毒性,盡管其在生物體內(nèi)的存留時(shí)間有長(zhǎng)有短,但最終都將被降解消除,這避免了如轉(zhuǎn)基因療法中外源基因整合到宿主染色體上的危險(xiǎn)性。與傳統(tǒng)藥物相比,反義核酸藥物具有特異性強(qiáng),效率高和毒副作用低等優(yōu)點(diǎn),在抑制腫瘤生長(zhǎng)和抗病毒復(fù)制等方面顯現(xiàn)出了良好的應(yīng)用價(jià)值。目前已有多個(gè)藥物進(jìn)入美國(guó)和歐洲市場(chǎng),另還有30多種反義`核酸藥物正在進(jìn)行臨床前期的研究或開發(fā)后進(jìn)入了 1、II和III期實(shí)驗(yàn)。由于動(dòng)物體內(nèi)存在大量的核酸外切酶,反義核酸若不經(jīng)過化學(xué)修飾,很快就被降解,失去活性。目前對(duì)反義核酸的化學(xué)修飾有很多方法,常見的有硫代修飾反義核酸及2’-甲氧基修飾反義核酸等。且目前硫代修飾藥物的研究最為全面,它可有效抵抗核酸酶的降解,同時(shí)可促進(jìn)核酸酶Rase H的活性,目前這種修飾方法已成功用于臨床的反義核酸藥物。但這些還只是第一代反義核酸的修飾方法,隨著技術(shù)的發(fā)展與進(jìn)步,新的修飾途徑與方法被開發(fā)出來,使得反義核酸的研究進(jìn)入了第二、三代,其中肽核酸的修飾最為引人關(guān)注。肽核酸(peptidenucleic acids,PNAs),是一種以中性酰胺鍵為骨架的全新的DNA類似物,可序列特異的靶向作用于DNA的大溝槽,其骨架的結(jié)構(gòu)單元為N(2-氨基乙基)-甘氨酸,堿基部分通過亞甲基羰基連接于主骨架的氨基N上。為反義核酸的第二代產(chǎn)品。PCV-2是目前嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重要病原之一。PCV2不僅可造成豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合癥、皮炎和腎病綜合癥、繁殖障礙等諸多類型的疾病,該病毒還能導(dǎo)致免疫抑制,引起繼發(fā)感染,嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展。到目前為止,對(duì)該病還沒有理想的防控措施,開發(fā)預(yù)防和治療PCV2感染的新手段顯得尤為迫切,但PCV2在細(xì)胞中增殖不引起細(xì)胞病變,感染后會(huì)弓I起免疫抑制,疫苗研究至今沒有根本性突破。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具備高水平的生物利用度、穩(wěn)定理化性能及高效安全的療效的用于預(yù)防和治療PCV-2病毒的肽核酸及其制劑。本發(fā)明所提供的肽核酸,由序列I和序列3或序列1、序列2、序列5和序列6所示的肽核酸組成;序列1:5,-AGATCTAGGAGCTCCACATTCGATC-3,;序列2:5,-TAGACAGGTCACTCCGTTGTCCTTG-3,;序列3:5,-TACATTGGTCTTCCAATCACGCTTC-3,;序列4:5,-TTGATAGTATATCCGAAGGTGCGGG-3,;序列5:5,-AATAGTGGAATCTAGGACAGGTTTG-3,;序列6:5’ -TGTAGTCTCAGCCAGAGCTGATTTC-3’。其中,所述肽核酸經(jīng)過咪唑丙烯酸殼聚糖化學(xué)修飾。本發(fā)明所提供的另一種肽核酸,由序列5和序列6所示的肽核酸組成;序列5:5,-AATAGTGGAATCTAGGACAGGTTTG-3,;序列6:5,-TGTAGTCTCAGCCAGAGCTGATTTC-3,。其中,所述肽核酸經(jīng)過咪唑丙烯酸殼聚糖化學(xué)修飾。本發(fā)明的肽核酸可以制成肽核酸制劑:1、采用控釋制藥工藝將經(jīng)修飾過的肽核酸制備成結(jié)腸溶控釋微丸制劑;2、采用冷凍干燥制藥工藝將經(jīng)修飾過的肽核酸制備成注射用凍干制劑;3、采用凍干后再制粒工藝將經(jīng)修飾過的肽核酸制備成口服用水溶性顆粒劑。肽核酸制劑穩(wěn)定性分析高溫:流通蒸汽高溫105°C,20分鐘滅菌不影響其生物活性。極端溫度:50°C存放6個(gè)月不影響其生物活性。室溫:存放24個(gè)月不影響其生物活性。低溫:-20°C存放48個(gè)月不影響其生物活性。本發(fā)明針對(duì)PCV-2的Rep和Cap兩種主要蛋白基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)的病毒特異性的反義寡核苷酸序列,合成肽核酸以及用殼聚糖進(jìn)行修飾,使其具備高水平的生物利用度、穩(wěn)定理化性能及高效安全的療效。
具體實(shí)施例方式主要材料與試劑病毒 毒株P(guān)CV-2毒株:WS01株,毒價(jià)為105.20TCID50,由楠森獸醫(yī)診斷技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室提供。細(xì)胞株Dulac細(xì)胞,楠森獸醫(yī)診斷技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室提供。實(shí)施例1針對(duì)PCV-2的肽核酸體外抗病毒效果分析從GenBank數(shù)據(jù)庫檢索出PCV-2的基因組,用生物學(xué)軟件進(jìn)行序列分析,綜合考慮序列的保守性,G+C%含量,堿基分布特點(diǎn),然后從中挑選出合適的區(qū)域設(shè)計(jì)反義核酸,然后根據(jù)反義核苷酸合成肽核酸。采用肽核酸的合成工藝進(jìn)行肽核酸的人工合成。Rep-ι:5,-AGATCTAGGAGCTCCACATTCGATC-3’Rep-2:5, -TAGACAGGTCACTCCGTTGTCCTTG-3,Rep-3:5’ -TACATTGGTCTTCCAATCACGCTTC-3’Cap-1:5’ -TTGATAGTATATCCGAAGGTGCGGG-3’Cap-2:5, -AATAGTGGAATCTAGGACAGGTTTG-3’Cap-3:5’ -TGTAGTCTCAGCCAGAGCTGATTTC-3’1.1以不同濃度分析它們抗病毒效果取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Dulac細(xì)胞,用胰酶消化后,鋪板于24孔細(xì)胞板中,0.5mL/孔(2.0X105個(gè)細(xì)胞),5% C02 37°C條件下培養(yǎng)24h后吸去培養(yǎng)液,加入0.1mL的105TCID50PCV-2 WSOl株感染上述細(xì)胞,感染后24h,每孔加入300 μ I待篩選藥物,以完全培養(yǎng)基作稀釋液,肽濃度(0.05 μ Μ, 0.1 μ Μ, 0.2 μ Μ, 0.4 μ Μ, 0.8 μ Μ, 1.6 μ Μ),每個(gè)藥物梯度設(shè)4個(gè)平行孔。加藥處理24h后收集上清和細(xì)胞,運(yùn)用TaqMan探針Real-time PCR法定量檢測(cè)各處理組中PCV2病毒拷貝數(shù)。同時(shí)設(shè)病毒感染陽性對(duì)照組,空白對(duì)照組,細(xì)胞陰性對(duì)照組。本發(fā)明參考Chung等提供的引物,采用real-time PCR定量檢測(cè)PCV2。弓丨物PCV2-1: 5' -TAGGTTAGGGCTGT-GGCCTTA-3'弓丨物PCV2-2: 5' -TTCTCCCGCACTTTCGGATAT-3'探針PCV2probe:5' -ATCTCATCATGTCCACCGCCCAGGA-3' -fluorescin以下述公式來計(jì)算不同的肽核酸對(duì)PCV-2病毒復(fù)制產(chǎn)生的抑制率。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防和治療PCV-2病毒的肽核酸,由序列I和序列3或序列1、序列2、序列5和序列6所示的肽核酸組成;序列 1:5’ -AGATCTAGGAGCTCCACATTCGATC-3’ ;序列 2:5,-TAGACAGGTCACTCCGTTGTCCTTG-3,;序列 3:5,-TACATTGGTCTTCCAATCACGCTTC-3,;序列 4:5’ -TTGATAGTATATCCGAAGGTGCGGG-3’ ;序列 5:5’ -AATAGTGGAATCTAGGACAGGTTTG-3’ ;序列 6:5’ -TGTAGTCTCAGCCAGAGCTGAITTC-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽核酸,其特征在于:所述肽核酸經(jīng)過咪唑丙烯酸殼聚糖化學(xué)修飾。
3.一種預(yù)防和治療PCV-2病毒的肽核酸,由序列5和序列6所示的肽核酸組成;序列 5:5’ -AATAGTGGAATCTAGGACAGGTTTG-3’ ;序列 6:5’ -TGTAGTCTCAGCCAGAGCTGATTTC-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的肽核酸,其特征在于:所述肽核酸經(jīng)過咪唑丙烯酸殼聚糖化學(xué)修飾。
5.一種預(yù)防和治療PCV-2病毒的肽核酸制劑,其活性成分為權(quán)利要求1-4任一所述的肽核酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的肽核酸制劑, 其特征在于:還包含可藥用載體或賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種預(yù)防和治療PCV-2病毒的肽核酸,由序列1和序列3或序列1、序列2、序列5和序列6所示的肽核酸組成;或由序列5和序列6所示的肽核酸組成。本發(fā)明還公開了含有所述肽核酸的肽核酸制劑。本發(fā)明針對(duì)PCV-2的Rep和Cap兩種主要蛋白基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)的病毒特異性的反義寡核苷酸序列,合成肽核酸以及用殼聚糖進(jìn)行修飾,使其具備高水平的生物利用度、穩(wěn)定理化性能及高效安全的療效。
文檔編號(hào)C07K14/00GK103102397SQ20111035182
公開日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2011年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月9日
發(fā)明者韓健寶 申請(qǐng)人:韓健寶
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