專利名稱：用于檢測細(xì)胞中的替代性端粒延長(alt)活性的方法和測定法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體來說涉及用于檢測細(xì)胞的活性替代性端粒延長(AlternativeLengthening of Telomeres) (ALT)活性的方法和測定法。更具體地,在脊椎動物細(xì)胞中,本發(fā)明的方法和測定法包括檢測部分雙鏈端粒環(huán)。本發(fā)明的方法特別用于疾病診斷、疾病狀態(tài)的確定、治療方案功效的分析和新型治療劑的鑒定。
背景技術(shù)：
體細(xì)胞具有有限的增殖能力。端粒在調(diào)控細(xì)胞分裂，特別是細(xì)胞譜系 可經(jīng)歷的細(xì)胞分裂的數(shù)目中的作用是至關(guān)重要的。端粒是重復(fù)DNA序列，通常在線性染色體的末端在一條鏈上富含G(在互補鏈上富含C)。在人(實際上在大多數(shù)脊椎動物)中，染色體端粒通常包括數(shù)千拷貝的序列(5' -TTAGGG-3' )n。通常地，端粒隨著每一輪細(xì)胞分裂縮短，至少部分歸因于線性染色體末端的不完全復(fù)制。當(dāng)端粒變得太短時，這誘發(fā)正常的細(xì)胞DNA損傷修復(fù)途徑。一系列復(fù)雜的生物化學(xué)和形態(tài)學(xué)變化跟著發(fā)生，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞死亡通過復(fù)制性衰老或通過程序化細(xì)胞死亡例如細(xì)胞凋亡。衰老和細(xì)胞凋亡各自構(gòu)成調(diào)控細(xì)胞增殖的主要途徑。這些過程在例如抑制腫瘤發(fā)生以及更一般地限制疾病進(jìn)展中是有益的(參見，例如，Collado等人，2005)。在特征在于異常細(xì)胞增殖的病理學(xué)狀況例如癌癥中，正常的老化和細(xì)胞凋亡途徑被避開，從而使細(xì)胞能夠變得永生。廣義上來說，兩個替代性端粒維持機制(alternative telomere maintenancemechanism)被癌細(xì)胞用于抵抗通常伴隨線性染色體復(fù)制的固有端粒丟失。第一個機制包括使用逆轉(zhuǎn)錄酶端粒酶從RNA模板合成新端粒DNA。可選擇地，端?？赏ㄟ^被稱為替代性端粒延長(ALT) (Bryan等人，1995 ;Bryan等人，1997)的端粒酶非依賴性過程得到維持。ALT機制包括使用相同端粒或另一個端粒，或可能地染色體外端粒DNA作為拷貝模板的重組依賴性DNA復(fù)制(參見，例如，Henson等人，2002)。ALT產(chǎn)生端粒長度的突然的大的增加，與長線性端粒模板或滾環(huán)機制例如滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)相一致。許多人腫瘤的細(xì)胞利用ALT，特別是在腦、骨和結(jié)締組織中產(chǎn)生的那些(參見，例如，Bryan 等人，1997 ;Hakin_Smith 等人,2003 ；Henson 等人,2005 ；Ulaner 等人,2003 ；Villa等人，2008)，但ALT在許多癌癥中的作用和重要性的完全程度仍然未被完全闡明。對患有ALT[+]癌癥的患者的預(yù)后通常是不良的，生存中值在2至5年之間。端粒酶和ALT都代表了用于抗癌治療的有吸引性的靶，并且日益認(rèn)識到對于許多癌癥，期望具有供我們?nèi)我馐褂玫奶禺愑贏LT [+]細(xì)胞的療法和特異于端粒酶[+]細(xì)胞的療法。一個個體的特定癌癥類型的癌細(xì)胞可能利用端粒酶來維持端粒，而另一個個體中的相同癌癥類型的細(xì)胞可能利用ALT，事實上單個腫瘤內(nèi)的細(xì)胞可能利用不同的端粒維持機制。也有人認(rèn)為癌細(xì)胞在某些條件下可具有在端粒酶誘導(dǎo)的端粒維持與ALT之間轉(zhuǎn)換的能力，從而產(chǎn)生了如下可能隨著端粒酶特異性癌癥療法在臨床應(yīng)用中增加，ALT[+]癌細(xì)胞的患病率可能增加。因此，隨著ALT-特異性和端粒酶特異性療法的發(fā)展，確定在任何給定個體中癌癥是ALT[+]還是端粒酶[+]將變得愈來愈重要。
還存在對能夠抑制ALT的適當(dāng)治療劑的鑒定和開發(fā)的需要。還存在對ALT激活劑的鑒定和開發(fā)的需要，以誘導(dǎo)細(xì)胞永生化并用于例如研究衰老。然而阻礙這樣的努力的是目前不存在已知的特異于ALT的酶活性或蛋白質(zhì)。迄今為止，以例如通過在端粒酶不存在的情況下在許多群體倍增過程中平均端粒長度的維持間接地證明了 ALT活性。還通過觀察ALT[+]細(xì)胞的個別端粒長度或其它特征的快速變化、高度異質(zhì)的端粒長度分布的存在、增加的端粒重組和前髓細(xì)胞性白血病核小體中端粒DNA的存在來推斷ALT的存在。ALT活性的當(dāng)前測定法沒有一個適合用于ALT抑制劑的篩選，所述篩選需要對ALT活性的變化作出快速和線性反應(yīng)的簡單的確定性的測定法。癌癥患者的ALT活性的檢測目前需要腫瘤樣品或活檢組織的可用性；可用的技術(shù)缺乏反應(yīng)性(responsiveness)和/或靈敏度,通常不適合在常規(guī)病理實驗室中使用。存在對基于特異于ALT [+]細(xì)胞的參數(shù)的ALT活性的準(zhǔn)確、可靠和快速反應(yīng)測定法 的開發(fā)的明確需要。如本文中所公開的，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)部分雙鏈端粒DNA環(huán)的存在對于細(xì)胞內(nèi)的活性ALT機制是高度特異性的并且是其定量標(biāo)志。發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了用于確定細(xì)胞是否具有活性ALT機制的方法，所述方法包括測定部分雙鏈端粒環(huán)的存在，其中所述端粒環(huán)的存在特異于包含活性ALT機制的細(xì)胞。在其中細(xì)胞為脊椎動物細(xì)胞的實施方案中，部分雙鏈端粒環(huán)通常在環(huán)狀鏈上包含序列(CCCTAA)1J^重復(fù)并在線性鏈上包含序列(TTAGGG)1J^重復(fù)。部分雙鏈端粒環(huán)可在環(huán)狀鏈上包含序列(TTAGGG)1J^重復(fù)并在線性鏈上包含序列(CCCTAA)1J^重復(fù)。環(huán)狀和/或線性鏈可包含變異和/或突變的端粒重復(fù)序列。環(huán)狀和/或線性鏈還可包含非端粒序列。所述細(xì)胞可以是癌細(xì)胞。所述細(xì)胞可來源于患有、懷疑患有與異常細(xì)胞增殖相關(guān)的疾病或病況或?qū)λ黾膊』虿r易感的受試者。所述疾病或病況可以是癌癥。所述癌癥可以選自例如肉瘤、母細(xì)胞瘤、癌、間皮瘤或星形細(xì)胞瘤。所述肉瘤可以是骨肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、脂肪肉瘤、滑膜肉瘤、纖維肉瘤、軟骨肉瘤、橫紋肌肉瘤或平滑肌肉瘤。所述母細(xì)胞瘤可以是神經(jīng)母細(xì)胞瘤。所述癌可以是非小細(xì)胞肺癌例如肺腺癌或乳腺癌。所述間皮瘤可以是腹膜間皮瘤。所述星形細(xì)胞瘤可以是低級星形細(xì)胞瘤、間變型星形細(xì)胞瘤(anaplastic astrocytoma)或多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤?？芍苯踊蜷g接檢測部分雙鏈端粒環(huán)。例如，可使用部分雙鏈環(huán)的環(huán)狀鏈作為模板在滾環(huán)擴(kuò)增后間接檢測。在一個實施方案中，檢測包括(a)任選地從細(xì)胞分離DNA ；(b)在適當(dāng)?shù)臈l件下在DNA聚合酶和一種或多種dNTP存在的情況下溫育DNA以便聚合酶介導(dǎo)的從不完全(線性)鏈的延伸產(chǎn)生單鏈端粒DNA的多聯(lián)體；和(c)檢測所述多聯(lián)體?？赏ㄟ^任何適當(dāng)?shù)姆椒ɡ珉s交、測序、PCR、分子信標(biāo)、核酸酶例如DNA partzyme或通過在溫育步驟(b)中摻入適當(dāng)標(biāo)記的dNTP來檢測所述多聯(lián)體。所述DNA聚合酶可以是例如小29DNA聚合酶。一般地，當(dāng)所述部分雙鏈端粒環(huán)在環(huán)狀鏈上包括序列(CCCTAA)n的重復(fù)時，所述dNTP由dATP、dGTP和dTTP以及任選地dCTP組成。根據(jù)上述方面，部分雙鏈端粒環(huán)的檢測可以是存在于細(xì)胞內(nèi)的所述環(huán)的檢測，或可選擇地可包括生物樣品例如來源于受試者的生物樣品中所述環(huán)的檢測。檢測可以是直接的或間接的。所述生物樣品可包括例如血液、尿、痰、胸膜液、腹膜液、支氣管和支氣管肺泡灌洗液或組織切片。可以例如通過細(xì)針抽吸活組織檢查獲得樣品。血液可以是全血、血清或血漿。本發(fā)明的第二方面提供了用于測定細(xì)胞中的ALT活性水平的方法，所述方法包括測定部分雙鏈端粒環(huán)的量，其中所述環(huán)的量表示細(xì)胞中的ALT活性的水平。所述細(xì)胞可以是癌細(xì)胞。 本發(fā)明的第三方面提供了用于測定受試者的癌癥的ALT狀態(tài)的方法，所述方法包括(a)從受試者獲得樣品；和(b)測定樣品的部分雙鏈端粒環(huán)的存在，其中所述環(huán)的存在表示癌細(xì)胞具有ALT活性，并且所述環(huán)的不存在表示癌細(xì)胞不具有ALT活性。方法還可包括測定樣品中部分雙鏈端粒環(huán)的量，從而定量癌細(xì)胞的ALT活性的水平和/或樣品中ALT[+]細(xì)胞的量或比例。癌癥可選自例如肉瘤、母細(xì)胞瘤、癌、間皮瘤或星形細(xì)胞瘤。所述肉瘤可以是骨肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、脂肪肉瘤、滑膜肉瘤、纖維肉瘤、軟骨肉瘤、橫紋肌肉瘤或平滑肌肉瘤。所述母細(xì)胞瘤可以是神經(jīng)母細(xì)胞瘤。所述癌可以是非小細(xì)胞肺癌例如肺腺癌、乳腺癌、胃癌、腎上腺皮質(zhì)癌、卵巢癌或黑素瘤。所述間皮瘤是腹膜間皮瘤。所述星形細(xì)胞瘤可以是低級星形細(xì)胞瘤、間變型星形細(xì)胞瘤、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。本發(fā)明的第四方面提供了診斷受試者的癌癥或預(yù)測其發(fā)作的方法，其中所述癌癥顯示ALT活性,所述方法包括(a)從受試者獲得樣品；和(b)測定樣品的部分雙鏈端粒環(huán)的存在和/或量，其中所述環(huán)的存在和/或量表示受試者患有癌癥或受試者的癌癥發(fā)作的可能性。僅作為例子，受試者可被懷疑患有癌癥，或易于患所述癌癥或?qū)ζ湟赘?，可具有一個或多個發(fā)生癌癥的高風(fēng)險因子或可患有癌癥傾向綜合征(cancer predispositionsyndrome),例如維爾納綜合征、羅-湯二氏綜合征(Rothmund-Thomson Syndrome)或李佛美尼綜合征。所述方法可用作這類受試者的篩查程序的一部分，或用于更廣群體的篩查程序。本發(fā)明的第五方面提供了用于測定患有顯示ALT活性的癌癥的受試者的疾病控制的方法，所述方法包括(a)從受:試者獲得樣品；和(b)測定樣品的部分雙鏈端粒環(huán)的存在，其中所述環(huán)的存在表示受試者的疾病控制。通常，受試者可以經(jīng)歷或已經(jīng)歷癌癥的治療例如手術(shù)、化學(xué)療法或放射療法。所述方法還可包括在一段時間內(nèi)監(jiān)控受試者的疾病控制，包括在一段時間內(nèi)重復(fù)步驟(a)和(b)至少一次，和確定所述環(huán)的存在和/或量在該段時間內(nèi)是否改變。本發(fā)明的第六方面提供了用于評估患有顯示ALT活性的癌癥的受試者的治療方案的功效的方法，所述方法包括(a)使用適當(dāng)?shù)目拱┲委煼桨钢委熓茉囌?，持續(xù)足以評估所述方案的功效的時間段；(b)從受試者獲得樣品；(C)測定樣品的部分雙鏈端粒環(huán)的存在和/或量；(d)在一段時間內(nèi)重復(fù)步驟(b)和(C)至少一次；和(e)確定所述環(huán)的存在和/或量在該段時間內(nèi)是否改變，其中所述環(huán)的存在和/或量的改變表示受試者的疾病控制的改變和治療方案的功效的程度。本發(fā)明的第七方面提供了設(shè)計用于患有癌癥的受試者的適當(dāng)治療方案的方法，所述方法包括確定部分雙鏈端粒環(huán)在來源于受試者的樣品中的存在或不存在，其中所述環(huán)的存在表示ALT [+]癌，從而指示需要ALT特異性治療方案。所述環(huán)的不存在可以表示端粒酶[+]癌，從而指示需要端粒酶特異性治療方案。本發(fā)明的第八方面提供了設(shè)計用于患有顯示ALT活性的癌癥的受試者的適當(dāng)治療方案的方法，所述方法包括在用于治療癌癥的治療方案存在或不存在的情況下按照上述任意方面監(jiān)控部分雙鏈端粒環(huán)在受試者的樣品中的存在和/或不存在，和調(diào)整治療方案的本性、時間安排和/或強度，以減少或消除所述環(huán)，其中所述環(huán)的減少或消除表示ALT活性的抑制。本發(fā)明的第九方面提供了用于治療患有顯示ALT活性的癌癥的受試者的方法，包括給受試者施用按照第七或第八方面設(shè)計的治療方案。本發(fā)明的第十方面提供了用于鑒定適合調(diào)節(jié)細(xì)胞中的ALT活性的化合物的方法，所述方法包括(a)提供一種或多種顯示或能夠顯示ALT活性的細(xì)胞；(b)按照上述任意方面測量部分雙鏈端粒環(huán)的量；(C)將所述一種或多種細(xì)胞與候選化合物接觸；和(d)根據(jù)上述任意方面測定所述環(huán)的量，其中步驟(b)與(d)之間的所述環(huán)的量的變化表示候選化合物調(diào)節(jié)ALT活性的能力。步驟(b)與(d)之間的所述環(huán)的量的減少表示候選化合物抑制ALT活性的能力，而步驟(b)與(d)之間所述環(huán)的量的增加表示候選化合物激活A(yù)LT活性的能力。候選化合物可以是例如抗癌劑、假定的抗癌劑或抗衰老化合物?？顾ダ匣衔锇辜?xì)胞或抗復(fù)制衰老化合物，或抗程序化細(xì)胞死亡化合物例如抗細(xì)胞凋亡化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，上述方面和實施方案可以指癌癥的診斷、評價和治療，這些方面和實施方案也適用于與異常細(xì)胞增殖相關(guān)的其它疾病(其中ALT活性被患病細(xì)胞用作維持端粒長度的手段)的診斷、評價和治療。本發(fā)明中包括的方法特別適合于分析人細(xì)胞的ALT活性和測定人疾病例如癌癥的ALT活性水平。然而，本發(fā)明不限定于這些并且擴(kuò)展至分析任何在線性染色體末端上包含端粒序列的物種的細(xì)胞和受試者的ALT。常見地所述細(xì)胞為真核細(xì)胞，更常見地為脊椎動物細(xì)胞，更具體地為哺乳動物細(xì)胞。附圖概述現(xiàn)參考附圖，僅以非限定性實例的方式描述本發(fā)明，其中圖I是按照本發(fā)明的實施方案利用滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)的測定法的示意性舉例說明。圖2舉例說明了檢測ALT[+]細(xì)胞的C-環(huán)。A :來自ALT [+] IIICF/c細(xì)胞但非TE-85ALT [-]細(xì)胞的30ng基因組DNA的C-環(huán)(CC)測定產(chǎn)生G-鏈產(chǎn)物，所述產(chǎn)物在凝膠電泳后從孔遷移的距離最短，并且當(dāng)略去基因組DNA或Φ 29DNA聚合酶時或當(dāng)利用雙鏈特異 性核酸酶(DSN)預(yù)處理DNA時未被檢測到。顯示了雙鏈(ds)DNA標(biāo)記物的位置。B和C:利用核酸外切酶λ、1和/或V消化2 μ g限制性酶處理的IIICF/cDNA，將I. 5%經(jīng)歷CC測定
(B)，將剩余的經(jīng)歷末端限制性片段(TRF)分析(C)。D:使用和不使用引物的IOOpg M13噬菌體環(huán)狀單鏈(SS)DNA的RCA。僅對于(D)，反應(yīng)包括dCTP，利用M13特異性探針檢測到產(chǎn)物。E :顯示了來自 ALT [+] I IICF/c、SUSM-1 和 U-20S 細(xì)胞以及 ALT [-] HeLa、HT1080 和 TE-85細(xì)胞的30ng基因組DNA的CC測定。圖3舉例說明了 CC測定的靈敏度和線性。A :利用ALT[+] IIICF/c基因組DNA和C96 (96個核苷酸)C-環(huán)的系列稀釋物的CC測定的斑點印跡。將I IICF/c DNA (B)和C96C-環(huán)
(C)的CC測定水平作圖，每一個點代表一個測定。對l_32ng的IIICF/c基因組DNA(B插圖)和8-1024fg的C96C-環(huán)(C)的范圍進(jìn)行線性回歸分析，畫出最佳擬合的線。圖4舉例說明CC測定特異于ALT。在聚合酶反應(yīng)中不使用和使用dCTP的情況下，將來自18個ALT[+]細(xì)胞系(Al-18)、15個端粒酶[+]細(xì)胞系(T1-15)、5個會死的細(xì)胞株(M1-5)的基因組DNA(30ng)經(jīng)歷CC測定。在表I中鑒定了各個細(xì)胞系/株系。A :分別顯示了具有低和高增益的代表性印跡，以允許比較強和弱水平。將A4的額外樣品(但具有dCTP) (A4+dCTP)包括在不利用dCTP的實驗中以將它們針對利用dCTP的實驗標(biāo)準(zhǔn)化。對照B :僅有緩沖液；0 :無DNA ；-φ Φ29被略去。B :按照端粒維持機制將平均值在對數(shù)標(biāo)度上作圖。ALT[+]平均值的75. 2任意單位(AU)(水平棒)，顯著高于端粒酶[+]細(xì)胞的O. IOAU(p < O. 001)和會死的細(xì)胞株的O. IlAU(P = O. 007)。C:將ALT[+]細(xì)胞系的利用dCTP與不利用dCTP的CC測定的比率作圖，標(biāo)示了異常值A(chǔ)4。將其余的ALT[+]細(xì)胞系聚簇，水平棒表示它們的平均比率。D :在來自在群體倍增(pd) 211時過表達(dá)hTR的HeLa細(xì)胞(HeLa hTR)的32ng基因組DNA上進(jìn)行的CC測定，所述細(xì)胞與只表達(dá)載體的HeLa (HeLa載體；pd211)或未處理的HeLa細(xì)胞相比具有端粒dsDNA環(huán)的顯著增加。E :將平均值土平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM) (η = 3)作圖。SEM不適用于用于校正一式三份CC測定的IIICF/c。圖5舉例說明C-環(huán)在ALT激活后出現(xiàn)。A :來源于李佛美尼綜合征患者的LFS-05F-24成纖維細(xì)胞(培養(yǎng)超過200pd，危險期在pd48至50發(fā)生)(箭頭)的生長曲線。B和C :利用TRF分析(2 μ g) (B)和利用CC測定(16ng) (C)檢查在pdl7、34、60、67和92提取的基因組DNA(A中的箭頭)，將其與HT1080端粒酶[+]細(xì)胞和IIICF/c ALT[+]細(xì)胞相比較。TRF分析⑶顯示在危險期后(pd60-92)與IIICF/c ALT[+]細(xì)胞相似的長異質(zhì)端粒。在危險期后但非危險期前細(xì)胞⑶中檢測到ALT相關(guān)PML小體(APB)。端粒重復(fù)擴(kuò)增方案(TRAP)分析(B)在任何時間點上未檢測到端粒酶活性。在對數(shù)標(biāo)度(C)上，用曲線圖將CC測定結(jié)果表示為平均值土SEM，n = 3，代表性斑點印跡在圖上方。將IIICF/c用于校正一式三份CC測定。I. 55AU上的水平虛線表示5xALT[-]HT1080水平，對于ALT活性為陽性的CC測定的閾值。圖6舉例說明當(dāng)ALT被抑制時C-環(huán)快速消失。A和B =ALT活性在表達(dá)全長黃色熒光蛋白(YFP)-SplOO融合蛋白的IIICF/c克隆、IIICF/c-17和IIICF/c-10中被抑制，但在表達(dá)YFP-SplOO缺失突變體的那些細(xì)胞IIICF/c-16和IIICF/c-11中不被抑制。用圖形(B)將來自這些克隆和ALT[-]TE-85細(xì)胞的16ng基因組DNA的CC測定(A)表示為平均值土 SEM，在0. 95AU處的水平虛線表示ALT[_]對照的5x水平。C-F :在3個獨立的實驗(A-C)中利用YFP-SplOO表達(dá)構(gòu)建體瞬時感染IIICF/c細(xì)胞。通過用抗-YFP抗體進(jìn)行免疫印跡(c)來確認(rèn)感染后48小時YFP-SplOO的表達(dá)。對于每一個獨立的實驗以一式三份進(jìn)行16ngDNA (D ;上面一行)的CC測定，并且用曲線圖(E)將其表示為平均值土SEM。組合實驗(F ；n表示獨立實驗的次數(shù))顯示YFP-SplOO表達(dá)，導(dǎo)致比單獨的載體284AU顯著更低的CC測定水平34. 6AU(p = 0. 007)。G :在來自在用 YFP-SplOO 和 ALT [-]對照 TE-85 感染后 24-96小時收獲的IIICF/c細(xì)胞的16ng DNA上進(jìn)行的CC測定(下面一行)的一式三份平均值。圖7舉例說明了 ALT[+]骨肉瘤患者的血液中的C-環(huán)的增加。A :對2%的核酸外切酶處理的DNA(分離自2ml來自7個兒科骨肉瘤患者和2個正常對照NI和N2的全血)進(jìn)行CC測定。4個患者具有ALT[+]骨肉瘤CA1-CA4，3個具有ALT[-]CBl-CB3(Henson等人，2005)?；加芯哂卸鄠€在診斷后不同時間點收集的樣品。也在分離自血漿(純化自2ml來自正常對照NlP和N2P的全血)的20% DNA和來自ALT [+] IIICF/c細(xì)胞和ALT [-] TE-85細(xì)胞的16ng基因組DNA上進(jìn)行CC測定。分別利用和不用小29+和-對全血進(jìn)行CC測定。B :用曲線圖將CC測定結(jié)果表示為平均值土SEM，n = 3。對于全血樣品，首先將不利用￠29的結(jié)果從利用￠29的結(jié)果中扣除。來自ALT[+]患者的9個血液樣品的平均CC測定水平102. 8AU顯著高于來自ALT [-]患者的8個血液樣品的23. 4AU(p = 0. 012)。C和D :對患者血液樣品CA3-3(C)的一系稀釋物進(jìn)行CC測定，將其作圖(D)，每一個點代表一個實驗。對0. 4% -2% CA3-3DNA的范圍進(jìn)行線性回歸分析，畫出最佳擬合的線。圖8顯示軟組織肉瘤(STS)腫瘤的CC測定結(jié)果。在18個STS和典型的ALT[+](IIICF/c)以及端粒酶[+] (HT1080)永生化細(xì)胞系上進(jìn)行CC測定。顯示了 CC測定產(chǎn)物的斑點印跡。圖9為16個軟組織肉瘤(STS)的CC測定(C-環(huán)測定)水平的散點圖，其之前已通過APB測定法確定了它們的ALT狀態(tài)。將CC測定水平在對數(shù)標(biāo)度上作圖。CC測定水平明確地區(qū)分了 ALT [+]與ALT [-] STS。具有通過APB測定法和CC測定法測定的低ALT活性的STS可歸因于一致的低水平或其ALT活性被鄰近的ALT[_]群體稀釋的ALT[+]亞群體。

圖10為27個多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤的CC測定(C-環(huán)測定)水平的散點圖，所述腫瘤先前已通過TRF測定法確定了它們的ALT狀態(tài)。CC測定水平明確地區(qū)分了 ALT[+]與ALT[_]多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。
本文中使用的特定寡核苷酸和引物的序列(參見實施例)提供于出現(xiàn)在說明書的結(jié)尾處的正式序列表中。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，所提供的序列僅僅是示例性的并且不以任何方式限定本公開內(nèi)容的范圍。發(fā)明詳述除非上下文另外要求，否則在整個本說明書和其后的權(quán)利要求中，單詞"包括"和變形例如"包含"或"含有"將被理解為暗指包括所述整體或步驟或者整體或步驟的組，但不排除任何其它整體或步驟或整體或步驟的組。冠詞"一個/種(a)"和"一個/種(an)"在本文中用于指一個/種或超過一個/種(即，指至少一個/種)所述冠詞的賓語。例如，“一個/種元素”意指一個/種元素或超過一個/種元素。本文中所使用的術(shù)語"ALT"是指被稱為"替代性端粒延長"或端粒酶非依賴性端粒維持的端粒維持的過程。因此，在其最廣的情境中，"ALT"是指維持端粒的長度(阻止端粒縮短)的方法或機制，所述方法或機制不依賴于端粒酶的活性。通常稱為"ALT機制"，應(yīng)理解，本發(fā)明不限于ALT可籍以在細(xì)胞中運行以維持端粒的任一特定機制。因此術(shù)語“機制”一般性地用于該上下文中而非指“ALT機制”籍以運行的特定生物化學(xué)機制或途徑。實際上可存在超過一種ALT籍以運行的特定途徑。" ALT[+]"意指細(xì)胞顯示或具有ALT活性(即，是'ALT活性'細(xì)胞)，而術(shù) 語"ALT[-]"表示細(xì)胞不顯示或具有ALT活性(即為'ALT陰性'細(xì)胞)。類似的意義在本文中用于術(shù)語"端粒酶[+]"和"端粒酶[_]"，分別表示端粒酶在細(xì)胞中是有活性或無活性的。本文中所使用的術(shù)語"與……相關(guān)"，當(dāng)用于“與異常細(xì)胞增殖相關(guān)”的疾病或病況的情境中時，意指所述疾病或病況可因不受調(diào)控的或過量的細(xì)胞增殖而引起；導(dǎo)致不受調(diào)控的或過量的細(xì)胞增殖；其特征在于不受調(diào)控的或過量的細(xì)胞增殖；或與不受調(diào)控的或過量的細(xì)胞增殖相關(guān)。因此，疾病或病況與過量的細(xì)胞增殖之間的關(guān)系可以是直接或間接的并且可在時間和/或空間上分開。如本文中所使用的，術(shù)語“疾病控制”意指疾病或病況的狀態(tài)，通常是就治療疾病或病況的干預(yù)而言。因此"疾病控制"描述了作為患者的疾病的結(jié)果由他們經(jīng)歷和遭受的癥狀和病況的范圍和嚴(yán)重度。疾病控制有效地提供了在個體的疾病狀態(tài)的給定時間點上的測量，反映了由個體使用的當(dāng)前治療性治療方案和個體的最近經(jīng)歷。本文中所使用的術(shù)語"有效量"在其意義內(nèi)包括無毒的但充足的量或劑量的提供期望的作用的試劑或化合物。所需的精確量或劑量因受試者而異，取決于因素例如被治療的物種、受試者的年齡和一般狀況、被治療的病況的嚴(yán)重度、被施用的具體試劑和施用模式等。因此，不可能規(guī)定確切"有效量"。然而，對于任何給定的情況，適當(dāng)?shù)?有效量"可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員僅使用常規(guī)實驗就測定。本文中所使用的術(shù)語"核酸"、"核苷酸序列"、"寡核苷酸"和"引物"表示任何基于核酸的分子，包括DNA、cDNA、RNA、mRNA、cRNA、PNA或其任何組合。因此，核酸分子、寡核苷酸或引物可包括天然存在的核苷酸、非天然核苷酸或其組合。本文中所使用的術(shù)語“寡核苷酸”是指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基的單鏈序列、天然核苷酸的已知類似物或其混合物。寡核苷酸通常是短(例如在長度少于100個核苷酸)序列，其可通過任何適當(dāng)?shù)姆椒āɡ缰苯踊瘜W(xué)合成或適當(dāng)序列的克隆和限制性酶切來制備。通常在本發(fā)明的情境中，寡核苷酸被設(shè)計為識別和結(jié)合位于另一個核酸分子內(nèi)的特定的互補核苷酸序列。寡核苷酸還可包括除與所述互補序列雜交所需的那些堿基之外的堿基。寡核苷酸可能能夠或可能不能作用作用于聚合酶介導(dǎo)的延伸的引物。并非要求寡核苷酸中的所有堿基與所述寡核苷酸被設(shè)計用以結(jié)合的序列互補；寡核苷酸只需要包含足夠的互補堿基來使所述寡核苷酸識別并且結(jié)合該序列。寡核苷酸序列可以是未修飾的核苷酸序列或可以通過多種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行化學(xué)修飾或綴合。本文中所使用的術(shù)語"部分雙鏈端粒環(huán)"在其最廣的意義上意指包含完整的或不間斷的環(huán)狀鏈(“閉合環(huán)狀鏈”)和線性鏈的DNA分子，其中所述環(huán)狀鏈包含富含C或富含G的端粒DNA序列并且所述線性鏈包含互補的富含G或富含C的端粒DNA序列。在本公開內(nèi)容的情境中，在環(huán)狀鏈上的包含富含C的端粒序列(例如端粒重復(fù)(CCCTAA)n)的部分雙鏈端粒環(huán)被稱為"C-環(huán)"，在環(huán)狀鏈上的包含富含G的端粒序列(例如端粒重復(fù)(TTAGGG) )的部分雙鏈端粒環(huán)被稱為“G-環(huán)”。在本定義的上下文中，術(shù)語“線性”以其最廣的解釋給出，意指'非環(huán)狀'，同時"環(huán)狀"意指完整的不間斷的環(huán)狀DNA鏈。因此，線性鏈可以是具有任何長度的DNA片段或區(qū)段，其不是完整的或不間斷的環(huán)，線性鏈包含與環(huán)狀鏈雜交、從而能夠在使用閉合環(huán)狀鏈作為模板的滾環(huán)復(fù)制/擴(kuò)增機制中利用聚合酶延伸的3' 末端；或可選擇地，線性鏈包含3'末端，所述3'末端不與環(huán)狀鏈雜交但被聚合酶或其它酶復(fù)合物加工以使其能夠在使用閉合環(huán)狀鏈作為模板的滾環(huán)復(fù)制/擴(kuò)增機制中被聚合酶延伸。例如，線性鏈可以是具有足以使得能夠與環(huán)狀鏈雜交以產(chǎn)生短雙鏈區(qū)的最少核苷酸的短片段，或可包含足夠的與環(huán)狀鏈互補的序列(以便雙鏈在環(huán)狀鏈與線性鏈之間幾乎是完整的，線性鏈包含切口)以及之間的所有中間體。線性鏈還可具有不與環(huán)狀鏈雜交的一個或多個5'尾。環(huán)狀和/或線性鏈的端粒序列可以是變異或突變的端粒重復(fù)序列。除了標(biāo)準(zhǔn)端粒重復(fù)序列外，環(huán)狀和/或線性鏈還可包含變異和/或突變的端粒重復(fù)序列。"變異"和"突變的"意指端粒序列在一個或多個核苷酸位置上通過下列方式與標(biāo)準(zhǔn)端粒序列相異堿基插入、缺失或置換。環(huán)狀和線性鏈的每一種或二者還可包含非端粒序列(以便鏈作為整體可以是或可以不是富含C的或富含G的)。所述鏈通常包含足夠的端粒序列(或具有足夠的與基因組端粒序列的同源性的變異或突變的端粒序列)以使得能夠通常在生理條件下與端粒DNA雜交。因此，在上述定義的上下文中，環(huán)狀和線性鏈只需包含端粒序列而不必主要由或只由端粒序列組成而被稱為“端粒的”。也在本定義的上下文中的是，術(shù)語“部分地”包括不是完整雙鏈的雙鏈的任何程度。本文中所使用的術(shù)語"引物"是指結(jié)合單鏈模板核酸分子的特定區(qū)域并且通過酶促反應(yīng)起始核酸合成(從引物的3'末端延伸并且與模板分子的序列互補)的寡核苷酸。根據(jù)常規(guī)，引物通常稱為'正向'和'反向'引物，所述引物之一與核酸鏈互補，并且所述引物的另一個引物與該鏈的互補鏈互補。本文中所使用的術(shù)語"樣品"是指包含核酸分子(通常包含DNA和/或RNA)的任何生物樣品。樣品可以是組織、細(xì)胞或其提取物，或可以是核酸分子的純化樣品。術(shù)語"樣品"的使用不一定意指待根據(jù)本文中描述的方法測定的序列在樣品中的存在。關(guān)于疾病例如癌癥，本文中所使用的術(shù)語"狀態(tài)"是指在給定的時間、給定的受試者的疾病狀態(tài)或疾病活性。"狀態(tài)"與本文中定義的部分雙鏈端粒環(huán)的存在或不存在相關(guān)。所述部分雙鏈端粒環(huán)的不存在或其量在一段時間內(nèi)的減少可表示無活性疾病狀態(tài)，例如疾病的靜止?fàn)顟B(tài)或減輕。所述部分雙鏈端粒環(huán)的存在或其量在一段時間內(nèi)的增加可表示活性疾病狀態(tài)，其可表示例如腫瘤的大小和/或程度的生長或擴(kuò)展，或與經(jīng)歷一個或多個與疾病相關(guān)的癥狀的受試者相關(guān)聯(lián)。本文中所使用的術(shù)語“治療”和其變形是指治療病況或癥狀，預(yù)防病況或疾病的建立，或以任何方式防止、阻止、延遲或逆轉(zhuǎn)病況或疾病或其它不期望的癥狀的進(jìn)展的任何和所有用途。因此術(shù)語"治療"等以它們的最廣情境來考慮。例如，治療不一定意指患者被治療至完全恢復(fù)。治療還包括特定病癥的癥狀的改善或防止或減少發(fā)生特定病癥的風(fēng)險。迄今為止，細(xì)胞中的ALT活性的測定已被限定于與ALT或ALT的作用相關(guān)的因素或現(xiàn)象的間接測定。這類測定可以通過測量末端限制性片段(TRF)、增加的端粒重組、端粒DNA或端粒結(jié)合蛋白在前髓細(xì)胞性白血病(PML)核小體中的存在、雙鏈染色體外端粒環(huán)(t-環(huán))、增加的復(fù)制后端粒交換和增加的特定衛(wèi)星重復(fù)的不穩(wěn)定性來測量或觀察例如高度異質(zhì)的端粒長度分布的存在。然而，所測量的屬性與ALT間接相關(guān)，并且在許多情況下可具有可選擇的解釋或誘因因素。例如，也已顯示長異質(zhì)端粒和包含端粒DNA的PML核小體存在于端粒酶陽性細(xì)胞中并且不存在于某些ALT[+]細(xì)胞中。目前可獲得的測定法通常遭受對于ALT的特異性的缺乏和由此的可靠性的缺乏。增加的端粒姐妹染色單體交換和t-環(huán)還可獨立于ALT發(fā)生。以下事實證明了對于用于ALT活性的簡單、靈敏、特異性和快速反應(yīng)的測定法的需求對于日益增加的蛋白質(zhì)的數(shù)目(例如MUS81、Rad51D、FANCD2、Topo III a、BLM和 FENl)，它們對于ALT機制的意義被詢問。例如，不清楚這些蛋白質(zhì)是否直接促成ALT，或在ALT[+]細(xì)胞中是間接需要的。此外，這些蛋白質(zhì)起著其它(通常是必需的)細(xì)胞作用，并且通常抑制會顯著地降低ALT細(xì)胞的存活力，從而使ALT活性的評估非常困難。如本文中所描述的，本發(fā)明人第一次鑒定了 ALT[+]_特異性標(biāo)志物。具體地本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)部分雙鏈端粒環(huán)特異于具有活性ALT機制的細(xì)胞。這些環(huán)在ALT激活后不久出現(xiàn)并且當(dāng)ALT被抑制時快速消失。此外，已顯示這些環(huán)的水平與ALT活性的水平相關(guān)聯(lián)。因此，本文中第一次描述了基于部分雙鏈端粒環(huán)的檢測和/或定量的針對ALT活性的可靠、特異性和定量測定法。本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)打開了開發(fā)替代目前可獲得的用于測定ALT活性的方法的準(zhǔn)確的、特異性的和高效替代方法的途徑。不希望受任一理論束縛，本發(fā)明人推測根據(jù)它們的環(huán)狀性質(zhì)、精確的特異性和短的半衰期，部分雙鏈端粒環(huán)與ALT直接關(guān)聯(lián)并且可能是ALT [+]滾環(huán)擴(kuò)增中的直接中間體而非苜丨J廣品。根據(jù)一個方面，本發(fā)明提供了用于確定細(xì)胞是否具有活性ALT機制的方法，所述方法包括測定部分雙鏈端粒環(huán)的存在，其中所述環(huán)的存在特異于包含活性ALT機制的細(xì)胞。在其中細(xì)胞為脊椎動物細(xì)胞的實施方案中，部分雙鏈端粒環(huán)通常在環(huán)狀鏈上包含序列(CCCTAA)n的重復(fù)并且在線性鏈上包含序列(TTAGGG)n，或可選擇地在環(huán)狀鏈上包含序列(TTAGGG)n的重復(fù)并且在線性鏈上包含序列(CCCTAA) n。本文中描述的方法特別用于，開發(fā)用于ALT[+]疾病的診斷的測定法，用于評估ALT[+]疾病對治療的治療性反應(yīng)和最優(yōu)化這樣的治療的測定法以及用于監(jiān)控ALT[+]疾病的進(jìn)展和發(fā)展的測定法。此外，應(yīng)理解，可靠且特異性地測量ALT活性的能力打開了用于開發(fā)ALT-特異性治療劑的途徑。根據(jù)本文中描述和舉例說明的實施方案，已開發(fā)了簡單ALT活性測定法，其中通過起始滾環(huán)擴(kuò)增和隨后分析這樣的擴(kuò)增的產(chǎn)物來檢測部分雙鏈端粒環(huán)。滾環(huán)擴(kuò)增是用于檢測環(huán)狀DNA的簡單靈敏的技術(shù)。滾環(huán)擴(kuò)增是對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的天然存在的復(fù)制方法，其被用于許多研究應(yīng)用(參見，例如，Dean等人，2001 ;將其公開內(nèi)容通過引用整體并入本文)并且用于滾環(huán)擴(kuò)增的技術(shù)完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)和能力范圍之內(nèi)。通常在適當(dāng)?shù)腄NA聚合酶和脫氧核糖核苷酸存在的情況下進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增。在一些情況下，滾環(huán)擴(kuò)增提供了優(yōu)于其它可獲得的檢測技術(shù)的有利方面，例如所需的簡單恒溫聚合酶溫育為常規(guī)病理學(xué)實驗室應(yīng)用提供了方便。然而，在一些情況下，期望或必需使用檢測部分雙鏈端粒環(huán)的可選擇方法，例如PCR、測序、雜交、分子信標(biāo)、核酸酶例如DNA partzymes。用于進(jìn)行可選擇的檢測方法的技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的并且完全在其技術(shù)和能力范圍之內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)理解，通過滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的產(chǎn)物的量或產(chǎn)物的產(chǎn)生速率可以例如通過向滾環(huán)上的多重引物中加入特異性引物來增強，從而使測定更快和/或更靈敏。用于按照本發(fā)明的實施方案基于滾環(huán)擴(kuò)增檢測部分雙鏈端粒環(huán)的測定法的圖示顯示于圖I中。應(yīng)當(dāng)指出，圖I中舉例說明了本發(fā)明涉及的部分雙鏈端粒環(huán)的一個示例，但本發(fā)明的實施方案的應(yīng)用不限于該單個示例。相反地，本文中定義的所有部分雙鏈端粒環(huán)易于通過描述的方法來檢測和定量。還是看圖1，部分雙鏈端粒環(huán)(10)包含完全的(完整的)環(huán)狀鏈(11)和與環(huán)狀鏈(11)退火以形成短雙鏈區(qū)的短線性區(qū)段(12)。圖I中顯示的部分雙鏈端粒環(huán)為"C-環(huán)"，其中環(huán)狀鏈(11)包括端粒序列(CCCTAA)n，線性區(qū)段(12)包括與所述環(huán)狀鏈的區(qū)域互補的序列。在進(jìn)行測定時，在使Φ29 ΝΑ聚合酶以環(huán)狀鏈(11)用作模板在線性區(qū)段(12)的3/末端起始第二鏈合成的條件下，在dNTP dATP、dGTP和dTTP (任選地包括dCTP)存在的情況下利用Φ29 ΝΑ聚合酶(13)溫育C-環(huán)(10)。結(jié)果是單鏈端粒DNA的長線性多聯(lián)體(14)的產(chǎn)生。這些多聯(lián)體產(chǎn)物可通過任何適當(dāng)?shù)姆椒z測，例如與適當(dāng)標(biāo)記的(CCCTAA)n探針雜交、測序或PCR?？蛇x擇地，檢測可以例如通過提供適當(dāng)標(biāo)記的和可檢測的dNTP(以通過聚合酶摻入)來實現(xiàn)。Φ29 ΝΑ聚合酶是按照本發(fā)明的實施方案使用的適當(dāng)?shù)木酆厦傅囊粋€實例。Φ29 ΝΑ聚合酶是具有鏈置換能力的高度持續(xù)聚合酶(processive polymerase),其通常產(chǎn)生長度> 70kb的滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物。然而本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，具有類似特征的其它聚合酶也可用于本文中并且包括在本文中。脫氧核糖核苷酸(dNTP)通常選自dATP、dGTP、dTTP和dCTP，雖然待使用的確切dNTP將取決于部分雙鏈端粒環(huán)的序列。例如，當(dāng)環(huán)狀鏈由端粒序列CCCTAA組成時，可在僅有dATP、dGTP和dTTP存在的情況下使用DNA聚合酶進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增。如圖I中所示，借助于提供環(huán)狀DNA的短雙鏈區(qū)的線性區(qū)段，可有利地進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增而無需提供外源引物。相反地，線性區(qū)段(12)的序列用作引物，從其起始Φ29 ΝΑ聚合酶介導(dǎo)的鏈合成。如本文中所舉例說明的，按照本文中描述的(和如圖I中示意性顯示的)方法進(jìn)行的測定是靈敏的，其能夠檢測納克量的來自ALT[+]細(xì)胞的基因組DNA中的部分雙鏈端粒環(huán)，并且在I至32ng的范圍內(nèi)是線性的。同樣地如所舉例說明的，通過該測定法檢測與一組38個細(xì)胞系和不同來源的細(xì)胞株的ALT活性精確確相關(guān)的部分雙鏈端粒環(huán)未被t-環(huán)的ALT獨立性產(chǎn)生顯著增加，在時間上與ALT的激活相關(guān)，并且在ALT的抑制后快速衰減。部分雙鏈端粒環(huán)因而特異于ALT [+]細(xì)胞，并且本文中描述的方法和測定法提供了 ALT活性水平的第一定量測量。本文中另外例舉的是下列發(fā)現(xiàn)在來自ALT[+]骨肉瘤患者的血液中檢、測到部分雙鏈端粒環(huán)，這表明這類環(huán)的測定具有用于ALT[+]腫瘤的診斷和管理的臨床效用。根據(jù)本文中描述的方法，可從分離的細(xì)胞分析部分雙鏈端粒環(huán)的存在和/或量。還可按照所述方法使用來源于受試者的生物樣品。按照本發(fā)明的實施方案使用的生物樣品可包括一種或多種液體或組織樣品，包括例如血液、尿、痰、胸膜液、腹膜液、支氣管和支氣管肺泡灌洗液或組織切片。所述樣品可以包括新鮮、冷凍或貯存的生物材料。所述樣品可通過細(xì)針抽吸活組織檢查獲得，從而使得能夠分析例如來自相同腫瘤或患病組織的多個切片。在一些情況下，樣品可在從受試者提取后經(jīng)歷處理、溫育或培養(yǎng)。通常地，按照本發(fā)明應(yīng)用的生物樣品包括血液。血液可包括全血、血清或更常見地血漿。因此，本發(fā)明的實施方案涉及用于按照本文中描述的方法進(jìn)行的ALT活性的簡單的基于血液的測試法的開發(fā)和實施。 在一些實施方案中，可在分析之前從細(xì)胞提取基因組DNA?？蛇x擇地，可另外處理細(xì)胞以使DNA可用于分析，例如可以在或可以不在對細(xì)胞蛋白質(zhì)進(jìn)行變性或降解的情況下使用細(xì)胞裂解物。也可在或不在之前固定和/或交聯(lián)的情況下在細(xì)胞通透化后原位進(jìn)行分析。用于固定、交聯(lián)和通透化的技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的。易于使用本文中描述的方法和測定法分析和/或治療的疾病可以是其中ALT機制被用作端粒維持的手段的任何疾病。在本文中描述和舉例說明的具體實施方案中，所述疾病是癌癥，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本公開內(nèi)容的范圍不限于此。僅舉例說明，所述癌癥可以是肉瘤、母細(xì)胞瘤、癌、間皮瘤或星形細(xì)胞瘤。所述肉瘤可以是例如骨肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、脂肪肉瘤、滑膜肉瘤、纖維肉瘤、軟骨肉瘤、橫紋肌肉瘤或平滑肌肉瘤。所述母細(xì)胞瘤可以是例如神經(jīng)母細(xì)胞瘤。所述癌可以是例如非小細(xì)胞肺癌例如肺腺癌、乳腺癌、胃癌、腎上腺皮質(zhì)癌、卵巢癌或黑素瘤。所述間皮瘤可以是例如腹膜間皮瘤。所述星形細(xì)胞瘤可以是例如低級星形細(xì)胞瘤、間變型星形細(xì)胞瘤或多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。應(yīng)理解，本發(fā)明的范圍不限于舉例說明的癌癥和腫瘤?？砂l(fā)現(xiàn)其它癌癥和腫瘤、事實上特征在于異常細(xì)胞增殖或與異常細(xì)胞增殖相關(guān)的其它疾病或病況利用ALT作為端粒維持的手段。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本文中描述的方法和測定法適用于特征在于或與異常細(xì)胞增殖相關(guān)的任何疾病或病況，所述疾病或病況利用ALT作為端粒維持的手段。此外，本發(fā)明的實施方案用于患有腫瘤傾向綜合征例如維爾納綜合征、羅-湯二氏綜合征和李佛美尼綜合征的受試者的評估、管理和癌癥診斷。本文中描述的本發(fā)明的實施方案提供了 ALT[+]疾病例如癌癥的診斷和ALT[+]疾病的發(fā)作可能性的預(yù)測。還提供了其中ALT活性的測定可用作處于發(fā)生ALT[+]疾病的風(fēng)險中的受試者的篩查測試。例如，可以例如憑借遺傳易感性、家族史或已暴露或正暴露于一個或多個高風(fēng)險因子(例如生物化學(xué)、行為和環(huán)境的)來將這類受試者鑒定為屬于處于發(fā)生特定疾病的高風(fēng)險的組。例如，受試者可具有腫瘤傾向綜合征例如維爾納綜合征、羅-湯二氏綜合征或李佛美尼綜合征(其中ALT[+]腫瘤已被發(fā)現(xiàn)(Henson，2006))，或可處于患非小細(xì)胞肺癌的增加風(fēng)險中；85%的來自肺和支氣管的癌癥為非小細(xì)胞肺癌并且8%的這類癌癥為ALT[+] (Henson，2006)?？蛇x擇地，還可使用本文中公開的方法進(jìn)行更廣群體的疾病篩查程序。本文中描述的實施方案提供了用于評估受試者的疾病例如癌癥的狀態(tài)，監(jiān)控受試者的疾病隨時間的狀態(tài)，評估治療或疾病管理方案的功效以及為個體設(shè)計適當(dāng)?shù)闹委熁蚣膊」芾矸桨傅姆椒ê蜏y定法。例如，本發(fā)明的方法和測定法可包括確定獲自患有與ALT活性相關(guān)的疾病的受試者的適當(dāng)樣品中部分雙鏈端粒環(huán)的水平是否在表示疾病的滿意控制或管理的預(yù)定范圍內(nèi)。預(yù)定范圍外的水平可以表示需要改變受試者的疾病治療或管理以改進(jìn)疾病控制，或應(yīng)當(dāng)將受試者置于適當(dāng)?shù)闹委煼桨钢?。類似地，部分雙鏈端粒環(huán)水平隨著時間的相對改變也可表示疾病的滿意控制或管理，或需要改變以改進(jìn)疾病治療和/或管理?？稍诮o定的時間段內(nèi)重復(fù)分析一次或多次以隨著時間的監(jiān)控受試者的疾病狀態(tài)。受試者的疾病狀態(tài)的測定，特別是隨著時間的狀態(tài)的監(jiān)控，也有利于對用于個別受試者的最適干預(yù)或治療方案作出決策。類似地，檢測部分雙鏈端粒環(huán)在樣品中的存在或不存在允許確定疾病為ALT [+]還是端粒酶[+]，從而影響待施用的療法。對于ALT[+]疾病，通?？啥ㄖ浦委煼桨敢垣@得隨著時間的部分雙鏈端粒環(huán)水平的降低，從而與ALT活性的抑制或ALT[+]細(xì)胞的殺死相關(guān)聯(lián)。在治療方案被啟動后，可存在部分雙鏈端粒環(huán)水平的初始增加，表示細(xì)胞死亡，然后這類環(huán)的水平隨著時間的降低表 示ALT[+]疾病細(xì)胞的流行率的降低。例如，這可包括引入新治療方案或改變現(xiàn)有方案以改善疾病癥狀或其它參數(shù)。方案的改變可以是關(guān)于多個因素(例如任何現(xiàn)有藥劑的性質(zhì)、其劑量、施用的時間安排和/或任何補充性的疾病管理策略)中的任一個或多個的改變。關(guān)于治療方案的這樣的決策將視病例而變化，最適合策略的確定完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力和經(jīng)驗范圍內(nèi)。例如，ALT活性是多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的目前最好的預(yù)后指標(biāo)(Hakin-Smith等人，2003)，并且與增至3倍的生存中值相關(guān)聯(lián)，雖然該存活率仍然較低。無論基于血液還是基于腫瘤樣品，按照本文中描述的方法進(jìn)行的測定具有允許常規(guī)鑒定多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中的ALT[+]組的潛力。同樣地例如，約50%的骨肉瘤為ALT[+] (Ulaner等人，2003 ；Henson等人，2005)并且ALT活性似乎不影響對目前化療方案的反應(yīng)。對術(shù)前化療方案的反應(yīng)是骨肉瘤的主要預(yù)后因子，然而目前其只可在完成術(shù)前化療后，對通過手術(shù)切除術(shù)除去的腫瘤進(jìn)行組織學(xué)分析來回顧性地確定。在術(shù)前化療過程中測定腫瘤抗性的特定測定法的開發(fā)將允許制定更具有攻擊性或靶向性的術(shù)前治療方案，所述治療方案可在殺死腫瘤細(xì)胞和增加患者存活率上更加成功。血漿DNA的水平在成功治療后的癌癥患者中可能顯著降低，反之可能以高水平持續(xù)或增加，缺乏對治療的反應(yīng)。此外，在本公開內(nèi)容的情境中，也可評估特定治療在殺死腫瘤細(xì)胞中的功效，其中腫瘤細(xì)胞死亡暫時導(dǎo)致在細(xì)胞死亡(例如細(xì)胞凋亡或壞死)的時期內(nèi)血漿中部分雙鏈端粒環(huán)的量的增加。因此，ALT活性的定量血液測試可幫助測定每一個化療周期后存活的ALT[+]骨肉瘤細(xì)胞的水平?？捎^察到部分雙鏈端粒環(huán)的量的初始增加，其表示細(xì)胞死亡，之后觀察到這類環(huán)的量的減少，表示剩下的ALT [+]骨肉瘤細(xì)胞的豐度降低。從而，由定量血液測試獲得的信息可允許定制術(shù)前化學(xué)療法來增加非反應(yīng)性和ALT[+]患者組的存活率。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可在臨床試驗的情境中確定疾病治療的功效的評估，在該情況下，如果待試驗的療法對于ALT [+]或ALT[_]疾病之一更加有效(相對于針對另一疾病)，則可能期望將正在進(jìn)行試驗的受試者分層。因此，本發(fā)明的實施方案涉及本文中描述的測定法用于測定受試者或受試者組的癌癥的ALT狀態(tài)的用途，所述分層可用于將反應(yīng)不良的受試者或受試者組從試驗中除去。
用于按照本發(fā)明 的方法治療/管理受試者的與ALT活性相關(guān)的疾病的治療方案可包括施用通常用于治療所述疾病的任何藥劑，例如在癌癥的情況下一種或多種化療劑或放射療法。所述治療方案可包括同時、相繼或彼此組合地施用多種藥物。施用的藥物類型、施用的劑量和頻率可由醫(yī)生按照接受的醫(yī)療原則來確定，并且將取決于因素例如疾病的嚴(yán)重度、受試者的年齡和體重、受試者的醫(yī)療史、受試者服用的其它藥劑、現(xiàn)有疾病和當(dāng)確定治療時通常考慮的任何其它健康相關(guān)因素。本文中還提供了基于檢測本文中公開的部分雙鏈端粒環(huán)的存在或不存在或其水平的改變鑒定能夠調(diào)節(jié)ALT活性的化合物和試劑的方法。所鑒定的化合物和試劑可以是ALT的抑制劑或激活劑。在具體的方面，提供了用于鑒定適合用于調(diào)節(jié)細(xì)胞的ALT活性的化合物的方法，所述方法包括提供一種或多種顯示或能夠顯示ALT活性的細(xì)胞；按照上述任意方面測定部分雙鏈端粒環(huán)的量；將所述一種或多種細(xì)胞與候選化合物接觸；以及按照上述任意方面測定所述環(huán)的量，其中所述測定之間的所述環(huán)的量的改變表示候選化合物調(diào)節(jié)ALT活性的能力。所述環(huán)的量的減少表示候選化合物抑制ALT活性的能力，而所述環(huán)的量的增加表示候選化合物激活A(yù)LT活性的能力。當(dāng)所述方法用于鑒定ALT抑制劑時，所提供的一種或多種細(xì)胞通常是ALT[+]的。當(dāng)所述方法用于鑒定ALT的激活劑時，所提供的一種或多種細(xì)胞可以是ALT[+]或ALT[_]的；在八1^[+]細(xì)胞的情況下，部分雙鏈端粒環(huán)的增加表示化合物激活A(yù)LT的能力，在ALT[_]細(xì)胞的情況下，部分雙鏈端粒環(huán)的出現(xiàn)表示化合物激活A(yù)LT的能力?？蓪凑毡景l(fā)明的方法檢測本文中公開的部分雙鏈端粒環(huán)所需的所有必需成分一起裝配在試劑盒中。所述試劑盒可包括用于檢測和定量部分雙鏈端粒環(huán)水平的適當(dāng)成分、適當(dāng)?shù)年栃院完幮詫φ?、稀釋緩沖液、試劑(例如dNTP;酶)、引物等。還可標(biāo)準(zhǔn)化這類試劑、緩沖液、對照等以適合用于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于分析樣品例如血液樣品的許多裝置中的任一裝置。試劑盒還可包括有利于應(yīng)用本文中公開的方法的裝置和/或軟件，例如包括基于測定的部分雙鏈端粒環(huán)水平測定或計算預(yù)后的適當(dāng)?shù)挠嬎銠C軟件。通常，所述試劑盒包括用于進(jìn)行本發(fā)明的方法(任選地與教導(dǎo)性信息一起)和用于基于使用本發(fā)明的方法和試劑盒獲得的結(jié)果的治療推薦的說明書。本說明書中對任何現(xiàn)有出版物(或來源于其的信息)或?qū)σ阎娜魏蝺?nèi)容的參考不被，并且應(yīng)當(dāng)不被認(rèn)為是對現(xiàn)有出版物(或來源于其的信息)或已知的內(nèi)容形成本說明書涉及的努力的領(lǐng)域中的共同的一般知識的部分的承認(rèn)或認(rèn)可或任何形式的建議。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，可對本發(fā)明進(jìn)行許多變化和/或變動而不背離廣泛描述的本發(fā)明的精神或范圍。因此，提出的實施方案在所有方面被認(rèn)為是舉例說明性的而不是限制性的?，F(xiàn)將參考下列具體實施例來描述本發(fā)明，所述實施例不應(yīng)當(dāng)解釋為以任何方式限定本發(fā)明的范圍。
實施例一般方法患者樣品經(jīng)Westmead兒童醫(yī)院的人類研究道德委員會批準(zhǔn)獲得患者樣品。全血樣品由CHW腫瘤組織標(biāo)本庫(CHW Tumour Bank) (_80°C貯存)提供。來自37歲的李佛美尼綜合征患者的皮膚樣品LFS-05由kConFab提供；使用短串聯(lián)重復(fù)分析法(short tandem repeatprofiling)由CellBank Australia確認(rèn)從該皮膚培養(yǎng)的危險期前和危險期后成纖維細(xì)胞的來源。DNA提取和定量通過用2% SDS緩沖液裂解和利用100 μ g/ml鏈霉蛋白酶(Pronase) (Sigma)降解蛋白質(zhì)而從細(xì)胞沉淀提取DNA。在SDS和鹽沉淀蛋白質(zhì)后，從上清液使用乙醇沉淀DNA。使用QIAamp DNA Blood Mini試劑盒(Qiagen)從全血提取DNA用于實施例2。通過在4°C離心10分鐘從新鮮收集的血液純化血漿兩次(第一次以1，600x g，然后以16，OOOx g)，將其快速冷凍，于-80°C下忙存，使用QIAamp UltraSens Virus試劑盒(Qiagen)提取DNA。在 Qubit 突光計(Invitrogen)上定量 ssDNA 和 dsDNA。DNA的核酸酶處理按照制造商的說明書使用雙鏈特異性核酸酶(DSN ;Evrogen)40U/y g、λ核酸外切酶(NEB) 12. 5單位/ μ g、IOOU/ μ g的核酸外切酶I (NEB)和30U/ μ g的核酸外切酶V (DNA酶，ATP-依賴性的；USB)。通過HinfI和RsaI限制性酶(NEB)預(yù)處理、利用O. 15U/y gA核酸外切酶和I. 5U/ μ g核酸外切酶I反復(fù)降解、最后利用60U/樣品核酸外切酶V消化來除去全血線性DNA。C-環(huán)測定("CC測定")其中利用4U/ μ g HinfI和RsaI限制性酶(NEB)以及25ng/ μ g RNA酶(不含DNA酶；Roche)消化適當(dāng)?shù)幕蚪MDNA。可選擇地，在一些實驗(實施例5)中，渦旋樣品替代對限制性酶消化或RNA酶處理的需要。將所有DNA溶液于-80°C下貯存在IOmM Tris[pH7. 6]中。將 10 μ I 樣品與 10 μ I O. 2mg/ml BSA、0. 1% Tween、各 ImM 的 dATP、dGTP 和 dTTP、1ΧΦ29緩沖液和7. 5單位的Φ29 ΝΑ聚合酶(NEB)組合，在30°C下溫育8小時，然后在65°C溫育20分鐘。只有當(dāng)提及時，ImM dCTP也被包括在聚合酶反應(yīng)中。為了進(jìn)行定量，以一式三份進(jìn)行CC測定。利用2X SSC將反應(yīng)產(chǎn)物稀釋至60 μ 1，將其斑點印跡至2Χ SSC浸濕的Biodyne B尼龍膜(Pall)上。通過紫外光(UV)將DNA交聯(lián)至膜上，隨后將膜在37°C下于PerfectHyb Plus雜交緩沖液(Sigma)中與末端標(biāo)記的32P-(CCCTAA) 3雜交。就熒光屏的線性范圍最優(yōu)化曝光，在STORM 860光學(xué)掃描儀上利用ImageQuant軟件(MolecularDynamics)掃描所述熒光屏，使用邊緣扣除以進(jìn)行本底校正。為了進(jìn)行大小分離，將反應(yīng)產(chǎn)物在 O. 6% SeaKem Gold 瓊脂糖(Lonza) -O. 5X Tris-硼酸鹽-EDTA 中以 1.75V/cm 進(jìn)行電泳，進(jìn)行12小時。將凝膠在真空下于60°C進(jìn)行干燥，在2X SSC中進(jìn)行洗滌，在37°C下用5XSSC、5X Denhardt' s溶液、O. 5mM焦磷酸四鈉和IOmM正磷酸氫二鈉溫育2小時，然后加入末端標(biāo)記的32P-(CCCTAA)3并且溫育過夜。用O. IX SSC在37°C洗滌凝膠，將其就斑點印跡膜成像。C96C-環(huán)和 M13DNA通過使用接頭5' -TGATATGGGGGGAATTGA-3 ' (SEQ ID NO :2)和 T4DNA 連接酶(NEB)環(huán)化 96 個堿基的寡核苷酸 5' -CCCATATCACTAA (CCCTAA) 12CCTCAATTCCC_3' (SEQ IDNO 1)來產(chǎn)生0960環(huán)。用8(^核酸外切酶1(肥8)消化未連接的寡核苷酸和游離接頭2次。邊界接頭(Bound linker)在CC測定中用作C96的引物。如先前所述(Dean等人,2001),利用Y -GTAAAACGACGGCCagt-3/ (SEQ ID NO :3 ;3個:V末端核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵)引發(fā)M13環(huán)M13mpl8ssDNA(NEB)，利用80U核酸外切酶I消化線性ssDNA 2次。將引發(fā)的M13環(huán)用于CC測定，將dCTP加入反應(yīng)混合物中，利用5' -ACAGGAAACAGCTATGAC-3' (SEQID NO 4)進(jìn)行探測。端粒維持狀態(tài)基本上如先前所述進(jìn)行末端限制性片段(TRF)長度(Perrem等人，2001)、APB檢測(Henson等人，2005)和免疫沉淀-TRAP (Pickett等人，2009)，后者利用產(chǎn)物的常規(guī)PCR檢測。免疫印跡在進(jìn)行免疫印跡(如由Jiang等人,2005所描述的)后,利用小鼠抗-綠色熒光 蛋白(BD Bioscience)、兔抗-RAD51 (Calbiochem)、兔抗-SMC5 (Bethyl Laboratory)和兔抗-MMS21 (來自R Potts博士)探測膜。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染、克隆和短干擾RNA通過將EYFP-Sp 100(來自 David Spector 博士)克隆入 pLXSN(Clontech)的多克隆位點來產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN-YFP-SplOO。在75cm2培養(yǎng)瓶中利用Fugene 6 (Roche)將等摩爾量的 pLXSN-YFP-SplOO (或僅 pLXSN)、pVPack-GP (gag-pol 表達(dá)載體；Statagene)和PMD2-VSVG包膜載體(來自Dr Luigi Naldini)，總共16 μ g DNA共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞。在第48和72小時收獲含有病毒的上清液,將其通過O. 45 μ m Ministart過濾器(Sartorius)過濾，在100，000MWC0 Vivaspin-20濃縮器(Sartorius)中濃縮50倍。向6孔板中的指數(shù)生長的IIICF/c細(xì)胞中加入Iml DMEM (具有8 μ g/μ I聚凝胺(polybrene))中的150μ1的新鮮濃縮物。按照制造商的說明書利用短干擾RNA(SiRNA)和jetPRIME (Polyplus-Transfection)處理細(xì)胞。所使用的siRNA寡核苷酸特異于SMC5 (5'-GAAGCAAGAUGUUAUAGAAdTdT-3' ) (SEQ ID NO :5)、MMS21(5' -CUCUGGUAUGGACACAGCUdTdT-3' ) (SEQ ID NO 6)和 RAD51 (經(jīng)驗證的 siRNA ；QIAGEN ；SI02663682)。數(shù)據(jù)分析對于之前的結(jié)果和患者數(shù)據(jù)，所有分析是盲測的。利用線性回歸分析評價CC測定的線性。利用雙尾t檢驗或曼-懷二氏檢驗(Mann-Whitney test)比較CC測定分布。誤差條表不SEM。實施例I-可通過滾環(huán)擴(kuò)增在ALT [+]細(xì)胞中檢測到部分雙鏈端粒環(huán)本發(fā)明人已開發(fā)了使用滾環(huán)擴(kuò)增檢測部分雙鏈端粒環(huán)的測定法。如本文中所舉例說明的，可將所述測定法(下文中稱為"CC測定")用于例如檢測C-環(huán)，通過環(huán)的不完整G-鏈(線性鏈)區(qū)段的Φ 29-介導(dǎo)的延伸，從而產(chǎn)生長端粒ssDNA多聯(lián)體(參見圖I)。使用30ng基因組DNA進(jìn)行CC測定，在瓊脂糖凝膠電泳后，在ALT [+] IIICF/c細(xì)胞中但非ALT[-]TE-85細(xì)胞中檢測到產(chǎn)物(參見圖2A)。IIICF/c細(xì)胞中的CC測定底物為(i)端粒，如通過dCTP (不是進(jìn)行RCA所必需的)，以及通過利用端粒G-鏈特異性探針檢測到產(chǎn)物所證明的；(ii)部分雙鏈的，如通過它們的自身引發(fā)(self-priming)的能力和由雙鏈特異性核酸酶(所述酶消化雙鏈DNA但非單鏈(ss)DNA) (DSN ;圖2A)產(chǎn)生的破壞顯示；和(iii)環(huán)狀的，如通過以下發(fā)現(xiàn)所證明盡管降解了大多數(shù)線性端粒DNA(圖2C)，但核酸外切酶X、1和V不減少CC測定產(chǎn)物(圖2B)。環(huán)狀模板也是通過滾環(huán)擴(kuò)增(圖2A)產(chǎn)生高分子量產(chǎn)物所必需的，如從M13環(huán)狀ssDNA產(chǎn)生的那些(圖2D)。
通過在CC測定中包括dCTP并利用端粒C-鏈-雜交探針“末端標(biāo)記的32P-(TTAGGG) 3”進(jìn)行探測，也在ALT[+]細(xì)胞系IIICF/c “Saos-2和U-20S”中但非在端粒酶[+]細(xì)胞系“HeLa、MG63和TE-85”中檢測到G-環(huán)。檢測到的G-環(huán)水平為ALT [+]細(xì)胞系中的C-環(huán)水平的1/100 (使用含有I. 6kb的端粒序列的變性質(zhì)粒來校正C-鏈-和G-鏈-雜交探針)。來自對ALT[+]和ALT[_]細(xì)胞進(jìn)行的CC測定的任何低分子量產(chǎn)物的不存在(圖2E)表示斑點印跡適合用于定量。本發(fā)明人還評估了對ALT [+] I IICF/c基因組DNA和C96 (包含96個核苷酸的C-環(huán))的系列稀釋物的CC測定(圖3)。來自Ing ALT [+]基因組DNA (lOOIIICF/c細(xì)胞當(dāng)量)的信號超過來自無DNA和ALT[_]對照的信號。CC測定水平在l_32ng的32倍范圍內(nèi)與 IIICF/c DNA 線性地成比例(R2 = 0. 990，p < 0. 001 ;圖 3B)。CC測定也與8-1024fg(128倍的線性范圍)的純C96C-環(huán)線性地成比例(R2 =0. 996，p < 0. 001 ;圖 3C)。20ng IIICF/c 基因組 DNA 具有等于 180fg C96C-環(huán)的 CC 測定信號，表明每IIICF/c細(xì)胞存在約1000個C-環(huán)。如果假定更大的C-環(huán)具有多個引發(fā)位點或允許比C96更好地接近0 29，那么實際數(shù)目可能更小。實施例2-部分雙鏈端粒環(huán)特異于ALT本發(fā)明人使用實施例I中描述的CC測定法測定了 18個ALT[+]細(xì)胞系和由15個端粒酶[+]細(xì)胞系和5個會死的細(xì)胞系組成的ALT[-]組。結(jié)果示于表I和圖4A中。表I.細(xì)胞系/株CC測定結(jié)果
權(quán)利要求
1.用于確定細(xì)胞是否具有活性ALT機制的方法，所述方法包括測定部分雙鏈端粒環(huán)的存在，其中所述環(huán)的存在特異于包含活性ALT機制的細(xì)胞。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述部分雙鏈端粒環(huán)在環(huán)狀鏈上包含序列(CCCTAA)n的重復(fù)并且在線性鏈上包含序列(TTAGGG) n。
3.權(quán)利要求I的方法，其中所述部分雙鏈端粒環(huán)在環(huán)狀鏈上包含序列(TTAGGG)n的重復(fù)并且在線性鏈上包含序列(CCCTAA) n。
4.權(quán)利要求I至3的任一項的方法，其中所述環(huán)狀鏈和/或線性鏈包含變體和/或突變的端粒重復(fù)序列。
5.權(quán)利要求I至4的任一項的方法，其中所述環(huán)狀鏈和/或線性鏈還包含非端粒序列。
6.權(quán)利要求I至5的任一項的方法，其中所述細(xì)胞是癌細(xì)胞。
7.權(quán)利要求I至6的任一項的方法，其中所述細(xì)胞來源于患有、懷疑患有與異常細(xì)胞增殖相關(guān)的疾病或病況或?qū)λ黾膊』虿r易感的受試者。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述疾病或病況是癌癥。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述癌癥選自肉瘤、母細(xì)胞瘤、癌、間皮瘤或星形細(xì)胞瘤。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述肉瘤選自骨肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、脂肪肉瘤、滑膜肉瘤、纖維肉瘤、軟骨肉瘤、橫紋肌肉瘤和平滑肌肉瘤。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述母細(xì)胞瘤是神經(jīng)母細(xì)胞瘤。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述癌是非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、胃癌、腎上腺皮質(zhì)癌、卵巢癌或黑素瘤。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述非小細(xì)胞肺癌是肺腺癌。
14.權(quán)利要求9的方法，其中所述間皮瘤是腹膜間皮瘤。
15.權(quán)利要求9的方法，其中所述星形細(xì)胞瘤是多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。
16.權(quán)利要求I至15的任一項的方法，其中在使用部分雙鏈環(huán)狀端粒DNA作為模板進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增后檢測到所述部分雙鏈端粒環(huán)。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述檢測包括 (a)任選地從細(xì)胞分離DNA； (b)在適當(dāng)?shù)臈l件下在DNA聚合酶和一種或多種dNTP存在的情況下溫育DNA以便聚合酶介導(dǎo)的從不完全(線性)鏈的延伸產(chǎn)生單鏈端粒DNA多聯(lián)體；和 (c)檢測所述多聯(lián)體。
18.權(quán)利要求17的方法，其中通過雜交、測序、PCR、分子信標(biāo)、核酸酶或通過在溫育步驟(b)中摻入適當(dāng)標(biāo)記的dNTP來檢測所述多聯(lián)體。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述DNA聚合酶是Φ29 ΝΑ聚合酶。
20.權(quán)利要求I至19的任一項的方法，其中在來源于受試者的生物樣品中檢測到所述部分雙鏈端粒環(huán)。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述生物樣品包括血液、尿、痰、胸膜液、腹膜液、支氣管或支氣管肺泡灌洗液或組織切片。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述血液是全血、血清或血漿。
23.用于測定細(xì)胞中的ALT活性的水平的方法，所述方法包括測定部分雙鏈端粒環(huán)的量，其中所述環(huán)的量表示細(xì)胞中的ALT活性的水平。
24.用于測定受試者中的癌癥的ALT狀態(tài)的方法，所述方法包括； (a)從受試者獲得樣品；和 (b)測定樣品的部分雙鏈端粒環(huán)的存在， 其中所述環(huán)的存在表示癌細(xì)胞具有ALT活性，并且所述環(huán)的不存在表示癌細(xì)胞不具有ALT活性。
25.權(quán)利要求24的方法，其還包括測定樣品中部分雙鏈端粒環(huán)的量，從而定量癌細(xì)胞中的ALT活性的水平和/或樣品中ALT[+]細(xì)胞的量或比例。
26.用于診斷受試者的癌癥或預(yù)測其發(fā)作的方法，其中所述癌癥顯示ALT活性，所述方法包括 (a)從受試者獲得樣品；和 (b)測定樣品的部分雙鏈端粒環(huán)的存在和/或量， 其中所述環(huán)的存在和/或量表示受試者患有癌癥或受試者的癌癥發(fā)作的可能性。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述受試者被懷疑患有癌癥，易于患所述癌癥或?qū)ζ湟赘校哂幸粋€或多個發(fā)生癌癥的高風(fēng)險因子或患有癌癥傾向綜合征。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述癌癥傾向綜合征為維爾納綜合征、羅-湯二氏綜合征或李佛美尼綜合征。
29.用于測定患有顯示ALT活性的癌癥的受試者中的疾病控制的方法，所述方法包括 (a)從受試者獲得樣品；和 (b)測定樣品的部分雙鏈端粒環(huán)的存在， 其中所述環(huán)的存在表示受試者中的疾病控制。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述受試者正在經(jīng)歷或已經(jīng)歷癌癥的治療。
31.權(quán)利要求29或30的方法，其還包括隨時間監(jiān)控受試者的疾病控制，包括在一段時間內(nèi)重復(fù)步驟(a)和(b)至少一次，和確定所述環(huán)的存在和/或量在該段時間內(nèi)是否改變。
32.用于評估患有顯示ALT活性的癌癥的受試者中的治療方案的功效的方法，所述方法包括 (a)使用適當(dāng)?shù)目拱┲委煼桨钢委熓茉囌?，持續(xù)足以評估所述方案的功效的時間段； (b)從受試者獲得樣品； (C)測定樣品的部分雙鏈端粒環(huán)的存在和/或量； (d)在一段時間內(nèi)重復(fù)步驟(b)和(c)至少一次；和 (e)確定所述環(huán)的存在和/或量在該段時間內(nèi)是否改變， 其中所述環(huán)的存在和/或量的改變表示受試者中的疾病控制的改變和治療方案的功效的程度。
33.設(shè)計用于患有癌癥的受試者的適當(dāng)治療方案的方法，所述方法包括確定部分雙鏈端粒環(huán)在來源于受試者的樣品中的存在或不存在，其中所述環(huán)的存在表示ALT[+]癌，從而指示需要ALT特異性治療方案。
34.設(shè)計用于患有顯示ALT活性的癌癥的受試者的適當(dāng)治療方案的方法，所述方法包括在用于治療癌癥的治療方案存在或不存在的情況下，按照任何上述方面監(jiān)控部分雙鏈端粒環(huán)在受試者的樣品中的存在和/或不存在，和調(diào)整治療方案的本性、時間安排和/或強度，以減少或消除所述環(huán)，其中所述環(huán)的減少或消除表示ALT活性的抑制或ALT[+]細(xì)胞的殺死。
35.用于治療患有顯示ALT活性的癌癥的受試者的方法，包括給受試者施用按照權(quán)利要求33或34設(shè)計的治療方案。
36.用于鑒定適合調(diào)節(jié)細(xì)胞中的ALT活性的化合物的方法，所述方法包括 (a)提供一種或多種顯示或能夠顯示ALT活性的細(xì)胞； (b)按照任何上述方面測量部分雙鏈端粒環(huán)的量； (C)將所述一種或多種細(xì)胞與候選化合物接觸；和 (d)根據(jù)任何上述方面測定所述環(huán)的量， 其中步驟(b)與(d)之間的所述環(huán)的量的變化表示候選化合物調(diào)節(jié)ALT活性的能力。
37.權(quán)利要求36的方法，其中步驟(b)與(d)之間所述環(huán)的量的減少表示候選化合物抑制ALT活性的能力，而步驟(b)與(d)之間所述環(huán)的量的增加表示候選化合物激活A(yù)LT活性的能力。
38.權(quán)利要求36或37的方法，其中所述候選化合物是抗癌劑、假定的抗癌劑或抗衰老化合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測細(xì)胞中的活性的替代性端粒延長(ALT)活性的方法和測定法。所述方法和測定法包括檢測或測定部分雙鏈端粒環(huán)，其中所述環(huán)的存在特異于包含活性ALT機制的細(xì)胞。在一些實施方案中，所述方法特別用于測定細(xì)胞中的ALT活性水平，測定受試者中的癌癥的ALT狀態(tài)，診斷和/或治療疾病，測定疾病狀態(tài)，分析治療功效和鑒定新型治療劑。
文檔編號C12Q1/68GK102639713SQ201080048175
公開日2012年8月15日 申請日期2010年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月22日
發(fā)明者J·D·漢森, R·R·雷戴爾 申請人:兒童醫(yī)學(xué)研究所