用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的電化學(xué)微流控器件的制備及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的電化學(xué)微流控器件的制備及其應(yīng)用。在印刷電極上直接構(gòu)建微流控電化學(xué)傳感器件，包含兩層PDMS芯片，上層的微通道以滿足各種樣品的充分混勻，下層微通道區(qū)域則是反應(yīng)區(qū)和檢測(cè)區(qū)；將溫控元件整合到上述器件上；對(duì)電極表面進(jìn)行功能化修飾，針對(duì)乙肝病毒核酸設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，將電化學(xué)報(bào)告分子修飾到引物上，將標(biāo)記好的引物與待檢測(cè)核酸混勻，注入到微流控芯片內(nèi)，控制合適溫度，對(duì)待測(cè)核酸樣品進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。被標(biāo)記的引物在擴(kuò)增的同時(shí)通過(guò)堿基配對(duì)作用結(jié)合到電極表面。對(duì)電化學(xué)報(bào)告分子檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒的檢測(cè)。本發(fā)明微型化，成本低，便攜，可實(shí)現(xiàn)快速、高靈敏檢測(cè)，方便用于野外和家庭診斷。
【專利說(shuō)明】用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的電化學(xué)微流控器件的制備及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種微流控器件，具體地說(shuō)，涉及一種用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的電化學(xué)微流控器件的制備方法及其在醫(yī)學(xué)檢測(cè)方面的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]微流控器件是把化學(xué)和生物等領(lǐng)域中所涉及的樣品轉(zhuǎn)移、分離和純化處理等基本操作單元集成或基本集成到一塊幾平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成網(wǎng)絡(luò)，以可控流體貫穿整個(gè)系統(tǒng)，用以取代常規(guī)化學(xué)或生物實(shí)驗(yàn)室的各種功能的一種技術(shù)平臺(tái)，由于低消耗、高通量和微型化的優(yōu)勢(shì)，該技術(shù)在臨床、診斷、藥物、毒理等研究方面具有很大的應(yīng)用潛力。
[0003]電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)具有高靈敏度，高特異性，成本低，便攜，微型化等特點(diǎn)，而且電化學(xué)檢測(cè)易的整合到微流控器件上，與傳統(tǒng)的分析平臺(tái)相比，如質(zhì)譜、光學(xué)檢測(cè)等相比，具有很大優(yōu)勢(shì)。電化學(xué)微流控器件這些優(yōu)越的性能將使其在生物醫(yī)學(xué)體外診斷上展示了巨大應(yīng)用價(jià)值。
[0004]目前傳統(tǒng)的微流控電化學(xué)90(:1(即使診斷)器件是采用復(fù)雜的磁控濺射技術(shù)、甩膠光刻技術(shù)、離子束刻蝕技術(shù)、濕法刻蝕技術(shù)等，在玻璃基質(zhì)上完成微型電極制備，通常為單層？013芯片長(zhǎng)方形管道設(shè)計(jì)；在三電極體系中，若工作電極、參比電極、對(duì)電極采用的材質(zhì)不同，其電極制備工藝將更加復(fù)雜。整個(gè)加工制備過(guò)程都需要在凈化間內(nèi)完成，成本高，另外由于制備過(guò)程涉及環(huán)節(jié)多，且每個(gè)環(huán)節(jié)參數(shù)設(shè)置很多，對(duì)技術(shù)操作人員要求非常高，因此很難保證不同批次產(chǎn)品的重復(fù)性。同時(shí)，采用這種方式難以實(shí)現(xiàn)大批量規(guī)?；a(chǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種簡(jiǎn)單，快速，低成本，高靈敏度，具有普適性的，溫度可控的用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的電化學(xué)微流控器件的制備，并將該電化學(xué)微流控器件應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)，如耶V、??！”、肺結(jié)核病毒等，以及野外和家庭診斷。
[0006]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0007]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的電化學(xué)微流控器件的制備方法，包括如下步驟:
[0008]第一步，設(shè)計(jì)所需要的微流控管道圖形，制繪掩模板，根據(jù)掩模板制備兩層帶有不同微流控管道的聚二甲基硅氧烷芯片，再將兩層聚二甲基硅氧烷芯片與印刷電極鍵合；
[0009]第二步，對(duì)電化學(xué)微流控器件中的印刷電極表面進(jìn)行功能化修飾，通過(guò)共價(jià)鍵法，將核酸捕獲探針固定到印刷電極表面；
[0010]第三步，將用于注入待檢測(cè)反應(yīng)物的進(jìn)樣通道連通至聚二甲基硅氧烷芯片位置，將用于進(jìn)行反應(yīng)物檢測(cè)的電化學(xué)傳感元件結(jié)合到印刷電極的工作區(qū)域，進(jìn)而得到電化學(xué)微流控器件。
[0011]優(yōu)選地，在第一步和第二步之間還包括如下步驟:在電化學(xué)微流控器件上結(jié)合微型溫控裝置。
[0012]優(yōu)選地，所述第一步中，兩層帶有不同微流控管道的聚二甲基硅氧烷芯片分別為上層聚二甲基硅氧烷芯片和下層聚二甲基硅氧烷芯片，其中，上層聚二甲基硅氧烷芯片上的微流控通道為蛇形通道，下層聚二甲基硅氧烷芯片上的微流控通道為橢圓形通道。
[0013]優(yōu)選地，所述第二步中，對(duì)印刷電極的功能化修飾，是以聚苯胺為反應(yīng)物，進(jìn)行電聚合，在印刷電極表面引入用于鍵和的氨基-NH2，再通過(guò)戊二醛將合成的捕獲探針共價(jià)修飾到印刷電極上。
[0014]優(yōu)選地，所述第三步中，進(jìn)樣通道為三條。
[0015]優(yōu)選地，所述微型溫控裝置包括溫控加熱元件和微型溫度傳感芯片，其中，所述溫控加熱元件通過(guò)微加工技術(shù)將鎳、鉻濺射到玻璃基底上，然后將溫控加熱元件與電化學(xué)微流控器件結(jié)合，最后在電化學(xué)微流控器件的印刷電極上插入微型溫度傳感芯片。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種按照上述用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的電化學(xué)微流控器件的制備方法制備得到的電化學(xué)微流控器件在檢測(cè)人血清中乙肝病毒、人類免疫缺陷病毒、肺結(jié)核病毒中的應(yīng)用。
[0017]優(yōu)選地，所述的用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的電化學(xué)微流控器件的制備方法制備得到的電化學(xué)微流控器件在檢測(cè)人血清中乙肝病毒的應(yīng)用，包括如下步驟:
[0018]步驟1，通過(guò)戊二醛將乙肝病毒捕獲探針固定到電化學(xué)微流控器件印刷電極的工作區(qū)域；設(shè)計(jì)針對(duì)乙肝病毒的引物，然后將電化學(xué)報(bào)告分子標(biāo)記到該引物上；
[0019]步驟2，以5?10 μ L/min的速度分別向進(jìn)樣通道注射18 μ L LAMP反應(yīng)液、I μ L鏈置換DNA聚合酶、I μ L標(biāo)記好的引物、I μ L乙肝病毒模板、若干μ L無(wú)核酸酶H2O,總反應(yīng)物體積25 μ L ;
[0020]步驟3，總反應(yīng)物在65°C條件下保溫60min，進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增；然后在80°C、1min的條件下滅活鏈置換DNA聚合酶；被標(biāo)記的引物在等溫?cái)U(kuò)增的同時(shí)通過(guò)堿基配對(duì)作用結(jié)合到印刷電極表面；
[0021]步驟4，采用磷酸鹽緩沖液洗滌電化學(xué)微流控器件下層聚二甲基硅氧烷芯片的橢圓形管道區(qū)域，以洗去滅活的鏈置換DNA聚合酶；
[0022]步驟5，再注入25 μ L含有氫醌和雙氧水的磷酸鹽緩沖液的混合溶液,采用庫(kù)倫安倍法在-0.3?4mV的恒電位下通過(guò)電化學(xué)傳感元件對(duì)電化學(xué)報(bào)告分子進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而檢測(cè)乙肝病毒。
[0023]優(yōu)選地，每組平行測(cè)定八次。
[0024]優(yōu)選地，所述的用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的電化學(xué)微流控器件的制備方法制備得到的電化學(xué)微流控器件在檢測(cè)人血清中人類免疫缺陷病毒的應(yīng)用，包括如下步驟:
[0025]步驟一，通過(guò)戊二醛將人類免疫缺陷病毒捕獲探針固定到電化學(xué)微流控器件印刷電極的工作區(qū)域；設(shè)計(jì)針對(duì)人類免疫缺陷病毒的引物，然后將電化學(xué)報(bào)告分子標(biāo)記到該引物上；
[0026]步驟二,通過(guò)注射泵以5?10 μ L/min的速度分別注射18 μ LLAMP (核酸環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增)反應(yīng)液、I μ L鏈置換DNA聚合酶、I μ L引物、I μ L人類免疫缺陷病毒模板、若干無(wú)核酸酶H2O,總反應(yīng)物體積25 μ L ;
[0027]步驟三，總反應(yīng)物在65°C條件下保溫60min，進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增；然后在80°C、1min的條件下滅活鏈置換0嫩聚合酶；被標(biāo)記的引物在等溫?cái)U(kuò)增的同時(shí)通過(guò)堿基配對(duì)作用結(jié)合到印刷電極表面；
[0028]步驟四，采用磷酸鹽緩沖液洗滌電化學(xué)微流控器件下層聚二甲基硅氧烷芯片的橢圓形管道區(qū)域，以洗去滅活的鏈置換0嫩聚合酶；
[0029]步驟五，再注入25 9 I含有氫醌和雙氧水的磷酸鹽緩沖液的混合溶液，采用庫(kù)倫安倍法在-0.3?4！^的恒電位下通過(guò)電化學(xué)傳感元件對(duì)電化學(xué)報(bào)告分子進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而檢測(cè)人類免疫缺陷病毒。
[0030]優(yōu)選地，每組平行測(cè)定八次。
[0031]優(yōu)選地，所述的用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的電化學(xué)微流控器件的制備方法制備得到的電化學(xué)微流控器件在檢測(cè)人血清中肺結(jié)核病毒的應(yīng)用，包括如下步驟:
[0032]步驟I，通過(guò)戊二醛將肺結(jié)核病毒捕獲探針固定到電化學(xué)微流控器件印刷電極的工作區(qū)域；設(shè)計(jì)針對(duì)肺結(jié)核病毒的引物，然后將電化學(xué)報(bào)告分子標(biāo)記到該引物上；
[0033]步驟II，通過(guò)注射泵以5?10 9 1/111111的速度分別注射18 9 1^1？反應(yīng)液、1 9 I鏈置換0嫩聚合酶、引物、[肺結(jié)核病毒模板、若干無(wú)核酸酶!120，總反應(yīng)物體積25 1^ I ；
[0034]步驟III，總反應(yīng)物在651條件下保溫60-11,進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增；然后在801100111的條件下滅活鏈置換0嫩聚合酶；被標(biāo)記的引物在等溫?cái)U(kuò)增的同時(shí)通過(guò)堿基配對(duì)作用結(jié)合到印刷電極表面；
[0035]步驟IV，采用磷酸鹽緩沖液洗滌電化學(xué)微流控器件下層聚二甲基硅氧烷芯片的橢圓形管道區(qū)域，以洗去滅活的鏈置換0嫩聚合酶；
[0036]步驟V，再注入25 “含有氫醌和雙氧水的磷酸鹽緩沖液的混合溶液，采用庫(kù)倫安倍法在-0.3?4！^的恒電位下通過(guò)電化學(xué)傳感元件對(duì)電化學(xué)報(bào)告分子進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而檢測(cè)肺結(jié)核病毒。
[0037]優(yōu)選地，每組平行測(cè)定八次。
[0038]上述電化學(xué)報(bào)告分子即能夠產(chǎn)生電化學(xué)響應(yīng)的物質(zhì)，如二茂鐵、三聯(lián)吡啶釕等。
[0039]本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單，快速，低成本，便攜式，通用性的電化學(xué)微流控器件的制備方法。本發(fā)明的獨(dú)特之處之一在于，設(shè)計(jì)了兩層？013芯片，上層用于混合樣品，下層用于核酸等溫?cái)U(kuò)增和檢測(cè)，有效減少了樣品使用量，節(jié)約了成本。然后將兩層芯片與標(biāo)準(zhǔn)化印刷電極直接鍵合，從而構(gòu)建一種新型的電化學(xué)微流控器件。最后，將微型溫控裝置以及微型溫度傳感器與上述器件整合，即得最終產(chǎn)品。該器件能夠?qū)ι镆簶?，如血清，尿液等各種樣品分析物進(jìn)行超靈敏檢測(cè)，以檢測(cè)人血清中乙肝病毒的“即為例，采用庫(kù)倫安倍法對(duì)耶乂檢測(cè)，具有超高的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性，高于其他電化學(xué)檢測(cè)器件，而且該器件易操作，能夠?qū)悠返幕旌希磻?yīng)，檢測(cè)等功能整合到一起。
[0040]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果:
[0041]1、重量輕，可便攜，多功用；
[0042]2、價(jià)格低廉；
[0043]3、超高靈敏度和精確度；
[0044]4、易操作，無(wú)需專業(yè)人員和復(fù)雜的儀器設(shè)備；
[0045]5、可在野外和家庭診斷；
[0046]6、該器件制備工藝簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，大規(guī)模生產(chǎn)；
[0047]7、本發(fā)明一方面可以很方便的控制核酸擴(kuò)增所需溫度，另一方面，針對(duì)現(xiàn)有的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)一般是通過(guò)肉眼觀察顏色變化來(lái)判斷擴(kuò)增結(jié)果，并不十分精確的問(wèn)題，提出將核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與電化學(xué)檢測(cè)相結(jié)合，極大地提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0048]通過(guò)閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯:
[0049]圖1為本發(fā)明采用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)CAD程序設(shè)計(jì)微流控管道繪制掩模板，其中，(a)為下層掩模板，(b)為上層掩模板；
[0050]圖2為本發(fā)明電化學(xué)微流控器件結(jié)構(gòu)示意圖；
[0051]圖3為本發(fā)明電化學(xué)微流控器件加工制備示意圖；
[0052]圖4(a)和圖4(b)分別為本發(fā)明采用庫(kù)倫安培法檢測(cè)在血清中檢測(cè)不同濃度HBV抗原譜圖以及在血清中檢測(cè)不同濃度HBV抗原的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0053]下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明:本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0054]實(shí)施例1
[0055]本實(shí)施例提供了一種用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的電化學(xué)微流控器件的制備方法，包括如下步驟:
[0056]第一步，設(shè)計(jì)所需要的微流控管道圖形，制繪掩模板，根據(jù)掩模板制備兩層帶有不同微流控管道的聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片，再將兩層聚二甲基硅氧烷芯片與印刷電極鍵合，進(jìn)而得到電化學(xué)微流控器件；
[0057]第二步，對(duì)電化學(xué)微流控器件中的印刷電極表面進(jìn)行功能化修飾，通過(guò)共價(jià)鍵法，將核酸捕獲探針固定到印刷電極表面；
[0058]第三步，將用于注入待檢測(cè)反應(yīng)物的進(jìn)樣通道連通至聚二甲基硅氧烷芯片位置，將用于進(jìn)行反應(yīng)物檢測(cè)的電化學(xué)傳感元件結(jié)合到印刷電極的工作區(qū)域，進(jìn)而得到電化學(xué)微流控器件。
[0059]進(jìn)一步地，在第一步和第二步之間還包括如下步驟:在電化學(xué)微流控器件上結(jié)合微型溫控裝置。
[0060]進(jìn)一步地，所述第一步中，兩層帶有不同微流控管道的聚二甲基硅氧烷芯片分別為上層聚二甲基硅氧烷芯片和下層聚二甲基硅氧烷芯片，其中，上層聚二甲基硅氧烷芯片上的微流控通道為蛇形通道，下層聚二甲基硅氧烷芯片上的微流控通道為橢圓形通道。
[0061]進(jìn)一步地，所述第二步中，對(duì)印刷電極的功能化修飾，是以聚苯胺為反應(yīng)物，進(jìn)行電聚合，在印刷電極表面引入用于鍵和的氨基-NH2，再通過(guò)戊二醛將合成的捕獲探針共價(jià)修飾到印刷電極上。
[0062]進(jìn)一步地，所述第三步中，進(jìn)樣通道為三條。
[0063]進(jìn)一步地，所述微型溫控裝置包括溫控加熱元件和微型溫度傳感芯片，其中，所述溫控加熱元件通過(guò)微加工技術(shù)將鎳、鉻濺射到玻璃基底上，然后將溫控加熱元件與電化學(xué)微流控器件結(jié)合，最后在電化學(xué)微流控器件的印刷電極上插入微型溫度傳感芯片。
[0064]本實(shí)施例的工作過(guò)程為:
[0065]設(shè)計(jì)針對(duì)待檢測(cè)核酸的引物，然后將電化學(xué)報(bào)告分子標(biāo)記到該引物上，再將標(biāo)記好的引物、待檢測(cè)核酸以及其他試劑(“即反應(yīng)液、鏈置換0嫩聚合酶和無(wú)核酸酶水混合溶液)通過(guò)三個(gè)孔道分別注入到電化學(xué)微流控器件內(nèi)，控制合適溫度，對(duì)待測(cè)核酸樣品進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增；被標(biāo)記的引物在等溫?cái)U(kuò)增的同時(shí)通過(guò)堿基配對(duì)作用結(jié)合到印刷電極表面；通過(guò)電化學(xué)傳感元件對(duì)電化學(xué)報(bào)告分子進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的檢測(cè)。
[0066]針對(duì)待檢測(cè)核酸的引物同時(shí)用于核酸等溫?cái)U(kuò)增。
[0067]電化學(xué)報(bào)告分子即能夠產(chǎn)生電化學(xué)響應(yīng)的物質(zhì)，如二茂鐵、三聯(lián)吡啶釕等。
[0068]下面結(jié)合附圖對(duì)本實(shí)施例作進(jìn)一步描述。
[0069]如圖2所示，為本實(shí)施例提供的用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的電化學(xué)微流控器件的制備方法制備得到的電化學(xué)微流控器件結(jié)構(gòu)示意圖，其中:1為第一進(jìn)樣口 ；2為第二進(jìn)樣口 ；3為第三進(jìn)樣口 ；4為上層微流控？01似芯片和下層微流控？013芯片對(duì)準(zhǔn)接口 ；5為上層微流控？013芯片；6為下層微流控？013芯片；7為印刷電極；8為微型溫度傳感芯片；9為微型溫控元件；10為…8接口(連接計(jì)算機(jī)系統(tǒng))；11為樣品出口。
[0070]本實(shí)施例具體為:
[0071]用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的電化學(xué)微流控器件的制備方法，具體步驟如下:
[0072]第一步，采用計(jì)算機(jī)輔助軟件設(shè)計(jì)蛇形和橢圓形微流控管道，繪制掩模板，利用標(biāo)準(zhǔn)的軟光刻技術(shù)加工微流控芯片，先將上層蛇形管道的？013芯片與下層橢圓形管道的？013芯片鍵合，然后與經(jīng)過(guò)表現(xiàn)處理的印刷電極鍵合，以制備電化學(xué)微流控器件；
[0073]第二步，印刷電極(工作電極)的功能化修飾，是將聚苯胺電聚合到電極上，再通過(guò)戊二醛將合成的捕獲探針共價(jià)修飾到電極上；
[0074]第三步，將用于注入待檢測(cè)反應(yīng)物的進(jìn)樣通道連通至聚二甲基硅氧烷芯片位置，將用于進(jìn)行反應(yīng)物檢測(cè)的電化學(xué)傳感元件結(jié)合到印刷電極的工作區(qū)域，進(jìn)而得到電化學(xué)微流控器件。
[0075]所述第一步和第二步之間還可以包括如下步驟:采用微加工精密制造技術(shù)，將微型溫控裝置有效與電化學(xué)微流控器件相結(jié)合。
[0076]第一步中，所述的微流控管道繪制掩模板，其上層？013芯片管道寬度25-100 4 III，總長(zhǎng)度為5-30111111，高度為25-200^111。下層？013芯片進(jìn)出口管道寬度為50-400^111，中間反應(yīng)及檢測(cè)區(qū)域?qū)挾葹?-10臟，總長(zhǎng)度為10-20臟，管道的高度為25-400 ^ 0。上層管道出口必須與下層管道入口對(duì)齊。
[0077]使用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)程序設(shè)計(jì)出所需要的芯片圖形，制備掩模板，采用微加工技術(shù)制備兩層帶有不同結(jié)構(gòu)微通道的聚二甲基硅氧烷$013)芯片，再將兩層芯片以及印刷電極鍵合，以制備電化學(xué)微流控器件。
[0078]兩層？013芯片的設(shè)計(jì)，上層？013芯片的蛇形微流控管道可使樣品充分混勻、孵化，是使從不同孔道同時(shí)進(jìn)入器件的樣品充分混勻，然后進(jìn)入下一層？013芯片中進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增及電化學(xué)檢測(cè)。此設(shè)計(jì)可以很好地節(jié)約試劑和樣品的用量，從而降低了檢測(cè)成本，而且，比起目前等溫?cái)U(kuò)增法方法使用肉眼觀察結(jié)果，我們通過(guò)電化學(xué)檢測(cè)更為靈敏。
[0079]所述將微型溫控裝置有效與電化學(xué)微流控器件相結(jié)合，是在印刷電極底部涂一層溶液，然后與制備好的溫控加熱元件粘合，置于601烘箱中1?2小時(shí)。取出后將微型溫度傳感芯片插入靠近反應(yīng)區(qū)域的印刷電極預(yù)留空隙中。
[0080]通過(guò)微加工精密制造技術(shù)，將微型溫控裝置有效結(jié)合到電化學(xué)微流控器件上，通過(guò)溫控加熱及溫度傳感裝置，可以有效控制溫度，保證擴(kuò)增在合適溫度下進(jìn)行。
[0081]通過(guò)微加工技術(shù)將鎳、鉻濺射到玻璃基底上，作為溫控加熱元器件。然后將該溫控加熱元件與上述電化學(xué)微流控器件結(jié)合，最后插入微型溫度傳感芯片。
[0082]溫度的控制可滿足不同核酸，不同等溫?cái)U(kuò)增方法所需要的不同溫度。
[0083]第二步中，在工作電極上采用循環(huán)伏安法，將聚苯胺電聚合到電極上，即在電極上修飾上可供共價(jià)結(jié)合的氨基-見(jiàn)12。
[0084]對(duì)電化學(xué)微流控器件中的工作電極表面進(jìn)行功能化修飾，即通過(guò)共價(jià)鍵法，將核酸捕獲探針固定到電極表面。
[0085]工作電極的功能化修飾，是以聚苯胺為反應(yīng)物，進(jìn)行電聚合，在電極表面引入可供鍵和的氨基(-冊(cè)12)，再通過(guò)戊二醛將合成的捕獲探針共價(jià)修飾到電極上。
[0086]本實(shí)施例運(yùn)用了電化學(xué)檢測(cè)的高靈敏性對(duì)核酸等溫?cái)U(kuò)增結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)。
[0087]設(shè)計(jì)針對(duì)待檢測(cè)核酸的引物。然后將電化學(xué)報(bào)告分子標(biāo)記到該引物上，再將標(biāo)記好的引物、待檢測(cè)核酸以及其他試劑通過(guò)三個(gè)孔道注入到器件內(nèi)，控制合適溫度，對(duì)待測(cè)核酸樣品進(jìn)行擴(kuò)增。被標(biāo)記的引物在等溫?cái)U(kuò)增的同時(shí)通過(guò)堿基配對(duì)作用結(jié)合到電極表面。通過(guò)電化學(xué)傳感元件對(duì)電化學(xué)報(bào)告分子檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的檢測(cè)，如乙肝病毒、、肺結(jié)核病毒等。
[0088]本實(shí)施例提供的用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的電化學(xué)微流控器件的制備方法，在印刷電極上直接構(gòu)建了一種微流控電化學(xué)傳感器件，包含兩層聚二甲基硅氧烷$013)芯片，上層里面含有微通道以滿足各種樣品的充分混勻，下層？013芯片的橢圓形區(qū)域則是反應(yīng)區(qū)和檢測(cè)區(qū)。通過(guò)微加工工藝將溫控元件整合到上述器件上。對(duì)電極表面進(jìn)行功能化修飾。再針對(duì)病毒核酸設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，同時(shí)將電化學(xué)報(bào)告分子修飾到引物上，再將標(biāo)記好的引物與待檢測(cè)核酸混勻，注入到微流控芯片內(nèi)，控制合適溫度，對(duì)待測(cè)核酸樣品進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。被標(biāo)記的引物在擴(kuò)增的同時(shí)通過(guò)堿基配對(duì)作用結(jié)合到電極表面。通過(guò)電化學(xué)傳感器對(duì)電化學(xué)報(bào)告分子檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)乙肝病毒的檢測(cè)。本實(shí)施例具有微型化，成本低，便攜，可實(shí)現(xiàn)快速、高靈敏檢測(cè)的特點(diǎn)，方便用于野外和家庭診斷。
[0089]實(shí)施例2
[0090]本實(shí)施例提供了一種按照實(shí)施例1提供的用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的電化學(xué)微流控器件的制備方法制備得到的電化學(xué)微流控器件在檢測(cè)人血清中乙肝病毒、人類免疫缺陷病毒、肺結(jié)核病毒中的應(yīng)用。
[0091]進(jìn)一步地，所述的用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的電化學(xué)微流控器件的制備方法制備得到的電化學(xué)微流控器件在檢測(cè)人血清中乙肝病毒(耶”的應(yīng)用，包括如下步驟:
[0092]步驟1，在印刷電極修飾上氨基-見(jiàn)12之后，通過(guò)戊二醛將乙肝病毒捕獲探針固定到電化學(xué)微流控器件印刷電極工作區(qū)域；
[0093]步驟2，通過(guò)注射泵以5?10 μ L/min的速度分別注射18 μ L LAMP反應(yīng)液、I μ L鏈置換DNA聚合酶、I μ L引物、I μ L乙肝病毒模板、若干無(wú)核酸酶Η20，總反應(yīng)物體積25 μ L ;
[0094]步驟3，總反應(yīng)物在65°C左右保溫60min，并在80°C、1min的條件下滅活鏈置換
DNA聚合酶；
[0095]步驟4，采用磷酸鹽緩沖液洗滌；
[0096]步驟5,再注入25 μ L含有氫醌和雙氧水的磷酸鹽緩沖液的混合溶液,采用庫(kù)倫安倍法在-0.3?4mV的恒電位下檢測(cè)乙肝病毒，每組平行測(cè)定八次。
[0097]具體為:
[0098](a)采用計(jì)算機(jī)輔助CAD程序設(shè)計(jì)微流控管道繪制掩模板，該管道設(shè)計(jì)根據(jù)流體力學(xué)設(shè)計(jì)如圖1(a)和圖1(b)所示，兩層PDMS芯片，上層蛇形管道的PDMS與下層橢圓形管道的PDMS，蛇形管道保證樣品充分混勻，橢圓形管道保證液體流暢通過(guò)，均勻的經(jīng)過(guò)工作電極表面。
[0099](b)利用軟光刻標(biāo)準(zhǔn)微加工技術(shù)制備PDMS芯片。
[0100](c)將PDMS芯片和印刷電極鍵合(如圖3)。
[0101](d)將微型溫控元件和微型溫度傳感器整合到印刷電極上去。
[0102](e)采用循環(huán)伏安法對(duì)工作電極(印刷電極)表面進(jìn)行功能化修飾。將玻碳電極用金相砂紙打磨；再用0.5μπι粒度的α-Α1203在絨布上拋光；依次在無(wú)水乙醇、丙酮和蒸懼水中分別超聲清洗3min ;再在0.lmol/L NaOH中，于1.2V電位下活化5min。準(zhǔn)確稱取0.0042g聚苯胺，溶于1mL0.lmol/L H2SO4溶液中配制成聚苯胺修飾液，備用；然后將預(yù)處理好的裸玻碳電極置于聚苯胺修飾液中，在氮?dú)怙柡头諊?，?0.6?1.0V范圍內(nèi)，以100mV/s掃速循環(huán)伏安掃描50次左右即可。然后在戊二醛作用下，將HBV抗原捕獲探針固定上去。
[0103](f)設(shè)計(jì)針對(duì)乙肝病毒核酸擴(kuò)增的引物，將電化學(xué)報(bào)告分子Fe修飾上去；
[0104](g)通過(guò)注射泵以5?10 μ L/min注入18 μ LLAMP反應(yīng)液，I μ L鏈置換DNA聚合酶，I μ L引物，I μ LHBV模板，若干無(wú)核酸酶Η20,總反應(yīng)體積25 μ L ；
[0105](h)注射結(jié)束后，控制合適溫度，進(jìn)行核酸等溫?cái)U(kuò)增，被標(biāo)記的引物在核酸等溫?cái)U(kuò)增的同時(shí)通過(guò)堿基配對(duì)作用結(jié)合到電極表面。
[0106](i)電化學(xué)傳感器對(duì)電化學(xué)報(bào)告分子產(chǎn)生感應(yīng),轉(zhuǎn)化為電信號(hào)輸出到計(jì)算機(jī),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的檢測(cè)。
[0107](j)最后采用庫(kù)倫安培法在-0.3?4mV的恒電位下檢測(cè)乙肝病毒，每組平行八次測(cè)定。
[0108]進(jìn)一步地，所述的用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的電化學(xué)微流控器件的制備方法制備得到的電化學(xué)微流控器件在檢測(cè)人血清中人類免疫缺陷病毒(HIV)的應(yīng)用，包括如下步驟:
[0109]步驟一，在印刷電極修飾上氨基-NH2之后，通過(guò)戊二醛將人類免疫缺陷病毒捕獲探針固定到電化學(xué)微流控器件印刷電極工作區(qū)域；
[0110]步驟二，通過(guò)注射泵以5?10 μ L/min的速度分別注射18 μ LLAMP反應(yīng)液、I μ L鏈置換DNA聚合酶、I μ L引物、I μ L人類免疫缺陷病毒模板、若干無(wú)核酸酶Η20，總反應(yīng)物體積25 μ L ；
[0111]步驟三，總反應(yīng)物在65°C左右保溫60min，并在80°C、1min的條件下滅活鏈置換0嫩聚合酶；
[0112]步驟四，采用磷酸鹽緩沖液洗滌；
[0113]步驟五，再注入25 9 I含有氫醌和雙氧水的磷酸鹽緩沖液的混合溶液，采用庫(kù)倫安倍法在-0.3?4！^的恒電位下檢測(cè)人類免疫缺陷病毒，每組平行測(cè)定八次。
[0114]具體為:
[0115](^)采用計(jì)算機(jī)輔助程序設(shè)計(jì)微流控管道繪制掩模板，該管道設(shè)計(jì)根據(jù)流體力學(xué)設(shè)計(jì)如圖1(3)和(幻所示，兩層？013芯片，上層蛇形管道的？013與下層橢圓形管道的？013，蛇形管道保證樣品充分混勻，橢圓形管道保證液體流暢通過(guò)，均勻的經(jīng)過(guò)工作電極表面，該技術(shù)不同于現(xiàn)有的微流控芯片通常采用的單層長(zhǎng)方形管道設(shè)計(jì)。
[0116](^)利用軟光刻標(biāo)準(zhǔn)微加工技術(shù)制備？013芯片。
[0117](0)將？013芯片和印刷電極鍵合(如圖3)。
[0118]((1)將微型溫控裝置和微型溫度傳感器整合上去。
[0119](6)采用循環(huán)伏安法對(duì)工作電極表面進(jìn)行功能化修飾。將玻碳電極用金相砂紙打磨；再用0.5 ^ III粒度的0 -八1203在絨布上拋光；依次在無(wú)水乙醇、丙酮和蒸餾水中分別超聲清洗3111111 ；再在0.111101/1版10?中，于1.2\電位下活化5111111。準(zhǔn)確稱取0.00428聚苯胺，溶于1011110.111101/1 112304溶液中配制成聚苯胺修飾液，備用；然后將預(yù)處理好的裸玻碳電極置于聚苯胺修飾液中，在氮?dú)怙柡头諊拢?0.6?1.07范圍內(nèi)，以100-/8掃速循環(huán)伏安掃描50次左右即可。然后在戊二醛作用下，將!IV抗原捕獲探針固定上去。
[0120](^)設(shè)計(jì)針對(duì)病毒核酸擴(kuò)增的引物，將電化學(xué)報(bào)告分子1?修飾上去；
[0121]⑷通過(guò)注射泵以5?10 9 1/111111注入18 9 11^1？反應(yīng)液，1 9 I鏈置換0嫩聚合酶，1 “引物，1 ^ “IV模板，若干無(wú)核酸酶訓(xùn)，總反應(yīng)體積25^1 ；
[0122](卜)注射結(jié)束后，控制合適溫度，進(jìn)行核酸等溫?cái)U(kuò)增，被標(biāo)記的引物在核酸等溫?cái)U(kuò)增的同時(shí)通過(guò)堿基配對(duì)作用結(jié)合到電極表面；
[0123](1)電化學(xué)傳感器對(duì)電化學(xué)報(bào)告分子產(chǎn)生感應(yīng)，轉(zhuǎn)化為電信號(hào)輸出到計(jì)算機(jī)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的檢測(cè)；
[0124]0)最后采用庫(kù)倫安培法在-0.3?4！^的恒電位下檢測(cè)病毒，每組平行八次測(cè)定。
[0125]進(jìn)一步地，所述的用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的電化學(xué)微流控器件的制備方法制備得到的電化學(xué)微流控器件在檢測(cè)人血清中肺結(jié)核病毒的應(yīng)用，包括如下步驟:
[0126]步驟I，在印刷電極修飾上氨基-冊(cè)12之后，通過(guò)戊二醛將肺結(jié)核病毒捕獲探針固定到電化學(xué)微流控器件印刷電極工作區(qū)域；
[0127]步驟II，通過(guò)注射泵以5?10 9 1/111111的速度分別注射18 9 11^1？反應(yīng)液、1 9 I鏈置換0嫩聚合酶、1 ^ I引物、1 ^ [肺結(jié)核病毒模板、若干無(wú)核酸酶!120，總反應(yīng)物體積25 1^ I ；
[0128]步驟III，總反應(yīng)物在651左右保溫600111，并在801、100111的條件下滅活鏈置換
0嫩聚合酶；
[0129]步驟IV，采用磷酸鹽緩沖液洗滌；
[0130]步驟V，再注入25 9 I含有氫醌和雙氧水的磷酸鹽緩沖液的混合溶液，采用庫(kù)倫安倍法在-0.3?4！^的恒電位下檢測(cè)肺結(jié)核病毒，每組平行測(cè)定八次。
[0131]具體為:
[0132](^)采用計(jì)算機(jī)輔助0\0程序設(shè)計(jì)微流控管道繪制掩模板，該管道設(shè)計(jì)根據(jù)流體力學(xué)設(shè)計(jì)如圖1(3)和(幻所示，兩層？013芯片，上層蛇形管道的？013與下層橢圓形管道的？013，蛇形管道保證樣品充分混勻，橢圓形管道保證液體流暢通過(guò)，均勻的經(jīng)過(guò)工作電極表面，該技術(shù)不同于現(xiàn)有的微流控芯片通常采用的單層長(zhǎng)方形管道設(shè)計(jì)。
[0133](^)利用軟光刻標(biāo)準(zhǔn)微加工技術(shù)制備？013芯片。
[0134](0)將？013芯片和印刷電極鍵合(如圖3)。
[0135]((1)將微型溫控裝置和微型溫度傳感器整合上去。
[0136](6)采用循環(huán)伏安法對(duì)工作電極表面進(jìn)行功能化修飾。將玻碳電極用金相砂紙打磨；再用0.5 ^ III粒度的0 -八1203在絨布上拋光；依次在無(wú)水乙醇、丙酮和蒸餾水中分別超聲清洗3111111 ；再在0.111101/1版10?中，于1.2\電位下活化5111111。準(zhǔn)確稱取0.00428聚苯胺，溶于1011110.111101/1 112304溶液中配制成聚苯胺修飾液，備用；然后將預(yù)處理好的裸玻碳電極置于聚苯胺修飾液中，在氮?dú)怙柡头諊?，?0.6?1.07范圍內(nèi)，以100-/8掃速循環(huán)伏安掃描50次左右即可。然后在戊二醛作用下，將肺結(jié)核病毒抗原捕獲探針固定上去；
[0137](^)設(shè)計(jì)針對(duì)肺結(jié)核病毒核酸擴(kuò)增的引物，將電化學(xué)報(bào)告分子1? (二茂鐵)修飾上去；
[0138]⑷通過(guò)注射泵以5?10 9 1/111111注入18 9 11^1？反應(yīng)液，1 9 I鏈置換0嫩聚合酶，1 ^ I引物，1 ^ I肺結(jié)核病毒擴(kuò)增模板，若干無(wú)核酸酶取0，總反應(yīng)體積25 4 I ；
[0139](卜)注射結(jié)束后，控制合適溫度，進(jìn)行核酸等溫?cái)U(kuò)增，被標(biāo)記的引物在核酸等溫?cái)U(kuò)增的同時(shí)通過(guò)堿基配對(duì)作用結(jié)合到電極表面；
[0140]⑴電化學(xué)傳感器對(duì)電化學(xué)報(bào)告分子產(chǎn)生感應(yīng)，轉(zhuǎn)化為電信號(hào)輸出到計(jì)算機(jī)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸的檢測(cè)；
[0141]0)最后采用庫(kù)倫安培法在-0.3?4！^的恒電位下檢測(cè)，每組平行八次測(cè)定。
[0142]上述兩個(gè)實(shí)施禮介紹了一種簡(jiǎn)單，快速加工制備用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的電化學(xué)微流控器件，并將該電化學(xué)微流控器件應(yīng)用于檢測(cè)耶7，，肺結(jié)核病毒等。其中，實(shí)施例1是將帶有不同設(shè)計(jì)管道的聚二甲基硅氧烷$013)直接耦合到標(biāo)準(zhǔn)化印刷電極上，從而構(gòu)建了一種新型的電化學(xué)微流控器件，并將該器件應(yīng)用于人血清中病毒的檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度比商業(yè)化臨床檢測(cè)要求的0.提高了兩個(gè)數(shù)量級(jí)，具有超高的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單新穎，材料簡(jiǎn)單，設(shè)備數(shù)量少，能耗低，加工條件要求不高，一般實(shí)驗(yàn)室或者廠房即可完成，便于推廣，可以實(shí)現(xiàn)芯片檢測(cè)微型化，同時(shí)該器件在人類健康，食品安全，環(huán)境檢測(cè)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0143]實(shí)施例1針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，在低成本的印刷電極上，采用微加工技術(shù)直接構(gòu)建而成，大大簡(jiǎn)化了制備過(guò)程，顯著地降低了成本，可進(jìn)行大批量生產(chǎn)。印刷電極具有設(shè)計(jì)靈活、種類多樣、價(jià)格低廉、制備簡(jiǎn)單、重復(fù)率高等優(yōu)點(diǎn)，而且對(duì)生產(chǎn)環(huán)境要求不是很苛刻，在一般的廠房和實(shí)驗(yàn)室條件下均可完成。實(shí)施例1提供的電化學(xué)微流控器件的制備方法，不僅保證了產(chǎn)品的低成本和可重復(fù)性，而且容易實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化，極大拓寬了應(yīng)用領(lǐng)域，其市場(chǎng)前景相當(dāng)可觀。
[0144]實(shí)施例1的獨(dú)特之處是制備了兩層結(jié)構(gòu)不同的？013芯片，并整合了微型溫控裝置以及溫度傳感器，可以通過(guò)溫控加熱裝置有效控制核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的最佳溫度，保證擴(kuò)增反應(yīng)順利進(jìn)行。核酸等溫?cái)U(kuò)增與電化學(xué)檢測(cè)有效結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)樣品的處理與檢測(cè)功能的聞效化。
[0145]利用實(shí)施例1提供的制備方法制備得到的電化學(xué)微流控器件，不僅節(jié)約空間和試齊U，其優(yōu)點(diǎn)還表現(xiàn)在:(I)加熱和冷卻系統(tǒng)體積小，熱容量小，可達(dá)到較高的加熱和冷卻速率；⑵由于尺寸的縮小使得比表面積增大，增大了熱傳導(dǎo)效率；⑶易于集成化。通過(guò)薄膜沉積和微加工技術(shù)在芯片底部將控溫單元的各部件集成為薄膜電阻，緊貼于微流控電化學(xué)芯片，進(jìn)行熱傳遞，將核酸等溫?cái)U(kuò)增系統(tǒng)與電化學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)集于一體，實(shí)現(xiàn)整個(gè)實(shí)驗(yàn)室微型化、自動(dòng)化、提高分析速度。
[0146]實(shí)施例1在生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)控、食品安全等領(lǐng)域具有非常廣泛的應(yīng)用前景。和常規(guī)實(shí)驗(yàn)相比，微流控器件具有許多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì):樣品和試劑量少，分析時(shí)間短，效率高，結(jié)果精確和靈敏度高，微型化和便攜化。微流控器件將多種單元技術(shù)在微小平臺(tái)上的靈活組合和大規(guī)模集成是其基本特征，也是其最大優(yōu)勢(shì)。因此可以利用微流控器件制作功能齊全的便攜儀器，用于各類現(xiàn)場(chǎng)分析。
[0147]以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。
【權(quán)利要求】
1.一種用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的電化學(xué)微流控器件的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 第一步，設(shè)計(jì)所需要的微流控管道圖形，制繪掩模板，根據(jù)掩模板制備兩層帶有不同微流控管道的聚二甲基硅氧烷芯片，再將兩層聚二甲基硅氧烷芯片與印刷電極鍵合； 第二步，對(duì)電化學(xué)微流控器件中的印刷電極表面進(jìn)行功能化修飾，通過(guò)共價(jià)鍵法，將核酸捕獲探針固定到印刷電極表面； 第三步，將用于注入待檢測(cè)反應(yīng)物的進(jìn)樣通道連通至聚二甲基硅氧烷芯片位置，將用于進(jìn)行反應(yīng)物檢測(cè)的電化學(xué)傳感元件結(jié)合到印刷電極的工作區(qū)域，進(jìn)而得到電化學(xué)微流控器件。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的電化學(xué)微流控器件的制備方法，其特征在于，在第一步和第二步之間還包括如下步驟:在電化學(xué)微流控器件上結(jié)合微型溫控裝置。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的電化學(xué)微流控器件的制備方法，其特征在于，所述第一步中，兩層帶有不同微流控管道的聚二甲基硅氧烷芯片分別為上層聚二甲基硅氧烷芯片和下層聚二甲基硅氧烷芯片，其中，上層聚二甲基硅氧烷芯片上的微流控通道為蛇形通道，下層聚二甲基硅氧烷芯片上的微流控通道為橢圓形通道。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的電化學(xué)微流控器件的制備方法，其特征在于，所述第二步中，對(duì)印刷電極的功能化修飾，是以聚苯胺為反應(yīng)物，進(jìn)行電聚合，在印刷電極表面弓I入用于鍵和的氨基-NH2，再通過(guò)戊二醛將合成的捕獲探針共價(jià)修飾到印刷電極上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的電化學(xué)微流控器件的制備方法，其特征在于，所述第三步中，進(jìn)樣通道為三條。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的電化學(xué)微流控器件的制備方法，其特征在于，所述微型溫控裝置包括溫控加熱元件和微型溫度傳感芯片，其中，所述溫控加熱元件通過(guò)微加工技術(shù)將鎳、鉻濺射到玻璃基底上，然后將溫控加熱元件與電化學(xué)微流控器件結(jié)合，最后在電化學(xué)微流控器件的印刷電極上插入微型溫度傳感芯片。
7.一種按照權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的電化學(xué)微流控器件的制備方法制備得到的電化學(xué)微流控器件在檢測(cè)人血清中乙肝病毒、人類免疫缺陷病毒、肺結(jié)核病毒中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的電化學(xué)微流控器件的制備方法制備得到的電化學(xué)微流控器件在檢測(cè)人血清中乙肝病毒的應(yīng)用，其特征在于，包括如下步驟: 步驟1，通過(guò)戊二醛將乙肝病毒捕獲探針固定到電化學(xué)微流控器件印刷電極的工作區(qū)域；設(shè)計(jì)針對(duì)乙肝病毒的引物，然后將電化學(xué)報(bào)告分子標(biāo)記到該引物上； 步驟2，以5?10 μ L/min的速度分別向進(jìn)樣通道注射18 μ L LAMP反應(yīng)液、I μ L鏈置換DNA聚合酶、I μ L標(biāo)記好的引物、I μ L乙肝病毒模板、若干μ L無(wú)核酸酶H2O,總反應(yīng)物體積 25 μ L ； 步驟3，總反應(yīng)物在65°C條件下保溫60min，進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增；然后在80°C、1min的條件下滅活鏈置換DNA聚合酶；被標(biāo)記的引物在等溫?cái)U(kuò)增的同時(shí)通過(guò)堿基配對(duì)作用結(jié)合到印刷電極表面； 步驟4，采用磷酸鹽緩沖液洗滌電化學(xué)微流控器件下層聚二甲基硅氧烷芯片的橢圓形管道區(qū)域，以洗去滅活的鏈置換DNA聚合酶； 步驟5，再注入25 μ L含有氫醌和雙氧水的磷酸鹽緩沖液的混合溶液,采用庫(kù)倫安倍法在-0.3?4mV的恒電位下通過(guò)電化學(xué)傳感元件對(duì)電化學(xué)報(bào)告分子進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而檢測(cè)乙肝病毒。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的電化學(xué)微流控器件的制備方法制備得到的電化學(xué)微流控器件在檢測(cè)人血清中人類免疫缺陷病毒的應(yīng)用，其特征在于，包括如下步驟: 步驟一，通過(guò)戊二醛將人類免疫缺陷病毒捕獲探針固定到電化學(xué)微流控器件印刷電極的工作區(qū)域；設(shè)計(jì)針對(duì)人類免疫缺陷病毒的引物，然后將電化學(xué)報(bào)告分子標(biāo)記到該引物上; 步驟二，通過(guò)注射泵以5?10 μ L/min的速度分別注射18 μ LLAMP反應(yīng)液、I μ L鏈置換DNA聚合酶、I μ L引物、I μ L人類免疫缺陷病毒模板、若干無(wú)核酸酶H2O,總反應(yīng)物體積25 μ L ； 步驟三，總反應(yīng)物在65°C條件下保溫60min，進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增；然后在80°C、1min的條件下滅活鏈置換DNA聚合酶；被標(biāo)記的引物在等溫?cái)U(kuò)增的同時(shí)通過(guò)堿基配對(duì)作用結(jié)合到印刷電極表面； 步驟四，采用磷酸鹽緩沖液洗滌電化學(xué)微流控器件下層聚二甲基硅氧烷芯片的橢圓形管道區(qū)域，以洗去滅活的鏈置換DNA聚合酶； 步驟五，再注入25 μ L含有氫醌和雙氧水的磷酸鹽緩沖液的混合溶液，采用庫(kù)倫安倍法在-0.3?4mV的恒電位下通過(guò)電化學(xué)傳感元件對(duì)電化學(xué)報(bào)告分子進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而檢測(cè)人類免疫缺陷病毒。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的電化學(xué)微流控器件的制備方法制備得到的電化學(xué)微流控器件在檢測(cè)人血清中肺結(jié)核病毒的應(yīng)用，其特征在于，包括如下步驟: 步驟I，通過(guò)戊二醛將肺結(jié)核病毒捕獲探針固定到電化學(xué)微流控器件印刷電極的工作區(qū)域；設(shè)計(jì)針對(duì)肺結(jié)核病毒的引物，然后將電化學(xué)報(bào)告分子標(biāo)記到該引物上； 步驟II，通過(guò)注射泵以5?10 μ L/min的速度分別注射18 μ LAMP反應(yīng)液、I μ L鏈置換DNA聚合酶、I μ L引物、I μ L肺結(jié)核病毒模板、若干無(wú)核酸酶Η20，總反應(yīng)物體積25 μ L ; 步驟III，總反應(yīng)物在65°C條件下保溫60min，進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增；然后在80°C、1min的條件下滅活鏈置換DNA聚合酶；被標(biāo)記的引物在等溫?cái)U(kuò)增的同時(shí)通過(guò)堿基配對(duì)作用結(jié)合到印刷電極表面； 步驟IV，采用磷酸鹽緩沖液洗滌電化學(xué)微流控器件下層聚二甲基硅氧烷芯片的橢圓形管道區(qū)域，以洗去滅活的鏈置換DNA聚合酶； 步驟V，再注入25 μ L含有氫醌和雙氧水的磷酸鹽緩沖液的混合溶液,采用庫(kù)倫安倍法在-0.3?4mV的恒電位下通過(guò)電化學(xué)傳感元件對(duì)電化學(xué)報(bào)告分子進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而檢測(cè)肺結(jié)核病毒。
【文檔編號(hào)】G01N27/416GK104407036SQ201410620976
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月6日
【發(fā)明者】陳守慧, 徐燕, 袁新旺 申請(qǐng)人:上?；塾^貿(mào)易有限公司