專利名稱：用于抑制基因表達(dá)的組合物及其用途的制作方法
用于抑制基因表達(dá)的組合物及其用途發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于抑制基因表達(dá)和/或活性的化合物、組合物及使用方法；或者用于診斷、治療和/或預(yù)防對(duì)所述基因表達(dá)和/或活性的抑制有響應(yīng)的疾病和/或病況的化合物、組合物及方法。相關(guān)技術(shù)的概述一種抑制基因表達(dá)的方法是反義技術(shù)或RNA抑制(RNAi)。這些方法利用基于DNA和 /或RNA 的寡核昔酸(DNA and/or RNA-based oligonucleotides)對(duì)選自 mRNA、微小 RNA、preRNA或線粒體RNA的靶標(biāo)的序列特異性結(jié)合，及其由此產(chǎn)生的翻譯抑制。這樣的基于寡核苷酸的翻譯的抑制以及最終的基因表達(dá)的抑制是一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞機(jī)制的結(jié)果，其中可以包括但不限于⑴翻譯的直接(立體)阻斷，(ii) RNA酶H介導(dǎo)的抑制，以及(iii)RNAi介導(dǎo)的抑制(例如短干擾-RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、DNA指導(dǎo)的RNAi (ddRNAi)、以及單 鏈 RNAi(ssRNAi))。反義技術(shù)的歷史解釋盡管與mRNA結(jié)合的反義寡核苷酸的確定是相對(duì)直接的，但優(yōu)化具有實(shí)際的基因表達(dá)抑制能力并且由此作為良好的臨床候選藥物的過程并不是如此。相應(yīng)地，如果一種基于寡核苷酸的基因表達(dá)下調(diào)方法要取得成功，需要最為有效地獲得該結(jié)果的經(jīng)優(yōu)化的反義寡核苷酸。這樣經(jīng)優(yōu)化的反義寡核苷酸可以單獨(dú)使用或與其它預(yù)防性和/或治療性組合物一起使用。自從Zamecnik和Stephenson發(fā)表了使用反義寡核苷酸作為抑制病毒蛋白質(zhì)翻譯的手段的第一個(gè)不例(Zemecnik 和 Stephenson (1978)Proc. Natl. Acad. Sci. 75 :285-288)以來，就存在對(duì)于利用基于寡核苷酸的化合物抑制基因的表達(dá)的巨大關(guān)注。這些初步的努力利用在體內(nèi)固有地不穩(wěn)定的單鏈、未修飾的寡脫氧核糖核苷酸或寡核糖核苷酸(Agrawal 等人(1992) Ann. NY Acad. Sci. 660 2-10)在體內(nèi)結(jié)合mRNA并產(chǎn)生雙鏈RNA模板，用于酶或RNA酶降解。隨后進(jìn)行的努力確定引入了抗核酸酶的硫代磷酸酯和/或甲基膦酸酯聯(lián)接的寡脫氧核糖核苷酸的用途(Agrawal 等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85 :7079-7083 ；Metelev 和 Agrawal US 5, 652, 355；Metelev 和 Agrawal US6, 143, 881 ；Matsukura 等人
(1987)Proc. Natl. Acad. Sci. 84 :7706)。另一類抑制基因表達(dá)的基于RNA的分子被稱為核酶(ribozymes)。核酶形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)并且結(jié)合于RNA祀標(biāo)從而直接調(diào)節(jié)其切割(Cech, T. (1990) Ann. Rev. Biochem. 59:543)。核酶選擇性地與靶RNA結(jié)合并且催化酯交換或水解反應(yīng)，以切割單鏈RNA中特定的磷酸二酯聯(lián)接。如果被導(dǎo)入到細(xì)胞中，核酶具有與靶mRNA結(jié)合并抑制該mRNA的翻譯的能力。和單鏈反義技術(shù)一樣，已經(jīng)通過向核酶結(jié)構(gòu)中引入一定的化學(xué)修飾證明了核酶的穩(wěn)定性和活性(Goodchild US 6, 204,027 ；Goodchild US 6,573,072)。隨著反義寡核苷酸和核酶技術(shù)的持續(xù)進(jìn)步，也發(fā)現(xiàn)了其它基于寡核苷酸的技術(shù)?；贔ire 和 Mello 的開拓性發(fā)現(xiàn)(Fire 等人(1998) Nature, 391 :806-811),人們的努力已經(jīng)轉(zhuǎn)向在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中的RNA干擾(RNAi)技術(shù)(例如短干擾-RNA(siRNA)、微小 RNA(miRNA)、DNA 指導(dǎo)的 RNAi (ddRNAi)、以及單鏈 RNAi (ssRNAi))。RNAi 是指利用設(shè)計(jì)為與特定的mRNA靶標(biāo)雜交的短寡核苷酸的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)抑制過程(Fire等人(1998)Nature 391 :806-811 ；Zamore 等人(2000)Cell, 101 :25-33)。在 siRNA 的情況下，短的、雙鏈的RNA分子利用細(xì)胞酶機(jī)制來切割同源靶RNA分子(Rana (2007) Nature Rev. Mo I.Cell. Biol. 8 :23-36)。雙鏈RNAi技術(shù)依賴于雙鏈RNA(dsRNA)的施用或表達(dá)，雙鏈RNA —旦出現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)，則會(huì)與被稱為dicer的酶結(jié)合并切割成21-23個(gè)核苷酸。結(jié)果產(chǎn)生的dicer-dsRNA復(fù)合物被轉(zhuǎn)移至含有Argonaut的蛋白質(zhì)復(fù)合物并與之相互作用，該復(fù)合物被稱為RNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)。認(rèn)為RISC存在于細(xì)胞中并且催化地分解特定的mRNA分子。一旦與RISC結(jié)合，該dsRNA會(huì)展開得到ssRNA-RISC復(fù)合物，其能夠水解靶mRNA。一旦發(fā)生雜交，則該RISC復(fù)合物分解mRNA。在一些情況下，使用單鏈RNAi (ssRNAi)組合物可以避開dicer的dsRNA特異性過程，該單鏈RNAi (ssRNAi)組合物與RISC直接相互作用從而實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的抑制(Holen等人(2003) Nuc. Acids Res. 31 :2401-2407)。盡管RNAi技術(shù)能夠選擇性地與靶mRNA結(jié)合，但已經(jīng)認(rèn)識(shí)到這樣的分子會(huì)通過與TLR3的相互作用誘導(dǎo)非特異性的免疫刺激(Kleinman 等人(2008) Nature 452 :591-597 ；De Veer 等人(2005)Immun. Cell Bio. 83 :224-228 ；Kariko 等人(2004) J. Immunol. 172 :6545-6549)。這樣的非特異性免疫激活在RNAi技術(shù)作為藥劑的應(yīng)用方面引發(fā)了問題。盡管上述每種基于反義的技術(shù)在使用時(shí)均取得了一定的成功，但由于它們是基于寡核苷酸的，這些技術(shù)均具有在體內(nèi)不穩(wěn)定以及可能產(chǎn)生脫靶效應(yīng)(例如非期望的免疫刺激，(Agrawal 和 Kandimalla (2004) Nature Biotech. 22 1533-1537))等固有問題。在 dsRNA的情況下，這些寡核苷酸還存在到細(xì)胞的體內(nèi)傳遞不充分的問題(Medarova等人(2007)Nature Med. 13 :372-377)。盡管有很多反義寡核苷酸藥物候選產(chǎn)品的臨床實(shí)驗(yàn)，但僅有一個(gè)這樣的化合物得到了 FDA的批準(zhǔn)作為藥物。該反義化合物被證實(shí)可以用于治療CMV，但是從未作為產(chǎn)品上市。另外，尚沒有核酶或siRNA藥物候選產(chǎn)品通過了 FDA的批準(zhǔn)。所有這些技術(shù)的優(yōu)化手段都聚焦于解決生物穩(wěn)定性、靶標(biāo)識(shí)別(例如，細(xì)胞滲透性、熱穩(wěn)定性)以及體內(nèi)活性等問題。通常，這些考慮因素是相互競(jìng)爭(zhēng)的。例如，傳統(tǒng)的反義寡核苷酸利用磷酸酯核苷酸間聯(lián)接，其被證實(shí)在生物學(xué)上過于不穩(wěn)定以至于無法有效地使用。因此，人們?cè)P(guān)注于對(duì)反義寡核苷酸進(jìn)行修飾以使得其生物學(xué)上更為穩(wěn)定。早期的方法關(guān)注于對(duì)核苷酸間聯(lián)接進(jìn)行修飾以使得它們對(duì)于細(xì)胞核酸酶的降解更有抗性。這些手段導(dǎo)致大量具有非天然核苷酸間聯(lián)接(例如硫代磷酸酯、甲基膦酸酯(Sarin等人
(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. 85 :7448-7451))，以及基于肽的聯(lián)接(Matsukura 等人(1987)Proc. Natl. Acad. Sci. 84 :7706 ；AgrawaI 等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85 :7079-7083 ；Miller(1991)Bio-Technology 9 :358)的反義寡核苷酸的開發(fā)。但是，這些修飾使得分子的靶標(biāo)特異性降低，并且產(chǎn)生不需要的生物活性。后來的改善穩(wěn)定性并且保持特異性及生物活性的方法使用了混合的主鏈寡核苷酸，混合的主鏈寡核苷酸含有磷酸二酯和硫代磷酸酯核苷酸間聯(lián)接。該混合的主鏈?zhǔn)沟门c僅具有磷酸二酯聯(lián)接的寡核苷酸相比，它們的生物穩(wěn)定性得到保持或改善(Agrawal等 人(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. 87 :1401-1405 ；US 專利公開 No. 20010049436)?？v觀寡核苷酸研究，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到這些分子在體內(nèi)對(duì)于外切核酸酶的降解敏感，其中主要的降解出現(xiàn)在分子的 3’ 端(Shaw 等人(1991)Nucleic Acids Res. 19 :747-750 ;Temsamani 等人(1993)Analytical Bioc. 215 :54-58)。因此，避免該外切核酸酶活性的途徑采用了下述方式(i)在 5’ 和 / 或 3’ 末端的帽狀結(jié)構(gòu)(Tesamani 等人(1992)Ann. NYAcad. Sci. 660 318-320 ；Temsamani 等人(1993) Antisense Res. Dev. 3 :277-284 ;Tang 等人(1993)Nucl.Acids Res. 20 :2729-2735)，(ii)通過分子之間的 5，_3，、5，_2、2，_3，、3，-2，或 3，-3，聯(lián)接連接兩個(gè)或多個(gè)寡核苷酸(Agrawal等人US6, 489，464), (iii)在3’端折疊回自身的自雜交寡核苷酸，其可產(chǎn)生發(fā)夾，并移除3’ -外切核酸酶活性啟動(dòng)所需的接觸位點(diǎn)(pointof access) (Tang 等人(1993) Nucl. Acids Res. 20 :2729-2735)，或者(iv)將 RNA 引入到寡核苷酸分子中，從而產(chǎn)生RNA/DNA雜合分子(Metelev等人(1994)Bioorg. Med. Chem.Lett. 4 :2929-2934 ；Metelev US 5，652，355 ;Metelev和 Agrawal US 6,143, 881 ；Metelev和 Agrawal US 6, 346, 614 ；Metelev 和 Agrawal US 6,683, 167, Metelev 和 Agrawal US7，045，609)。其它提高反義寡核苷酸穩(wěn)定性、保持反義寡核苷酸的特異性和生物學(xué)活性的手、段利用可形成三鏈體的(triplex-forming)、與雙鏈DNA或RNA祀標(biāo)結(jié)合的多喃唳寡核苷酸。多嘧啶寡核苷酸可以通過Hoogsteen氫鍵在大溝與雙鏈體DNA結(jié)合并形成含有具有T =A-T和C =G-C+堿基三鏈體的一個(gè)多嘌呤和兩個(gè)多嘧啶鏈(Moser，H. E.和Dervan，P.B. (1987) Science 238，645-650 ;Cooney 等(1988) Science 241,456-459)。當(dāng) DNA 同型嘌呤和同型卩密唳鏈解鏈和再折疊時(shí)也會(huì)形成分子內(nèi)三鏈體(Vasqueza, K. M. and Wilson,J.H. (1998) Trends Bioche. Sci. 23，4_9)。第三條鏈的存在對(duì)DNA柔性產(chǎn)生嚴(yán)格的限制，改變其沿著大溝識(shí)別特異蛋白質(zhì)的能力(Shields, G. C.等人(1997)Am. Chem. Soc. , 119,7463-7469 Jimenez-Garcia, E 等人(1998) J. Biol. Chem. 273，24640-24648)，導(dǎo)致對(duì)轉(zhuǎn)錄的抑制并最終會(huì)減少基因表達(dá)。能夠序列特異性地與雙鏈DNA或RNA結(jié)合的寡核苷酸可以作為轉(zhuǎn)錄/翻譯的調(diào)節(jié)劑，并且提供了有前景的控制基因表達(dá)的調(diào)節(jié)的抗原/反義策略(Giovannangeli, C.和 Helene, C. (1997)Antisense Nucleic Acid Drug Dev. ,413 ；Giovannangeli,C.等(1996)Biochemistry 35,10539 ；Maher,L. J.等(1992)Biochemistry31，70)。但是，形成穩(wěn)定三鏈體的條件是有問題的，原因是堿基識(shí)別受限制，以及在形成三鏈體的寡核苷酸中胞嘧啶質(zhì)子化所需的非生理學(xué)的酸性PH條件。在嘗試形成這樣穩(wěn)定的三鏈體的過程中，描述了通過接頭連接具有反轉(zhuǎn)極性的多嘧啶寡核苷酸(即，具有5’ 一 3’極性的一個(gè)序列后續(xù)具有3’ 一 5’極性的另一個(gè)序列，或相反)(Froehler，US5, 399，676 ；Froehler US5, 527，899 ；Froehler US5, 721，218)。在這樣反轉(zhuǎn)極性的寡核苷酸中，在反轉(zhuǎn)一側(cè)的序列根據(jù)三螺旋編碼與雙鏈體的多嘌呤鏈結(jié)合，而另一側(cè)的序列會(huì)結(jié)合至雙鏈體的相對(duì)鏈中的相鄰位置的多嘌呤位點(diǎn)(示意
圖1A)。以這種方式，如果需要并且有這樣的靶標(biāo)序列段可用的話，可以通過使識(shí)別從雙鏈體的一條鏈轉(zhuǎn)換到另一條鏈，然后又轉(zhuǎn)換回來，使三螺旋識(shí)別(triple helix recognition)延伸。此夕卜，這些寡核苷酸也可以與雙鏈體形成D-環(huán)，如示意圖IB所示。在這種情況下，具有第一種極性的區(qū)域可以形成三鏈體，而反轉(zhuǎn)的部分取代雙鏈體的一個(gè)鏈的一部分，結(jié)果在相關(guān)區(qū)域中形成取代雙鏈體(substitute duplex)。由于這樣的回轉(zhuǎn)寡核苷酸(swithchbackoligonucleotide)具有顯著的雙鏈體結(jié)合活性,可以利用這些寡核苷酸來使可致病的不期望的雙鏈體形式的DNA或RNA失活。但是，該分子的組成僅限于靶向雙鏈RNA或DNA的多嘌呤位點(diǎn)的多嘧啶序列。
A
權(quán)利要求
1.一種合成的基于寡核苷酸的化合物，其包含與一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列互補(bǔ)的兩個(gè)或多個(gè)寡核苷酸，其中所述各寡核苷酸在它們的5’端連接，使得所述基于寡核苷酸的化合物具有兩個(gè)或多個(gè)可及的3’端，并且所述基于寡核苷酸的化合物特異性地與所述一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列雜交并抑制所述一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列的表達(dá)。
2.權(quán)利要求I的基于寡核苷酸的化合物，其中所述各寡核苷酸獨(dú)立地具有15至40個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
3.權(quán)利要求I的基于寡核苷酸的化合物，其中所述各寡核苷酸通過核苷酸聯(lián)接彼此連接
4.權(quán)利要求I的基于寡核苷酸的化合物，其中所述各寡核苷酸通過接頭彼此連接。
5.權(quán)利要求4的基于寡核苷酸的化合物，其中所述接頭是非核苷酸接頭。
6.權(quán)利要求I的基于寡核苷酸的化合物，其中所述各寡核苷酸包含一個(gè)或多個(gè)核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、鎖定核酸、阿拉伯糖核苷酸或它們的組合。
7.權(quán)利要求I的基于寡核苷酸的化合物，其中所述各寡核苷酸中的至少一個(gè)是經(jīng)修飾的。
8.權(quán)利要求7的基于寡核苷酸的化合物，其中所述經(jīng)修飾的寡核苷酸具有至少一個(gè)選自下組的核苷酸間聯(lián)接烷基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、以及非核苷Ife接頭。
9.權(quán)利要求7的基于寡核苷酸的化合物，其中所述經(jīng)修飾的寡核苷酸包括至少一個(gè)2’ -O-取代的核苷酸。
10.權(quán)利要求9的基于寡核苷酸的化合物，其中所述2’-0-取代選自2’ -0-甲基、2’ 甲氧基、2’ 乙氧基、2’ 甲氧基乙基、2’ 燒基、2’ -0-芳基、以及2’ -0-稀丙基基團(tuán)。
11.根據(jù)權(quán)利要求I的基于寡核苷酸的化合物，其中所述基于寡核苷酸的化合物被RNAi介導(dǎo)的基因表達(dá)抑制中涉及的蛋白質(zhì)選擇性地結(jié)合和/或切割。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的基于寡核苷酸的化合物，其中所述RNAi介導(dǎo)的基因表達(dá)抑制中涉及的蛋白質(zhì)選自Dicer、Argonaut、和RISC。
13.根據(jù)權(quán)利要求I的基于寡核苷酸的化合物，其中所述基于寡核苷酸的化合物被RNaseH介導(dǎo)的基因表達(dá)抑制中涉及的蛋白質(zhì)選擇性地結(jié)合和/或切割。
14.一種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求I的基于寡核苷酸的化合物和生理學(xué)可接受的載體。
15.一種基于寡核苷酸的化合物，其包含與一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列互補(bǔ)的兩個(gè)寡核苷酸，其中所述各寡核苷酸在它們的5’端連接，使得該基于寡核苷酸的化合物具有兩個(gè)可及的3’端，并且該基于寡核苷酸的化合物特異性地與所述一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列雜交并抑制所述一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列的表達(dá)，該基于寡核苷酸的化合物具有如下結(jié)構(gòu) 域A域B式 II3_5_l_5_3 其中域A或域B中的至少一個(gè)是與互補(bǔ)的寡核糖核苷酸雜交以形成siRNA的寡核糖核苷酸。
16.一種基于寡核苷酸的化合物，其包含與一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列互補(bǔ)的三個(gè)寡核苷酸，其中所述各寡核苷酸在它們的5’端連接，使得該基于寡核苷酸的化合物具有兩個(gè)或多個(gè)可及的3’端，并且該基于寡核苷酸的化合物特異性地與所述一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列雜交并抑制所述一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列的表達(dá)，該基于寡核苷酸的化合物具有如下結(jié)構(gòu)
17.一種基于寡核苷酸的化合物，其包含與一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列互補(bǔ)的三個(gè)寡核苷酸，其中，所述各寡核苷酸中的兩個(gè)在它們的5’端連接，使得該基于寡核苷酸的化合物具有兩個(gè)可及的3’端，并且該基于寡核苷酸的化合物特異性地與所述一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列雜交并抑制所述一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列的表達(dá)，該基于寡核苷酸的化合物具有如下結(jié)
18.一種基于寡核苷酸的化合物，其包含與一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列互補(bǔ)的四個(gè)寡核苷酸，其中所述各寡核苷酸在它們的5’端連接，使得該基于寡核苷酸的化合物具有兩個(gè)可及的3’端，并且該基于寡核苷酸的化合物特異性地與所述一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列雜交并抑制所述一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列的表達(dá)，該基于寡核苷酸的化合物具有如下結(jié)構(gòu)
19.一種基于寡核苷酸的化合物，其包含三個(gè)寡核苷酸，其中所述各寡核苷酸中的兩個(gè)在它們的5’端連接，使得該基于寡核苷酸的化合物具有兩個(gè)可及的3’端，該基于寡核苷酸的化合物具有如下結(jié)構(gòu)
20.根據(jù)權(quán)利要求19的所述基于寡核苷酸的化合物，其中所述受體是TLR。
21.一種用于抑制基因表達(dá)的方法，該方法包括使細(xì)胞與合成的基于寡核苷酸的化合物接觸，所述合成的基于寡核苷酸的化合物包含與一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列互補(bǔ)的兩個(gè)或多個(gè)寡核苷酸，其中所述各寡核苷酸在它們的5’端連接，使得該寡核苷酸具有兩個(gè)或多個(gè)可及的3’端，并且所述各寡核苷酸特異性地與該一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列雜交并抑制該一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列的表達(dá)。
22.一種用于抑制體內(nèi)基因表達(dá)的方法，該方法包括以藥學(xué)有效量對(duì)哺乳動(dòng)物施用基于寡核苷酸的化合物，所述基于寡核苷酸的化合物包含與一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列互補(bǔ)的兩個(gè)或多個(gè)寡核苷酸，其中所述各寡核苷酸在它們的5’端連接，使得該寡核苷酸具有兩個(gè)或多個(gè)可及的3’端并且所述各寡核苷酸特異性地與該一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列雜交并抑制該一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列的表達(dá)。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述寡核苷酸與一個(gè)或多個(gè)編碼Bcl-2、EGFR、mdm2、MyD88、PCSK9、存活蛋白或VEGF的RNA互補(bǔ)。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述寡核苷酸與一個(gè)或多個(gè)編碼TLR的RNA互補(bǔ)。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述TLR選自TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8 和 TLR9。
26.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中施用路徑選自胃腸外、肌肉內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、粘膜投遞、口服、舌下、經(jīng)皮、局部、吸入、鼻內(nèi)、氣霧劑、眼內(nèi)、氣管內(nèi)、直腸內(nèi)、陰道、基因槍、皮膚貼片、滴眼劑或漱口劑。
27.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中每一個(gè)所述寡核苷酸與不同的單鏈RNA序列互補(bǔ)。
28.一種用于治療性處理患有由一種或多種蛋白質(zhì)介導(dǎo)的疾病或病癥的哺乳動(dòng)物的方法，該方法包括以藥學(xué)有效量對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用合成的基于寡核苷酸的化合物，該合成的基于寡核苷酸的化合物包含與一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列互補(bǔ)的兩個(gè)或多個(gè)寡核苷酸，其中所述各寡核苷酸在它們的5’端連接，使得所述寡核苷酸具有兩個(gè)或多個(gè)可及的3’端，并且所述各寡核苷酸特異性地與所述一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列雜交并抑制該一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列的表達(dá)，其中所述各寡核苷酸中的至少一個(gè)與編碼所述一種或多種蛋白質(zhì)的單鏈RNA互補(bǔ)。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法,其中多于一個(gè)的所述各寡核苷酸與編碼所述一種或多種蛋白質(zhì)的單鏈RNA互補(bǔ)。
30.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一種選自Bcl-2、EGFR、mdm2、MyD88、PCSK9、存活蛋白、VEGF、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8 和TLR9。
31.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述一種或多種蛋白質(zhì)選自Bcl-2、EGFR、mdm2、MyD88、PCSK9、存活蛋白、VEGF、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8 和 TLR9。
32.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述疾病或病癥選自癌癥、自身免疫性病癥、氣道炎癥、炎性病癥、感染性疾病、皮膚病癥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、細(xì)菌、病毒或真菌感染、或由病原體引起的疾病。
33.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其包括進(jìn)一步施用一種或多種疫苗、抗原、抗體、細(xì)胞毒劑、變應(yīng)原、抗生素、TLR激動(dòng)劑、TLR拮抗劑、siRNA分子、miRNA分子、反義寡核苷酸、適體、蛋白質(zhì)、肽、基因療法載體、DNA疫苗、佐劑、共刺激分子或它們的組合。
34.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中施用路徑選自胃腸夕卜、肌肉內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、粘膜投遞、口服、舌下、經(jīng)皮、局部、吸入、鼻內(nèi)、氣霧劑、眼內(nèi)、氣管內(nèi)、直腸內(nèi)、陰道、基因槍、皮膚貼片、滴眼劑或漱口劑。
35.一種用于在有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生由一種或多種蛋白質(zhì)介導(dǎo)的疾病或病癥的哺乳動(dòng)物中預(yù)防該疾病或病癥的方法，該方法包括以預(yù)防有效量對(duì)哺乳動(dòng)物施用合成的基于寡核苷酸的化合物，所述基于寡核苷酸的化合物包含與一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列互補(bǔ)的兩個(gè)或多個(gè)寡核苷酸，其中所述各寡核苷酸在它們的5’端連接，使得所述各寡核苷酸具有兩個(gè)或多個(gè)可及的3’端，并且所述各寡核苷酸特異性地與所述一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列雜交并抑制該一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列的表達(dá)，其中所述各寡核苷酸中的至少一個(gè)與編碼一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)的單鏈RNA互補(bǔ)。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述一種或多種蛋白質(zhì)中的至少一個(gè)選自Bcl-2、EGFR、mdm2、MyD88、PCSK9、存活蛋白、VEGF、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8 和TLR9。
37.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述一種或多種蛋白質(zhì)選自Bcl-2、EGFR、mdm2、MyD88、PCSK9、存活蛋白、VEGF、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8 和 TLR9。
38.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述疾病或病癥選自癌癥、自身免疫性病癥、氣道炎癥、炎性病癥、感染性疾病、皮膚病癥、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、細(xì)菌、病毒或真菌感染、或由病原體引起的疾病。
39.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
40.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中施用路徑選自胃腸夕卜、肌肉內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、粘膜投遞、口服、舌下、經(jīng)皮、局部、吸入、鼻內(nèi)、氣霧劑、眼內(nèi)、氣管內(nèi)、直腸內(nèi)、陰道、基因槍、皮膚貼片、滴眼劑或漱口劑。
41.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其包括進(jìn)一步施用一種或多種疫苗、抗原、抗體、細(xì)胞毒齊U、變應(yīng)原、抗生素、反義寡核苷酸、TLR激動(dòng)劑、TLR拮抗劑、siRNA分子、miRNA分子、反義寡核苷酸、適體、蛋白質(zhì)、肽、基因療法載體、DNA疫苗、佐劑、共刺激分子或它們的組合。
42.一種在哺乳動(dòng)物中抑制單鏈RNA表達(dá)和選定的分子的蛋白質(zhì)活性的方法，該方法包括以藥學(xué)有效量對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用基于寡核苷酸的化合物與蛋白質(zhì)活性拮抗劑的組合，所述基于寡核苷酸的化合物包含與一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列互補(bǔ)的兩個(gè)或多個(gè)寡核苷酸，其中各所述寡核苷酸在它們的5’端連接，使得所述各寡核苷酸具有兩個(gè)或多個(gè)可及的3’端，并且所述各寡核苷酸特異性地與所述一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列雜交并抑制該一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列的表達(dá)。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中所述選定的分子是TLR。
44.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中所述TLR拮抗劑選自下組抗-TLR抗體或其結(jié)合片段或其模擬肽、基于RNA的化合物、基于寡核苷酸的化合物、以及該TLR活性的小分子抑制劑。
45.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述基于寡核苷酸的化合物包含與一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列互補(bǔ)的兩個(gè)寡核苷酸，其中所述各寡核苷酸在它們的5’端連接，使得該基于寡核苷酸的化合物具有兩個(gè)可及的3’端，并且該基于寡核苷酸的化合物特異性地與所述一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列雜交并抑制該一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列的表達(dá)，所述基于寡核苷酸的化合物具有如下結(jié)構(gòu)
46.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述基于寡核苷酸的化合物包含與一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列互補(bǔ)的三個(gè)寡核苷酸，其中所述各寡核苷酸在它們的5’端連接，使得該基于寡核苷酸的化合物具有兩個(gè)或多個(gè)可及的3’端，并且該基于寡核苷酸的化合物特異性地與所述一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列雜交并抑制該一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列的表達(dá)，所述基于寡核苷酸的化合物具有如下結(jié)構(gòu)
47.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述基于寡核苷酸的化合物包含與一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列互補(bǔ)的三個(gè)寡核苷酸，其中所述各寡核苷酸中的兩個(gè)在它們的5’端連接，使得該基于寡核苷酸的化合物具有兩個(gè)可及的3’端，并且該基于寡核苷酸的化合物特異性地與所述一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列雜交并抑制該一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列的表達(dá)，所述基于寡核苷酸的化合物具有如下結(jié)構(gòu)
48.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述基于寡核苷酸的化合物包含與一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列互補(bǔ)的四個(gè)寡核苷酸，其中所述各寡核苷酸在它們的5’端連接，使得該基于寡核苷酸的化合物具有兩個(gè)可及的3’端，并且該基于寡核苷酸的化合物特異性地與所述一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列雜交并抑制該一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列的表達(dá)，所述基于寡核苷酸的化合物具有如下結(jié)構(gòu)
49.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述基于寡核苷酸的化合物包含三個(gè)寡核苷酸，其中所述各寡核苷酸中的兩個(gè)在它們的5’端連接，使得該基于寡核苷酸的化合物具有兩個(gè)可及的3’端，所述基于寡核苷酸的化合物具有如下結(jié)構(gòu)
50.根據(jù)權(quán)利要求49的方法，其中所述受體是TLR。
51.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述基于寡核苷酸的化合物包含與一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列互補(bǔ)的兩個(gè)寡核苷酸，其中所述各寡核苷酸在它們的5’端連接，使得該基于寡核苷酸的化合物具有兩個(gè)可及的3’端，并且該基于寡核苷酸的化合物特異性地與所述一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列雜交并抑制該一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列的表達(dá)，所述基于寡核苷酸的化合物具有如下結(jié)構(gòu)
52.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述基于寡核苷酸的化合物包括與一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列互補(bǔ)的三個(gè)寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在它們的5’端連接，使得所述基于寡核苷酸的化合物具有兩個(gè)或多個(gè)可及的3’端并且所述基于寡核苷酸的化合物特異性地與一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列雜交并抑制該一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列的表達(dá)，所述基于寡核苷酸的化合物具有如下結(jié)構(gòu)
53.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述基于寡核苷酸的化合物包含與一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列互補(bǔ)的三個(gè)寡核苷酸，其中各所述寡核苷酸中的兩個(gè)在它們的5’端連接，使得該基于寡核苷酸的化合物具有兩個(gè)可及的3’端，并且該基于寡核苷酸的化合物特異性地與所述一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列雜交并抑制該一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列的表達(dá)，所述基于寡核苷酸的化合物具有如下結(jié)構(gòu)
54.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述基于寡核苷酸的化合物包含與一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列互補(bǔ)的四個(gè)寡核苷酸，其中所述各寡核苷酸在它們的5’端連接，使得該基于寡核苷酸的化合物具有兩個(gè)可及的3’端，并且該基于寡核苷酸的化合物特異性地與所述一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列雜交并抑制該一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列的表達(dá)，所述基于寡核苷酸的化合物具有如下結(jié)構(gòu)
55.根據(jù)權(quán)利要求28的方法,其中所述基于寡核苷酸的化合物包含三個(gè)寡核苷酸,其中所述各寡核苷酸中的兩個(gè)在它們的5’端連接，使得該所述基于寡核苷酸的化合物具有兩個(gè)可及的3’端，該基于寡核苷酸的化合物具有如下結(jié)構(gòu)
56.根據(jù)權(quán)利要求55的方法，其中所述受體是TLR。
57.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述基于寡核苷酸的化合物包含與一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列互補(bǔ)的兩個(gè)寡核苷酸，其中所述各寡核苷酸在它們的5’端連接，使得該基于寡核苷酸的化合物具有兩個(gè)可及的3’端，并且該基于寡核苷酸的化合物特異性地與所述一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列雜交并且抑制該一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列的表達(dá)，所述基于寡核苷酸的化合物具有如下結(jié)構(gòu)
58.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述基于寡核苷酸的化合物包含與一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列互補(bǔ)的三個(gè)寡核苷酸，其中所述各寡核苷酸在它們的5’端連接，使得該基于寡核苷酸的化合物具有兩個(gè)或多個(gè)可及的3’端，并且所述基于寡核苷酸的化合物特異性地與一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列雜交并且抑制一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列的表達(dá)，所述基于寡核苷酸的化合物具有如下結(jié)構(gòu)
59.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述基于寡核苷酸的化合物包含與一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列互補(bǔ)的三個(gè)寡核苷酸，其中所述各寡核苷酸中的兩個(gè)在它們的5’端連接，使得該基于寡核苷酸的化合物具有兩個(gè)可及的3’端，并且該基于寡核苷酸的化合物特異性地與所述一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列雜交并且抑制該一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列的表達(dá)，所述基于寡核苷酸的化合物具有如下結(jié)構(gòu)
60.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述基于寡核苷酸的化合物包含與一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列互補(bǔ)的四個(gè)寡核苷酸，其中所述各寡核苷酸在它們的5’端連接，使得該基于寡核苷酸的化合物具有兩個(gè)可及的3’端，并且所述基于寡核苷酸的化合物特異性地與所述一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列雜交并抑制該一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列的表達(dá)，所述基于寡核苷酸的化合物具有如下結(jié)構(gòu)
61.根據(jù)權(quán)利要求35的方法,其中所述基于寡核苷酸的化合物包含三個(gè)寡核苷酸,其中所述各寡核苷酸中的兩個(gè)在它們的5’端連接，使得該基于寡核苷酸的化合物具有兩個(gè)可及的3’端，所述基于寡核苷酸的化合物具有如下結(jié)構(gòu)
62.根據(jù)權(quán)利要求61的方法，其中所述受體是TLR。
63.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中所述基于寡核苷酸的化合物包含與一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列互補(bǔ)的兩個(gè)寡核苷酸，其中所述各寡核苷酸在它們的5’端連接，使得該基于寡核苷酸的化合物具有兩個(gè)可及的3’端，并且所述基于寡核苷酸的化合物特異性地與所述一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列雜交并且抑制該一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列的表達(dá)，所述基于寡核苷酸的化合物具有如下結(jié)構(gòu)
64.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中所述基于寡核苷酸的化合物包含與一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列互補(bǔ)的三個(gè)寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在它們的5’端連接，該基于寡核苷酸的化合物具有兩個(gè)或多個(gè)可及的3’端并且所述基于寡核苷酸的化合物特異性地與一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列雜交并抑制該一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列的表達(dá)，所述基于寡核苷酸的化合物具有如下結(jié)構(gòu)
65.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中所述基于寡核苷酸的化合物包含與一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列互補(bǔ)的三個(gè)寡核苷酸，其中所述各寡核苷酸中的兩個(gè)在它們的5’端連接，該基于寡核苷酸的化合物具有兩個(gè)可及的3’端并且所述基于寡核苷酸的化合物特異性地與一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列雜交并抑制該一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列的表達(dá)，所述基于寡核苷酸的化合物具有如下結(jié)構(gòu)
66.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中所述基于寡核苷酸的化合物包含與一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列互補(bǔ)的四個(gè)寡核苷酸，其中所述各寡核苷酸在它們的5’端連接，使得該基于寡核苷酸的化合物具有兩個(gè)可及的3’端，并且該基于寡核苷酸的化合物特異性地與所述一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列雜交并抑制該一個(gè)或多個(gè)單鏈RNA序列的表達(dá)，所述基于寡核苷酸的化合物具有如下結(jié)構(gòu)
67.根據(jù)權(quán)利要求46的方法,其中所述基于寡核苷酸的化合物包含三個(gè)寡核苷酸,其中所述各寡核苷酸中的兩個(gè)在它們的5’端連接，使得該基于寡核苷酸的化合物具有兩個(gè)可及的3’端，所述基于寡核苷酸的化合物具有如下結(jié)構(gòu)
68. 其中域A、域B或域C中的至少一個(gè)是與單鏈RNA序列互補(bǔ)的寡核苷酸，使得該基于寡核苷酸的化合物特異性地與至少一個(gè)單鏈RNA序列雜交并抑制所述至少一個(gè)單鏈RNA序列的表達(dá)，以及其中域A、域B或域C中的至少一個(gè)是作為細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外受體的拮抗劑的寡核苷酸。68.根據(jù)權(quán)利要求67的方法，其中所述受體是TLR。
全文摘要
本發(fā)明人已經(jīng)檢查了用于提供更有效的基因表達(dá)封閉化合物的手段。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了令人驚奇地提高基因表達(dá)封閉分子的效率的新結(jié)構(gòu)特征。這些特征包括存在多個(gè)3’端以及5’端的接頭。令人驚奇的是，這些特征以降低基因表達(dá)封閉化合物的生物不穩(wěn)定性的方式提高了該化合物的效率。更令人驚奇的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些效果可以用于基于DNA和RNA寡核苷酸的化合物兩者并且可以用于傳統(tǒng)的反義以及RNAi技術(shù)。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102712926SQ201080048450
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2010年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月27日
發(fā)明者E.坎迪馬拉, L.巴加特, M.普塔, S.阿格拉瓦爾, 蘭濤, 王大慶, 郁東 申請(qǐng)人:艾德拉藥物股份有限公司