檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒的rt-lamp核酸試紙條試劑盒及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒及應(yīng)用。該試劑盒包含核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1～6所示的引物組和核酸檢測(cè)試紙條。該試劑盒的使用方法如下：首先配制RT-LAMP反應(yīng)體系，包含AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、1倍反應(yīng)緩沖液、鏈置換DNA聚合酶、dNTP混合物、甜菜堿、MgSO4、FIP引物、BIP引物、LoopF引物、LoopB引物、F3引物、B3引物以及待測(cè)樣品RNA；恒溫反應(yīng)所得產(chǎn)物用核酸檢測(cè)試紙條檢測(cè)后直接進(jìn)行判讀：陽(yáng)性結(jié)果為出現(xiàn)兩條紅色條帶，一條位于檢測(cè)區(qū)內(nèi)，另一條位于質(zhì)控區(qū)內(nèi)。該試劑盒操作簡(jiǎn)單、成本低廉，反應(yīng)結(jié)果易于觀察，特異性好，易于大范圍推廣應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]豬傳染性胃腸炎(transmissiblegastroenteritisof swine, TGE)是由冠狀病毒科(coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus)豬傳染性胃腸炎病毒(transmissiblegastroenteritisvirus, TGEV)引起豬的一種高度接觸性腸道疾病。該病以嘔吐、嚴(yán)重腹灣和失水為特征，各種年齡和品種的豬均易感，尤其是兩周齡以內(nèi)的仔豬感染后致死率可高達(dá)100%，雖然5周齡以上豬的死亡率很低，但這些豬通常成為僵豬，飼料報(bào)酬低。該病是導(dǎo)致世界各養(yǎng)豬國(guó)家仔豬早期死亡的重要疫病之一。
[0003]臨床資料顯示早在1933年，美國(guó)依利諾斯州就關(guān)于TGEV的記載，但直到1945年Doyle和Hutchings才確定該病的病原為病毒，日本1956和英國(guó)1957年先后報(bào)道TGE的發(fā)生與流行，自此之后歐美亞等多個(gè)國(guó)家相繼報(bào)道發(fā)生了 TGEV的傳播流行，現(xiàn)已成為一種世界性病毒性傳染疫病。我國(guó)從20世紀(jì)50年代起就有發(fā)生TGE流行的報(bào)道，1956年臺(tái)灣省首次分離到TGEV，到目前為止我國(guó)大部分省市(自治區(qū))都有該病的發(fā)生流行，近年來(lái)有流行加劇的趨勢(shì)，尤其是冬季和早春寒冷季節(jié)常呈地方性爆發(fā)流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成極大危害。
[0004]TGEV屬于冠狀病毒屬,是一種多形性有囊膜的病毒。TGEV核酸為單股RNA,病毒粒子呈圓形或橢圓形，直徑約為90~160nm，外膜上覆有花瓣?duì)罾w突，纖突長(zhǎng)(約18~24nm)而稀疏，末端呈球狀，直徑IOnm左右。某些病毒粒子在以磷鎢酸負(fù)染后，可見到一個(gè)電子透明中心或沒(méi)有特征的核心，其內(nèi)部具有一個(gè)`呈串珠樣的絲狀物。病毒粒子由3種主要結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成，一種是磷蛋白(N，即核蛋白)，它包裹著基因組RNA;另一種是膜結(jié)合蛋白(M或El)，主要包埋在脂質(zhì)囊膜中；第三種為大的糖蛋白(S或E2)，它形成病毒的突起。據(jù)推測(cè)，E2在決定宿主細(xì)胞親嗜性方面起作用，還具有膜融合作用，使病毒核蛋白進(jìn)入細(xì)胞漿，E2還攜帶主要的B淋巴細(xì)胞抗原決定簇，在提高獲得免疫力中可能起關(guān)鍵作用。
[0005]TGE病毒只有一個(gè)血清型，各毒株之間有密切的抗原關(guān)系，但也存在廣泛的抗原異質(zhì)性。TGE病毒與豬血凝性腦脊髓炎病毒和豬流行性腹瀉病毒無(wú)抗原相關(guān)性，但與豬呼吸道冠狀病毒有交叉保護(hù)。TGE病毒與狗冠狀病毒(CCV)和貓冠狀病毒(FIPV)之間都有抗原相關(guān)性。通過(guò)血清中和試驗(yàn)和間接免疫熒光法證明，TGE病毒與CCV、TGE病毒與FIPV之間存在雙相交叉反應(yīng)，只是同源病毒的中和滴度高于異源病毒。因此，這三種病毒在流行病學(xué)、診斷和免疫方面有一定的關(guān)系。
[0006]由于豬傳染性胃腸炎的臨床癥狀與豬流行性腹瀉病毒以及豬輪狀病毒引起疾病的臨場(chǎng)癥狀十分相似，因此不能從臨床癥狀上對(duì)豬傳染性胃腸炎進(jìn)行確診。因此在實(shí)驗(yàn)室建立豬傳染性胃腸炎病毒的診斷是十分必要的。目前，有許多技術(shù)可用于PEDV的檢測(cè)，如免疫熒光法、免疫組織化學(xué)技術(shù)、直接電鏡、免疫電鏡、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、阻斷ELISA、鏈霉親和素-生物素技術(shù)、原位雜交法、競(jìng)爭(zhēng)阻斷ELISA。然而這些檢測(cè)方法不但費(fèi)時(shí)，而且特異性和敏感性較低。
[0007]環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)是由日本學(xué)者Notomi于2000年開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，該技術(shù)利用4種不同的特異性引物識(shí)別靶基因的6個(gè)特定區(qū)域，通過(guò)一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等溫條件下進(jìn)行革巴序列高效快速擴(kuò)增。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已將該技術(shù)廣泛應(yīng)用于病原體檢測(cè)。Hong TC等人(Development and evaluation of a novel loop-mediated isothermal amplificationmethod for rapid detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus.ClinMicrobiol, 2004May ；42(5):1956-61)于 2004 年根據(jù) LAMP 原理設(shè)計(jì)了實(shí)時(shí)定量RT-LAMP方法，以快速檢測(cè)SARS-Cov，結(jié)果RT-LAMP的靈敏度是RT-PCR的100倍；MasakiImai 等人(Rapid diagnosis of H5Nlavian influenza virus infection by newlydeveloped influenza H5hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermalamplification method.Virol Methods.2007May; 141 (2): 173-80.)于 2007 年建立了快速診斷H5N1禽流感病毒的RT-LAMP檢測(cè)體系。由于LAMP的擴(kuò)增產(chǎn)物是白色焦磷酸鎂沉淀，用肉眼難以觀察，日本已研制出專門對(duì)LAMP產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控的濁度儀。但是濁度儀的使用不但增加了費(fèi)用，而且不方便攜帶；有學(xué)者利用往反應(yīng)后的體系中加入SYBR Green I染料的方法來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，但是這樣觀察又必需開蓋處理，LAMP擴(kuò)增的高效性及高敏感性使得產(chǎn)物中含有大量目的片段，開蓋添加染料極其容易污染環(huán)境。后來(lái)，有研究對(duì)LAMP方法作進(jìn)一步改進(jìn)，在原有LAMP反應(yīng)試劑的基礎(chǔ)上添加鈣黃綠素和氯化錳后，可以衍生出另外一種更為簡(jiǎn)便的可視化LAMP，一步即可完成LAMP擴(kuò)增及結(jié)果判定，LAMP產(chǎn)物無(wú)需開蓋分析即可用肉眼觀察結(jié)果。但這種方法因存在假陽(yáng)性率過(guò)高、弱陽(yáng)性結(jié)果的判別不夠準(zhǔn)確、且鈣黃綠素與錳離子的濃度配比體系不穩(wěn)定等缺點(diǎn)而使該方法的應(yīng)用推廣受到限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，該試劑盒具有高靈敏度、高特異性、可視化、操作方法簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。
`[0009]本發(fā)明的另一目的在于提供實(shí)現(xiàn)上述檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，包含如下引物組和核酸檢測(cè)試紙條:
[0011]所述的引物組的核苷酸序列如下所示:
[0012]F3:5， -CAAGAGACACTACGCCTAAG-3，；
[0013]B3:5， -AATGCTGGACACAGATGG-3，；
[0014]FIP:5，-GGCTGAACTACTTCGAGTTCCAACACACCTGGAAGAGAAC-3，；
[0015]BIP:5’ -GGTGACAGTGACCTTGTTGCACATTCGGCCAATTGTGG-3’
[0016]LoopF:5’ -Biotin-TCTTGTCACATCACCTTTACCTG_3’ ；
[0017]LoopB:5，-FITC-GGAGCAGTGCCAAGCATTAC-3，；
[0018]所述的核酸檢測(cè)試紙條為通用型核酸檢測(cè)試紙條；[0019]所述的檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒優(yōu)選包含上述引物組和全封閉式靶核酸擴(kuò)增物快速檢測(cè)裝置；
[0020]所述的全封閉式靶核酸擴(kuò)增物快速檢測(cè)裝置為杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；該檢測(cè)裝置是通過(guò)將通用型核酸檢測(cè)試紙條置入一個(gè)掌上塑料檢測(cè)裝置內(nèi)得到的；
[0021]所述的檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，還包含dNTP混合物溶液、MgSO4溶液、反應(yīng)緩沖液、鏈置換DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)、甜菜堿(Betaine)溶液和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶；
[0022]所述的檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒更優(yōu)選為包含濃度為5U/μ L的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、10倍反應(yīng)緩沖液(10 X ThermoPol Reaction Buffer)、濃度為8U/L的鏈置換DNA聚合酶、濃度為2.5mmol/L的dNTP混合物溶液、濃度為lOmol/L的甜菜堿溶液、濃度為lOOmmol/L的MgSO4溶液、濃度為10 μ mol/L的引物FIP、濃度為10 μ mol/L的引物BIP、濃度為10 μ mol/L的引物F3、濃度為10 μ mol/L的引物B3、濃度為10 μ mol/L的引物L(fēng)oopF和濃度為10 μ mol/L的引物L(fēng)oopB ；
[0023]所述的檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒的應(yīng)用，包含以下步驟:
[0024](I)配制RT-LAMP反應(yīng)體系，按終濃度計(jì)算，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶為105U/L、10倍反應(yīng)緩沖液(10 X ThermoPol Reaction Buffer)為 I 倍(I X )、鏈置換 DNA 聚合酶為 0.32U/L、dNTP混合物為0.4~0.6mmol/L、甜菜喊為O~2.5mol/L、MgSO4為O~3mmol/L、FIP引物為1.6 μ mol/L,BIP 引物為 1.6ymol/L、F3 引物為 0.2ymol/L、B3 引物為 0.2 μ mol/L、LoopF弓丨物為0.4 μ mol/L、 LoopB弓丨物為0.4 μ mol/L,待測(cè)樣品RNA為12ng/ μ L ;恒溫反應(yīng)；
[0025](2)反應(yīng):將步驟(1)恒溫反應(yīng)后的產(chǎn)物用核酸檢測(cè)試紙條檢測(cè)，IOmin觀察結(jié)果；
[0026](3)結(jié)果判讀:直接肉眼判讀；
[0027]①陰性(一):僅在質(zhì)控區(qū)(C)出現(xiàn)一條紅色條帶，在檢測(cè)區(qū)(T)內(nèi)無(wú)紅色條帶出現(xiàn)，證明所檢測(cè)的樣本沒(méi)有豬傳染性胃腸炎病毒感染；
[0028]②陽(yáng)性(+):出現(xiàn)兩條紅色條帶，一條位于檢測(cè)區(qū)(T)內(nèi)，另一條位于質(zhì)控區(qū)(C)內(nèi)，證明所檢測(cè)的樣本為豬傳染性胃腸炎病毒感染；
[0029]③無(wú)效:質(zhì)控區(qū)(C)和檢測(cè)區(qū)(T)內(nèi)均無(wú)紅色條帶出現(xiàn)，表明核酸試紙條失效。
[0030]步驟(1)中所述的dNTP混合物的終濃度優(yōu)選為0.5mmol/L ；
[0031]步驟(1)中所述的甜菜堿的終濃度優(yōu)選為0.5mol/L ；
[0032]步驟(1)中所述的MgSO4的終濃度優(yōu)選為3mmol/L ；
[0033]步驟(2)中所述的恒溫反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選為20~50min ；
[0034]步驟(2)中所述的恒溫反應(yīng)的條件優(yōu)選為62°C反應(yīng)40min。
[0035]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果:
[0036](I) RT-LAMP核酸試紙條檢測(cè)方法成本低廉,利用Bst DNA polymerase在62°C實(shí)現(xiàn)等溫?cái)U(kuò)增，不需要復(fù)雜且昂貴的PCR儀，因此，本發(fā)明提供的檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒使用成本低。
[0037](2)本發(fā)明提供的檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒反應(yīng)迅速，利用AMV反轉(zhuǎn)錄酶實(shí)現(xiàn)一步法RT-LAMP，無(wú)需增加42°C Ih的反轉(zhuǎn)錄過(guò)程，可以在40min內(nèi)完成反應(yīng)，最快可以在20min內(nèi)完成。[0038](3)本發(fā)明提供的檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒得到的反應(yīng)結(jié)果直觀準(zhǔn)確，無(wú)需進(jìn)行復(fù)雜操作。雖然LAMP在DNA擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生大量焦磷酸鎂沉淀使反應(yīng)液呈現(xiàn)渾濁，在反應(yīng)結(jié)束后無(wú)需瓊脂糖凝膠電泳即可直接肉眼觀察反應(yīng)管中渾濁來(lái)判斷陽(yáng)性與否，但弱陽(yáng)性結(jié)果仍給判別帶來(lái)較大困難，如果在引物5’端進(jìn)行特異性生物標(biāo)記，然后再用全封閉式靶核酸擴(kuò)增物快速檢測(cè)裝置對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，既可以準(zhǔn)確對(duì)結(jié)果進(jìn)行直觀、快速的判讀，又可以防止污染。
[0039](4)本發(fā)明提供的檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒特異性好，對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬流行性腹瀉病毒等都呈陰性反應(yīng)；靈敏度高，最低可以檢測(cè)到3pg的RNA模板，與RT-LAMP瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)限一致，比RT-PCR方法、鈣黃綠素可視化RT-LAMP方法的靈敏度高10倍(即檢測(cè)限低10倍)。即使是幾個(gè)病毒粒子，也能被快速準(zhǔn)確的檢測(cè)出來(lái)。
[0040](5)本發(fā)明提供的檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒可快速、靈敏地檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒，無(wú)需昂貴儀器，只需一個(gè)恒溫水浴鍋即可完成反應(yīng)。該試劑盒操作簡(jiǎn)單、成本低廉，反應(yīng)結(jié)果易于觀察，特異性好，非常適用于出口檢疫、食品衛(wèi)生以及畜牧養(yǎng)殖場(chǎng)的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，易于大范圍推廣應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0041]圖1為RT-LAMP反應(yīng)檢測(cè)體系優(yōu)化結(jié)果圖，其中:
[0042]A為dNTP不同終濃度與電泳亮度關(guān)系圖，泳道M為DNA Marker DL2000，泳道I~6依次對(duì)應(yīng)dNTP終濃 度分別為0.lmM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM和0.6mM得到的反應(yīng)產(chǎn)物；
[0043]B為甜菜堿不同終濃度與電泳亮度關(guān)系圖，泳道M為DNA Marker DL2000，泳道I~5依次對(duì)應(yīng)甜菜堿終濃度分別為0M、0.5M、1.0M、1.5M和2M得到的反應(yīng)產(chǎn)物；
[0044]C為MgSO4F同終濃度與電泳亮度關(guān)系圖，泳道M為DNA Marker DL2000，泳道I~5依次對(duì)應(yīng)MgSO4終濃度分別為OmM、lmM、2mM、3mM和4mM得到的反應(yīng)產(chǎn)物；
[0045]D為內(nèi)引物(FIP+BIP )與外引物(F3+B3 )不同終濃度比例與電泳亮度關(guān)系圖，泳道M為DNA Marker DL2000，泳道I~6依次對(duì)應(yīng)內(nèi)引物和外引物按終濃度比為2:1、4:1、6:1、8:1、10:1和12:1得到的反應(yīng)產(chǎn)物，其中，外引物終濃度為0.2 μ mol/L ；
[0046]E為不同環(huán)引物(LoopF+LoopB )與外引物(F3+B3 )終濃度比例與電泳亮度關(guān)系圖，泳道M為DNA Marker DL2000,泳道I~8依次對(duì)應(yīng)環(huán)引物和外引物按終濃度比為1: 1、2: 1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1和8:1得到的反應(yīng)產(chǎn)物，外引物終濃度為0.2 μ mol/L。
[0047]圖2為RT-LAMP反應(yīng)檢測(cè)條件優(yōu)化結(jié)果圖，其中:
[0048]A為不同溫度下RT-LAMP反應(yīng)的電泳亮度關(guān)系圖，泳道M為DNA MarkerDL2000，泳道I~8依次對(duì)應(yīng)反應(yīng)溫度為59°C、60°C、61°C、62°C、63°C、64°C、65°C和66°C的產(chǎn)物；
[0049]B為不同反應(yīng)時(shí)間下RT-LAMP反應(yīng)的電泳亮度關(guān)系圖，泳道M為DNAMarkerDL2000,泳道 I ~7 依次對(duì)應(yīng)反應(yīng)時(shí)間為 10min、20min、30min、40min、50min、60min 和 70min
的產(chǎn)物。
[0050]圖3為檢測(cè)本發(fā)明試劑盒特異性實(shí)驗(yàn)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖，其中:
[0051]泳道M為DNA Marker DL2000 ;泳道I是以TGEV疫苗株基因組為模板的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物；泳道2是以CSFV基因組為模板的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物；泳道3是以PEDV CV777基因組為模板的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物；泳道4是以PRRSV經(jīng)典株⑶08_2株基因組為模板的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物；泳道5是以PCV-2基因組為模板的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物；泳道6是以大腸桿菌基因組為模板的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物。
[0052]圖4為RT-LAMP和RT-PCR的靈敏度檢測(cè)結(jié)果圖，其中:
[0053]A為紫外條件下鈣黃綠素法對(duì)本發(fā)明提供的RT-LAMP產(chǎn)物檢測(cè)的結(jié)果圖；
[0054]B為利用本發(fā)明試劑盒得到的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳得到的結(jié)果圖；
[0055]C為利用RT-PCR方法得到的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳得到的圖；圖中均為:1的模板為TGEV RNA標(biāo)準(zhǔn)品(IOOng/ μ L)進(jìn)行10倍稀釋；2的模板為TGEV RNA標(biāo)準(zhǔn)品(IOOng/μ L)進(jìn)行IO2倍稀釋；3的模板為TGEV RNA標(biāo)準(zhǔn)品(IOOng/ μ L)進(jìn)行IO3倍稀釋；4的模板為TGEV RNA標(biāo)準(zhǔn)品(IOOng/ μ L)進(jìn)行IO4倍稀釋；5的模板為TGEV RNA標(biāo)準(zhǔn)品(IOOng/μ L)進(jìn)行IO5倍稀釋；6的模板為TGEV RNA標(biāo)準(zhǔn)品(IOOng/ μ L)進(jìn)行IO6倍稀釋；7的模板為TGEV RNA標(biāo)準(zhǔn)品(IOOng/ μ L)進(jìn)行IO7倍稀釋；8為陰性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0056]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0057]以下實(shí)施例中所用的引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；BstDNA聚合酶大片段購(gòu)自New England公司；甜菜堿(Betaine)和MgSO4購(gòu)自Sigma公司；Trizol、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、隨機(jī)引物、Ex-Taq DNA聚合酶、dNTP (2.5mM)、瓊脂糖購(gòu)自Takara公司；全封閉式靶核酸擴(kuò)增物快速檢測(cè)裝置購(gòu)自杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司(貨號(hào):20120420-32)。
[0058]實(shí)施例1`
[0059]一、引物設(shè)計(jì)
[0060]根據(jù)LAMP引物設(shè)計(jì)原則，針對(duì)TGEV N基因的保守區(qū)域序列，根據(jù)LAMP引物的設(shè)計(jì)原則，應(yīng)用在線引物設(shè)計(jì)軟件PrimerExporer4.0進(jìn)行LAMP引物設(shè)計(jì)。同時(shí)應(yīng)用Larsergene7.0生物軟件的PrimerSelect工具對(duì)引物進(jìn)行初步篩選,保證各引物對(duì)之間產(chǎn)生的二聚體較少。通過(guò)初步篩選得到理論值最優(yōu)的兩套引物，如表1所示(此時(shí)，LoopF和LoopB未進(jìn)行Biotin和FITC標(biāo)記)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，合成后的引物用滅菌三蒸水稀釋成IOpmol/μ L溶液，-20°C避光保存。包括I對(duì)外部引物(F3和B3，B3為B3c的互補(bǔ)序列)、I對(duì)內(nèi)部引物(FIP和BIP)和I對(duì)環(huán)引物(LoopF和LoopB,LoopF為L(zhǎng)oopFc的互補(bǔ)序列)。FIP由Flc (Fl的互補(bǔ)序列)和F2序列組成；BIP由Blc和B2 (B2c的互補(bǔ)序)列組成。初步試驗(yàn)得到第一套引物61°C 60min達(dá)到最佳反應(yīng)量，而第二套引物6rC 90min才達(dá)到最佳反應(yīng)量，故選擇第一套引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司分別對(duì)第一套引物中的FIP引物和LoopF引物的5’端進(jìn)行Biotin (生物素)標(biāo)記，再分別對(duì)BIP引物和LoopB引物的5’端進(jìn)行FITC (異硫氰酸熒光素)標(biāo)記。對(duì)FIP和BIP引物標(biāo)記組和LoopF和LoopB引物標(biāo)記組分別進(jìn)行LAMP的空白樣品試驗(yàn)，產(chǎn)物用核酸試紙條進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)LoopF和LoopB引物標(biāo)記組的空白樣品核酸試紙條檢測(cè)呈陰性，而FIP和BIP引物標(biāo)記組的空白樣品呈陽(yáng)性，所以選用LoopF和LoopB引物的5’端分別進(jìn)行Biotin (生物素)和FITC (異硫氰酸熒光素)標(biāo)記為最佳標(biāo)記方式(如表1所示)。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，其特征在于包含如下引物組和核酸檢測(cè)試紙條: 所述的引物組的核苷酸序列如下所示:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，其特征在于:所述的核酸檢測(cè)試紙條為通用型核酸檢測(cè)試紙條。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，其特征在于:包含全封閉式靶核酸擴(kuò)增物快速檢測(cè)裝置和權(quán)利要求1所述的引物組；全封閉式靶核酸擴(kuò)增物快速檢測(cè)裝置為將通用型核酸檢測(cè)試紙條置入一個(gè)掌上塑料檢測(cè)裝置內(nèi)得到。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，其特征在于:還包含dNTP混合物溶液、MgSO4溶液、反應(yīng)緩沖液、鏈置換DNA聚合酶、甜菜堿溶液和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，其特征在于:包含濃度為5υ/μ L的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、10倍反應(yīng)緩沖液、濃度為8U/L的鏈置換DNA聚合酶、濃度為2.5mmol/L的dNTP混合物溶液、濃度為lOmol/L的甜菜堿溶液、濃度為IOOmmoI/L的MgSO4溶液、濃度為10ymol/L的引物FIP、濃度為10ymol/L的引物BIP、濃度為ΙΟμπιοΙ/L的引物F3、濃度為ΙΟμπιοΙ/L的引物B3、濃度為ΙΟμπιοΙ/L的引物L(fēng)oopF和濃度為10 μ mol/L的引物L(fēng)oopB。
6.權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述的檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒的應(yīng)用，其特征在于包含以下步驟: (1)配制RT-LAMP反應(yīng)體系，按終濃度計(jì)算，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶為105U/L、10倍反應(yīng)緩沖液為I倍、鏈置換DNA聚合酶為0.32U/L、dNTP混合物為0.4~0.6mmol/L、甜菜堿為O~2.5mol/L、MgS04 為 O ~3mmol/L、FIP 引物為 1.6 μ mol/L、BIP 引物為 1.6ymol/L、F3 引物為 0.2ymol/L、B3 引物為 0.2 μ mol/L、LoopF 引物為 0.4 μ mol/L、LoopB 引物為 0.4ymol/L，待測(cè)樣品RNA為12ng/ u L ;恒溫反應(yīng)； (2)反應(yīng):將步驟(1)恒溫反應(yīng)后的產(chǎn)物用核酸檢測(cè)試紙條檢測(cè)，IOmin觀察結(jié)果； (3)結(jié)果判讀:直接肉眼判讀； ①陰性:僅在質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紅色條帶，在檢測(cè)區(qū)內(nèi)無(wú)紅色條帶出現(xiàn)，證明所檢測(cè)的樣本沒(méi)有豬傳染性胃腸炎病毒感染； ②陽(yáng)性:出現(xiàn)兩條紅色條帶，一條位于檢測(cè)區(qū)內(nèi)，另一條位于質(zhì)控區(qū)內(nèi)，證明所檢測(cè)的樣本為豬傳染性胃腸炎病毒感染； ③無(wú)效:質(zhì)控區(qū)和檢測(cè)區(qū)內(nèi)均無(wú)紅色條帶出現(xiàn)，表明核酸試紙條失效。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒的應(yīng)用，其特征在于: 步驟(1)中所述的dNTP混合物的終濃度為0.5mmol/L ； 步驟(1)中所述的甜菜堿的終濃度為0.5mol/L ； 步驟(1)中所述的MgSO4的終濃度為3mmol/L ； 步驟(2)中所述的恒溫反應(yīng)的時(shí)間為20~50min。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)豬傳染性胃腸炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒的應(yīng)用，其特征在于: 步驟(2)中所述的恒溫反應(yīng)`的條件為62°C反應(yīng)40min。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK103627821SQ201310632188
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月29日
【發(fā)明者】陳金頂, 鄧潔汝, 勾紅潮, 裴晶晶, 葉佐東, 劉翠翠, 鄭仲華 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)