專利名稱：：胚珠體細(xì)胞特異性啟動(dòng)子及應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體而言涉及植物中基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。
背景技術(shù)：
：異源DNA序列在植物宿主中的表達(dá)有賴于在該植物宿主中有功能的可操作地連接的調(diào)節(jié)元件的存在。啟動(dòng)子序列的選擇將決定異源DNA序列在生物體中何時(shí)和何處表達(dá)。在需要在特定組織或器官中表達(dá)的情況中，可使用組織偏好的啟動(dòng)子。在需要響應(yīng)刺激來(lái)進(jìn)行基因表達(dá)的情況中，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是首選的調(diào)節(jié)元件。相比之下，在需要在植物各細(xì)胞中連續(xù)表達(dá)的情況中，采用組成型啟動(dòng)子。在轉(zhuǎn)化載體的表達(dá)構(gòu)建體中可包括位于核心啟動(dòng)子序列上游和/或下游的另外的調(diào)節(jié)序列，以在轉(zhuǎn)基因植物中導(dǎo)致異源核苷酸序列的不同水平的表達(dá)。常常需要在植物的特定組織或器官中表達(dá)DNA序列。例如，通過(guò)遺傳操縱植物的基因組以包含可操作地連接到異源病原體抗性基因的組織偏好啟動(dòng)子，使得在所需的植物組織中產(chǎn)生病原體抗性蛋白質(zhì)，可實(shí)現(xiàn)植物對(duì)土壤和空氣傳播的病原體感染的抗性提高?；蛘?，可能需要抑制植物組織內(nèi)的天然DNA序列的表達(dá)以實(shí)現(xiàn)所需的表型。在這個(gè)情況中，可如下實(shí)現(xiàn)這種抑制對(duì)植物進(jìn)行轉(zhuǎn)化使其包含可操作地連接到反義核苷酸序列的組織偏好啟動(dòng)子，使得該翻譯序列的表達(dá)產(chǎn)生出能干擾天然DNA序列的mRNA的翻譯的RNA轉(zhuǎn)錄物。另外，可能需要在處于特定生長(zhǎng)或發(fā)育階段(例如細(xì)胞分裂或伸長(zhǎng))的植物組織中表達(dá)DNA序列。這種DNA序列可用于促進(jìn)或抑制植物生長(zhǎng)過(guò)程，從而影響植物的生長(zhǎng)速率或結(jié)構(gòu)(architecture)。為了影響植物的各種性狀和為了與可評(píng)分標(biāo)志物(scorablemarker)一起使用，需要分離和表征胚珠體細(xì)胞(somaticovule)偏好的啟動(dòng)子，特別是能在種子發(fā)育早期充當(dāng)目的分離核苷酸序列的表達(dá)的調(diào)節(jié)元件的啟動(dòng)子。
發(fā)明內(nèi)容提供了用于調(diào)節(jié)植物中的基因表達(dá)的組合物和方法。組合物包含在授粉之前、授粉過(guò)程中和授粉之后在胚珠體細(xì)胞組織中活躍的啟動(dòng)子的新型核苷酸序列。這種偏好性表達(dá)對(duì)于篩選不定胚生殖是特別合乎需要的。更具體而言，該啟動(dòng)子在胚珠中活躍，大約在受精時(shí)和在受精之前直至球形胚形成為止主要在擬南芥(Arabidopsis)的內(nèi)珠被的珠孔端。本發(fā)明的某些實(shí)施方案包括SEQIDNO:1或2所示的核苷酸序列以及SEQIDN0:1或2所示的核苷酸序列的片段。還包括SEQIDNO:1或2所示的序列的功能片段，所述功能片段驅(qū)動(dòng)可操作地連接的核苷酸序列的胚珠偏好性表達(dá)。本發(fā)明的實(shí)施方案還包括包含可操作地連接到目的異源核苷酸序列的啟動(dòng)子的DNA構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)所述核苷酸序列在植物細(xì)胞中的表達(dá)，且所述啟動(dòng)子包含本文公開(kāi)的核苷酸序列之一。本發(fā)明的實(shí)施方案還提供表達(dá)載體，以及在其基因組中穩(wěn)定摻入了如上所述的DNA構(gòu)建體的植物或植物細(xì)胞。另外，組合物包括這種植物的轉(zhuǎn)基因種子。具有這種偏好性空間和時(shí)間表達(dá)的啟動(dòng)子對(duì)于雙子葉植物中的不定胚生殖是特別合乎需要的。不定胚生殖是無(wú)孢子生殖的單性生殖(通過(guò)種子無(wú)性繁殖)的組成部分，其在使穩(wěn)定的、基于雜種的雜種優(yōu)勢(shì)維持?jǐn)?shù)代中將有用。另外的實(shí)施方案包括在植物中選擇性表達(dá)核苷酸序列的方法，該方法包括用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，并從所述植物細(xì)胞再生出轉(zhuǎn)化植物，所述DNA構(gòu)建體包含本發(fā)明的啟動(dòng)子和可操作地連接到所述啟動(dòng)子的異源核苷酸序列，其中所述啟動(dòng)子啟動(dòng)所述核苷酸序列在再生的植物中的胚珠偏好性轉(zhuǎn)錄。按這個(gè)方式，啟動(dòng)子序列可用于以組織偏好性方式控制可操作地連接的編碼序列的表達(dá)。在啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的下游將是目的序列，其將提供對(duì)植物的表型的修飾。這種修飾包括調(diào)節(jié)內(nèi)源產(chǎn)物的生成(數(shù)量、相對(duì)分布等方面)或者外源表達(dá)產(chǎn)物的生成，以在植物中提供新穎的或者經(jīng)調(diào)節(jié)的功能或產(chǎn)物。例如，涵蓋編碼這樣的基因產(chǎn)物的異源核苷酸序列，該基因產(chǎn)物賦予對(duì)除草劑、鹽、寒冷、干旱、病原體、線蟲(chóng)或昆蟲(chóng)的抗性或耐受性。在又一個(gè)實(shí)施方案中，提供了調(diào)節(jié)基因在經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物中的表達(dá)的方法，所述方法包括以下步驟(a)用包含可操作地連接到至少一條核苷酸序列的本發(fā)明啟動(dòng)子的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；(b)使該植物細(xì)胞在植物生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)；和(c)從該植物細(xì)胞再生出穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物，其中該連接的核苷酸序列的表達(dá)改變?cè)撝参锏谋硇?。圖Ia是本發(fā)明的擬南芥NUCl序列，圖Ib是本發(fā)明的經(jīng)修飾的NUCl(ALTl)序列，圖Ic是AT-NUC1PR0禾口AT-NUClPRO(ALTl)的比對(duì)。圖2是擬南芥NUCl序列和大麥NUCl序列的比對(duì)。具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及針對(duì)植物啟動(dòng)子的組合物和方法以及它們的應(yīng)用方法。組合物包含被稱為ATNUCl的胚珠體細(xì)胞組織偏好性(ovulesomatictissue-preferred)啟動(dòng)子的核苷酸序列。組合物還包含DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含ATNUCl啟動(dòng)子區(qū)的核苷酸序列和與其可操作地連接的目的異源核苷酸序列。具體而言，本發(fā)明提供包含SEQIDNO1或2所示的核苷酸序列及其片段、變體和互補(bǔ)序列的分離核酸分子。本發(fā)明的ATNUCl啟動(dòng)子序列包括可以在植物中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的核苷酸構(gòu)建體。在具體的實(shí)施方案中，ATNUCl啟動(dòng)子序列可以以組織偏好性方式、更具體而言以胚珠體細(xì)胞組織偏好性啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明的這種構(gòu)建體包括與植物發(fā)育調(diào)節(jié)相關(guān)的經(jīng)調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域。因此，本發(fā)明的組合物包括包含可操作地連接到植物啟動(dòng)子的目的核苷酸序列的DNA構(gòu)建體，所述植物啟動(dòng)子具體而言是胚珠體細(xì)胞組織偏好性啟動(dòng)子序列，更具體而言是擬南芥NUCl啟動(dòng)子序列。包含擬南芥NUCl啟動(dòng)子區(qū)的序列在SEQIDNO:1或2中示出。本發(fā)明的組合物包括天然ATNUCl啟動(dòng)子的核苷酸序列及其片段和變體。本發(fā)明的啟動(dòng)子序列可用于表達(dá)序列。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的啟動(dòng)子序列可用于在早期胚形成中表達(dá)目的序列，特別是以胚珠體細(xì)胞組織偏好性方式表達(dá)目的序列。該啟動(dòng)子在珠孔內(nèi)珠被和合點(diǎn)內(nèi)珠被和/或珠心中顯示表達(dá)模式，且表達(dá)似乎存在于授粉前幾天到授粉后幾天。本發(fā)明的核苷酸序列還可用于構(gòu)建表達(dá)載體，所述表達(dá)載體用于異源核苷酸序列隨后在目的植物中的表達(dá)，或者作為探針以分離其他胚珠體細(xì)胞組織樣啟動(dòng)子。具體而言，本發(fā)明提供分離的DNA構(gòu)建體，其包含SEQIDNO:1或2所示的ATNUCl啟動(dòng)子核苷酸序列和與其可操作地連接的目的核苷酸序列。ATNUCl的表達(dá)模式對(duì)于無(wú)孢子生殖和不定胚生殖以及其他在雙子葉作物(如大豆等)中產(chǎn)生自繁殖雜種的方式而言是特別合乎需要的。本發(fā)明涵蓋分離的或基本上純化的核酸組合物?！胺蛛x的”或“純化的”核酸分子或其生物活性部分，當(dāng)通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)基本上不含其他細(xì)胞材料或培養(yǎng)基，或者當(dāng)用化學(xué)法合成時(shí)基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)?！胺蛛x的”核酸基本上不含在該核酸的來(lái)源生物體的基因組DNA中天然地側(cè)接該核酸的序列(即位于該核酸的5'和3'端的序列)(包括蛋白質(zhì)編碼序列)。例如，在各個(gè)實(shí)施方案中，分離的核酸分子可含有少于約51Λ、4kb,3kb,2kbUkb,0.5kb或0.Ikb的在該核酸的來(lái)源細(xì)胞的基因組DNA中天然側(cè)接該核酸的核苷酸序列。本發(fā)明的ATNUCl啟動(dòng)子序列可從它們各自的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)旁側(cè)的5'非翻譯區(qū)分離。所公開(kāi)的啟動(dòng)子核苷酸序列的片段和變體也為本發(fā)明所涵蓋。具體而言，SEQIDNO:1或2的ATNUCl啟動(dòng)子序列的片段和變體可用于本發(fā)明的DNA構(gòu)建體。本文所用的術(shù)語(yǔ)“片段”指核酸序列的一部分。ATNUCl啟動(dòng)子序列的片段可保留啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的生物活性，更具體而言，以胚珠體細(xì)胞組織偏好性方式驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄。或者，可用作雜交探針的核苷酸序列片段可不必保留生物活性。ATNUCl啟動(dòng)子區(qū)的核苷酸序列的片段可為SEQIDN0:1或2的至少約20個(gè)核苷酸、約50個(gè)核苷酸、約100個(gè)核苷酸直至全長(zhǎng)。ATNUCl啟動(dòng)子的生物活性部分，可通過(guò)分離本發(fā)明的ATNUCl啟動(dòng)子序列的一部分并評(píng)估該部分的啟動(dòng)子活性來(lái)制備。作為ATNUCl啟動(dòng)子核苷酸序列的片段的核酸分子，包含至少約16、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700或800個(gè)核苷酸或者直至本文所公開(kāi)的全長(zhǎng)ATNUCl啟動(dòng)子序列中存在的核苷酸數(shù)目。本文所用的術(shù)語(yǔ)“變體”意在指與本文所公開(kāi)的啟動(dòng)子序列具有實(shí)質(zhì)相似性的序列。變體包含天然多核苷酸內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部位點(diǎn)處的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失和/或添加，和/或天然多核苷酸中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的置換。本文所用的“天然”核苷酸序列包含自然出現(xiàn)的核苷酸序列。對(duì)于核苷酸序列，可用公知的分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)鑒定自然出現(xiàn)的變體，例如用下文所述的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和雜交技術(shù)來(lái)鑒定。變體核苷酸序列還包括合成法得到的核苷酸序列，如那些例如采用定點(diǎn)誘變產(chǎn)生的核苷酸序列。通常，通過(guò)本文別處所述的序列比對(duì)程序采用默認(rèn)參數(shù)測(cè)定出，各實(shí)施方案的特定多核苷酸的變體將與該特定多核苷酸具有至少約40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性。生物活性變體也被各實(shí)施方案涵蓋。生物活性變體包括例如各實(shí)施方案的具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸置換、缺失或插入的天然啟動(dòng)子序列?？刹捎弥T如RNA印跡分析、從轉(zhuǎn)錄融合體獲得的報(bào)道分子活性測(cè)量值等技術(shù)，來(lái)測(cè)量啟動(dòng)子活性。參見(jiàn)例如Sambrook等人，(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor，N.Y.)，下文簡(jiǎn)稱“Sambrook”，將其以引用方式整體并入本文。或者，可測(cè)量在啟動(dòng)子片段或變體的控制下產(chǎn)生的報(bào)道基因(如綠色熒光蛋白(GFP)或黃色熒光蛋白(YFP)等)的水平。參見(jiàn)例如Matz等人，(1999)NatureBiotechnology17:969-973；美國(guó)專利第6，072，050號(hào)，將其以引用方式并入本文；Nagai等人，(2002)NatureBiotechnology20(1):87-90。變體核苷酸序列還涵蓋從誘變和誘重組方法(如DNA改組)得到的序列。用這種方法，可對(duì)該啟動(dòng)子的一種或多種不同的ATNUCl核苷酸序列進(jìn)行操縱以產(chǎn)生新的ATNUCl啟動(dòng)子。按這種方式，從包含具有實(shí)質(zhì)序列同一性的序列區(qū)域的相關(guān)序列多核苷酸的群體產(chǎn)生重組多核苷酸的文庫(kù)，并可將文庫(kù)在體外或體內(nèi)進(jìn)行同源重組。這種DNA改組的策略是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)例如乂61111^1·，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:10747-10751；Stemmer,(1994)Nature370:389391；Crameri等人，(1997)NatureBiotech.15:436-438;Moore等人，(1997)J.Mol.Biol.272336-347;Zhang等人，(1997)Proc.Natl.Acad.ki.USA94:4504-4509;Crameri等人，(1998)Nature391:288-291和美國(guó)專利第5，605，793號(hào)和第5，837，458號(hào)，以引用方式整體并入本文。誘變和核苷酸序列變更的方法是本領(lǐng)域公知的。參見(jiàn)例如Kunkel，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488-492；Kunkel等人，(1987)MethodsinEnzymo1.154367-382；美國(guó)專利第4，873，192號(hào)；Walker和Gaastra編輯，(1983)TechniquesinMolecularBiology(MacMillanPublishingCompany,NewYork)及其中弓I述的參考文獻(xiàn)，以引用方式整體并入本文。本發(fā)明的核苷酸序列可用來(lái)從其他生物，特別是其他植物，更具體而言其他單子葉植物分離相應(yīng)的序列。按此方式，可使用諸如PCR、雜交等之類的方法，對(duì)這類序列基于其與本文給出的序列的序列同一性來(lái)進(jìn)行鑒定?；谄渑c本文給出的完整ATNUCl序列或者與完整ATNUCl序列的片段的序列同一性而分離的序列，被本發(fā)明涵蓋。在PCR方法中，可設(shè)計(jì)寡核苷酸引物用于PCR反應(yīng)來(lái)從提取自任何目的植物的cDNA或基因組DNA擴(kuò)增相應(yīng)的DNA序列。設(shè)計(jì)PCR弓丨物和PCR克隆的方法是本領(lǐng)域公知的，在Sambrook(同上)中有公開(kāi)。另參見(jiàn)hnis等人編輯，(1990)PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(AcademicPress,NewYork)；Innis禾口Gelfand編輯，(1995)PCRStrategies(AcademicPress,NewYork)；以及hnis和Gelfand編輯，(1999)PCRMethodsManual(AcademicPress,NewYork)，以引用方式整體并入本文。已知的PCR方法包括但不限于利用成對(duì)引物、巢式引物、單一特異引物、簡(jiǎn)并引物、基因特異性引物、載體特異性引物、部分錯(cuò)配引物等的方法。在雜交技術(shù)中，已知的核苷酸序列的全部或部分被用作探針，該探針與一群克隆的基因組DNA片段或cDNA片段(即基因組或cDNA文庫(kù))中存在的其他相應(yīng)核苷酸序列選擇性雜交。雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可用諸如32P之類的可檢測(cè)基團(tuán)或任何其他可檢測(cè)標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。因此，例如，雜交用探針可通過(guò)基于本發(fā)明的ATNUCl啟動(dòng)子序列對(duì)合成的寡核苷酸進(jìn)行標(biāo)記來(lái)制備。制備雜交用探針和構(gòu)建基因組文庫(kù)的方法是本領(lǐng)域公知的，在Sambr00k(同上)中有公開(kāi)。例如，本文所公開(kāi)的完整ATNUCl啟動(dòng)子序列或其一個(gè)或多個(gè)部分，可用作能夠與相應(yīng)的雙子葉植物NUCl啟動(dòng)子序列和信使RNA特異性雜交的探針。為了在多種條件下實(shí)現(xiàn)特異性雜交，這種探針包括在各ATNUCl啟動(dòng)子序列當(dāng)中獨(dú)特的且長(zhǎng)度通常為至少約10個(gè)核苷酸或至少約20個(gè)核苷酸的序列。這種探針可用于通過(guò)PCR從選定的植物擴(kuò)增相應(yīng)的ATNUCl啟動(dòng)子序列。這個(gè)技術(shù)可用于從所需生物體分離另外的編碼序列，或者用作診斷測(cè)定法以確定編碼序列在生物體中的存在。雜交技術(shù)包括對(duì)平板(plated)DNA文庫(kù)(噬菌斑或菌落，參見(jiàn)例如(同上))的雜交篩選。這類序列的雜交可在嚴(yán)格條件下進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”或“嚴(yán)格雜交條件”意在指探針與其靶標(biāo)序列雜交的程度比其與其他序列雜交的程度可檢測(cè)地(detectably)更高(例如比背景高至少2倍)的條件。嚴(yán)格條件是序列依賴性的，在不同的環(huán)境中將會(huì)不同。通過(guò)控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，可鑒定與探針100%互補(bǔ)的靶標(biāo)序列(同源探測(cè))。或者，可調(diào)節(jié)嚴(yán)格性條件以允許序列中有一些錯(cuò)配，以使得檢測(cè)到較低程度的相似性(異源探測(cè))。通常，探針長(zhǎng)度小于約1000個(gè)核苷酸，優(yōu)選長(zhǎng)度小于500個(gè)核苷酸。通常，嚴(yán)格條件將為其中鹽濃度低于約1.5M鈉離子，通常為約0.01至1.OM鈉離子濃度(或其他鹽)，PH為7.0至8.3，對(duì)短探針(例如，10至50個(gè)核苷酸)而言溫度為至少30°C，對(duì)長(zhǎng)探針(例如超過(guò)50個(gè)核苷酸)而言溫度為至少約60°C的那些條件。嚴(yán)格條件還可通過(guò)添加去穩(wěn)定劑如甲酰胺來(lái)實(shí)現(xiàn)。示例性的低嚴(yán)格條件包括用30-35%甲酰胺、IMNaClU%SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液在37°C下雜交并在1倍至2倍SSC(20倍SSC=3.OMNaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中在50_55°C下洗滌。示例性的中等嚴(yán)格條件包括在40-45%甲酰胺、1.OMNaClU%SDS中在37°C下雜交并在0.5倍至1倍SSC中在55_60°C下洗滌。示例性的高嚴(yán)格條件包括在50%甲酰胺、IMNaCl、1%SDS中在37°C下雜交，并在0.1倍SSC中在60-65°C下進(jìn)行至少30分鐘時(shí)間的最終洗滌。雜交的持續(xù)時(shí)間通常少于約24小時(shí)，往往約4至約12小時(shí)。洗滌的持續(xù)時(shí)間將為至少足以達(dá)到平衡的時(shí)間長(zhǎng)度。特異性通常決定于雜交后的洗滌，關(guān)鍵因素為最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度。對(duì)于DNA-DNA雜交體，可由Meinkoth和Wahl，(1984)Anal.Biochem138:267沘4的方程式估計(jì)熱解鏈溫度(Tm)=Tm=81.50C+16.6(IogM)+0.41(%GC)-0.61(%form)-500/L；其中M為單價(jià)陽(yáng)離子的摩爾濃度，％GC為DNA中的鳥(niǎo)嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分?jǐn)?shù)，％form為雜交溶液中的甲酰胺的百分?jǐn)?shù)，L為雜交體的長(zhǎng)度(單位為堿基對(duì))。1為50%的互補(bǔ)靶標(biāo)序列與完美匹配的探針雜交時(shí)的溫度(在確定的離子強(qiáng)度和PH下)。每錯(cuò)配，Tm降低約1°C，因而，可調(diào)整Tm、雜交和/或洗滌條件以與具有所需同一性的序列雜交。例如，如果尋求具有90%同一性的序列，則可將Tm降低10°C。通常，將嚴(yán)格條件選擇為比特定序列及其互補(bǔ)序列在確定的離子強(qiáng)度和PH下的Tm低約5°C。然而，極嚴(yán)格條件可采用在比1低1、2、3或4°C下雜交和/或洗滌；中等嚴(yán)格條件可采用在比T1JS6、7、8、9或10°C下雜交和/或洗滌；低嚴(yán)格條件可采用在比T1JS11、12、13、14、15或20°C下雜交和/或洗滌。利用該公式，雜交和洗滌組成以及所需的Tm，普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，雜交和/或洗滌溶液的嚴(yán)格性的變化固有地得到了描述。如果所需的錯(cuò)配程度導(dǎo)致Tm低于45°C(水溶液)或320C(甲酰胺溶液)，則優(yōu)選增加SSC濃度以使得可使用較高的溫度。有關(guān)核酸雜交的詳盡指南可見(jiàn)于Tijssen，(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology—HybridizationwithNucleicAcidProbes，第I部分第2章(Elsevier,NewYork)；禾口Ausubel等人編輯，(1995)CurrentProtocolsinMolecularBiology，第2章(GreenePublishingandWiley-InterscienceiNewYork)，以弓|用方式整體并入本文。另參見(jiàn)Sambrook0因此，本發(fā)明涵蓋具有早期胚乳偏好性啟動(dòng)子活性、特別是胚珠體細(xì)胞組織偏好性啟動(dòng)子活性，且在嚴(yán)格條件下與本文所公開(kāi)的ATNUCl啟動(dòng)子序列或與ATNUCl啟動(dòng)子序列的片段雜交的分離序列。一般而言，具有啟動(dòng)子活性且與本文公開(kāi)的啟動(dòng)子序列雜交的序列，將與所述公開(kāi)的序列具有至少40%-50%同源性，約60%、70%、80%、85%、90%、95%-98%同源性或更高的同源性。也即，各序列的序列相似性可在一定范圍內(nèi)變化，共享至少約40%-50%,約60%-70%和約80%,85%,90%,95%-98%序列相似性。以下術(shù)語(yǔ)用來(lái)描述兩條或更多條核酸或多核苷酸之間的序列關(guān)系(a)“參比序列”、(b)“比較窗口”、(c)“序列同一性”、(d)“序列同一性的百分?jǐn)?shù)”和(e)“實(shí)質(zhì)同一性”。本文所用的“參比序列”是用作序列比較的基礎(chǔ)的確定的序列。參比序列可為指定的序列的子集或全部；例如作為全長(zhǎng)cDNA或基因序列的區(qū)段或者該完全cDNA或基因序列。本文所用的“比較窗口，，是指多核苷酸序列的連續(xù)和指定的區(qū)段，其中該比較窗口中的該多核苷酸序列相比于參比序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便兩條序列的最佳比對(duì)。通常，比較窗口長(zhǎng)度為至少20個(gè)連續(xù)的核苷酸，任選可為30、40、50、100個(gè)或更長(zhǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，為避免由于在多核苷酸序列中加入空位所致的與參比序列的高度相似性，通常引入空位罰分并從匹配數(shù)扣除空位罰分。將序列進(jìn)行比對(duì)以作比較的方法是本領(lǐng)域公知的。因此，對(duì)任何兩個(gè)序列之間的序列同一性百分?jǐn)?shù)的確定，可使用數(shù)學(xué)算法來(lái)完成。這類數(shù)學(xué)算法的非限制性實(shí)例有Myers和Miller，(1988)CABIOS4:11-17的算法；Smith等人，(1981)Adv.Appl.Math.2:482的算法；Needleman和Wunsch，(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的算法；Pearson和Lipman，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444-2448的算法；KarIin和Altschul,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA872:264的算法，其在Karlin和Altschul，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877中作了改進(jìn)，將這些文獻(xiàn)以引用方式整體并入本文?？衫眠@些數(shù)學(xué)算法的計(jì)算機(jī)實(shí)施進(jìn)行序列的比較，從而確定序列同一性。這類執(zhí)行包括但不限于PC/Gene程序(可獲自Intelligenetics，美國(guó)加州MountainView)中的CLUSTAL；GCGWisconsinGeneticsSoftwarePackage版本10(可獲自AccelrysInc.，9685ScrantonRoad，美國(guó)加州圣迭哥)中的ALIGN程序(版本2.0)和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用這些程序的比對(duì)可用默認(rèn)參數(shù)來(lái)進(jìn)行。CLUSTAL程序在以下文獻(xiàn)中得到很好的描述Higgins等人，(1988)Gene73:237-244(1988)；Higgins等人，(1989)CABIOS5:151-153；Corpet等人，(1988)NucleicAcidsRes.16:10881-90；Huang等人(1992)CABIOS8155-65；和Pearson等人(1994)Meth.Mol.Biol.24:307_331，將這些文獻(xiàn)以引用方式整體并入本文。ALIGN程序是基于Myers和Miller，(1988)(出處同上)的算法。當(dāng)比較氨基酸序列時(shí)，ALIGN程序可使用PAM120加權(quán)殘基表(weightresiduetable)、空位長(zhǎng)度罰分12和空位罰分4。Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403(以引用方式整體并入本文)的BLAST程序是基于Karlin和Altschul，(1990)(同上)的算法。BLAST核苷酸搜索可用BLASTN程序、得分=100、字長(zhǎng)=12來(lái)進(jìn)行，以獲得與編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質(zhì)搜索可用BLASTX程序、得分=50、字長(zhǎng)=3來(lái)進(jìn)行，以獲得與本發(fā)明蛋白質(zhì)或多肽同源的氨基酸序列。為出于比較目的獲得帶空位的比對(duì)，可如Altschul等人，(1997)NucleicAcidsRes.25:3389(以引用方式整體并入本文)中所述利用空位BLAST(在BLAST2.0中)?；蛘?，可使用PSI-BLAST(在BLAST2.0中)來(lái)進(jìn)行迭代搜索，該搜索可檢測(cè)分子之間的遠(yuǎn)源關(guān)系。參見(jiàn)Altschul等人，(1997)(出處同上)。當(dāng)采用BLAST、GappedBLAST、PSI_BLAST時(shí)，可使用各個(gè)程序的默認(rèn)參數(shù)(例如BLASTN用于核苷酸序列，BLASTX用于蛋白質(zhì))。參見(jiàn)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)網(wǎng)站www.ncbi.nlm.nih.gov。還可以以手動(dòng)方式通過(guò)檢查來(lái)進(jìn)行比對(duì)。除非另有規(guī)定，否則本文提供的序列同一性/相似性值是指使用GAP版本10用以下參數(shù)獲得的值使用GAP權(quán)重50和長(zhǎng)度權(quán)重3及nwsgapdna.cmp打分矩陣，獲得核苷酸序列的同一性百分?jǐn)?shù)和相似性百分?jǐn)?shù)；使用GAP權(quán)重8和長(zhǎng)度權(quán)重2及BL0SUM62打分矩陣或其任何等同程序，獲得氨基酸序列的同一性百分?jǐn)?shù)和相似性百分?jǐn)?shù)。本文所用的“等同程序”是任何這樣的序列比較程序，其對(duì)于任何兩個(gè)所考慮的序列，相比于GAP版本10所產(chǎn)生的相應(yīng)比對(duì)，能產(chǎn)生出具有相同的核苷酸或氨基酸殘基匹配和相同的序列同一性百分?jǐn)?shù)的比對(duì)。GAP程序利用Needleman和^msch(出處同上)的算法來(lái)尋找兩條完整序列的比對(duì)，該比對(duì)使匹配數(shù)最大而使空位數(shù)最小。GAP會(huì)考慮所有可能的比對(duì)和空位位置，并產(chǎn)生具有最大數(shù)目的匹配堿基和最少的空位的比對(duì)。其允許提供以匹配堿基數(shù)為單位的空位產(chǎn)生罰分和空位延伸罰分。GAP對(duì)于其插入的每個(gè)空位，都必須利用匹配的空位產(chǎn)生罰分?jǐn)?shù)。如果選擇大于零的空位延伸罰分，GAP對(duì)于每個(gè)插入的空位必須另外利用空位長(zhǎng)度乘以空位延伸罰分。對(duì)于蛋白質(zhì)序列，GCGWisconsinGeneticsSoftwarePackage的版本10中的默認(rèn)空位產(chǎn)生罰分值和空位延伸罰分值分別為8和2。對(duì)于核苷酸序列，默認(rèn)空位產(chǎn)生罰分為50，而默認(rèn)空位延伸罰分為3?？瘴划a(chǎn)生罰分和空位延伸罰分可以以選自0-200的整數(shù)來(lái)表示。因此，例如，空位產(chǎn)生罰分和空位延伸罰分可為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。GAP給出具有最好的比對(duì)的家族中的一個(gè)成員。這個(gè)家族可能存在許多成員，但其他成員沒(méi)有更好的品質(zhì)。GAP顯示關(guān)于比對(duì)的四個(gè)品質(zhì)因素質(zhì)量(quanlity)、比率(ratio)、同一性(identity)和相似性(similarity)。質(zhì)量是為了比對(duì)序列而被最大化的指標(biāo)(metric)。比率是質(zhì)量除以較短區(qū)段中的堿基數(shù)。同一性百分?jǐn)?shù)是實(shí)際匹配的符號(hào)的百分?jǐn)?shù)。相似性百分?jǐn)?shù)是相似的符號(hào)的百分?jǐn)?shù)。將對(duì)應(yīng)于空位的符號(hào)忽略。當(dāng)一對(duì)符號(hào)的打分矩陣值大于或等于0.50(相似性閾值)時(shí)，對(duì)相似性打分。GCGWisconsinGeneticsSoftwarePackage的版本10中使用的打分矩陣為BL0SUM62(參見(jiàn)Henikoff和Henikoff，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915,以引用方式整體并入本文).在兩條核酸或多肽序列的情形中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”是指當(dāng)在指定的比較窗口上進(jìn)行比對(duì)以獲得最大對(duì)應(yīng)時(shí)該兩條序列中相同的殘基。當(dāng)序列同一性百分?jǐn)?shù)針對(duì)蛋白質(zhì)使用時(shí)，應(yīng)認(rèn)識(shí)到，不相同的殘基位置往往差別在于保守氨基酸置換，其中氨基酸殘基被其他具有相似的化學(xué)性質(zhì)(例如電荷或疏水性)的氨基酸殘基置換，因此不會(huì)改變分子的功能性質(zhì)。當(dāng)序列差別在于保守置換，則可上調(diào)百分比序列同一性以校正置換的保守性質(zhì)。差異在于這種保守置換的序列被稱為具有“序列相似性”或“相似性”。作出這個(gè)調(diào)整的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。通常，這涉及將保守置換打分為部分錯(cuò)配而不是完全錯(cuò)配，從而提高序列同一性百分?jǐn)?shù)。因而，例如，如果相同的氨基酸給予1分，非保守置換給予0分，則保守置換給予0至1之間的分?jǐn)?shù)。保守置換的打分是(例如)如在程序PC/GENEantelligenetics，MountainView，美國(guó)加州)中所執(zhí)行那樣進(jìn)行計(jì)算。本文所用的“序列同一性百分?jǐn)?shù)”意指通過(guò)在比較窗口上比較兩個(gè)最佳比對(duì)的序列所確定的數(shù)值，其中多核苷酸序列在比較窗口中的部分與參比序列(不包含添加或缺失)相比包含添加或缺失(即空位)，以便兩個(gè)序列的最佳比對(duì)。該百分?jǐn)?shù)是這樣計(jì)算的確定在兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)目以得到匹配的位置的數(shù)目，將匹配的位置的數(shù)目除以比較窗口中的位置的總數(shù)目，然后將結(jié)果乘以100以得到序列同一性百分?jǐn)?shù)。術(shù)語(yǔ)多核苷酸序列的“實(shí)質(zhì)同一性”是指某多核苷酸與參比序列相比包含具有至少70%、優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少90%、最優(yōu)選至少95%序列同一性的序列，所述百分比是用比對(duì)程序采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)得到。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，可通過(guò)考慮密碼子簡(jiǎn)并性、氨基酸相似性、閱讀框定位等等適當(dāng)調(diào)整這些值以確定兩條核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)的相應(yīng)同一性。出于這些目的，氨基酸序列的實(shí)質(zhì)同一性通常是指至少60%、70%、80%、90%和至少95%的序列同一性。核苷酸序列實(shí)質(zhì)上相同的另一指示是兩個(gè)分子在嚴(yán)格條件下是否彼此雜交。通常，將嚴(yán)格條件選擇為比特定序列在確定的離子強(qiáng)度和PH下的Tm低約5°C。但是，嚴(yán)格條件涵蓋比Tm低約1°C至約20°C的范圍內(nèi)的溫度，取決于本文另外限定的所需嚴(yán)格性程度。在嚴(yán)格條件下不互相雜交的核酸，如果它們編碼的多肽是實(shí)質(zhì)上相同的，則它們?nèi)允菍?shí)質(zhì)上相同的。例如，當(dāng)利用遺傳密碼所允許的最大密碼子簡(jiǎn)并性產(chǎn)生一個(gè)核酸拷貝時(shí)，這可能會(huì)發(fā)生。兩條核酸序列基本上相同的一個(gè)指示是，第一核酸編碼的多肽與第二核酸編碼的多肽發(fā)生免疫交叉反應(yīng)。本文所公開(kāi)的ATNUCl啟動(dòng)子序列及其變體和片段可用于植物的遺傳工程，例如用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)基因植物，以表達(dá)目的表型。本文所用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化植物”和“轉(zhuǎn)基因植物”指在其基因組中包含異源多核苷酸的植物。通常，異源多核苷酸穩(wěn)定整合在轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)化植物的基因組中，使得該多核苷酸被傳遞到后續(xù)各代。異源多核苷酸可單獨(dú)地或者作為重組DNA構(gòu)建體的一部分整合到基因組中。應(yīng)理解，本文所用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”包括任何其基因型已因異源核酸的存在而被變更的細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，包括那些最初以此方式變更的轉(zhuǎn)基因以及那些通過(guò)從最初的轉(zhuǎn)基因進(jìn)行有性雜交或無(wú)性繁殖而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因在內(nèi)。如下產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因“事件”用異源DNA構(gòu)建體(包括包含目的轉(zhuǎn)基因的核酸表達(dá)盒)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，由于該轉(zhuǎn)基因插入到該植物的基因組中而再生出一批植株，和選出以插入到特定基因組位置中為特征的特定植株。事件通過(guò)該轉(zhuǎn)基因的表達(dá)在表型上(phenotypically)進(jìn)行表征。在遺傳水平上，事件是植物的基因構(gòu)成(geneticmakeup)的一部分。術(shù)語(yǔ)“事件”還指該轉(zhuǎn)化體和另一植物之間的有性雜交所產(chǎn)生的后代，其中該后代包含異源DNA。本文所用的術(shù)語(yǔ)植物包括整株植物、植物器官(例如葉、莖、根等)、植物細(xì)胞、植物原生質(zhì)體、從中可再生出植物的植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、在植物或植物部分中完好的植物塊和植物細(xì)胞如胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果實(shí)、仁、穗、穗軸、殼、稈、根、根尖、花粉囊等。谷粒旨在表示商業(yè)種植者出于栽培或繁殖物種之外的目的生產(chǎn)的成熟種子。再生的植物的后代、變體和突變體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，前提是這些部分包含所引入的多核苷酸。本發(fā)明可用于任何植物物種(包括但不限于單子葉植物和雙子葉植物)的轉(zhuǎn)化。植物物種的實(shí)例包括玉米(Zeamays)；蕓苔屬物種(Brassicasp.)(例如甘藍(lán)型油菜(B.napus)、蕪菁(B.rapa)、芥菜(B.jimcea))，特別是可用作種子油來(lái)源的那些蕓苔屬物禾中、苜猜(Medicagosativa)、水禾§(Oryzasativa)、漂麥(Secalecereale)、高梁(Sorghumbicolor，Sorghumvulgare)、粟(例如珍珠粟(Pennisetumglaucum)、黃米(Panicummiliaceum)、谷子(Setariaitalica)、龍爪稷(Eleusinecoracana))、向日葵(Helianthusannuus)、紅花(Carthamustinctorius)、小麥(Triticumaestivum)、大豆(Glycinemax)、煙草(Nicotianatabacum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、落花生(Arachishypogaea)、棉花(海島棉(Gossypiumbarbadense)、陸地棉(Gossypiumhirsutum))、甘薯(Ipomoeabatatus)、木薯(Manihotesculenta)、咖啡(Coffeaspp.)、椰子(Cocosnucifera)、菠蘿(Ananascomosus)、柑橘(Citrusspp.)、可可(Theobromacacao)、荼(Camelliasinensis)、香蕉(Musaspp·)、魚(yú)萼梨(Perseaamericana)、無(wú)花果(Ficuscasica)、番石^(Psidiumguajava)λS^(Mangiferaindica)λ^(Oleaeuropaea)(Caricapapaya)、腰果(Anacardiumoccidentale)、澳洲堅(jiān)果(Macadamiaintegrifolia)、杏樹(shù)(Prunusamygdalus)、用舌甘胃(Betavulgaris)^^M(Saccharumspp.)λ^^λ^^λ^菜、觀賞植物和針葉樹(shù)。蔬菜包括番前(Lycopersiconesculentum)、萵苣(例如Lactucasativa)、青豆(Phaseolusvulgaris)、利馬豆(Phaseoluslimensis)、豌豆(Lathyrusspp.)禾口黃瓜屬(Cucumis)的成員如黃瓜(C.sativus)、香瓜(C.cmtalupensis)和甜瓜(C.melo)。觀賞植物包括杜_(tái)!花(Rhododendronspp.)、八仙花(Macrophyllahydrangea)、朱槿(Hibiscusrosasanensis)、攻瑰(Rosaspp·)、郁金香(Tulipaspp·)、水仙花(Narcissusspp·)、Μ^Ψ^Ι(Petuniahybrida)λ^75(Dianthuscaryophyllus)、一品紅(Euphorbiapulcherrima)禾口菊花?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明的針葉樹(shù)包括例如松樹(shù)如火炬松(Pinustaeda)、濕地松(Pinuselliotii)、美國(guó)黃松(Pinusponderosa)、美國(guó)黑松(Pinuscontorta)和輻射松(Pinusradiata)；花方萁松(Pseudotsugamenziesii)；力口拿大鐵杉(Tsugacanadensis)；北美云杉(Piceaglauca)；紅杉(Sequoiasempervirens)；真冷杉如銀微(Abiesamabilis)和香脂冷杉(Abiesbalsamea)；和雪松如西岸紅雪松(Thujaplicata)和黃扁桕(Chamaecyparisnootkatensis)。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的植物是作物植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、蕓苔、大豆、棉花、紅花、花生、高粱、小麥、小米、煙草等等)。在其他實(shí)施方案中，玉米和大豆植物是優(yōu)選的，在另外其他實(shí)施方案中，玉米植物是優(yōu)選的。其他目的植物包括提供目的種子的谷物植物、油料種子植物和豆科植物。目的種子包括谷物種子，如玉米、小麥、大麥、水稻、高粱、黑麥等。油料種子植物包括棉花、大豆、紅花、向日葵、蕓苔、玉米、苜蓿、棕櫚、椰子等。豆科植物包括豆類(berns)和豌豆。莢果類包括瓜爾豆、槐豆、胡蘆巴、大豆、四季豆、豇豆、綠豆、利馬豆、蠶豆、小扁豆、鷹嘴豆等等。本發(fā)明的ATNUCl啟動(dòng)子所表達(dá)的異源編碼序列可用于改變植物的表型。表型的各種變化是所關(guān)注的，包括修飾基因在植物中的表達(dá)，改變植物對(duì)病原體或昆蟲(chóng)的防御機(jī)制，提高植物對(duì)除草劑的耐受性，改變植物發(fā)育以響應(yīng)環(huán)境脅迫，調(diào)節(jié)植物對(duì)鹽、溫度(熱和寒冷)、干旱的響應(yīng)等。這些結(jié)果可通過(guò)表達(dá)包含適當(dāng)基因產(chǎn)物的目的異源核苷酸序列來(lái)獲得。在具體的實(shí)施方案中，目的異源核苷酸序列是其表達(dá)水平在該植物或植物部分中得到提高的內(nèi)源植物序列?？赏ㄟ^(guò)提供一種或多種內(nèi)源基因產(chǎn)物(特別是激素、受體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子、酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或輔因子)的表達(dá)改變，或者通過(guò)影響植物中的營(yíng)養(yǎng)物吸收，來(lái)獲得結(jié)果。ATNUCl啟動(dòng)子所提供的組織偏好性表達(dá)可將表達(dá)的改變靶向所特別關(guān)注的植物部分和/或生長(zhǎng)階段，如發(fā)育中的種子組織，特別是胚珠體細(xì)胞組織。這些改變導(dǎo)致轉(zhuǎn)化植物的表型變化。在某些實(shí)施方案中，由于表達(dá)模式主要是在胚囊(胚在其中形成)的珠孔端，因此ATNUCl的表達(dá)模式特別可用于對(duì)無(wú)融合生殖、不定胚生殖、人工無(wú)孢子生殖和對(duì)自繁殖雜種的產(chǎn)生的篩選。的確，該表達(dá)模式遍布助細(xì)胞和卵細(xì)胞，且非常接近卵囊，盡管不在卵囊內(nèi)。本發(fā)明目的核苷酸序列的大體類別包括例如涉及信息的那些基因(如鋅指)、涉及通信的那些基因(如激酶)和涉及看家的那些基因(如熱休克蛋白)。轉(zhuǎn)基因的更具體的類別例如包括編碼農(nóng)藝學(xué)、昆蟲(chóng)抗性、抗病、除草劑抗性、環(huán)境脅迫抗性(對(duì)寒冷、鹽、干旱等的耐受性改變)和谷粒特性的重要性狀的基因。另外其他的轉(zhuǎn)基因類別包括用于誘導(dǎo)從植物及其他真核生物和原核生物表達(dá)外源產(chǎn)物(如酶、輔因子和激素)的基因。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，任何目的基因可可操作地連接到本發(fā)明的啟動(dòng)子并在植物中表達(dá)。影響谷粒質(zhì)量的農(nóng)藝上重要的性狀可用各實(shí)施方案的方法進(jìn)行遺傳改變，所述谷粒質(zhì)量例如飽和與不飽和油類的水平和種類、必需氨基酸的質(zhì)量和數(shù)量、纖維素含量、淀粉和蛋白質(zhì)含量。對(duì)谷粒性狀的修飾包括但不限于提高油酸、飽和與不飽和油類的含量，提高賴氨酸和硫的水平，提供必需氨基酸和修飾淀粉。玉米中的Hordothionin蛋白修飾在美國(guó)專利第5，990，389號(hào)、第5，885，801號(hào)、第5，885，802號(hào)和第5，703，049號(hào)中有描述，將這些專利以引用方式并入本文。另一個(gè)實(shí)例是1996年3月20日提交的美國(guó)專利第5，850，016號(hào)中所描述的由大豆2S白蛋白編碼的富賴氨酸和/或富硫種子蛋白，和Williamson等人，(1987)Eur.J.Biochem165:99-106中所描述的來(lái)自大麥的胰凝乳蛋白酶抑制劑，將該專利和文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容以引用方式整體并入本文。昆蟲(chóng)抗性基因可編碼針對(duì)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量大跌的害蟲(chóng)(如根蟲(chóng)、切根蟲(chóng)、歐洲玉米螟等)的抗性。這種基因包括例如蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis)毒性蛋白基因，美國(guó)專利第5，366，892號(hào)、第5，747，450號(hào)、第5，736，514號(hào)、第5，723，756號(hào)和第5，593，881號(hào)以及Geiser等人，(1986)Gene48:109，將這些專利和文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容以引用方式整體并入本文。編碼抗病性狀的基因包括例如解毒基因，如串珠鐮孢菌毒素的解毒基因(美國(guó)專利第號(hào)5，792，931)；無(wú)毒性(avr)和抗病(R)基因(Jones等人，(1994)Science266789;Martin等人，(1993)Science2621432；和Mindrinos等人，(1994)Cell78:1089)，將這些專利和文獻(xiàn)以引用方式整體并入本文。除草劑抗性性狀可包括編碼對(duì)能抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的作用的除草劑(特別是磺酰脲類除草劑)的抗性的基因(例如含有導(dǎo)致這種抗性的突變，特別是S4和/或Hra突變的乙酰乳酸合酶(ALQ基因)、編碼對(duì)能抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草劑(例如草胺膦或basta)的抗性的基因(例如bar基因)、編碼對(duì)草甘膦的抗性的基因(例如EPSPS基因和GAT基因；參見(jiàn)例如美國(guó)專利申請(qǐng)發(fā)明者M(jìn)·錢(qián)伯林,S·萊維特申請(qǐng)人:先鋒國(guó)際良種公司