一種對(duì)細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性原位成像的納米探針及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種可對(duì)細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性進(jìn)行原位成像檢測(cè)的納米探針及其制備方法。納米探針以金納米粒子(AuNP)為載體，負(fù)載特殊設(shè)計(jì)的DNA分子信標(biāo)(MB)。該MB為莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，并帶有一個(gè)缺口，將整個(gè)DNA序列分為兩段：較短的一段是端粒酶引物序列(TSP)；較長(zhǎng)的一段(1-MB)含環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其莖部3’端的巰基可共價(jià)連接AuNP，5’端修飾熒光分子Cy5。由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移，Cy5的熒光被AuNP猝滅，納米探針的熒光狀態(tài)為“關(guān)”。將探針與細(xì)胞溫育，探針進(jìn)入細(xì)胞后，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)端粒酶的作用下，TSP被延長(zhǎng)并發(fā)生內(nèi)部鏈取代，使1-MB環(huán)被打開，導(dǎo)致Cy5離開AuNP表面，將熒光狀態(tài)轉(zhuǎn)換為“開”，進(jìn)而利用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察Cy5的熒光，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的原位成像分析。該探針可區(qū)分腫瘤和正常細(xì)胞，還可用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性在端粒酶抑制藥物作用下的變化，因此該發(fā)明具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種對(duì)細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性原位成像的納米探針及其制備方法
一、【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種可對(duì)細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性原位成像的納米探針及其制備方法。
二、【背景技術(shù)】
[0002]人端粒酶是一種核糖核蛋白的復(fù)合體，通過其內(nèi)部的RNA模板，可將長(zhǎng)度為六個(gè)堿基的DNA重復(fù)片段合成到端粒末端。在正常細(xì)胞內(nèi)，端粒的長(zhǎng)度隨著細(xì)胞復(fù)制周期的進(jìn)行而不斷縮短，最終導(dǎo)致細(xì)胞衰老和凋亡。然而在多種腫瘤細(xì)胞中，由于端粒酶的激活，端粒的長(zhǎng)度得以維持，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的無限繁殖。腫瘤轉(zhuǎn)移組織中，端粒酶活性通常也是高度表達(dá)的。因此，端粒酶被認(rèn)為是一種很有前景的腫瘤標(biāo)志物，端粒酶活性的檢測(cè)對(duì)腫瘤的診斷，治療和監(jiān)測(cè)具有重要的意義。
[0003]自從1985年端粒酶被發(fā)現(xiàn)以來，一大批檢測(cè)端粒酶活性的方法被提出，主要分為三類:基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的端粒重復(fù)擴(kuò)增方法(TRAP)，等溫DNA擴(kuò)增或DNA酶方法，以及基于納米材料的生物傳感檢測(cè)方法。這些方法具有令人滿意的靈敏度和檢測(cè)限，但是大部分都是利用細(xì)胞提取液進(jìn)行端粒酶檢測(cè)，無法提供活細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的直接信息。
[0004]金納米粒子(AuNP)作為固定DNA的良好底物，可通過金-巰基共價(jià)鍵將DNA連接到表面上，還可以保護(hù)DNA在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的影響下不被降解。因此AuNP特別適合作為進(jìn)入細(xì)胞的載體運(yùn)輸識(shí)別和信號(hào)分子。
[0005]為了簡(jiǎn)化細(xì)胞內(nèi)端粒酶檢測(cè)的步驟，提高檢測(cè)靈敏度，該專利制備的納米探針為端粒酶響應(yīng)的熒光“關(guān)-開”結(jié)構(gòu)，只有在端粒酶的作用下才會(huì)發(fā)光，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞酶端粒酶活性的原位成像和檢測(cè)。通過比較不同細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，可區(qū)分腫瘤和正常細(xì)胞，利用藥物作用后細(xì)胞內(nèi)熒光的變化，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性對(duì)藥物響應(yīng)的動(dòng)態(tài)檢測(cè)。
三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是:基于端粒酶的催化作用，設(shè)計(jì)包含端粒酶引物和熒光分子的分子信標(biāo)，共價(jià)組裝在AuNP表面，得到對(duì)細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性原位成像檢測(cè)的納米探針。利用分子信標(biāo)在端粒酶作用下的延長(zhǎng)打開環(huán)結(jié)構(gòu)，改變熒光分子與AuNP表面的距離，實(shí)現(xiàn)納米探針熒光的端粒酶響應(yīng)性恢復(fù)。以Hela宮頸癌細(xì)胞系為模型，制備的探針實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的原位“關(guān)-開”熒光成像和檢測(cè)，以及端粒酶抑制藥物作用后細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性變化的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。通過對(duì)多種細(xì)胞進(jìn)行成像，證實(shí)探針可用于區(qū)分腫瘤和正常細(xì)胞。
[0007]本發(fā)明提出的可對(duì)細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性進(jìn)行原位成像的納米探針如圖1所示。以AuNP為載體，在其表面負(fù)載帶一個(gè)缺口、含TSP序列和莖環(huán)結(jié)構(gòu)的MB，得到該納米探針。
[0008]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
[0009]I)具有端粒酶響應(yīng)性的帶一個(gè)缺口的MB由兩個(gè)部分組成:較短的一段是TSP ;較長(zhǎng)的一段(1-MB)可形 成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在莖部3’端有可共價(jià)連接AuNP的巰基，在5’端修飾有Cy5，3’端的莖可以與TSP的延長(zhǎng)產(chǎn)物互補(bǔ)雜交。[0010]2)納米探針以AuNP為載體，將TSP，1-MB與AuNP混合后，TSP與1-MB雜交形成的MB通過金-巰基共價(jià)鍵組裝在金納米粒子表面，如圖1所示。
[0011]本發(fā)明的工作原理:
[0012]本發(fā)明的工作原理如圖2所示，所述的可對(duì)細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性進(jìn)行原位成像的納米探針以AuNP為載體，在其表面上組裝含TSP并標(biāo)記有Cy5的MB。在沒有端粒酶存在時(shí)，由于MB的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，Cy5靠近AuNP表面，其熒光被AuNP通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移而猝滅，納米探針的熒光狀態(tài)為“關(guān)”。將納米探針與細(xì)胞共溫育，探針進(jìn)入細(xì)胞后，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)端粒酶的作用下，MB內(nèi)部的TSP被延長(zhǎng)，其延長(zhǎng)部分與1-MB的3’端莖互補(bǔ)雜交而導(dǎo)致內(nèi)部鏈取代，從而打開MB的環(huán)，使Cy5遠(yuǎn)離AuNP表面，熒光信號(hào)恢復(fù)。通過激光共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的原位成像和檢測(cè)。利用所述的納米探針對(duì)端粒酶抑制藥物作用后的細(xì)胞進(jìn)行端粒酶活性成像，可以分析藥物對(duì)細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的影響并對(duì)其進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。通過比較不同細(xì)胞在探針作用后的共聚焦熒光圖像，可以區(qū)分腫瘤和正常細(xì)胞。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點(diǎn):
[0014]本發(fā)明基于AuNP對(duì)DNA鏈的保護(hù)功能和易于修飾的特點(diǎn)，制備的MB納米探針可被端粒酶特異性識(shí)別，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的開關(guān)可控原位熒光成像和檢測(cè)，并且可用于監(jiān)測(cè)藥物作用下細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的變化，還可以區(qū)分腫瘤和正常細(xì)胞。與已有的端粒酶檢測(cè)方法相比，本發(fā)明具備以下優(yōu)點(diǎn):
[0015]1.本發(fā)明所述的納米探針制備方法簡(jiǎn)便，細(xì)胞毒性低，通過與細(xì)胞進(jìn)行“一步溫育”，即可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)端 粒酶活性的原位熒光成像和檢測(cè)。該方法無需細(xì)胞破碎及其它預(yù)處理步驟，與已有方法相比更有優(yōu)勢(shì)。
[0016]2.本發(fā)明涉及的MB為含端粒酶引物片段TSP、帶缺口的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，TSP可在端粒酶作用下延長(zhǎng)并導(dǎo)致MB內(nèi)部發(fā)生鏈取代反應(yīng)，使得MB的環(huán)被打開而發(fā)生構(gòu)型變化，從而實(shí)現(xiàn)具有端粒酶響應(yīng)特異性的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。
[0017]3.本發(fā)明涉及的探針以AuNP為基底，結(jié)合熒光共振能量轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的熒光猝滅作用和端粒酶響應(yīng)控制的MB構(gòu)型改變，實(shí)現(xiàn)了由生物分子識(shí)別來控制的熒光從猝滅到恢復(fù)的轉(zhuǎn)換機(jī)制。
[0018]4.本發(fā)明所述的納米探針充分利用AuNP對(duì)DNA鏈的保護(hù)作用和金-巰基共價(jià)鍵的穩(wěn)定性，使探針在細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)都具有很好的穩(wěn)定性。
四、【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1.納米探針的結(jié)構(gòu)及合成示意圖
[0020]圖2.納米探針對(duì)細(xì)胞內(nèi)端粒酶原位成像檢測(cè)的原理圖
五、【具體實(shí)施方式】
[0021]實(shí)施例1:結(jié)合圖1,合成可對(duì)細(xì)胞內(nèi)端粒酶原位成像的納米探針
[0022]將10 μ Ll-MB (100 μ Μ)和 10 μ L TSP (100 μ Μ)與 ImLAuNP (13nm, 5ηΜ)混合后，在室溫下攪拌過夜。然后將0.1mL含有2MNaCl的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)逐滴加入到上述混合液中穩(wěn)定納米探針。將上述溶液離心并用PBS洗滌后，重新分散在ImL PBS中，得到MB納米探針，于4°C條件下保存。
[0023]實(shí)施例2:結(jié)合圖2，利用納米探針進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的原位成像
[0024]以HeLa宮頸癌細(xì)胞系為基本模型，將HeLa細(xì)胞(0.5mL, I X IOW1)種在20_mm共聚焦培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24h。然后將25 μ L探針加入培養(yǎng)皿并溫育1.5h,利用激光共聚焦突光顯微鏡進(jìn)行觀察。在端粒酶陽(yáng)性的HeLa細(xì)胞中，探針表面的MB被打開，熒光恢復(fù)，因此在共聚焦顯微圖像上可以看到細(xì)胞質(zhì)中的熒光信號(hào)。將端粒酶抑制藥物兒茶素(125yg)與HeLa細(xì)胞(0.5mL, I X IOW1)共溫育48h，然后加入25 μ L探針并溫育1.5h，用共聚焦顯微鏡觀察，可看到細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)的明顯降低，說明細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性受到藥物的抑制。將探針分別與不同種類的腫瘤細(xì)胞(HeLa，BGC，MCF，BEL)和正常細(xì)胞(QSG)溫育后進(jìn)行熒光觀察，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的熒 光信號(hào)明顯強(qiáng)于正常細(xì)胞，說明腫瘤細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性高表達(dá)。
【權(quán)利要求】
1.一種可對(duì)細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性進(jìn)行原位成像檢測(cè)的納米探針，其特征為以金納米粒子(AuNP)為載體，負(fù)載帶有一個(gè)缺口的DNA分子信標(biāo)(MB)。該MB為莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，并帶有一個(gè)缺口，將MB分為兩段:較短的一段是端粒酶引物序列(TSP);較長(zhǎng)的一段(1-MB)含環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其莖部3’端的巰基可共價(jià)連接AuNP，5’端修飾熒光分子Cy5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米探針，其特征在于可特異性響應(yīng)端粒酶，對(duì)細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性實(shí)現(xiàn)“關(guān)-開”可控的原位熒光成像檢測(cè)。同時(shí)還可以區(qū)分腫瘤和正常細(xì)胞，并動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性在端粒酶抑制藥物作用下的變化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的納米探針，其特征在于所用MB為莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，并帶有一個(gè)缺口，將其分為兩段:較短的一段是TSP序列；較長(zhǎng)的一段ι-MB含環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其莖部3’端的巰基可共價(jià)連接AuNP，5’端修飾有Cy5。在端粒酶作用下，TSP被延長(zhǎng)，導(dǎo)致內(nèi)部鏈取代，從而打開1-MB的環(huán)，實(shí)現(xiàn)MB的響應(yīng)性結(jié)構(gòu)改變。所述TSP的核苷酸序列為:5’ -AATCCG TCG AGC AGA GTT-3’ ； 1-MB 的序列為:5’-Cy5_AGG GTT (AAA) 7AAC CCTAAC TCT GCT CGA CGGATT-SH-3，。
4.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的納米探針，其特征在于其熒光“關(guān)-開”的轉(zhuǎn)換是通過MB環(huán)狀結(jié)構(gòu)的“關(guān)-開”轉(zhuǎn)換來實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)MB為環(huán)狀關(guān)閉結(jié)構(gòu)時(shí)，Cy5的熒光被AuNP猝滅，當(dāng)環(huán)被打開時(shí)，Cy5遠(yuǎn)離AuNP表面,突光恢復(fù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的納米探針，其特征在于在探針進(jìn)入細(xì)胞后，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)端粒酶的作用下通過內(nèi)部鏈取代打開MB環(huán)，從而恢復(fù)熒光，用共聚焦顯微鏡觀察Cy5的熒光恢復(fù)情況來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi) 端粒酶活性的原位成像與檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/02GK103993078SQ201410193997
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年5月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月9日
【發(fā)明者】鞠熀先, 丁霖, 錢若燦 申請(qǐng)人:南京大學(xué)