專(zhuān)利名稱(chēng)：：乙型肝炎病毒表面抗原檢測(cè)微粒、其制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及乙肝的診斷試劑，具體涉及基于光激化學(xué)發(fā)光原理的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)檢測(cè)顆粒、其制備及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：免疫學(xué)檢測(cè)是基于抗原和抗體的特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的一種手段，由于其可以利用同位素、酶、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等對(duì)被檢測(cè)信號(hào)進(jìn)行放大和顯示，因此常被用于檢測(cè)蛋白質(zhì)，激素等微量生物活性物質(zhì)。我國(guó)免疫學(xué)檢測(cè)基本經(jīng)歷了放射免疫檢測(cè)(興起于20世紀(jì)70年代，現(xiàn)仍普遍使用于縣級(jí)以上醫(yī)院)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)(興起于20世紀(jì)80年代，各臨床機(jī)構(gòu)普遍使用)；以化學(xué)發(fā)光為代表的光生物學(xué)標(biāo)記及免疫檢測(cè)技術(shù)(20世紀(jì)90年代開(kāi)始推廣使用，產(chǎn)品步入成長(zhǎng)期)三個(gè)階段。這一衍變過(guò)程主要是基于對(duì)檢測(cè)方法的敏感性、準(zhǔn)確性、以及操作簡(jiǎn)捷性的需求的不斷提高而決定的。化學(xué)發(fā)光免疫分析(ChemiluminescenceImmunoassay)是近十年來(lái)在世界范圍內(nèi)發(fā)展非常迅速的非放射性免疫分析技術(shù)。檢測(cè)原理是以發(fā)光物質(zhì)作為信號(hào)放大系統(tǒng)并籍助其發(fā)光強(qiáng)度直接測(cè)定免疫結(jié)合。由于其高靈敏度，檢測(cè)范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，已成為放射性免疫分析與普通酶免疫分析的取代者，是免疫學(xué)檢測(cè)重要的發(fā)展方向。但目前國(guó)內(nèi)自行研制的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑，大多為非均相反應(yīng)，采用化學(xué)底物直接標(biāo)記，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)激發(fā)。其分析過(guò)程與傳統(tǒng)酶標(biāo)檢測(cè)類(lèi)似，需反復(fù)清洗與分離，檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，自動(dòng)化程度不高。國(guó)外廠家檢測(cè)試劑隨發(fā)光基質(zhì)與檢測(cè)形式而各不相同。以Abbott,Bayer與Chiron等公司為代表的化學(xué)激發(fā)，即以化學(xué)發(fā)光底物直接標(biāo)記抗原或抗體進(jìn)行免疫測(cè)定。最常用的為吖啶酯，在堿性環(huán)境中可被過(guò)氧化氫氧化而發(fā)光。BD則以AKP,金鋼脘為基質(zhì)采用酶促化學(xué)發(fā)光。Roche為則采用電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)，發(fā)光底物二價(jià)的三聯(lián)吡啶釕及反應(yīng)參與物三丙胺在電極表面失去電子而被氧化。氧化的三丙胺失去一個(gè)H+而成為強(qiáng)還原劑，將氧化型的三價(jià)釕還原為激發(fā)態(tài)的二價(jià)釕，隨即釋放光子而恢復(fù)為基態(tài)的發(fā)光底物。這一過(guò)程在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行，不斷地發(fā)出光子而常保持底物濃度的恒定。因反應(yīng)過(guò)程中牽涉到分離清洗，自動(dòng)化設(shè)計(jì)復(fù)雜，儀器相當(dāng)6昂貴。此外，發(fā)光基質(zhì)的穩(wěn)定性也是一大問(wèn)題。光激化學(xué)發(fā)光法通過(guò)引入激光技術(shù)與納米微球技術(shù)，成功地解決了上述不足。因反應(yīng)在均相中進(jìn)行，既加快了反應(yīng)速度，又避免了反復(fù)分離與清洗步驟，能有效降低檢測(cè)背景值，減少反應(yīng)時(shí)間，并可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作。目前，PE公司推出了針對(duì)生物研究用的光激化學(xué)發(fā)光試劑Alpha-Screen。但在臨床檢測(cè)領(lǐng)域，還沒(méi)有面世的光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑，尤其是用于腫瘤標(biāo)志物與肝炎檢測(cè)項(xiàng)目。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種可用于定性或定量檢測(cè)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的檢測(cè)微粒，其制備、檢測(cè)條件及應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)原理本發(fā)明的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)檢測(cè)試劑及試劑盒與光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)相關(guān)，光激化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)是一種利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)發(fā)射的光波進(jìn)行免疫測(cè)定的方法。該技術(shù)主要整合了高分子微粒技術(shù)，有機(jī)合成，蛋白質(zhì)化學(xué)與臨床檢測(cè)相關(guān)領(lǐng)域的研究。本發(fā)明之所以能檢測(cè)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，是由于在均相條件下，將內(nèi)部帶有染料的感光微粒(納米級(jí))以及包被有表面抗體(HBsAb)并且內(nèi)部帶有發(fā)光化合物的發(fā)光微粒(納米級(jí))的混合物作為試劑和檢測(cè)樣品混合。此時(shí)納米感光微粒和包被有表面抗體(HBsAb)的納米發(fā)光微?？裳杆儆行У夭蹲紿BeAg，在近距離內(nèi)，三者形成免疫夾心復(fù)合物。激發(fā)光照射后，納米感光微粒中的染料被誘導(dǎo)激活，并釋放高能態(tài)的活性氧離子(單線態(tài)氧)。該高能態(tài)的活性氧離子被近距離的納米發(fā)光微粒俘獲，從而傳遞能量以激活所述發(fā)光微粒中的發(fā)光化合物。數(shù)微秒后，發(fā)光微粒中的發(fā)光化合物將釋放出高能級(jí)紅光。用光子計(jì)數(shù)器測(cè)定這些高能級(jí)光子，并通過(guò)電腦將光子數(shù)換算為目標(biāo)分子濃度，光子數(shù)的多少即精確地反映了目標(biāo)分子的濃度。而當(dāng)樣本不含HBeAg時(shí)，無(wú)法在近距離形成免疫夾心復(fù)合物，活性氧離子也無(wú)法傳遞至發(fā)光微粒表面。活性氧離子在液相中迅速衰減，檢測(cè)時(shí)則無(wú)高能級(jí)紅光產(chǎn)生。具體原理參見(jiàn)圖1及圖2?；谏鲜鲈?，本發(fā)明第一方面提供了一種用于檢測(cè)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的檢測(cè)微粒，為乙型肝炎表面抗體(冊(cè)sAb)包被的發(fā)光微粒。本發(fā)明第二方面提供了一種乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的檢測(cè)試劑盒，包括上述表面抗體(HBsAb)包被的發(fā)光微粒。試劑盒中，還可包括生物素標(biāo)記的乙型肝炎表面抗體(HBsAb)和親和素包被的感光微粒。在試劑盒中，上述表面抗體(HBsAb)包被的發(fā)光微粒、生物素標(biāo)記的表面抗體(HBsAb)和親和素包被的感光微粒分別獨(dú)立包裝，且均為混懸液。上述含有表面抗體(HBsAb)包被的發(fā)光微粒、生物素標(biāo)記的表面抗體(HBsAb)或親和素包被的感光微粒的溶液的溶劑可以是常規(guī)的適合抗原抗體反應(yīng)的溶劑體系，如服PES緩沖體系、Tris緩沖體系。表面抗體(HBsAb)包被的發(fā)光微粒的溶劑優(yōu)選pH8.0的成分為HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H20的HEPES緩沖液，生物素標(biāo)記的表面抗體(HBsAb)的溶劑優(yōu)選p朋.0的成分為T(mén)ris、NaCl和EDTA-Na_2H20的Tris緩沖液，親和素包被的感光微粒的溶劑優(yōu)選HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H20的HEPES緩沖液，上述各種溶劑中還可添加起封閉和蛋白保護(hù)作用的物質(zhì)如BSA以及防止微粒聚集的穩(wěn)定試劑如Tween20，出于對(duì)試劑防腐以及長(zhǎng)期儲(chǔ)存的考慮還可在溶劑中添加防腐劑，防腐劑優(yōu)選100U/ml慶大霉素和質(zhì)量百分比為萬(wàn)分之五的Proclin300作為防腐劑。在用于定量檢測(cè)乙型肝炎表面抗原時(shí)，上述試劑盒中還可包括定標(biāo)品，即含有多種確定濃度乙型肝炎表面抗原的溶液。上述不同乙型肝炎表面抗原濃度的溶液分別獨(dú)立包裝。用于定性檢測(cè)乙型肝炎表面抗原時(shí)，上述試劑盒中還可包括陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照，以及參考樣品，上述參考樣品為含有確定濃度乙型肝炎表面抗原的溶液。上述陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照，以及參考樣品分別獨(dú)立包裝。含有確定濃度乙型肝炎表面抗原的溶液中乙型肝炎表面抗原的濃度為乙型肝炎表面抗原臨床cutoff點(diǎn)對(duì)應(yīng)的濃度。上述發(fā)光微粒是指填充有發(fā)光化合物和鑭系元素化合物的高分子微粒。發(fā)光化合物可以是Dioxene(二氧雜環(huán)己烯)或thioxene(二甲基噻吩)的衍生物等，鑭系元素化合物可以是Eu(TTA)3/T0P0或Eu(TTA)3/Phen等，該微粒可由市場(chǎng)上購(gòu)得。研究發(fā)現(xiàn)，由于最終的檢測(cè)反應(yīng)是均相反應(yīng)，發(fā)光微粒的粒徑(微粒的平均直徑)太大(〉400ntn)會(huì)自然沉降，影響檢測(cè)效果，微粒的粒徑太小(<50nm),會(huì)使制備過(guò)程中的清洗工作比較困難，對(duì)抗體連接工作不利，因此發(fā)光微粒的粒徑范圍應(yīng)在50-400nm之間，較好為100-300nm之間，優(yōu)選250nm。發(fā)光微粒的表面官能團(tuán)可以是任何能聯(lián)接蛋白質(zhì)的基團(tuán)，但最常用的主要有羧基和醛基表面官能團(tuán)的微粒。使用不同的微粒表面官能團(tuán)，連接抗體的反應(yīng)方式和條件也不相同。鑒于獲得更好的表面抗體(HBsAb)連接效率，試劑穩(wěn)定性和連接重復(fù)性，經(jīng)試驗(yàn)優(yōu)選醛基表面官能團(tuán)的微粒，并應(yīng)用了NaBH3CN的還原胺化反應(yīng)作為抗體的連接方法。發(fā)光微粒的發(fā)光量會(huì)直接影響最終檢測(cè)的發(fā)光效果。市場(chǎng)提供的發(fā)光微粒發(fā)光量一般會(huì)在50，000——10，000，000光子數(shù)/10(^g發(fā)光微粒范圍內(nèi)，優(yōu)選150'000-350，000光子數(shù)/100l^g)發(fā)光微粒。上述表面抗體(HBsAb)包被的發(fā)光微粒中，發(fā)光微粒與表面抗體(HBsAb)的質(zhì)量比例較佳為10:(1-4)，優(yōu)選10:2。上述生物素標(biāo)記的表面抗體(HBsAb)中，生物素與抗體的分子比例較佳為(10-50):1，優(yōu)選40:1。上述感光微粒是填充有感光化合物的高分子微粒。在670-690nm光激發(fā)下，可以產(chǎn)生單線涂氧離子，當(dāng)其與發(fā)光微粒距離足夠近的情況下，單線氧離子傳遞到發(fā)光微粒，與發(fā)光微粒中的發(fā)光化合物反應(yīng)，產(chǎn)生紫外光，紫外光再進(jìn)一步激發(fā)鑭系元素化合物，產(chǎn)生520-620nm波長(zhǎng)光子。感光化合物可以是酞菁染料等，該微粒也可由市場(chǎng)上購(gòu)得。上述親和素包被的感光微粒中，親和素與感光微粒的質(zhì)量比例無(wú)特殊限制，較佳為l:(3-10)，優(yōu)選l:5。市售感光微粒均適用于本發(fā)明，微粒粒徑較佳為180-260nm，優(yōu)選220nm。表面抗體(HBsAb)包被的發(fā)光微粒采用NaBH3CN的還原胺化反應(yīng)法制備，反應(yīng)步驟如下1)混合將發(fā)光微粒與表面抗體(HBsAb)按質(zhì)量比例為10:(1-4)混合于緩沖液中；2)反應(yīng)加入緩沖液配制的NaBH3CN溶液混合并反應(yīng)；3)封閉加入緩沖液配制的Gly及NaBH3CN溶液，混勻反應(yīng)后，再加入BSA溶液封閉；4)清洗產(chǎn)物，獲得表面抗體(HBsAb)包被的發(fā)光微粒。其中，混合步驟中，發(fā)光微粒與表面抗體(HBsAb)的質(zhì)量比例為10:(1-4)優(yōu)選10:2。反應(yīng)緩沖液可為MES緩沖液、磷酸緩沖液，優(yōu)選MES緩沖液，濃度優(yōu)選0.05M，反應(yīng)步驟中，反應(yīng)溶液中發(fā)光微粒的濃度可為10-40mg/ml，優(yōu)選20mg/ml。清洗的方式可以為離心法清洗或透析法清洗。透析法清洗步驟采用反應(yīng)緩沖液透析，每次4-5小時(shí)，更換緩沖液4次。透析清洗操作時(shí)間較長(zhǎng)，且微粒損失較多，造成收率降低。離心法清洗步驟包括離心去上清，加入反應(yīng)緩沖液洗滌，超聲處理打開(kāi)沉淀，如此反復(fù)3—5次。離心法清洗時(shí)離心力會(huì)使發(fā)光微粒暫時(shí)聚集在一起，但經(jīng)過(guò)超聲處理可以很容易再次分散打開(kāi)，此法操作時(shí)間短，且收率較高。因此優(yōu)選采用此種清洗方式。9親和素包被的感光微?？刹捎肗aBH3CN的還原胺化反應(yīng)法制備。本發(fā)明第三方面，公開(kāi)了上述乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的檢測(cè)試劑盒的使用方法，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的檢測(cè)試劑盒利用光激化學(xué)發(fā)光原理，采用雙抗體夾心法，可定性或定量檢測(cè)乙型肝炎表面抗原。乙型肝炎表面抗原(朋sAg)的檢測(cè)試劑盒的使用方法包括下列步驟將樣品與試劑盒中用于檢測(cè)乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)微粒、生物素標(biāo)記的表面抗體(HBsAb)和親和素包被的感光微?；旌戏磻?yīng)，而后用激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測(cè)量每個(gè)反應(yīng)孔發(fā)光光子量獲得光信號(hào)值。具體包括下列步驟1)在反應(yīng)孔中加入樣品、試劑盒中用于檢測(cè)乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)微粒和生物素標(biāo)記的表面抗體(HBsAb)，獲得初始反應(yīng)溶液，混合反應(yīng)；2)再加入親和素包被的感光微粒獲得最終反應(yīng)溶液進(jìn)行反應(yīng)；3)激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測(cè)量每個(gè)反應(yīng)孔發(fā)光光子量獲得光信號(hào)值。上述激發(fā)光光源波長(zhǎng)范圍為600-700nm，優(yōu)選640-680nm;反應(yīng)孔發(fā)光的發(fā)射光光源波長(zhǎng)范圍為600-680nm，優(yōu)選610-620nm;發(fā)射光延遲時(shí)間范圍為100ms-1000ms;激發(fā)光光源的功率范圍為5-100mw,優(yōu)選40-60w。上述乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的檢測(cè)試劑盒的使用方法，在定量檢測(cè)乙型肝炎表面抗原時(shí)，還包括根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品冊(cè)sAg含量。上述乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的檢測(cè)試劑盒的使用方法，在定性檢測(cè)乙型肝炎表面抗原時(shí)，還包括計(jì)算待測(cè)樣品光信號(hào)值與朋sAg參考樣品光信號(hào)的比值，即S/CO值，當(dāng)S/CO》1時(shí)待測(cè)樣品被判定為陽(yáng)性，當(dāng)S/C0<1時(shí)待測(cè)樣品被判定為陰性。上述參考樣品中，HBsAg的濃度與乙型肝炎表面抗原臨床cutoff點(diǎn)對(duì)應(yīng)。上述步驟1)的反應(yīng)條件為37。C溫育10-30分鐘，優(yōu)選20分鐘，步驟2的反應(yīng)條件也為37。C溫育10-30分鐘，優(yōu)選15分鐘。上述初始反應(yīng)溶液中，表面抗體(HBsAb)包被的發(fā)光微粒的濃度無(wú)特殊限制，可以為100-400^g/ml，優(yōu)選250Hg/ml。初始反應(yīng)溶液中，生物素標(biāo)記的表面抗體(朋sAb)的濃度無(wú)特殊限制，可以為8-2化g/ml，較佳為12Pg/ml。在最終反應(yīng)溶液中，親和素包被的感光微粒的濃度一般控制在30-10(^g/ml，可以為30-50Mg/ml，優(yōu)選40Pg/ml。10上述方法中，初始反應(yīng)溶液的體積無(wú)特殊限制，可以為30—75ri，優(yōu)選75W;最終反應(yīng)溶液的體積也無(wú)特殊限制，可以為100—250W，優(yōu)選250W。上述樣品包括血清、血漿、全血、前述參考樣品或定標(biāo)品。本發(fā)明是采用光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)，測(cè)定人血清樣品中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的定量及定性體外診斷試劑盒，可以與其它血清和臨床信息聯(lián)合用于診斷個(gè)體發(fā)生急性或慢性乙型肝炎感染的情況，也可用于對(duì)圍產(chǎn)期女性乙型肝炎的篩選，以判斷新生兒感染乙型肝炎的危險(xiǎn)性。本發(fā)明與檢測(cè)對(duì)象相近的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)酶免法試劑盒在方法學(xué)上比較，酶免法以O(shè)D值體現(xiàn)樣本檢測(cè)值，OD值可檢測(cè)范圍窄，僅可做定性檢測(cè)，且靈敏度低。本發(fā)明的試劑盒采用光激化學(xué)發(fā)光法測(cè)定標(biāo)本中的HBsAg，具有靈敏度高、檢測(cè)范圍寬等特點(diǎn)，在方法學(xué)上較酶免法能達(dá)到更高的靈敏度和更優(yōu)的檢測(cè)范圍。、圖l:光激化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)原理圖:微粒結(jié)合形成二聚體，產(chǎn)生光子信號(hào)圖2:光激化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)原理圖未結(jié)合微粒，無(wú)光子信號(hào)產(chǎn)生圖3:單線態(tài)氧隨微粒間距離衰減，在大概600nm的距離，基本沒(méi)有單線氧的存在，因此也不發(fā)光FGBEAD:發(fā)光微粒，內(nèi)含發(fā)光分子；GGBEAD:感光微粒，內(nèi)含感光分子；SingletOxygen:單線態(tài)氧，活性氧離子；A/B:兩者可直接或間接特異結(jié)合的活性分子。如在雙抗夾心檢測(cè)中，A,B為針對(duì)靶分子C不同的表位的單克隆抗體具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法及未說(shuō)明配方的試劑均為按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆試驗(yàn)手冊(cè)(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件或者制造商建議的條件進(jìn)行或配置。實(shí)驗(yàn)中儀器原料來(lái)源及試劑配方:原料及試劑廠家Biotin-X-X-NHSSigmaTLC》95%BSAEquitech/proteasefreeGlySigma》95%HEPES華美TrisSigma歸眼AcrosAvidinPierceHBsAb廈門(mén)波生生物技術(shù)有限公司感光微粒美國(guó)PentaTek公司發(fā)光微粒美國(guó)PentaTek公司儀器型號(hào)廠家粒徑儀Model370Nicomp酶標(biāo)儀MultiSKANMK3labsystem紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)752P上海光譜有限公司熒光分光光度計(jì)F95上海棱光技術(shù)有限公司光激化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)博陽(yáng)生物/上海北濱光子實(shí)施例1表面抗體包被的發(fā)光微粒的制備制備方法1)發(fā)光微?；鞈乙禾幚砦∫欢康陌l(fā)光微粒于高速冷凍離心機(jī)中離心，棄去上清，加入一定量MES緩沖液，超聲破碎至微粒重新懸浮，加入MES緩沖液調(diào)節(jié)發(fā)光微粒濃度至100mg/ml。2)抗體處理HBsAb于0.05MpH6.0的MES緩沖液(以下簡(jiǎn)稱(chēng)MES緩沖液)透析，透析完成后測(cè)定濃度，并調(diào)節(jié)濃度至8mg/ml。3)MES緩沖液、100mg/ml的發(fā)光微粒混懸液(MES緩沖液)和8mg/ml的抗—HBe(MES緩沖液)以及，以h2:5的體積比進(jìn)行混合，迅速混勻，得到反應(yīng)液。4)用MES緩沖液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應(yīng)液1:25的體積比加入，迅速混勻，37'C旋轉(zhuǎn)反應(yīng)48小時(shí)。5)MES緩沖液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應(yīng)液2:1:10的體積比加入上述溶液中，混勻，37。C旋轉(zhuǎn)反應(yīng)2小時(shí)。再加入200mg/ml的BSA溶液(MES緩沖液)，其與反應(yīng)液體積比為5:8，迅速混勻，37'C旋轉(zhuǎn)反應(yīng)16小時(shí)。6)用MES緩沖液離心清洗四次，最后用發(fā)光試劑緩沖液進(jìn)行懸浮，測(cè)定粒徑和固含量，調(diào)節(jié)濃度至10mg/ml。參照前述1)的制備方法制備表面抗體(HBsAb)包被的發(fā)光微粒，并通過(guò)各項(xiàng)性能測(cè)試比較從以下幾方面進(jìn)行了具體工藝條件的選擇研究研究中涉及的各個(gè)參數(shù)的檢測(cè)方法如下1.光信號(hào)檢測(cè)方法在反應(yīng)孔中分別加入樣品，再依次加入發(fā)光試劑(25(￥g/ml)和25W生物素化抗體試劑(12^/ral)。然后放入儀器(光激化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng))，由儀器自動(dòng)按以下步驟操作振動(dòng)，37i:溫育20分鐘，再自動(dòng)加入175W親和素包被的感光微粒試劑(40Pg/ml)后37t)溫育15分鐘。儀器自動(dòng)產(chǎn)生激光照射微孔計(jì)算每孔發(fā)光光子量。2.靈敏度檢測(cè)方法檢測(cè)靈敏度參考品(編號(hào)L1-13、L2-l3、L3-13)光信號(hào)，均需檢出所要求的企業(yè)靈敏度參考品(需檢出Ll-2;L2-2;L3-2)。Ll-13、L2-l3、L3-13配方選取了3份不同來(lái)源的血清標(biāo)本，經(jīng)檢測(cè)HCV、HIV均為陰性，HBsAg經(jīng)ABBOTT公司試劑盒檢測(cè)確認(rèn)為陽(yáng)性，分別按照比例稀釋后得到3個(gè)標(biāo)本系列編號(hào)1:2561:5121:10241:20481:4096ltt(s/co值)9.384.942.331.120.62編號(hào)1:2561:5121:10241:20481:40962#(S/CO值)14.067.743.731.840.9213編號(hào)1:2561:5121:10241:20481:40963tt(S/C0值)3.241.580.840.490.29結(jié)果表明按上述比例稀釋后組成的3個(gè)標(biāo)本系列為弱陽(yáng)性標(biāo)本，可用于試劑盒靈敏度的考核。以l財(cái)示本的l:512-1:2048、2財(cái)示本的1:1024-1:4096、3財(cái)示本的1:256-1:1024組成的3個(gè)標(biāo)本系列作為公司內(nèi)部靈敏度參考品(編號(hào)L1-13、L2-13、L3_l3)。3.特異性檢測(cè)方法檢測(cè)20份特異性參考品光信號(hào)，不得檢出假陽(yáng)性，無(wú)假陽(yáng)性則記為20/20。特異性參考品配方:從收集的HBsAg陰性標(biāo)本中選取20份，組成特異性參考品，編號(hào)N-01N-20。標(biāo)本選擇時(shí)既包括了健康人標(biāo)本，也包括了的較易引起假陽(yáng)性的特殊人群標(biāo)本。其具體組成如下標(biāo)本類(lèi)型份數(shù)正常獻(xiàn)血員標(biāo)本5份甲肝陽(yáng)性標(biāo)本4份丙肝陽(yáng)性標(biāo)本4份類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人標(biāo)本4份高血脂等其他病人標(biāo)本3份4.Hook檢測(cè)檢測(cè)HBsAg濃度分別為80Pg/ral、100Pg/ml、120Pg/ml、14(￥g/ml的樣本光信號(hào)，結(jié)果應(yīng)大于500ng/ml。5.精密性檢測(cè)方法檢測(cè)HBsAg濃度分別為10ng/ml和200ng/ml的質(zhì)控品光信號(hào)，每個(gè)濃度做10孔重復(fù)測(cè)定，代入公式，計(jì)算CV值。低濃度的精密性測(cè)定表示為QCL，高濃度的精密性測(cè)定表示為QCH。工藝條件選擇6.緩沖液及反應(yīng)pH值選擇其它反應(yīng)條件20mg/ml的發(fā)光微粒反應(yīng)濃度，10:2的FG-bead與HBsAb質(zhì)量比，離心法清洗pH5.0:0.lMMES緩沖反應(yīng)體系中有明顯的微粒聚集現(xiàn)象，故不采用此反應(yīng)條件。p服.0:140.1MMES緩沖體系反應(yīng)基本正常，抗體連接率及HbsAg檢測(cè)比pH7.0的0.1M磷酸緩沖體系稍差。pH7.0:0.1M磷酸緩沖體系反應(yīng)基本正常，抗體連接率及HbsAg檢測(cè)比p朋MES緩沖體系稍好，且考慮到一般購(gòu)買(mǎi)的抗體均保存在PBbuffer中，在抗體的前處理過(guò)程中會(huì)避免因抗體緩沖液的改變帶來(lái)的抗體的損失。故選擇pH7.0的0.1MPBbuffer作為反應(yīng)緩沖液。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>b.發(fā)光微粒在反應(yīng)液中的濃度其它反應(yīng)條件0.1MpH7.0的PBbuffer作為反應(yīng)緩沖液，10:2的FG-bead與HBsAb的質(zhì)量比，離心法清洗<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>10mg/ml反應(yīng)濃度時(shí)，抗體連接率及靈敏度均不佳。反應(yīng)濃度升高有利于抗體的連接，當(dāng)發(fā)光微粒濃度為20mg/ml時(shí)，抗體連接率基本達(dá)到平臺(tái)，濃度再高，達(dá)到40mg,/ml時(shí)，由于溶液濃度較大，在37'C反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)的情況下黏附損失較嚴(yán)重。故選擇20mg/ml的發(fā)光微粒反應(yīng)濃度為宜。c.發(fā)光微粒與抗體的反應(yīng)比例其它反應(yīng)條件0.1MpH7.0的PBbuffer作為反應(yīng)緩沖液，20mg/ml的發(fā)光微粒反應(yīng)濃度，離心法清洗。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>抗體加入量與發(fā)光微粒上包被的抗體量基本呈正比關(guān)系，但抗體繼續(xù)增加時(shí)包被上的抗體達(dá)到飽和。綜合考慮QC結(jié)果及成本問(wèn)題，選擇10mgFG-bead與2mgHBsAb反應(yīng)條件。d.清洗方式其它反應(yīng)條件0.1MpH7.0的PBbuffer作為反應(yīng)緩沖液，20mg/ml的發(fā)光微粒反應(yīng)濃度，10:2的FG-bead與HBsAb比例。透析法清洗步驟100倍體積透析，每次4-5小時(shí)，更換緩沖液4次。透析清洗操作時(shí)間較長(zhǎng)，透析過(guò)程中微粒損失較多。離心法清洗步驟12000rpm離心30分鐘，清洗4次。離心法清洗的離心力會(huì)使發(fā)光微粒暫時(shí)聚集，但經(jīng)過(guò)超聲處理很容易可再次分散打開(kāi)。且操作時(shí)間短，收率較高?？紤]到生產(chǎn)周期以及生產(chǎn)成本，決定采用此種清洗方式。最終選擇250nm的粒徑，發(fā)光量為》250，000光子數(shù)/100)"tg的發(fā)光微粒，0.1MpH7.0的PBbuffer作為反應(yīng)緩沖液，20mg/ml的發(fā)光微粒反應(yīng)濃度，10:2的FG-bead與HBsAb比例，離心法清洗作為最優(yōu)制備條件。實(shí)施例2生物素標(biāo)記抗體的制備制備方法1)抗體處理將HBsAb透析于0.1MNaHCO3溶液，測(cè)定抗體濃度并調(diào)節(jié)至lmg/ml。2)用DMSO配制16.17mg/ml的Biotin溶液。3)標(biāo)記取處理好的lmg/mlHBsAb標(biāo)記抗體與配制好的Biotin溶液，二者按照72:10000的體積比進(jìn)行混合，迅速混勻。4匸靜置反應(yīng)1216小時(shí)。4)透析將反應(yīng)好的生物素標(biāo)記抗體透析于生物素標(biāo)記透析緩沖液(pH8.00)。5)將透析好的生物素化抗體吸出轉(zhuǎn)移至干凈離心管中，取樣測(cè)定抗體濃度。將質(zhì)檢合格的生物素標(biāo)記抗體濃度調(diào)節(jié)至0.5mg/ml。將抗體與Biotin按照不同比例進(jìn)行反應(yīng)并進(jìn)行檢測(cè)光信號(hào)檢測(cè)方法在反應(yīng)孔中分別加入25W樣品，再依次加入25W發(fā)光試劑(25(￥g/ml)和25W生物素化抗體試劑(12Pg/ml)。然后放入儀器(光激化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng))，由儀器自動(dòng)按以下步驟操作振動(dòng)，37l溫育15分鐘，再自動(dòng)加入175W親和素包被的感光微粒試劑(40Pg/ml)后37'C溫育15分鐘。儀器自動(dòng)產(chǎn)生激光照射微孔計(jì)算每孔發(fā)光光子量。標(biāo)記分子比例(生物素抗體)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>L2-20.290.330.350.370.36L3-20.280.290.320.330.34特異性符合率20/2020/2020/2020/2020/20Hook(10(mg/ml檢測(cè)值)425.84478.09527.39544.37539.15QCH均值203.8203.87206.19201.55199.71CV(%)4.865.315.034.884.95QCL均值10.0210.0510.4210.3310.22CV(%)5.986.585.475.456.32標(biāo)記比例越高，與實(shí)際測(cè)定比例之間的偏差越大。從靈敏度及Hookeffect等方面進(jìn)行考慮，最終選擇40:1的比例。實(shí)施例3親和素包被的感光微粒的制備感光微粒采用粒徑為220土40nm的感光微粒(美國(guó)PentaTek公司)制備方法a、感光微?；鞈乙禾幚砦∫欢康母泄馕⒘Ｓ诟咚倮鋬鲭x心機(jī)中離心，棄去上清，加入一定量MES緩沖液，超聲細(xì)胞破碎儀上超聲至微粒重新懸浮，加入MES緩沖液調(diào)節(jié)感光微粒濃度至100mg/ml。b、親和素溶液配制稱(chēng)量一定量Avidin，加MES緩沖液溶解至8mg/ml。c、混合將處理好的感光微粒混懸液、8mg/ml的Avidin以及MES緩沖液，以2:5:l的體積比進(jìn)行混合，迅速混勻，得到反應(yīng)液。d、反應(yīng)MES緩沖液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應(yīng)液1:25的體積比加入，迅速混勻。37。C旋轉(zhuǎn)反應(yīng)48小時(shí)。e、封閉MES緩沖液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應(yīng)液2:1:10的體積比加入上述溶液中，混勻，37"C旋轉(zhuǎn)反應(yīng)2小時(shí)。再加入200mg/ml的BSA溶液(MES緩沖液)，其與反應(yīng)液體積比為5:8，迅速混勻，37'C旋轉(zhuǎn)反應(yīng)16小時(shí)。f、清洗向反應(yīng)好的溶液中加入MES緩沖液，高速冷凍離心機(jī)離心，棄上清，加入新鮮MES緩沖液超聲法重新懸浮，再次離心，如此清洗3次，最后用少量的感光試劑緩沖液進(jìn)行懸浮，測(cè)定固含量，用感光試劑緩沖液調(diào)節(jié)濃度至10mg/ml。18實(shí)施例4臨床cutoff點(diǎn)確定試劑配制1.發(fā)光抗體緩沖液pH8.0成分為HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H20的HEPES緩沖液，添加BSA及100U/ml慶大霉素和質(zhì)量百分比為萬(wàn)分之五Proclin300。2.生物素標(biāo)記抗體緩沖液pH8.0的成分為T(mén)ris、NaCl和EDTA-Na-2H20的Tris緩沖液，添加BSA及100U/ml慶大霉素和質(zhì)量百分比為萬(wàn)分之五Proclin300。3.表面抗體(HBsAb)包被的發(fā)光微粒試劑采用實(shí)施例l的方法，選擇250nm的粒徑，發(fā)光量為》250，000光子數(shù)/100Pg的發(fā)光微粒，0.1MpH7.0的PBbuffer作為反應(yīng)緩沖液，20mg/ml的發(fā)光微粒反應(yīng)濃度，10:2的FG-bead與HBsAb比例，透析法清洗制得表面抗體包被的發(fā)光微粒。將抗體包被的發(fā)光微粒用發(fā)光抗體緩沖液調(diào)節(jié)濃度至10mg/ml。4.生物素標(biāo)記抗體試劑采用實(shí)施例2的方法，抗體與Biotin按照40:1的比例制得生物素標(biāo)記抗體。將生物素標(biāo)記抗體用生物素標(biāo)記抗體緩沖液調(diào)節(jié)濃度至0.5mg/ml。5.親和素包被的感光微粒試劑由實(shí)施例3的方法制得親和素包被的感光微粒，將親和素包被的感光微粒用感光試劑緩沖液調(diào)節(jié)濃度至10mg/ml。光信號(hào)檢測(cè)方法在反應(yīng)孔中分別加入25W樣品，再依次加入25W發(fā)光試劑和25W生物素化抗體試劑。然后放入儀器(光激化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng))，由儀器自動(dòng)按以下步驟操作振動(dòng)，37t:溫育20分鐘，再自動(dòng)加入175W親和素包被的感光微粒試劑后37'C溫育15分鐘。儀器自動(dòng)產(chǎn)生激光照射微孔計(jì)算每孔發(fā)光光子量。根據(jù)對(duì)1042個(gè)正常非乙型肝炎患者的血樣進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果，99%的樣品HBsAg水平小于0.2ng/ml，所以我們可以認(rèn)為0.2ng/ml是本試劑的臨床cutoff點(diǎn)，所以我們配制濃度為0.2ng/ml的樣品作為我們的HBsAg參考樣品并使用賦值后的定標(biāo)品對(duì)HBsAg參考樣品進(jìn)行三次重復(fù)標(biāo)定，最終測(cè)定均值必須在0.19-0.21ng/ml。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>實(shí)施例5陰性、陽(yáng)性對(duì)照、參考樣及定標(biāo)品的制備1.HBsAg陰性對(duì)照經(jīng)過(guò)之前試驗(yàn)驗(yàn)證新生牛血清的光信號(hào)水平與臨床陰性血清相當(dāng)，故1使用新生牛血清作為HBsAg陰性對(duì)照。2.朋sAg陽(yáng)性對(duì)照使用衛(wèi)生部臨檢中心出品的乙型肝炎表面抗原定量參考品以新生牛血清為稀釋液配制濃度為3ng/ml的溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。3.根據(jù)對(duì)臨床cutoff點(diǎn)的研究，使用衛(wèi)生部臨檢中心出品的乙型肝炎表面抗原定量參考品，以新生牛血清為稀釋液，配制濃度為0.2ng/ml的樣品作為參考樣。4.定標(biāo)品使用衛(wèi)生部臨檢中心出品的乙型肝炎表面抗原定量參考品，以新生牛血清為稀釋液，按照濃度0ng/ml，0.2ng/ml，4ng/ml，30ng/ml，150ng/ml，500ng/ml配制6個(gè)定標(biāo)品實(shí)施例6乙型肝炎表面抗原定性及定量檢測(cè)首先向反應(yīng)孔中分別加入樣品，再依次加入發(fā)光試劑(抗體包被的發(fā)光微粒)和生物素標(biāo)記抗體。然后放入儀器(光激化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng))，由儀器自動(dòng)按以下步驟操作振動(dòng)，37'C溫育。再自動(dòng)加入親和素包被的感光微粒后37'C再次溫育。溫育結(jié)束后儀器自動(dòng)產(chǎn)生激光照射微孔計(jì)算每孔發(fā)光光子量。按上述方法檢測(cè)各個(gè)定標(biāo)品的發(fā)光光子量，將測(cè)得的光信號(hào)值與相應(yīng)的定標(biāo)品濃度采用cubicspline擬和作圖即得，標(biāo)準(zhǔn)曲線呈線性。在定量測(cè)定中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，按樣本實(shí)測(cè)光信號(hào)值計(jì)算每一個(gè)樣本的HBsAg含量，單位是ng/ml。定性檢測(cè)在定性測(cè)定中，檢測(cè)參考樣品的光信號(hào)值計(jì)，計(jì)算每一個(gè)樣本的S/C0(即待測(cè)樣品光信號(hào)值與HBeAg參考樣品光信號(hào)的比值)，當(dāng)S/C0》1時(shí)待測(cè)樣品被判定為陽(yáng)性，當(dāng)S/C0<1時(shí)待測(cè)樣品被判定為陰性。檢測(cè)陰陽(yáng)對(duì)照的光信號(hào)，如檢測(cè)結(jié)果出錯(cuò)，則檢測(cè)無(wú)效，需重新檢測(cè)。檢測(cè)條件的優(yōu)化試驗(yàn)l.l溫育時(shí)間的確定試驗(yàn)材料采用抗體包被的25(^g/ml的發(fā)光微粒試劑(下簡(jiǎn)稱(chēng)發(fā)光抗體試劑)和12Pg/ml的生物素標(biāo)記抗體試劑，及40Pg/ml的親和素包被的感光微粒試劑檢驗(yàn)樣本靈敏度參考品和質(zhì)控品Q(chēng)cL，QcH。初始反應(yīng)條件加樣量為樣品25W，發(fā)光微粒試劑25W，生物素標(biāo)記抗體試劑25ri，親和20素包被的感光微粒試劑為175W，兩步溫浴。1.1.1第一步溫育時(shí)間的確定第一步溫育時(shí)間分別為10min、15min、20min、30min，第二步溫育時(shí)間為20min對(duì)檢驗(yàn)樣本進(jìn)行檢測(cè)，分別考察靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性、精密度等指標(biāo)。結(jié)果見(jiàn)下表<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行分析比較，在其余條件相同的情況下，第二步溫育時(shí)間為15min結(jié)果已經(jīng)趨于穩(wěn)定，延長(zhǎng)第二步溫育時(shí)間已經(jīng)沒(méi)有實(shí)際意義，所以我們將第二步溫育時(shí)間確定為為15min。1.2加樣模式的考察試驗(yàn)材料采用抗體包被的25(^g/ml的發(fā)光微粒試劑(下簡(jiǎn)稱(chēng)發(fā)光抗體試劑)和12Pg/ml的生物素標(biāo)記抗體試劑，及4Cmg/ml的親和素包被的感光微粒試劑檢驗(yàn)樣本靈敏度參考品和質(zhì)控品Q(chēng)cL,QeH。初始反應(yīng)條件依次添加樣品、發(fā)光微粒試劑、生物素標(biāo)記抗體試劑、親和素包被的感光微粒，兩步溫浴，其中第一溫浴時(shí)間為20min，第二溫浴時(shí)間為15min。設(shè)計(jì)了三種加樣模式進(jìn)行考察。模式l:樣品+10W發(fā)光抗體試劑+10W生物素化抗體試劑+70W親和素包被的感光微粒試劑；模式2:樣品+15W發(fā)光抗體試劑+15W生物素化抗體試劑+105W親和素包被的感光微粒試劑；模式3:25W樣品+25W發(fā)光抗體試劑+25W生物素化抗體試劑+175|4親和素包被的感光微粒試劑。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行分析比較，在其余條件相同的情況下，并考慮到手工加樣樣品量過(guò)小會(huì)造成不便于操作的影響以及更容易產(chǎn)生誤差，所以我們選擇模式3為我們的加樣模式。1.3發(fā)光抗體、生物素化抗體、親和素包被的感光微粒濃度的篩選試驗(yàn)材料采用抗體包被的發(fā)光微粒試劑(下簡(jiǎn)稱(chēng)發(fā)光抗體試劑)和生物素標(biāo)記抗體試劑，及親和素包被的感光微粒試劑檢驗(yàn)樣本靈敏度參考品和質(zhì)控品Q(chēng)cL，QcH。初始反應(yīng)條件依次添加25)4樣品、2514發(fā)光微粒試劑、生物素標(biāo)記抗體試劑、親和素包被的感光微粒，兩步溫浴，其中第一溫浴時(shí)間為20min,第二溫浴時(shí)間為15min。1.3.1發(fā)光抗體和生物素化抗體濃度的初篩親和素包被的感光微粒采用40Pg/ml的濃度，分別配制濃度為100Pg/ml、200Pg/ml、300Pg/ml和400Pg/ml的發(fā)光抗體以及濃度為8Pg/ml、16|ig/ml、24[ig/ml的生物素化抗體交叉配對(duì)進(jìn)行檢測(cè)，在初始條件下結(jié)果分別如下<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行分析比較，發(fā)光試劑的濃度在20(^g/ml-30(mg/ml之間，生物素化抗體的濃度在8[ig/ml-16^/ml之間結(jié)果較為理想。1.3.2發(fā)光抗體和生物素化抗體濃度的精篩根據(jù)初篩的結(jié)果分別配制濃度為200Pg/ml、250Pg/ml、30(￥g/ml的發(fā)光抗體以及濃度為8化/ml、12Pg/ml、16Pg/ml的生物素化抗體交叉配對(duì)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果分別如下200Pg/ml發(fā)光抗體<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行分析比較，發(fā)光試劑的濃度在250Pg/ml，生物素化抗體的濃度在12化/ml時(shí)結(jié)果最為理想，故選擇以上濃度為工作濃度。發(fā)光抗體濃度選用250Pg/ml，生物素化抗體的濃度選用12Pg/ml，親和素包被的感光微粒濃度分別配制為301^g/ml，4(mg/ml，50[ig/ml，在初始反應(yīng)條件下，結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>根據(jù)靈敏度比較，QcL和QcH的測(cè)定濃度，親和素包被的感光微粒濃度在40Pg/ml時(shí)結(jié)果最為理想。實(shí)施例7評(píng)價(jià)試驗(yàn)試劑采用發(fā)光抗體試劑(250Pg/ml)、生物素標(biāo)記抗體試劑(12Pg/ml)及親和素包被的感光微粒試劑UOPg/ml)。檢測(cè)方法在反應(yīng)孔中分別加入25W樣品，再依次加入25W發(fā)光試劑和25W生物素化抗體試劑。然后放入儀器，由儀器自動(dòng)按以下步驟操作振動(dòng)，37"C溫育20分鐘，再自動(dòng)加入親和素包被的感光微粒試劑后37。C溫育15分鐘。儀器自動(dòng)產(chǎn)生激光照射微孔計(jì)算每孔發(fā)光光子量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以推算樣品HBsAg濃度，單位是ng/ml，也可以根據(jù)S/CO值判斷樣品的陰陽(yáng)性，最后打印試驗(yàn)報(bào)告。1.定量模式性能評(píng)價(jià)1.1檢測(cè)范圍在3個(gè)臨床試驗(yàn)點(diǎn)對(duì)1042個(gè)正常非乙型肝炎患者的血樣進(jìn)行檢測(cè)，99%的樣品HBsAg水平小于0.2ng/ml。而高濃度HBsAg水平的病人樣品可導(dǎo)致RLU(相對(duì)光子單位)的反常性下降(即高滴度的鉤帶效應(yīng))。在本測(cè)定方法中，HBsAg水平高達(dá)100Mg/ml的病人樣品的檢測(cè)結(jié)果將大于500ng/ml。因此確定檢測(cè)范圍為0.2-500ng/ml。1.2靈敏度的檢測(cè)對(duì)靈敏度參考品(編號(hào)L1-13、L2-13、L3-l3)，均需檢出所要求的靈敏度參考品(要求檢出L1-2;L2-2;L3-2)。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>1.3特異性的檢測(cè)檢測(cè)20份特異性參考品，不得檢出假陽(yáng)性。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>2.3線性的檢測(cè)對(duì)除0值外其他5點(diǎn)定標(biāo)品(實(shí)施例6制備)做線性分析，計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)r(r應(yīng)大于0.99)，r=0.9997。2.4精密性的檢測(cè)分別采用2個(gè)批號(hào)的試劑對(duì)高、低2個(gè)水平的乙肝e抗原質(zhì)控品進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)10次，將結(jié)果數(shù)值代入公式，計(jì)算CV值<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>(s/co)L2-2+L3-2+特異性符合率20/20陰性對(duì)照(s/co)均值0.56CV(%)4.67陽(yáng)性對(duì)照(s/co)均值5.81CV(%)3.49由上述結(jié)果確定本產(chǎn)品在定性模式下靈敏度、特異性、精密性等指標(biāo)均能達(dá)到要求。實(shí)施例8比較試驗(yàn)試劑采用發(fā)光抗體試劑(250Pg/ml)、生物素標(biāo)記抗體試劑(12化/ml)及親和素包被的感光微粒試劑(60化/ml)。以美國(guó)Abbott公司HBeAg試劑盒(磁性微粒發(fā)光系統(tǒng))為參照進(jìn)行了質(zhì)量水平比較，所用標(biāo)本為前述靈敏度參考品，結(jié)果如下樣品Beyond公司(S/C0)Abbott公司(S/C0)靈敏度參考品L1-21.512.33L2-21.461.84L3-21.381.58企業(yè)20份特異性參考品符合率20/2020/20根據(jù)以上結(jié)果，本公司試劑盒的最低檢出率與特異性已和AbboU公司的產(chǎn)品基本相當(dāng)。實(shí)施例9試劑盒的組配將實(shí)施例1-3中按照各種方法制備的的三種試劑分別獨(dú)立包裝，組配后獲得基本試劑盒?？捎糜跈z測(cè)待測(cè)樣本的光激化學(xué)反應(yīng)光信號(hào)。在上述試劑盒中加入分別獨(dú)立包裝的實(shí)施例6配制的陰性、陽(yáng)性對(duì)照及參考樣后獲得定性檢測(cè)試劑盒?？捎糜诙ㄐ詸z測(cè)乙型肝炎表面抗原。在上述試劑盒中加入獨(dú)立包裝的實(shí)施例6配制的定標(biāo)品后獲得定量檢測(cè)試劑盒?？捎糜诙繖z測(cè)乙型肝炎表面抗原。權(quán)利要求1.一種乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)微粒，為乙型肝炎表面抗體包被的發(fā)光微粒。2.如權(quán)利要求l所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)微粒，其特征在于，所述發(fā)光微粒的粒徑范圍為50-400nm。3.如權(quán)利要求2所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)微粒，其特征在于，所述發(fā)光微粒的粒徑范圍為100-300nm。4.如權(quán)利要求1所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)微粒，其特征在于，所述發(fā)光微粒的表面官能團(tuán)選自羧基或醛基。5.如權(quán)利要求1所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)微粒，其特征在于，所述發(fā)光微粒的發(fā)光量為150，000-350,000光子數(shù)/100^g發(fā)光微粒。6.如權(quán)利要求1-5中任一權(quán)利要求所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)微粒，其特征在于，所述發(fā)光微粒與乙型肝炎表面抗體的質(zhì)量比例為10:(1-4)。7.如權(quán)利要求6所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)微粒，其特征在于，所述發(fā)光微粒與乙型肝炎表面抗體的質(zhì)量比例為10:2。8.如權(quán)利要求1-7中任一權(quán)利要求所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)微粒的制備方法，包括下列步驟a)將發(fā)光微粒與乙型肝炎表面抗體混合于緩沖液中獲得混合液；b)加入緩沖液配制的NaBH3CN溶液混合并反應(yīng)；c)加入緩沖液配制的Gly及NaBH3CN溶液，混勻反應(yīng)后，再加入BSA溶液封閉；d)清洗產(chǎn)物，獲得乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)微粒。9.如權(quán)利要求8所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)微粒的制備方法，其特征在于，所述緩沖液為MES緩沖液或磷酸緩沖液。10.如權(quán)利要求8所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)微粒的制備方法，其特征在于，所述步驟a的混合液中，發(fā)光微粒的濃度為10-40mg/ml。11.如權(quán)利要求8所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)微粒的制備方法,其特征在于，所述步驟d的清洗的方式為離心法清洗。12.—種乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)試劑盒，包括權(quán)利要求1-7中任一權(quán)利要求所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)微粒。13.如權(quán)利要求12所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，還包括生物素標(biāo)記的乙型肝炎表面抗體或親和素包被的感光微粒中的一種或兩種。14.如權(quán)利要求13所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述生物素標(biāo)記的乙型肝炎表面抗體中，生物素與乙型肝炎表面抗體的分子比例為(10-50):1。15.如權(quán)利要求14所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述生物素標(biāo)記的乙型肝炎表面抗體中，生物素與乙型肝炎表面抗體的分子比例為40:1。16.如權(quán)利要求13所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述親和素包被的感光微粒中，親和素與感光微粒的質(zhì)量比例為1:(3-10)。17.如權(quán)利要求16所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述親和素包被的感光微粒中，親和素與感光微粒的質(zhì)量比例為l:5。18.如權(quán)利要求13所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)微粒、生物素標(biāo)記的乙型肝炎表面抗體以及親和素包被的感光微粒分別獨(dú)立包裝，且均為混懸液。19.如權(quán)利要求18所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述混懸液的溶劑選自HEPES緩沖體系或Tris緩沖體系。20.如權(quán)利要求19所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)微?；鞈乙旱娜軇閜H8.0的成分為HEPES、NaCl和EDTA-Na-2H20的HEPES緩沖液。21.如權(quán)利要求19所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，生物素標(biāo)記的乙型肝炎表面抗體混懸液的溶劑為pH8.0的成分為T(mén)ris、NaCl和EDTA-Na-2H20的Tris緩沖液。22.如權(quán)利要求19所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，親和素包被的感光微?；鞈乙旱娜軇槌煞譃镠EPES、NaCl和EDTA-Na-2H20的HEPES緩沖液。23.如權(quán)利要求18所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述混懸液中還包括蛋白保護(hù)劑、防止微粒聚集的穩(wěn)定試劑或防腐劑中的一種或多種。24.如權(quán)利要求23所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述蛋白保護(hù)劑為BSA,防止微粒聚集的穩(wěn)定試劑為T(mén)ween20，防腐劑為慶大霉素和Proclin300。25.如權(quán)利要求13所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述檢測(cè)試劑盒中還包括陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照以及參考樣品。26.如權(quán)利要求25所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述參考樣品為含有乙型肝炎表面抗原的溶液，其乙型肝炎表面抗原的濃度為乙型肝炎表面抗原臨床cutoff點(diǎn)對(duì)應(yīng)的濃度。27.如權(quán)利要求13所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述檢測(cè)試劑盒中還包括定標(biāo)品。28.如權(quán)利要求12-27中任一權(quán)利要求所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)試劑盒的使用方法，包括下列步驟1)在反應(yīng)孔中加入樣品、乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)微粒和生物素標(biāo)記的乙型肝炎表面抗體，獲得初始反應(yīng)溶液，混合反應(yīng)；2)再加入親和素包被的感光微粒獲得最終反應(yīng)溶液進(jìn)行反應(yīng)；3)激發(fā)光照射反應(yīng)孔，測(cè)量每個(gè)反應(yīng)孔發(fā)光光子量獲得光信號(hào)值。29.如權(quán)利要求28所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，所述步驟3的激發(fā)光光源波長(zhǎng)范圍為600-700nm。30.如權(quán)利要求29所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，所述激發(fā)光光源的功率范圍為5-100mw。31.如權(quán)利要求30所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，所述激發(fā)光光源波長(zhǎng)范圍為640-680nm，激發(fā)光光源的功率范圍為40-60w。32.如權(quán)利要求28所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，所述步驟l)和2)的反應(yīng)條件為37'C溫育10-30分鐘。33.如權(quán)利要求32所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，所述步驟1)的反應(yīng)條件為37。C溫育20分鐘，步驟2)的反應(yīng)條件為37。C溫育15分鐘。34.如權(quán)利要求28所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，所述初始反應(yīng)溶液中，乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)微粒的濃度為100-40(￥g/ml，生物素標(biāo)記的乙型肝炎表面抗體的濃度為8-24[ig/ml，所述最終反應(yīng)溶液中，親和素包被的感光微粒的濃度為30-10(mg/ml。35.如權(quán)利要求34所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，所述初始反應(yīng)溶液中，乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)微粒的濃度為25(^g/ml，生物素標(biāo)記的乙型肝炎表面抗體的濃度為12Pg/ml，所述最終反應(yīng)溶液中，親和素包被的感光微粒的濃度為鄉(xiāng)g/ml。36.如權(quán)利要求28-35中任一權(quán)利要求所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，還包括根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品HBsAg含量。37.如權(quán)利要求28-35中任一權(quán)利要求所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，還包括計(jì)算樣品光信號(hào)值與HBsAg參考樣品光信號(hào)的比值，即S/CO值。38.如權(quán)利要求28-35中任一權(quán)利要求所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，初始反應(yīng)溶液的體積為30—75W;最終反應(yīng)溶液的體積為100—250W。39.如權(quán)利要求38所述乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，初始反應(yīng)溶液的體積為75W，最終反應(yīng)溶液的體積為250)4。全文摘要本發(fā)明涉及乙肝的診斷試劑，公開(kāi)了一種乙型肝炎表面抗原的檢測(cè)微粒，為乙型肝炎表面抗體包被的發(fā)光微粒。本發(fā)明還公開(kāi)了上述乙型肝炎表面抗原檢測(cè)微粒的制備及應(yīng)用。此外，本發(fā)明又進(jìn)一步公開(kāi)了一種測(cè)定樣品中乙型肝炎表面抗原的體外診斷試劑盒，同時(shí)公開(kāi)了該試劑盒的使用方法。本發(fā)明的試劑盒，可以與其它血清和臨床信息聯(lián)合用于診斷個(gè)體發(fā)生急性或慢性乙型肝炎感染的情況，也可用于對(duì)圍產(chǎn)期女性乙型肝炎的篩選，以判斷新生兒感染乙型肝炎的危險(xiǎn)性。文檔編號(hào)G01N33/576GK101666801SQ20081004239公開(kāi)日2010年3月10日申請(qǐng)日期2008年9月2日優(yōu)先權(quán)日2008年9月2日發(fā)明者旸吳,偉張,王海蛟,趙衛(wèi)國(guó)申請(qǐng)人:博陽(yáng)生物科技(上海)有限公司