專利名稱：改良的核酸定量法的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于基因表達研究的定量核酸的方法且特別涉及定量核酸的改良通用方法，而無需針對持家基因或合成的目的基因標準化數(shù)據(jù)。這種方法可應用于診斷、法醫(yī)學和研究用途，然而，應當理解本發(fā)明并不限于這些具體使用領域。
背景技術：
貫穿說明書的現(xiàn)有技術的任何討論決不應視為承認此類現(xiàn)有技術是廣·泛已知的或構(gòu)成本領域普通一般知識的一部分。用于定量基因表達的PCR技術已通過快速熱循環(huán)儀的開發(fā)和在每個循環(huán)后引入擴增產(chǎn)物的熒光監(jiān)控(實時PCR)得到改良?；虮磉_的定量通過使用染料特別是熒光染料以及檢測與反應開始時樣品中的核酸量成比例的在PCR擴增的指數(shù)期過程中熒光增加而發(fā)生。定量基于閾值循環(huán)，即具有可檢測熒光的第一個循環(huán)，并且可以以絕對方式用外部標準(通常為合成基因)或以相對方式用充當內(nèi)部校準物的比較標準化參考基因(即持家基因)執(zhí)行。對照基因或持家基因用于標準化在不同樣品之間的mRNA水平。關鍵的是所選參考基因不會波動，因為即使在基因表達的邊緣變動也將改變靶基因的相對定量概況。吸取和稀釋誤差也改變擴增水平，并且從而改變定量概況。基因例如3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、膽色素原脫氨酶(PB⑶)、^ _2微珠蛋白或肌動蛋白通常用作實時PCR中的內(nèi)部校準物。然而，上述基因已顯示響應實驗條件或處理而移動。豐富表達的基因例如18S也不是理想的參考基因，因為PCR條件需要進行限制，以便不干擾反應。因此，合適的持家基因應在目的組織中充分表達，并且最重要的是，顯示在樣品之間和在使用的實驗條件或處理下在表達中的最低限度變化性。然而，這些對照基因中的許多可以顯示在表達中無法接受的變化性。已顯示此類基因的表達水平可以在組織或細胞中不同，并且可以在特定環(huán)境即不同處理下改變。因此，關鍵的是在任何新的實驗系統(tǒng)中驗證持家基因。發(fā)現(xiàn)適合于在具體實驗系統(tǒng)中使用的持家基因或參考基因通常是耗時和困難的任務。在某些情況下，這是太不可能的。外部標準(即合成序列)在基因表達研究中的使用一般要求克隆目的基因以提供合成參考基因。在這種方法中，將已知量的合成參考基因序列系列稀釋，隨后實施擴增以產(chǎn)生標準曲線。用于這種方法的克隆序列的產(chǎn)生一般是耗時的費力的任務，并且稀釋誤差被指數(shù)擴增，這可以導致核酸水平的不準確評估。高度稀釋的克隆序列的穩(wěn)定性和保存也可以造成困難。因此，存在關于定量核酸的快速和有效通用方法的需要，所述方法可應用于任何實驗情況或處理條件，不需要使用持家基因或合成的目的基因以標準化數(shù)據(jù)。本發(fā)明的目的之一是克服或改善現(xiàn)有技術的至少一個缺點，或提供有用的替代方法。

發(fā)明內(nèi)容
在一個廣泛方面，本發(fā)明涉及用于定量核酸的方法，其不需要使用持家基因或合成的參考基因以標準化核酸表達數(shù)據(jù)。相反，本發(fā)明的方法利用與合適染料組合的通用參考寡核苷酸(或可以使用一種或多種此類寡核苷酸)，這可以用于生成標準曲線，可以由所述標準曲線計算樣品中擴增的靶核酸的絕對水平。因此，本發(fā)明的方法可以利用相同參考寡核苷酸，以個別地或在此類目的核酸的混合物中定量不同目的核酸。本發(fā)明還涉及用于在本發(fā)明的方法中使用的試劑盒。在第一個方面，提供了用于定量靶核酸的方法，其包含
a)用可檢測標記物來標記具有預定長度的參考寡核苷酸；
b)使用標記的參考寡核苷酸的系列稀釋，通過將可檢測標記物的強度針對標記的參考寡核苷酸的濃度作圖生成標準曲線；
c)在標記擴增的靶核酸的可檢測標記物的存在下擴增靶核酸，
d)比較與標記的擴增靶核酸結(jié)合的可檢測標記物的強度與標準曲線，并且測定擴增的革巴核酸的數(shù)量。在第二個方面，提供了用于定量靶核酸的方法，其包含
a)用可檢測標記物來標記具有預定長度的參考寡核苷酸；
b)使用標記的參考寡核苷酸的系列稀釋，通過將可檢測標記物的強度針對標記的參考寡核苷酸的濃度作圖生成標準曲線；
c)擴增靶核酸；
d)用可檢測標記物來標記擴增的靶核酸；
e)比較與標記的擴增靶核酸結(jié)合的可檢測標記物的強度與標準曲線，并且測定擴增的靶核酸的數(shù)量。參考寡核苷酸序列無需與靶核酸或任何持家基因序列具有任何同源性。然而，因為其中參考寡核苷酸在本發(fā)明的方法中使用的特定方式(即在參考寡核苷酸的系列稀釋后制備標準曲線)，參考寡核苷酸序列可以與靶核酸序列或持家基因或其較小部分具有一定程度的同源性(homo I ogy )或甚至同一'丨生(i dent i ty )。本發(fā)明的優(yōu)點之一是該方法可以利用相同單一參考寡核苷酸以定量不同靶核酸。在實踐中，參考寡核苷酸可以是通用的寡核苷酸，具有特定固定長度和GC含量，一般為100 bp和50% GC含量的寡核苷酸。優(yōu)選地，靶核酸的擴增通過聚合酶鏈反應(PCR)法執(zhí)行。一般地，靶核酸經(jīng)過15個循環(huán)擴增，但這對于本發(fā)明的方法并不是關鍵的。還可以執(zhí)行在一個反應中多種(multiple)目的祀核酸的同時擴增(即多路(multiplex) PCR)。參考寡核苷酸可以與靶核酸序列具有相同或相似的長度，但這無需如此。參考寡核苷酸可以長于或短于靶核酸。優(yōu)選地，單一標準曲線用單一參考寡核苷酸進行制備，并且用于多種靶核酸擴增和定量。需要時，多種靶核酸擴增和定量可以各自在不同時間執(zhí)行。優(yōu)選地，可檢測標記物是結(jié)合dsDNA的染料，并且它可以是嵌入染料。優(yōu)選地，染料是熒光染料。使用的染料可以選自SYBR綠I、SYBR綠II、CYBR金、Evagreen、噁唑黃、噻唑橙、picogreen、TOTO或BEBO、Deep Purple 中的任何一種，然而，染料的選擇并不是關鍵的，因為其他合適染料也可以使用且將是本領域技術人員已知的。優(yōu)選地，染料化學計量學是一對一的，但可以更高。
在第三個方面，提供了用于在第一個或第二個方面的方法中使用的試劑盒，其包含一種或多種參考寡核苷酸和熒光染料。優(yōu)選地，僅一種參考寡核苷酸存在于試劑盒中。如果存在超過一種寡核苷酸，每種可以具有相同或不同長度。在第四個方面，提供了用于在第一個或第二個方面的方法中使用的試劑盒，其包含用突光染料標記的一種或多種參考寡核苷酸。在第五個方面，提供了用于在第一個或第二個方面的方法中使用的試劑盒，其包含用熒光染料標記的一種或多種參考寡核苷酸的系列稀釋。參考寡核苷酸應優(yōu)選具有大于60bp的長度，并且一般在約60bp -約170bp的范圍中。最優(yōu)選地，參考寡核苷酸應具有IOObp的長度，可以用于定量靶核酸，其通常在長度約60bp -約210bp的范圍中。參考寡核苷酸的長度上限并不是關鍵的，并且將受實際考慮控制。希望參考寡核苷酸的GC含量是45%或以上。一般地，參考寡核苷酸的GC含量可 以選擇在約45%-約75%的范圍中，并且最優(yōu)選它是50%。GC含量的上限并不是關鍵的。參考寡核苷酸可以使用已知技術得自天然或其他方式的生物學來源，或它可以合成制備。除非上下文另有明確要求，說明書和權利要求自始至終，單詞“包含”(“comprise”, “comprising”)等應以包括在內(nèi)的(inclusive)含義進行解釋，與專有(exclusive)或窮舉(exhaustive)的含義相反；即，在“包括但不限于”的含義中。


圖I :經(jīng)過15個循環(huán)以不同濃度的參考寡核苷酸標準的熒光。每條水平線代表一個濃度。在反應混合物中酶的缺乏確保熒光經(jīng)過眾多循環(huán)是不改變的。該圖進一步指出參考寡核苷酸染料復合物通過反復變性和退火循環(huán)的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。圖2 :由圖I中所示的熒光數(shù)據(jù)生成的標準曲線。圖3 :關于6個基因(由括號定義)的循環(huán)曲線。關于每種基因獲得3個給定熒光水平fl、f2、f3 (例如65、60和55)所需的循環(huán)得自這個數(shù)據(jù)。圖4 :在SHR大鼠的心臟中5種目的基因的表達。每種目的基因的表達使用參考募核苷酸(空心條)，參考寡核苷酸加上20個堿基對(陰影條)和參考寡核苷酸加上100個堿基對(實心條)進行計算。增加參考寡核苷酸長度不顯著影響目的基因表達的計算。對于參考寡核苷酸與參考寡核苷酸加上20和100個堿基對比較TNFa p=0. 3946 ；TGF^ p=0. 7151 ；AngO p=0. 6158 ;CTGF p=0. 4955 和 ATla p=0. 5589 (ANOVA)0圖5 :在3個實驗組中在以高鹽飲食為主的WKY大鼠的心臟中5種目的基因的表達-零時間對照(14周齡)空心條，在4周對照媒介物輸注后(18周齡)陰影條和在用VIP 4周處理后(18周齡)實心條。圖6 :經(jīng)過3周生成的標準曲線。在運行之間將參考寡核苷酸染料反應混合物冷凍且貯存于_20°C，對于每個循環(huán)解凍且再冷凍。如可以看出的，生成的標準曲線隨著時間過去以及反復冷凍和再解凍是穩(wěn)定的。圖7A-F :使用長度范圍為70 - 170個堿基對且GC含量為50%到74%不等的5種參考寡核苷酸，對于6種目的基因(血管緊張素原、TGFP ,TNFa、CTGF、Atla和N0N0)的定量結(jié)果。這些例子中所示的參考寡核苷酸是CTGF 70個堿基對、50% GC含量(CTGF 70/50)，CTGF 73個堿基對、74%6(含量((^6卩73/74)，^肌動蛋白90個堿基對、50% GC含量(肌動蛋白 90/50)，CTGF 90 個堿基對、50% GC 含量(CTGF 90/50)，和 CTGF 170 個堿基對、52%GC 含量(CTGF 170/52)。圖8A-F :顯示使用長度范圍為50 - 144個堿基對且GC含量為40%到50%不等的4種參考寡核苷酸，對于6種目的基因(血管緊張素原、TGFP ,TNFa、CTGF、Atla和N0N0)的定量結(jié)果。這些例子中所示的參考寡核苷酸是肌動蛋白144/40( 3肌動蛋白144個堿基對、40% GC含量)、CTGF 50/50 (CTGF 50個堿基對、50% GC含量)、肌動蛋白90/50 ( ^肌動蛋白90個堿基對、50% GC含量)和CTGF 90/50( CTGF 90個堿基對、50% GC含量)。與肌動蛋白 90/50 比較，* p〈0.005、** p〈0. 0005 ;與 CTGF 90/50 比較，# p<0.01、## p〈0. 005、###p<0. 001和 #### p〈0.0005。圖9A VIP或依那普利處理對SHR中的血管緊張素原(AGT)、TGF ^和CTGF表達的作用零時間對照(空心條)、媒介物對照(陰影條)、VIP輸注(實心條)和依那普利處理(交叉 陰影條)。對于VIP或依那普利與媒介物對照比較，* p〈0. 05、# p〈0. 025、*#p〈0. 0005。對于VIP或依那普利與零時間對照比較，# p〈0. 001 ## p〈0. 0005。圖9B :用VIP或依那普利處理對SHR中的NF k B、TNF a和ATla受體表達的作用。對于VIP或依那普利與媒介物對照比較，* p〈0. 01 ** p〈0. 0005 ;對于VIP或依那普利與零時間對照比較，# p〈0. 05、## p〈0.0005。圖9C :用VIP或依那普利處理對SHR中的金屬蛋白酶和TMP表達的作用。對于VIP或依那普利與媒介物對照比較，*p〈0. 025、** p〈0. 0005 ；VIP或依那普利與零時間對照比較，# p〈0. 01、## p<0. OOU ### p<0. 0005 VIP。值是對于n=6只大鼠的平均值土標準誤。定義
如本文使用的，術語/短語“基因”或“靶核酸”或“靶基因”或“目的基因”或“目的靶序列”或“目的靶”或“目的核酸”已可互換使用且指相同概念。術語“核酸”指由單體核苷酸的鏈組成的分子。如本文使用的，該術語意圖包含DNA、RNA及其變體和衍生物。如本文使用的，術語“基因”可以是包含轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)節(jié)序列和/或編碼區(qū)和/或非翻譯序列(例如內(nèi)含子、5’和3’非翻譯序列)的天然(例如基因組)或合成基因?；虻木幋a區(qū)可以是編碼氨基酸序列或功能RNA例如tRNA、rRNA、催化RNA、siRNA、miRNA或反義RNA的核苷酸序列。術語“基因”還可以包含對應于編碼序列(例如外顯子)的cDNA，任選包含與之連接的5’或3’非翻譯序列?；蜻€可以是在體外產(chǎn)生的擴增的核酸分子，包含編碼區(qū)和/或與之連接的5’或3’非翻譯序列的全部或部分。核酸序列的“擴增”可以常規(guī)地通過聚合酶鏈反應(PCR)完成，但還可以通過另一種合適方法例如連接酶鏈反應完成。在本說明書的上下文中，術語“聚合酶鏈反應”及其首字母縮寫詞“PCR”根據(jù)其如本領域技術人員理解的普通含義使用。PCR法的例子可以在本領域使用的普通分子生物學教材和參考手冊中發(fā)現(xiàn)。例如，PCR Technology principlesand Applications for DNA Amplification (1989) Ed H A Erlich. Stockton Press,New York。為了最佳化PCR擴增，引物可以以不同濃度和比例使用。這些及其他變量的選擇將是本領域技術人員理解和可獲得的。在本發(fā)明的上下文中的“擴增子”指通過擴增反應形成的DNA或核酸產(chǎn)物的片段，例如通過PCR或連接酶鏈反應進行的那些。在一種情況中，擴增子可以是“靶核酸”或“目的基因”或“目的核酸”等的產(chǎn)物。“引物”可以與“寡核苷酸”互換使用，并且可以是天然、合成的或其修飾，并且與在模板分子上的特異性核苷酸序列充分互補能夠充當核苷酸合成的起始點。如在本發(fā)明的上下文中使用的，“參考寡核苷酸”或“參考核酸序列”或“通用參考寡核苷酸”是核酸，優(yōu)選雙鏈DNA，且涵蓋在標準曲線的制備中有用的或以其他方式適合于目的靶核酸的定量的任何有適當大小的核酸，。因此，參考寡核苷酸可以是多核苷酸，但還可以是更短序列。合適的參考寡核苷酸特征在本文中描述。參考寡核苷酸可以是完全合成的，或可以使用合適的限制性酶從天然來源的DNA獲得，以獲得合適大小的核酸作為參考寡核苷酸。 為了獲得適當?shù)剌^大數(shù)量，參考寡核苷酸可以使用擴增反應(例如PCR或連接酶鏈反應)進行擴增，或可以在微生物中重組表達且在使用前純化。如果參考寡核苷酸的大小允許，那么它還可以通過合成方法大量制備?！俺旨一颉币话闶墙M成基因，這是基本細胞功能的維持所需的。此類基因在所有細胞中發(fā)現(xiàn)。某些持家基因以相對恒定的水平表達，然而，其他持家基因可以在表達上不同，這取決于使用的實驗條件?！皹藴是€”是定量研究工具，標繪測定數(shù)據(jù)的方法，所述測定數(shù)據(jù)用于測定物質(zhì)例如DNA和蛋白質(zhì)的絕對濃度。如本發(fā)明背景中使用的“定量”意指檢測物質(zhì)的絕對量，在本文情況下“目的靶核酸”?！跋盗邢♂尅敝钢苽錁藴是€所需的任何形式的稀釋，涵蓋由其可以定量“靶核酸”的量的一系列物質(zhì)(例如核酸)濃度。在本發(fā)明的上下文中，“dsDNA”指雙鏈DNA，“bp”指堿基對，“dNTP”指脫氧核苷三磷酸，“RNA”指核糖核酸，“tRNA”指轉(zhuǎn)移RNA，“rRNA”指核糖體RNA，“siRNA”指小干擾RNA，“miRNA”指微小RNA，“mRNA”指信使RNA，并且“cDNA”指互補DNA。核酸序列例如引物的“GC含量”對引物的多種性質(zhì)包括其解鏈溫度(Tm)具有作用。發(fā)明優(yōu)選實施方案
本發(fā)明已通過缺乏用于在對照和處理動物/人組中定量核酸表達的準確和有效方法而被推動。它還通過下述事實被推動在基因表達研究中使用的大多數(shù)已知持家基因響應實驗條件或處理移動，從而使結(jié)果有偏差。本發(fā)明的優(yōu)點之一是所述方法去除對用于標準化數(shù)據(jù)和定量基因表達的持家基因或合成參考基因的需要。本發(fā)明的另一個優(yōu)點是通常通過PCR但可以使用其他方法的靶核酸擴增可以經(jīng)過減少數(shù)目的循環(huán)(例如15個循環(huán))執(zhí)行，而不是用于基因表達研究的通常30個循環(huán)左右，從而提供足夠量的靶核酸用于在定量測定中使用，同時顯著減少測定的時間和成本。在本文描述的新方法中，與預定長度的參考寡核苷酸組合的染料用于生成標準曲線，所述參考寡核苷酸有利地可以與目的靶核酸無關，但也可以與目的基因相似或等同。通過系列稀釋根據(jù)本發(fā)明的熒光標記的參考寡核苷酸，且將熒光染料的強度水平針對標記的參考寡核苷酸濃度作圖，生成標準曲線。不需要參考寡核苷酸的擴增以產(chǎn)生標準曲線。這與用于評估基因表達的目前方法形成對比，在目前的方法中，測試樣品和持家基因/合成參考基因并排(side by side)進行擴增或在一個反應混合物中組合。一旦制備，如果需要定量超過一種目的靶核酸，同一標準曲線就可以使用多次。用于制備標準曲線的稀釋的參考寡核苷酸溶液隨著時間過去例如經(jīng)過約一個月的時期以及溶液的反復冷凍和解凍是穩(wěn)定的。這使得能夠在任何實驗需求前制備和貯存參考寡核苷酸溶液。參考寡核苷酸可以是完全合成的序列，擴增的序列(例如PCR生成的)，或從天然來源中分離的較大核酸的適當大小的限制性片段。在本發(fā)明的方法中使用的參考寡核苷酸不是描述為“持家基因”或“合成參考基因”的那種，即它不需要連同目的基因進行擴增。
可能希望設計不同長度的參考寡核苷酸，以制備用于定量不同長度的靶核酸的標準曲線，但這對于本發(fā)明的方法不是關鍵的。然而，本發(fā)明的一個特定優(yōu)點是特定固定長度的單一參考寡核苷酸可以用于標準曲線中，以定量長于或短于參考寡核苷酸以及具有不同核酸序列的靶核酸。參考寡核苷酸將希望地具有大于60bp的長度，且一般將在60bp -約170bp的范圍中(即約 60、70、80、90 100、110、120、130、140、150、160 或約 170 bp)，這可以用于定量長度在約80 -約210 bp的范圍中的靶核酸，更通常在長度約80 -約150bp的范圍中。進一步地，具有上述范圍中的長度的任何參考寡核苷酸可以用于定量長度在上述范圍中的任何一種或多種靶核酸產(chǎn)物。應當理解靶序列的長度對于本發(fā)明的方法是不重要的，因為它通過使用該方法的那些人選擇為目的核酸(或多種目的核酸)。參考寡核苷酸的長度上限并不是關鍵的，并且將受實際考慮控制。因此，需要時，在本發(fā)明的方法中可以使用大于170bp的參考寡核苷酸，而對靶核酸的定量沒有有害作用(例如約 170-180,180- 200、200-220、220-240、240-260、260-280、280-300、300-320、320-340、340-360、360-380、380-400 bp 等的長度)。希望參考寡核苷酸的GC含量是45%或以上。GC含量的上限并不是關鍵的。因此，具有75% GC含量的參考寡核苷酸獲得與具有較低GC含量的參考寡核苷酸相似的結(jié)果。一般地，參考寡核苷酸的GC含量可以選擇在約45% -約75%的范圍中(例如約45%、50%、55%、55%、60%、65%、70%或約 75%)。參考寡核苷酸序列無需與靶核酸或任何持家基因序列具有任何同源性。然而，因為其中參考寡核苷酸在本發(fā)明的方法中使用的特定方式(即在參考寡核苷酸的連續(xù)稀釋后建立標準曲線)，參考寡核苷酸序列可以與靶核酸序列或持家基因或其較小部分具有一定程度的同源性或甚至同一性。本發(fā)明的優(yōu)點之一是該方法可以利用相同參考寡核苷酸，以定量不同靶核酸。在實踐中，參考寡核苷酸將是通用的寡核苷酸，具有特定固定長度和GC含量，一般為100 bp和50% GC含量的寡核苷酸。設想在上述范圍中的至少3種不同參考寡核苷酸包括在試劑盒中，以便能夠定量通常測量的基因(核酸)大小的完全范圍。如果參考寡核苷酸使用限制性酶得自天然或其他方式的生物學來源，以獲得合適大小的片段，那么GC含量可以使用本領域技術人員眾所周知的標準分子生物學技術進行測定，并且將不需要超過簡單分析程序，以選擇且測定適當大小的片段(Sambix)Ok等人 Molecular Cloning A Laboratory Manual,第 2 版(1989) Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. ) 合成參考寡核苷酸還可以是方便地使用的，并且可以通過已知技術進行簡單制備，例如下述中描述的那些Sambrook等人 Molecular Cloning A Laboratory Manual, 第 2 版(1989) Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.和 Roe 等人 DNA Isolation andSequencing" (Essential Techniques Series) (1996)John Wiley & Sons,Inc. ,N.Y。合成參考寡核苷酸的所需長度和GC含量可以在合成過程中容易地選擇。本發(fā)明的方法適合于與嵌入染料以及熒光探針(染料)一起使用。對于嵌入染料，參考寡核苷酸的長度不影響對于給定濃度的參考寡核苷酸的突光強度，只要參考寡核苷酸的長度是60bp或更長?？雌饋韺τ绊憻晒鈴姸鹊膮⒖脊押塑账衢L度不存在上限。因此，一個參考寡核苷酸適合于用作參考標準用于任何數(shù)目的目的核酸靶序列，所述核酸靶序列可以具有不同長度、GC含量和/或核苷酸序列。對于熒光探針，相同參考寡核苷酸可以用于系列研究的許多核酸靶，條件是使用相同熒光團?？商娲?，多重標準曲線可以使用一種參考寡核苷酸但不同熒光團生成，以提供用于多路rt-PCR產(chǎn)物的定量框架。因此，本發(fā)明的方法是有利的，因為它去除擴增持家基因且不斷地運行關于持家基因或合成持家基因的測定以在每個實驗內(nèi)標準化核酸表達數(shù)據(jù)的需要。一個標準曲線可以制備且使用一段時間，以定量可以在大小和序列方面不同的超過一種目的靶核酸，從而當與常規(guī)基因表達測定比較時，削減成本和時間。本發(fā)明的方法適合于自動化以及實時監(jiān)控靶核酸擴增和定量，其通過在擴增目的靶核酸開始前將參考寡核苷酸標準曲線信息存儲于基于計算機的系統(tǒng)中，且在特定時間段獲得擴增反應的樣品或監(jiān)控隨著時間過去(實時)熒光的增加且使信息與存儲的標準曲線信息關聯(lián)來進行。當以這樣的模式操作方法時，標準曲線可以定期例如每周或每月生成，并 且這種信息存儲且用于一段時間定量目的靶核酸，而無需制備新標準曲線。本發(fā)明的方法和試劑盒可以使用單一參考寡核苷酸有利地用于定量具有基因(核酸)產(chǎn)物的目的基因(核酸)，其通常在分析和研究實驗室中遇到，且通常在長度80 - 150bp的范圍中且具有30%- 60% GC含量。更具體而言，本發(fā)明的方法和試劑盒使用優(yōu)選長度是IOObp且具有50 % GC含量的單一參考寡核苷酸用于定量長度超過60bp和35 % GC含量的核酸產(chǎn)物。試劑盒的優(yōu)選形式從而由此類參考寡核苷酸或其系列稀釋和用于目的核酸的反應的染料或其他合適可檢測標記物組成?？商娲?，試劑盒包括用染料或其他合適標記物來標記的參考寡核苷酸，或此類標記的參考寡核苷酸的系列稀釋，和待用于標記目的核酸的染料或標記物。
作為用于制備在本發(fā)明的方法中使用的標準曲線的一般指導，使用與用于目的基因的反應緩沖液相同的反應緩沖液一式兩份地系列稀釋參考寡核苷酸，以給出例如在約0.01 -約IOpmol參考寡核苷酸/反應管范圍中(可以是更窄或更寬的范圍)的最終量，以使得如本文描述的標準(參考)曲線的構(gòu)建成為可能。參考核苷酸的濃度范圍通過簡單嘗試和誤差進行測定，取決于需求?？蓹z測標記物例如熒光染料(與用于目的基因的那種相同且以與用于目的基因反應的那種相同的量)隨后加入每個反應管中。一般地，反應管在實時rt-PCR機器中經(jīng)歷15個循環(huán)(或需要時，可以是更多循環(huán))，循環(huán)條件反映用于目的基因的那些。因此，如果關于目的基因的起始變性條件是例如94°C和2分鐘，那么含有參考寡核苷酸的系列稀釋(待用于構(gòu)建標準曲線)的管經(jīng)歷在94°C 2分鐘的起始變性。接下來的15個循環(huán)隨后與目的基因的條件平行，從而使得如果目的基因循環(huán)條件包括例如在95°C 30秒的變性，隨后為在60°C 30秒的退火，含有參考寡核苷酸的系列稀釋的管也在95°C 30秒(變性)和60°C 30秒(退火)進行循環(huán)。如果熒光染料用作標記或標記物，那么熒光可以在每個退火期獲得，如圖I和2中證實的。隨后如本文描述的構(gòu)建突光相對于核酸(例如DNA)的量的標準(參考)曲線。盡管本發(fā)明已通過例子進行描述，但應當理解可以做出變化和修飾，而不背離本發(fā)明的范圍。此外，當對于特定特征存在已知等效特征(equivalent)時,此類等效特征可被并入，如同本說明書中具體提及。
實施例實施例I
計算
在rt-PCR中，在預定循環(huán)數(shù)目(c)后，存在的目的基因的量(R)以可重復方式與PCR擴增開始時存在的那種基因的量(n)相關，條件是復制效率是100%，并且在每個循環(huán)時基因的每個拷貝都被復制。R = n X 2C
n =在時間0時存在的復制數(shù) C=在預定熒光時的循環(huán)數(shù)目 R=在c個循環(huán)后存在的復制數(shù)
當效率小于100%，并且并非基因的所有拷貝都在每個循環(huán)時復制時，等式修改為考慮在復制效率中的這種減少，那么R = n X ece=復制效率
C=在預定熒光時的循環(huán)數(shù)目 R=在c個循環(huán)后存在的復制數(shù) 實施例2
參考寡核苷酸的制備
盡管引用的實施例使用結(jié)締組織生長因子(CTGF)的RNA以生成參考寡核苷酸，但應當理解用作標準的參考寡核苷酸可以由任何基因的RNA或編碼或非編碼DNA生成。如下通過擴增來自自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)的心臟組織的CTGF基因的片段制備長度70、90和170個堿基對的參考寡核苷酸
I) RNA提取
從SHR動物中收集組織用于總RNA提取，所述總RNA提取通過具有修改的苯酚和異硫氰酸狐(Chomczynski 和 Sacchi 1987)進行。通過 Mixer Mill MM300 (Retsch GmbH,德國)均質(zhì)化液氮冷凍的SHR心臟。將各IOOmg的冷凍樣品加入在具有Tungsten CarbideBeads 3mm (Qiagen)的 I. 5mL 安全鎖(Safe-Lock)微量試管(Eppendorf Biopur,Hamburg,德國)中的ImL Trizol試劑(Invitrogen),且以30Hz的頻率磨碎。隨后根據(jù)制造商的建議(Invitrogen)進行RNA提取。在破裂樣品用于RNA提取后，進行相分離，由此加入200mL氯仿(Lab-Scan Analytical Sciences, Lomb Scientific, Taren Point, NSW, Australia),并且將樣品手工劇烈振蕩15秒，并且隨后在使用Sigma 1-15PK離心機(John MorrisScientific, Chatswood,NSW,Australia)以 12, OOOrpm (13，20Ig)在 4°C離心 20 分鐘(制動脫開(brake off))前，在室溫(23_30°C )溫育5分鐘。將300mL上層水相收集到新的I. 5mLeppendorf 管，并且加入 500mL 預冷的 2_ 丙醇(異丙醇)(Lab-Scan Analytical Sciences,Lomb Scientific, Taren Point, NSW, Australia),并且通過手工倒置樣品數(shù)次以混合?；旌衔镌谑覝販赜?0分鐘，以沉淀RNA。通過以12，OOOrpm在4°C離心20分鐘形成沉淀(JohnMorris Scientific, Chatswood, NSW, Australia)。棄去上清液,并且隨后用在焦碳酸二乙酯(DEPC) (Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia)中稀釋的 ImL 75% (v/v)絕對分子級別乙酉享(Lab-Scan Analytical Scienc es, Lomb Scientific, Taren Point, NSW,Australia)洗漆沉淀，并且以 10，OOOrpm 在 4°C旋轉(zhuǎn) 10 分鐘(John Morris Scientific,Chatswood, NSW, Australia)。收集沉淀,并且在通風櫥中風干數(shù)分鐘，隨后溶解于DEPC處理的Milli-Q水且貯存于_80°C。通過分光光度計吸光度測定總RNA濃度，使用在260nm(A26tl)的 Nanodrop 1000 (Nd-1000, Thermo Scientific)進行；并且如果 A26tl:A28c!的比是約2. 0，那么RNA的純度視為令人滿意的。2)脫氧核糖核酸酶I (DNA酶-I)處理
在逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)前，用DNA酶-I (Invitrogen)處理RNA樣品，以消除雙鏈和單鏈DNA。在0. 5mL無DNA酶和RNA酶的印pendorf管中，用在含DEPC處理的水的IOML總體積中的I單位/ML DNA酶-I和IML IOX DNA酶-I反應緩沖液消化高達1吒RNA。在溶液混合物中通過用IML 25mM EDTA螯合鈣和鎂離子且在65°C加熱10分鐘滅活DNA酶-I前，將樣品在室溫溫育15分鐘。將樣品在冰上冷卻且貯存于_80°C。混合物的所有組分在DNA酶-I試劑盒(Invitrogen)中供應。3) RNA質(zhì)量和濃度的評估
在 MCE-202 MultiNA 微芯片自動化電泳儀器(Shimadzu Biotech, Rydalmere, NSW,Australia)上，就核糖體RNA (rRNA) 18S和28S亞單位的純度、大小和濃度分析DNA酶-I處理的DNA樣品。所有步驟根據(jù)制造商的建議執(zhí)行，伴隨微小修飾。簡言之，將3ML每種樣品與等體積的內(nèi)部 RNA 標記物(Shimadzu Biotech,Rydalmere,NSW,Australia)在 96 孔板中混合，并且用粘性PCR招箔(Thermo Scientific, Integrated Sciences,NSW,Australia)密封。RNA連同已知濃度和大小的內(nèi)部標準標記物(更低和更高的分子大小標記物)自動地校正電泳結(jié)果用于RNA樣品的自動化大小預測和定量。用DEPC處理的水以l:5(v/v)的比例稀釋 RNA-6000 梯帶(Applied Biosystems, Victoria, Australia);隨后將溶液混合物與RNA標記物溶液以1:1( v/v)混合。樣品和梯帶混合物兩者在65°C熱變性5分鐘，并且立即在冰上冷卻5分鐘。這些大小范圍分離在MultiNA的微芯片(Shimadzu Biotech, Rydalmere,NSW, Australia)上在 RNA 分離緩沖液(Shimadzu Biotech, Rydalmere, NSW, Australia)中執(zhí)行，所述RNA分離緩沖液含有10，OOOX熒光嵌入染料SYBR綠II( Invitrogen)，用TE( IOmMTris-HCl, ImM EDTA 二鈉，pH8. 0) (Sigma-Aldrich)和 20(v/v)甲酸胺(Invitrogen)稀釋1:99。4)逆轉(zhuǎn)錄根據(jù)制造商的說明書，使用 Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix 試劑盒(Invitoogen)的莫洛尼-鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV RT),由單鏈RNA模板合成第一鏈互補DNA (cDNA)o所有反應在0. 2mL薄壁的eppendorf管中執(zhí)行；并且所有溫育步驟在 Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Sydney, Australia ;Qiagen)上執(zhí)行。高達 5Mg總RNA在65°C熱變性5分鐘，用在含DEPC處理的水的8ML總體積中的IML 50剛寡核苷酸(dT)2(l和IML退火緩沖液進行。在加入IOML 2X第一鏈反應混合物和2ML SuperScriptIII/RNaseOUT酶混合物前，樣品在冰上冷卻至少I分鐘。將樣品短暫渦旋以混合，并且隨后通過脈沖旋轉(zhuǎn)收集，隨后在50°C溫育50分鐘用于cDNA合成。將RT酶在85°C變性5分鐘以終止反應，并且將樣品立即在冰上冷卻且貯存于_20°C。包括不含RT酶或RNA的陰性對照樣品，以驗證DNA污染的不存在。
5)引物
基于由NCBI GenBank公開的結(jié)締組織生長因子(CTGF)的大鼠mRNA序列(登記號AB023068)，設計生成70bp、90bp和170bp的PCR產(chǎn)物長度的引物對。將引物序列(引物序列自身是長度21-24個堿基)寄出用于合成為脫鹽的凍干產(chǎn)物(Invitrogen)。用TE (IOmMTris-HCl, pH8. 0，ImM EDTA ) (Invitrogen)將引物重建為50剛的濃度，并且貯存于_20°C。表I :用于大鼠CTGF的引物序列。
權利要求
1.一種用于定量核酸的方法，其包含 a)用可檢測標記物來標記具有預定長度的參考寡核苷酸； b)使用標記的參考寡核苷酸的系列稀釋，通過將可檢測標記物的強度針對標記的參考寡核苷酸的濃度作圖生成標準曲線； c)在標記擴增的靶核酸的可檢測標記物的存在下擴增靶核酸， d)比較與標記的擴增的靶核酸結(jié)合的可檢測標記物的強度與標準曲線，并且測定擴增的靶核酸的數(shù)量。
2.一種用于定量核酸的方法，其包含 a)用可檢測標記物來標記具有預定長度的參考寡核苷酸； b)使用標記的參考寡核苷酸的系列稀釋，通過將可檢測標記物的強度針對標記的參考寡核苷酸的濃度作圖生成標準曲線； c)擴增靶核酸； d)用可檢測標記物來標記擴增的靶核酸； e)比較與標記的擴增的靶核酸結(jié)合的可檢測標記物的強度與標準曲線，并且測定擴增的靶核酸的數(shù)量。
3.根據(jù)權利要求I或權利要求2的方法，其中所述可檢測標記物是染料。
4.根據(jù)權利要求3的方法，其中所述染料與dsDNA結(jié)合。
5.根據(jù)權利要求4的方法，其中所述染料是嵌入染料。
6.根據(jù)權利要求3- 5中任一項的方法，其中所述染料是熒光染料。
7.根據(jù)任何權利要求6的方法，其中使用的所述染料選自SYBR綠I、SYBR綠II、CYBR金、Evagreen、卩惡唑黃、噻唑澄、picogreen、TOTO、BEBO 或 Deep Purple 中的任何一種。
8.根據(jù)權利要求I- 7中任一項的方法，其中所述參考寡核苷酸具有約60bp或更大的長度。
9.根據(jù)權利要求I- 8中任一項的方法，其中所述參考寡核苷酸具有45%或更大的GC含量。
10.根據(jù)權利要求8的方法，其中所述參考寡核苷酸具有約60bp-約170bp的長度。
11.根據(jù)權利要求9或權利要求10的方法，其中所述參考寡核苷酸具有約45%-約75%的GC含量。
12.根據(jù)權利要求I- 11中任一項的方法，其中所述參考寡核苷酸具有約IOObp的長度和約50%的GC含量。
13.根據(jù)權利要求I- 9中任一項的方法,其中所述參考寡核苷酸長于或短于所述革巴核酸。
14.根據(jù)權利要求I- 13中任一項的方法，其中所述靶核酸的擴增通過聚合酶鏈反應(PCR)法執(zhí)行。
15.根據(jù)權利要求I- 14中任一項的方法，其中單一標準曲線用于多種靶核酸擴增和定量。
16.根據(jù)權利要求15的方法，其中所述多種靶核酸擴增和定量各自在不同時間執(zhí)行。
17.根據(jù)權利要求14- 16中任一項的方法，其中所述靶核酸經(jīng)過15個循環(huán)的擴增。
18.—種用于在權利要求I - 17中任一項的方法中使用的試劑盒,其包含一種或多種參考寡核苷酸和熒光染料。
19.根據(jù)權利要求18的試劑盒，其中如果存在超過一種參考寡核苷酸，那么各自具有不同長度。
20.一種用于在權利要求I - 17中任一項的方法中使用的試劑盒，其包含用可檢測標記物來標記的一種或多種參考寡核苷酸。
21.一種用于在權利要求I - 17中任一項的方法中使用的試劑盒，其包含用可檢測標記物來標記的一種或多種參考寡核苷酸的系列稀釋。
22.根據(jù)權利要求18- 21中任一項的試劑盒，其中至少一種參考寡核苷酸長度是約60bp -約170bp，具有約45% -約75%的GC含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于基因表達研究的定量核酸的方法且特別涉及定量核酸的改良通用方法，而無需針對持家基因或合成目的基因標準化數(shù)據(jù)。
文檔編號C12Q1/68GK102725421SQ201080048692
公開日2012年10月10日 申請日期2010年9月2日 優(yōu)先權日2009年9月2日
發(fā)明者G.霍德格, H.哈, K.A.杜岡 申請人:阿庫根股份有限公司