專利名稱：抑制pcsk9基因表達的組合物和方法
技術領域：
本發(fā)明涉及雙鏈核糖核酸(dsRNA)及其介導RNA干涉以抑制PCSK9基 因表達的用途，以及dsRNA在治療如高脂血癥等可由PCSK9下調(diào)介導的病 理過程的用途。
背景技》
枯草溶菌素前蛋白轉(zhuǎn)化酶9(Proprotein convertase subtilisin kexin 9, PCSK9)是枯草溶菌素絲氨酸蛋白酶家族的成員。其它8個哺乳動物枯草溶菌 素蛋白酶PCSK1-PCSK8(也被稱為PC1/3、 PC2、弗林蛋白酶、PC4、 PC5/6、 PACE4、 PC7和S1P/SKI-1)是加工多種分泌通路中蛋白質(zhì)并在多種生物進程 中發(fā)揮作用的前蛋白轉(zhuǎn)化酶(Bergeron， F. (2000) J Mo/. &^ocn'w /. 24, 1-22, Gensberg, K., (1998) Ce〃 Z)ev.歷o/. 9, 11-17， Seidah, N. G. (1999) 5ra/"
848， 45-62, Taylor, N. A.， (2003) E45SB J 17, 1215-1227，和Zhou, A.， (1999)乂 C/zem. 274, 20745-20748)?，F(xiàn)已提出PCSK9在膽固醇代謝中發(fā) 揮作用。PCSK9 mRNA的表達在膽固醇膳食飼養(yǎng)的小鼠中下調(diào)(Maxwell, K. N., (2003) /丄—細.44, 2109-2119)，在HepG2細胞系中上調(diào)(Dubuc, G., (2004)y^ten'asc/eK 77zramZ). Fosc.傷o/. 24, 1454-1459)，而在固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合 蛋白(SREBP)的轉(zhuǎn)基因小鼠中上調(diào)(Horton, J. D., (2003)戶rac. Ato/.爿cad SW. t/&4 100， 12027-12032)，這類似于膽固醇生物合成酶以及低密度脂蛋白受體
5(LDLR)。此外，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)PCSK9錯義突變與常染色體顯性高膽固醇血癥 (Hchola3)相關(Abifadel， M.， "a/. (2003) A^. 34， 154-156, Timms， K. M"
(2004) //m附.Gew". 114, 349-353， Leren, T. P. (2004) C7/w. 65, 419-422)。 因為現(xiàn)己在日本人中發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性(SNP)與膽固醇水平相關，因此 PCSK9可能還決定普通人群的LDL膽固醇水平(Shioji, K., (2004) / //wm.
49, 109-114)。
常染色體顯性高膽固醇血癥(ADH)是單基因疾病，其患者表現(xiàn)為升高的 總膽固醇水平和LDL膽固醇水平、肌腱黃色瘤和過早的動脈粥樣硬化(Rader, D. J.， (2003)C//". / vm/. Ill, 1795-1803)。 ADH及退行性疾病隱性遺傳性高 膽固醇血癥(ARH) (Cohen, J. C., (2003) Q#r hj^V/o/. 14, 121-127)的發(fā)
病機理是肝臟對LDL吸收的缺陷。阻礙LDL吸收的LDLR突變或LDL上與 LDLR結(jié)合的載脂蛋白B的突變均可導致ADH。 ARH是由ARH蛋白質(zhì)中的 突變造成的，其中ARH蛋白質(zhì)是通過與網(wǎng)格蛋白相互作用而內(nèi)吞LDLR-LDL 復合物所必需的。因此，如果PCSK9突變是Hchola3家族病的病因，那么 PCSK9很可能在受體介導的LDL吸收中起作用。
過表達研究指出PCSK9可以控制LDLR的水平，并以此控制肝臟對LDL 的吸收(Maxwell， K. N. (2004) /Voc. 7Va//. Jc^/. 5W. 101, 7100-7105，
Benjannet， S., d a/. (2004)Ao/. 279， 48865-48875, Park, S. W., (2004)
J. B/o/. CAem. 279, 50630-50638)。小鼠中由腺病毒介導的小鼠或人PCSK9過 表達3或4天可導致總膽固醇水平和LDL膽固醇水平的升高，而在LDLR 敲除動物中則未發(fā)現(xiàn)此作用(Maxwell， K. N. (2004) Prac. A^/. Jc^/. 5W. 101， 7100-7105， Benjannet, S., d a/. (2004) J 5/o/. Ozem. 279， 48865-48875, Park, S. W.， (2004) J 5/o/. 279, 50630-50638)。此外，PCSK9過表達造
成肝臟LDLR蛋白質(zhì)的大量減少，但不影響LDLR mRNA水平、SREBP蛋 白質(zhì)水平或SREBP蛋白的細胞核/細胞質(zhì)比例。這些結(jié)果說明PCSK9通過轉(zhuǎn) 錄后機制直接或間接地降低LDLR蛋白質(zhì)水平。
現(xiàn)已設計出PCSK9功能缺失突變的小鼠模型(Rashid et.al., (2005) /WAS, 102， 5374-5379)，并在人類個體中鑒定出PCSK9功能缺失突變(Cohen et al.,
(2005) , Nature Genetics., 37， 161-165)。在這兩種情況下，PCSK9功能缺失均 導致總膽固醇水平和LDLc膽固醇水平的降低?；仡欉^去15年的研究成果發(fā)現(xiàn)，缺失一個拷貝PCSK9可降低LDLc，并有助于提高對抗心血管疾病風險 的能力(Cohen et.al., 2006 N. Engl. J. Med., 354., 1264-1272.)。迄今為止的證據(jù) 清楚地說明降低PCSK9水平可降低LDLc。
目前已發(fā)現(xiàn)雙鏈RNA分子(dsRNA)通過被稱為RNA干擾(RNAi)的高度 保守的調(diào)控機制來阻斷基因表達。WO 99/32619 (Fire et al.)公開了長度為至少 25個核苷酸的dsRNA在抑制線蟲(C. e/egflra)基因表達中的用途。現(xiàn)還發(fā)現(xiàn) dsRNA在其它生物體中降解耙RNA，其中所述生物體包括植物(參見，例如 WO 99/53050, Waterhouse et al.和WO 99/61631, Heifetz et al.)、果蠅(參見，例 如Yang, D., et al" Cww說o/. (2000) 10:1191-1200)和哺乳動物(參見WO 00/44895, Limmer和DE 101 00 586.5, Kreutzer et al.)。這種天然機制I見已成為 治療因基因異?；蛴泻φ{(diào)控而引發(fā)的疾病的新型藥物的研發(fā)熱點。
除了在RNAi領域的顯著進展以及由下調(diào)PCSK9基因表達介導的病理過 程治療的進展之外，人們還需要能夠抑制PCSK9基因表達并能夠治療如高脂 血癥等與PCSK9基因表達相關疾病的藥劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過使用雙鏈核糖核酸(dsRNA)沉默枯草溶菌素前蛋白轉(zhuǎn)化酶9 (PCSK9)表達，從而提供了關于可受PCSK9基因下調(diào)調(diào)節(jié)的疾病治療的問題
解決方案。
本發(fā)明提供了雙鏈核糖核酸(dsRNA)以及使用此類dsRNA抑制細胞或哺 乳動物中PCSK9基因表達的組合物和方法。本發(fā)明還提供了用于治療如高脂 血癥等可受PCSK9基因表達下調(diào)調(diào)節(jié)的病癥的組合物和方法。本發(fā)明的 dsRNA包含具有長度小于30個核苷酸且通常長度為19-24個核苷酸區(qū)域的 RNA鏈(反義鏈)，并且其中所述區(qū)域基本與PCSK9基因mRNA轉(zhuǎn)錄本的至 少一部分互補。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于抑制PCSK9基因表達的雙鏈核糖 核酸(dsRNA)分子。所述dsRNA包含至少兩條彼此互補的序列。所述dsRNA 包含具有第一序列的正義鏈和具有第二序列的反義鏈。所述反義鏈包含與
PCSK9編碼mRNA的至少一部分基本互補的核苷酸序列，并且互補區(qū)的長 度小于30個核苷酸，通常為19-24個核苷酸。所述dsRNA在與表達PCSK9的細胞接觸時可至少抑制40%的PCSK9基因表達。
例如，本發(fā)明的dsRNA分子可由dsRNA的第一序列和第二序列組成， 其中所述第一序列選自于由表1和表2中正義序列組成的組，所述第二序列 選自于由表1和表2中反義序列組成的組。本發(fā)明的dsRNA分子可包含天然 存在的核苷酸或包含至少一種修飾核苷酸，所述修飾核苷酸例如為2'-0-甲基 修飾的核苷酸、包含5'-硫代磷酸酯基團的核苷酸以及與膽甾醇基衍生物相連 接的末端核苷酸。或者，所述修飾核苷酸可選自以下組2'-脫氧-2'-氟代修飾 核苷酸、2'-脫氧-修飾核苷酸、鎖核苷酸(lockednucleotide)、無堿基核苷酸、 2'-氨基-修飾核苷酸、2'-烷基-修飾核苷酸、嗎啉代核苷酸、氨基磷酸酯和含 有非天然堿基的核苷酸。通常，此類修飾序列可基于所述dsRNA的第一序列 和第二序列，其中所述第一序列選自于由表1和表2中正義序列組成的組， 所述第二序列選自于由表1和表2中反義序列組成的組。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含一種本發(fā)明dsRNA的細胞。所 述細胞通常為哺乳動物細胞，例如人類細胞。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了抑制生物體(通常為人類受試者)體 內(nèi)PCSK9基因表達的藥物組合物，所述藥物組合物包含一種或多種本發(fā)明的 dsRNA以及藥學上可接受的載體或遞送載體。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了抑制細胞內(nèi)PCSK9基因表達的方 法，所述方法包含以下歩驟
(a) 將雙鏈核糖核酸(dsRNA)引入細胞中，其中所述dsRNA包含至少 兩條彼此互補的序列。所述dsRNA包含正義鏈和反義鏈，其中所述正義 鏈包含第一序列，所述反義鏈包含第二序列。所述反義鏈包含與PCSK9 編碼mRNA的至少一部分基本互補的互補區(qū)，并且所述互補區(qū)域的長度 小于30個核苷酸，通常為19-24個核苷酸，并且所述dsRNA在與表達 PCSK9接觸時可至少抑制40%的PCSK9基因表達；和
(b) 將步驟(a)中得到的細胞維持足夠長的時間以降解PCSK9基因的 mRNA轉(zhuǎn)錄本，從而抑制細胞內(nèi)PCSK9基因的表達。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療、預防或控制如高脂血癥等可 由PCSK9基因表達下調(diào)介導的病理過程的方法，所述方法包含向需要此類治 療、預防或控制的患者施用治療有效量或預防有效量的一種或多種本發(fā)明的ds脂A。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了抑制細胞內(nèi)PCSK9基因表達的載 體，所述載體包含可操作地與編碼本發(fā)明dsRNA的至少一條鏈的核苷酸序列 連接的調(diào)控序列。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種細胞，其包含抑制細胞內(nèi) PCSK9基因表達的載體。所述載體包含可操作地與編碼本發(fā)明dsRNA的至 少 -條鏈的核苷酸序列連接的調(diào)控序列。


圖1:顯示ND-98脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)。
圖2:顯示耙向PCSK9 mRNA的不同ORF區(qū)域(具有圖中所指出的ORF 位點的第一個核苷酸)的16種小鼠特異性PCSK9 siRNA (AL-DP-9327至 AL-DP-9342)在C57/BL6小鼠(每組5只)體內(nèi)的篩選結(jié)果。計算各處理組肝臟 裂解物中PCSK9 mRNA與GAPDH mRNA比例的平均值，并與使用PBS處 理的對照組或使用不相關siRNA(凝血因子VII)的對照組進行比較。
圖3:顯示耙向PCSK9mRNA的不同ORF區(qū)域(具有圖中所指出的ORF 位點的第一個核苷酸)的16種人/小鼠/大鼠交叉反應性PCSK9 siRNA (AL-DP-9311至AL-DP-9326)在C57/BL6小鼠(每組5只)體內(nèi)的篩選結(jié)果。 計算各處理組肝臟裂解物中PCSK9 mRNA與GAPDH mRNA比例的平均值， 并與使用PBS處理的對照組或使用不相關siRNA(凝血因子VII)的對照組進 行比較。
PCSK9 mRNA的沉默造成血清總膽固醇水平的下降。 能最有效地敲除PSCK9信使的siRNA顯示最顯著的膽固醇降低效果(約 20-30%)。
圖4:顯示16種小鼠特異性PCSK9 siRNA(AL-DP-9327至AL-DP-9342) 在C57/BL6小鼠(每組5只)體內(nèi)的篩選結(jié)果。計算各處理組血清總膽固醇水 平的平均值，并與使用PBS處理的對照組或使用不相關siRNA(凝血因子VII) 的對照組進行比較。
圖5:顯示在16種人/小鼠/大鼠交叉反應性PCSK9siRNA(AL-DP-9327 至AL-DP-9342)在C57/BL6小鼠(每組5只)體內(nèi)的篩選結(jié)果。計算各處理組 血清總膽固醇水平的平均值，并與使用PBS處理的對照組或使用不相關siRNA(凝血因子VII)的對照組進行比較。
圖6:顯示體外和體內(nèi)PCSK9沉默結(jié)果的比較。
圖7A和圖7B:顯示使用猴原代肝細胞在體外沉默PCSK9的結(jié)果。
圖8:顯示由LNP-01配制的耙向pcsk-9的siRNA的體內(nèi)活性。
圖9:顯示由LNP-01配制的修飾親本分子9314和10792在不同時期的
體內(nèi)活性。修飾型10792清楚地顯示出體內(nèi)沉默活性。
具體實施例方式
本發(fā)明提供了關于可受PCSK9基因下調(diào)調(diào)節(jié)的治療疾病的問題解決方 案，通過使用雙鏈核糖核酸(dsRNA)沉默PCSK9基因從而提供如高脂血癥等 疾病的治療方法。
本發(fā)明提供了雙鏈核糖核酸(dsRNA)以及以及使用所述dsRNA抑制細胞 或哺乳動物中PCSK9基因表達的組合物和方法。本發(fā)明還提供了用于治療由 PCSK9基因表達下調(diào)調(diào)節(jié)的病理過程和疾病的組合物和方法。dsRNA通過被 稱為RNA干擾(RNAi)的過程指導序列特異性mRNA降解。本發(fā)明的dsRNA 包含具有長度小于30個核苷酸，通常長度為19-24個核苷酸區(qū)域的RNA鏈 (反義鏈)，其中所述區(qū)域與PCSK9基因mRNA轉(zhuǎn)錄本的至少一部分互補。 使用這些dsRNA能夠耙向降解參與鈉運輸?shù)膍RNA。使用基于細胞的試驗 以及動物試驗，本發(fā)明人已證明極低劑量的這些dsRNA可特異且高效介導 RNAi，造成PCSK9基因表達的顯著抑制。因此，本發(fā)明中包含這些dsRNA 的方法和組合物可用于可受PCSK9下調(diào)介導的病理過程治療，例如高脂血癥 的治療。
下文的詳細說明公開了制備和使用dsRNA和包含dsRNA的組合物以抑 制耙基因PCSK9表達，以及治療如高脂血癥等可受PCSK9表達下調(diào)調(diào)節(jié)的 疾病的組合物和方法。本發(fā)明的藥物組合物包含dsRNA和藥學上可接受的載 體，其中所述dsRNA具有長度小于30個核苷酸，通常長度為19-24個核苷 酸互補區(qū)域的反義鏈，其中所述互補區(qū)域與PCSK9基因mRNA轉(zhuǎn)錄本的至 少-部分互補。
因此，本發(fā)明的某些方面提供了包含本發(fā)明的dsRNA和藥學上可接受的 載體的藥物組合物，使用所述組合物抑制PCSK9基因表達的方法和使用所述
10藥物組合物治療可受PCSK9表達下調(diào)調(diào)節(jié)的疾病的方法。 I.定義
為了方便起見，下文提供了本說明書、實施例和權(quán)利要求書中使用的特 定術語和短語的含義。如果某術語在本說明書其它部分中的用法與本節(jié)中提 供的其定義之間有明顯差異，應以本節(jié)中的定義為準。
"G"、 "C"、 "A"和"U"通常分別代表包含鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤
和尿嘧啶作為堿基的核苷酸。然而，應理解的是術語"核糖核苷酸"或"核
苷酸"也可指如下文詳述的修飾核苷酸，或具替換部分的替代物(surrogate replacement moiety )。技術人員熟知可將鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶替 換成其它部分而基本不改變包含帶有此類替換部分的核苷酸的寡核苷酸堿基 配對性質(zhì)。例如但不限于包含次黃嘌呤作為其堿基的核苷酸可與包含腺嘌 呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸進行堿基配對。因此，本發(fā)明的核苷酸序列中 包含尿嘧啶、鳥嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可被替換成包含如次黃嘌呤等的核苷 酸。包含此類替換部分的序列是本發(fā)明的實施方案。
本文所使用的"PCSK9"是指枯草溶菌素前蛋白轉(zhuǎn)化酶9基因或蛋白(也 被稱為FH3、 HCHOLA3、 NARC-1、 NARC1)。所提供的PCSK9的mRNA 序列有人類NM—174936;小鼠NM—153565;和大鼠NM—199253。
本文所使用的"靶序列"是指PCSK9基因轉(zhuǎn)錄過程中形成的mRNA分 子核苷酸序列中的連續(xù)部分，包括作為初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的RNA加工產(chǎn)物的 mRNA。
本文所用術語"包含序列的鏈"是指包含核苷酸鏈的寡核苷酸，該寡核 苷酸鏈通過利用標準核苷酸命名法表示的序列進行闡述。
除非另有說明，否則在用于描述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的關 系時，本文所用術語"互補"是指包含所述第一核苷酸序列的寡核苷酸或多 核苷酸在某些條件下與包含所述第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸雜交 并形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的能力，本領域技術人員可理解這一點。例如，此類條件 可以是嚴格條件，其中所述嚴格條件可包括400mMNaCl、 40mMPIPESpH 6.4、 lmMEDTA，在50。C或70。C下持續(xù)12-16小時，隨后進行清洗。也可 應用其它條件，例如可能在生物體內(nèi)遇到的生理相關條件。本領域技術人員 能夠根據(jù)雜交核苷酸的最終應用決定最適合于兩序列互補試驗的系列條件。
ii這包括包含所述第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸與包含所述第二 核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在第一和第二核苷酸序列的全長范圍內(nèi)的 堿基配對。本文中這些序列被稱為彼此"完全互補"。然而，在本文中當提到 所述第一序列與所述第二序列"基本互補"時，所述兩個序列可完全互補或 在雜交時形成一個或多個，但通常不超過4個、3個或2個錯配堿基對，同 時保留與其最終應用最相關的條件下的雜交能力。但是，當兩個寡核苷酸經(jīng) 設計以雜交形成一個或多個單鏈懸端時，考慮到互補的定義這種懸端不應該
被認做是錯配。例如，在包含一條長度為21個核苷酸的寡核苷酸和另一條長 度為23個核苷酸的寡核苷酸的dsRNA中，較長寡核苷酸包含與較短寡核苷 酸完全互補的21個核苷酸的序列，在本發(fā)明的目的下，這種情況也屬于"完 全互補"。
只要其雜交能力能夠滿足上述需求，本文所用"互補"序列也可以包含 或完全由非Watson-Crick堿基對形成和/或由非天然和修飾核苷酸形成的堿
基對形成。
本文中對于dsRNA的正義鏈與反義鏈間堿基配對，或dsRNA的反義鏈 與靶序列間堿基配對可使用術語"互補"、"完全互補"和"基本互補"，所述 術語可根據(jù)其所處上下文進行理解。
本文所用的與信使RNA (mRNA)的"至少一部分基本互補"的多核苷 酸是指與目標mRNA(例如，編碼PCSK9的mRNA)的連續(xù)片段基本互補的多 核苷酸。例如，如果多核苷酸的序列與編碼PCSK9的mRNA中的非中斷片 段基本互補，那么所述多核苷酸與PCSK9 mRNA的至少一部分互補。
本文所用術語"雙鏈RNA"或"dsRNA"是指核糖核酸分子的復合物， 所述復合物具有雙鏈結(jié)構(gòu)并包含兩條反平行且如上所述的基本互補的核酸 鏈。形成所述雙鏈結(jié)構(gòu)的兩條鏈可以是同一條較大RNA分子的不同部分， 或者是單獨的RNA分子。如果所述兩條鏈為單獨的RNA分子，此類dsRNA 在文獻中常被稱為siRNA("小干擾RNA")。如果所述兩條鏈為一個較大分 子的部分并且通過形成雙鏈結(jié)構(gòu)的一條鏈3'-末端及另一條鏈5'-末端之間的 非中斷核苷酸鏈相連接，那么所述相連的RNA鏈被稱為"發(fā)夾環(huán)"、"短發(fā) 夾RNA"或"shRNA"。如果所述兩條鏈通過形成雙鏈結(jié)構(gòu)的一條鏈3'-末端 及另-條鏈5'-末端之間的非中斷鏈之外的方式共價連接，那么所述連接結(jié)構(gòu)被稱為"接頭(linker)"。所述RNA鏈可具有相同或不同數(shù)量的核苷酸。堿 基對的最大值是dsRNA中的最短鏈減去雙鏈中存在的任何懸端后的核苷酸 數(shù)冃。除雙鏈結(jié)構(gòu)之外，dsRNA可包含一個或多個核苷酸懸端。此外，在本 說明書中使用的"dsRNA"可包括對核糖核苷酸的化學修飾，包括對多個核 苷酸的修飾，并包括本文公開或本領域己知的所有修飾類型?；诒菊f明書 和權(quán)利要求書的目的，"dsRNA"涵蓋用于siRNA類型分子的所有此類修飾。 本文所用"核苷酸懸端"是指當dsRNA的一條鏈的3'末端超過另一條 鏈的5'末端或反之時從dsRNA的雙鏈結(jié)構(gòu)突出的一個或多個未配對核苷酸。 "平端"或"平末端"是指在dsRNA的末端沒有未配對的核苷酸，即沒有核 苷酸懸端。"平末端化的"dsRNA是指在其全長范圍均為雙鏈的dsRNA，即 在此分子任一個末端均沒有核苷酸懸端。為清楚起見，在確定siRNA是否具 有懸端或平端時，不考慮結(jié)合到siRNA的3'-末端或5'-末端的化學帽或非核 苷酸的化學部分。
術語"反義鏈"是指dsRNA中的一條鏈，其包含與靶序列基本互補的區(qū) 域。本文所用術語"互補區(qū)"是指反義鏈上與本文所定義的序列(例如靶序列) 基本互補的區(qū)域。如果互補區(qū)與靶序列不完全互補，則最能容許的錯配發(fā)生 在末端區(qū)域，并且如果存在錯配，則通常位于末端區(qū)域，或者例如5'和/或3' 末端的6、 5、 4、 3或2個核苷酸之內(nèi)。
本文所用術語"正義鏈"是指dsRNA中的一條鏈，其包含與所述反義鏈 區(qū)域基本互補的區(qū)域。
如本領域技術人員的理解，所述"引入到細胞中(或向細胞引入)"在用 于dsRNA時，是指便于攝取或吸收進入細胞。dsRNA的吸收或攝取可通過 非輔助性擴散或主動的細胞過程發(fā)生，或者通過輔助試劑或設備發(fā)生。此術 語的內(nèi)涵不限定于體外細胞；也可以將dsRNA"引入到細胞中(或向細胞引 入dsRNA)"，其中所述細胞是活生物體一部分。在此情況下，引入到細胞中 將包括向生物體的遞送。例如，在體內(nèi)遞送中，可將dsRNA注射到組織位點 或進行全身施用。向體外細胞的引入包括本領域已知的方法，例如電穿孔法 和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法(lipofection)。
當術語"沉默"和"抑制表達"是針對PCSK9基因的表達時，它們在本文指至少部分抑制PCSK9基因的表達，通過與第二細胞或細胞群相比可以從第一
細胞或細胞群中分離的轉(zhuǎn)錄自PCSK9基因的mRNA數(shù)量的減少來表示，其 屮所述第一細胞或細胞群中PCSK9基因被轉(zhuǎn)錄且其已經(jīng)被處理以至PCSK9 基因的表達被抑制，所述第二細胞或細胞群與所述第一細胞或細胞群基本相 巧但其沒有作此處理(對照細胞)。抑制度通常用以下方式表示
對照細胞的mRNA-處理細胞的mRNA
對照細胞的mRNA X 1Q(>%
或者，將抑制度表示為與PCSK9基因轉(zhuǎn)錄在功能上相關的參數(shù)的減小， 例如由細胞分泌的PCSK9基因編碼蛋白質(zhì)的量，或顯示特定表型的細胞數(shù) 量，例如凋亡細胞的數(shù)量。理論上講，可以組成型地或通過基因工程方法或 任意合適的試驗在任意表達所述靶標的細胞中測定PCSK9基因沉默。然而， 當需要參考以測定給定dsRNA是否在特定程度上抑制PCSK9基因的表達并 因此屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)時，以下實施例中提供的試驗可作為此類參考。
例如，在某些情況下，通過施用本發(fā)明的雙鏈寡核苷酸將PCSK9基因的 表達抑制至少約20%、 25%、 35%或50%。在一些實施方案中，通過施用本 發(fā)明的雙鏈寡核苷酸將PCSK9基因抑制至少約60%、 70%或80%。在一些實 施方案中，通過施用本發(fā)明的雙鏈寡核苷酸將PCSK9基因抑制至少約85%、 90%或95%。表1和表2提供了在體外試驗中使用不同濃度的不同PCSK9 dsRNA分子所獲得的寬范圍的表達抑制值。
如本文在PCSK9表達的上下文中所使用的，術語"治療"("treat", "treatment")等是指由下調(diào)PCSK9基因介導的病理過程的緩解或減輕。在 本發(fā)明的上下文中只要它涉及下文陳述的其它任意病癥(除可通過下調(diào) PCSK9基因介導的病理過程之外)，術語"治療"等表示緩解或減輕至少一 種與所述病癥相關的癥狀，或者減緩或逆轉(zhuǎn)所述病癥的進程。例如，對于高 脂血癥，所述治療可包括降低血脂水平。本文所用短語"治療有效量"和"預 防有效量"是指在可通過PCSK9基因下調(diào)介導的病理過程或在可通過PCSK9
基因下調(diào)介導的病理過程的一個明顯癥狀的治療、預防或控制中產(chǎn)生治療效 果的量。治療有效的特定量可簡單地由普通醫(yī)務工作者來確定，并可根據(jù)本 領域已知的因素進行改變，例如可通過下調(diào)PCSK9基因介導的病理過程的類型，患者的病史和年齡，可通過下調(diào)PCSK9基因表達介導的病理過程的階段，
以及對可通過下調(diào)PCSK9基因表達介導的病理過程的抗性藥物的施用。
本文所用"藥物組合物"包含藥理學有效量的dsRNA和藥學上可接受的 載體。本文所用"藥理學有效量"、"治療有效量"或"有效量"是指有效產(chǎn) 生所需藥理學、治療性或預防性結(jié)果的RNA量。例如，如果認為使疾病或 病變相關的可測量參數(shù)下降至少25%的給定臨床治療為有效治療，那么用于 治療所述疾病或病變的藥物的治療有效量是將所述參數(shù)減少至少25%時所必 需的量。術語"藥學上可接受的載體"是指施用治療劑所用的載體。此類載 體包括但不限于鹽溶液、緩沖鹽溶液、葡萄糖、水、甘油、乙醇和其組合物， 并在下文中有詳細描述。所述術語明確地排除了細胞培養(yǎng)基。
本文所用"轉(zhuǎn)化細胞"是指向其引入載體的細胞，其中所述載體可表達 dsRNA分子。
II.雙鏈核糖核酸(dsRNA)
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于抑制細胞或哺乳動物中PCSK9 基因表達的雙鏈核糖核酸(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含具有互補區(qū)的 反義鏈，所述互補區(qū)與PCSK9基因表達過程中形成的mRNA至少一部分互 補，并且所述互補區(qū)的長度小于30個核苷酸，通常為19-24個核苷酸，并且 所述dsRNA在與表達所述PCSK9基因的細胞接觸時，可將所述PCSK9基因 的表達抑制至少40%。所述dsRNA包含兩條充分互補以雜交從而形成雙鏈 結(jié)構(gòu)的RNA鏈。所述dsRNA中的一條鏈(反義鏈)包含與靶基因基本互補， 或通常為完全互補的互補區(qū)，而另一條鏈(正義鏈)包含與所述反義鏈互補的 區(qū)域，這樣當在適當?shù)臈l件下混合時所述兩條鏈就會雜交并形成雙鏈結(jié)構(gòu)， 其中所述靶基因衍生自PCSK9基因表達期間形成的mRNA序列。通常，所 述雙鏈結(jié)構(gòu)的長度為15-30個堿基對，更常見18-25個，還更常見19-24個， 最常見為19-21個堿基對。類似地，與靶序列互補的區(qū)域的長度為15-30個 堿基對，更常見18-25個，還更常見19-24個，最常見為19-21個堿基對。本 發(fā)明的dsRNA還可以包含一個或多個單鏈核苷酸懸端?？赏ㄟ^下文進一步討 論的本領域已知的標準方法合成所述dsRNA，例如使用自動DNA合成儀(例 如，可商購自Biosearch， Applied Biosystems， Inc.)。在優(yōu)選的實施方案中，所
15述PCSK9基因是人類PCSK9基因。在特定的實施方案中，所述dsRNA的反 義鏈包含選自于表1和表2中正義序列鏈和選自于表1和表2中反義鏈的第 二鏈。可簡單地使用靶序列和PCSK9側(cè)翼序列容易地確定靶向表1和表2 提供的靶序列中其它靶向部位的其它反義試劑。在另一個實施方案中，所述 dsRNA包含至少一條選自于由表1和表2所示序列組成的組的核苷酸序列。 在其它實施方案中，所述dsRNA包含至少兩條選自所述組的序列，其中所述 至少兩條序列中的一條與所述至少兩條序列中的另一條互補，并且所述至少 兩條序列中的一條與在PCSK9基因表達過程中產(chǎn)生的mRNA序列基本互補。 通常，所述dsRNA包含兩條寡核苷酸，其中將一條寡核苷酸描述為如表1 和表2中的正義鏈，而將第二寡核苷酸描述為如表1和表2中的反義鏈。
本領域技術人員清楚地知道，目前廣泛認為包含20-23個，特別是21個 堿基對的雙鏈結(jié)構(gòu)的dsRNA可特別有效地誘導RNA干擾(Elbashir et al.， EMBO 2001, 20:6877-6888)。然而，也發(fā)現(xiàn)較短或較長的dsRNAs也可同樣有 效。在一個上述實施方案中，借助于表1和表2提供的寡核苷酸的特質(zhì)，本 發(fā)明的dsRNA可包含至少一條最短長度為21nt的鏈?？梢院侠淼仄谕?，包 含一條僅在一端或兩端缺失若干個核苷酸的表1和表2的序列的較短dsRNA 可具有與上述dsRNA相類似的功效。因此，本發(fā)明關注以下所描述的dsRNA: 其包含來自表1和表2的一條序列的部分序列(至少15、 16、 17、 18、 19、 20或更多個連續(xù)的核苷酸)，且在下文中所述的FACS試驗中其抑制PCSK9 基因表達能力的區(qū)別在于抑制能力不超過包含全長序列dsRNA的抑制能力 的5、 10、 15、 20、 25或30%。可使用所提供的PCSK9序列和靶序列簡單 地制備在表1和表2提供的耙序列內(nèi)部進行切割的其它dsRNA。此外，表1 和表2提供的RNAi試劑可識別PCSK9 mRNA內(nèi)對基于RNAi的切割敏感的 位點。因此，本發(fā)明還包括靶向被本發(fā)明一種試劑靶向的序列之內(nèi)的RNAi 試劑。如本文所使用的，如果第二 RNAi試劑在與第一 RNAi試劑反義鏈互 補的mRNA中任意位點進行切割，則第二 RNAi試劑可被稱為靶向所述第一 RNAi試劑的序列之內(nèi)的RNAi試齊IJ。此類第二試劑可通常由來自表1和表2 提供的一條序列的至少15個連續(xù)核苷酸組成，并連接有來自PCSK9基因中 選定序列的相鄰區(qū)域的其它核苷酸序列。例如，將SEQIDNO:l (減去添加的 AA序列)的最后15個核苷酸和靶基因PCSK9的隨后6個核苷酸結(jié)合可產(chǎn)生基于表1和表2提供的一條序列且長度為21個核苷酸的單鏈試劑。
本發(fā)明的dsRNA可以包含與耙序列的一個或多個錯配。在一個優(yōu)選實施 方案中，本發(fā)明的dsRNA包含不超過3個錯配。如果所述dsRNA的反義鏈 包含與耙序列的錯配，則優(yōu)選所述錯配區(qū)域不位于互補區(qū)的中心。如果所述 dsRNA的反義鏈包含與靶序列的錯配，則優(yōu)選所述錯配區(qū)域被限制為任一末 端的5個核苷酸，例如互補區(qū)5'-或3'-末端的5、 4、 3、 2或1個核苷酸。例 如，對于與PCSK9基因中一個區(qū)域互補的23個核苷酸dsRNA鏈而言，所述 dsRNA通常在其中心的13個核苷酸內(nèi)不包含任何錯配。本文所述的方法可 用于檢測包含與靶序列錯配的dsRNA是否能有效抑制PCSK9基因的表達。 對帶有錯配的dsRNA在抑制PCSK9基因表達中的效力的考慮非常重要，特 別是在已知PCSK9基因中的特定互補區(qū)在群體中具有多態(tài)性序列變異的情 況下。在一個實施方案中，dsRNA的至少一個末端具有1-4個，通常1或2 個核苷酸的單鏈核苷酸懸端。與其平端對應物相比，具有至少一個核苷酸懸 端的dsRNA具有意想不到的較高的抑制特性。此外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)僅一個 核苷酸懸端的存在可增強dsRNA的干擾活性，而不影響其整體穩(wěn)定性。已證 明僅具有一個懸端的dsRNA在體內(nèi)以及多種細胞、細胞培養(yǎng)基、血液和血清 中尤其穩(wěn)定和有效。通常，單鏈懸端位于反義鏈的3'-末端，或者正義鏈的 3'-末端。所述dsRNA也可以具有平端，通常位于反義鏈的5'-末端。此類 dsRNA具有改進的穩(wěn)定性和抑制活性，因此能夠以低劑量施用，即每天施用 小于5 mg/kg受試者體重。通常，所述dsRNA的反義鏈在3'-末端具有核苷 酸懸端，而5'-末端為平端。在另一個實施方案中，懸端中的一個或多個核苷 酸被替代為核苷硫代磷酸酯。
在另一個實施方案中，對所述dsRNA進行化學修飾以增強穩(wěn)定性。可通 過本領域的常規(guī)方法合成和/或修飾本發(fā)明的核酸，例如那些描述于"Current protocols in nucleic acid chemistry", Beaucage， S丄.et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA中的方法，以上文獻通過引用并入本文。所述 化學修飾可包括但不限于2'-修飾，對寡核苷酸中其它堿基或糖位點的修飾， 向寡核苷酸鏈中弓I入非天然堿基，與配體或化學部分的共價連接以及將核苷 酸間磷酸鍵替換成如硫代磷酸酯的其它連接鍵。可使用不只一種此類修飾。
可通過任意的多種熟知技術完成兩條單獨dsRNA鏈的化學連接，例如通過引入共價鍵、離子鍵或氫鍵、疏水相互作用、范德華或堆積相互作用；通 過金屬離子配位或通過使用嘌呤類似物完成所述化學連接。通常，可用來修
飾dsRNA的化學基團包括但不限于亞甲基藍；雙官能團，通常為雙-(2-氯乙
基)胺；N-乙酰-N'-(p-乙醛酰苯甲?；?半胱胺；4-硫尿嘧啶和補骨脂素。在一 個實施方案中，所述接頭是六乙二醇接頭。在這種情況下，可通過固相合成
制備所述dsRNA，并根據(jù)標準方法(例如，Williams, D丄，and K.B. Hall, 歷oc/ze肌(1996) 35:14665-14670)并入六乙二醇接頭。在特定的實施方案中， 通過六乙二醇接頭化學連接反義鏈的5'-末端和正義鏈的3'-末端。在另一個 實施方案中，所述dsRNA中的至少一個核苷酸包含硫代磷酸酯或二硫代磷酸 酯基團。所述dsRNA末端的化學鍵通常通過三螺旋鍵形成。表1和表2提供 了本發(fā)明的修飾RNAi試劑的實例。
在另一個實施方案中，可對兩條單鏈中一個或兩個末端的核苷酸進行修 飾以防止或抑制細胞酶(例如，但不限于某些核酸酶)的降解活性。本領域中 抑制細胞酶對核酸降解活性的已知技術包括但不限于2'-氨基修飾、2'-氨基糖 修飾、2'-F糖修飾、2'-F修飾、2'-烷基糖修飾、無電荷骨架修飾、嗎啉基修 飾、2'-0-甲基修飾和氨基磷酸酯(參見，例如Wagner， Ato. Md (1995) 1:1116-8)。因此，所述dsRNA中核苷酸的至少一個2'-羥基基團被化學基團 取代，通常被取代為2'-氨基或2'-甲基。同樣可對至少一個核苷酸進行修飾 以形成鎖核苷酸。此類鎖核苷酸包含連接核糖2'-氧和核糖4'-碳的亞甲基橋。 包含所述鎖核苷酸的寡核苷酸描述于Koshkin， A.A., et al., 7^ra/ze^w7 (1998), 54: 3607-3630)和Obika， S. et al.， r"ra/z^raw丄欲.(1998)， 39: 5401-5404)。向寡 核苷酸中引入鎖核苷酸可改進對互補序列的親和力，并將解鏈溫度提高若干 度(Braasch, D,A. andD.R. Corey, Oze肌5"/. (2001)， 8:1-7)。
將配體與dsRNA結(jié)合可增強其細胞吸收性以及對特定組織的靶向性或 被特定類型的細胞(例如，肝細胞)攝取。在某些情況下，使疏水性配體與 dsRNA相結(jié)合從而促進對細胞膜的直接穿透或經(jīng)肝細胞的吸收?；蛘?，與 dsRNA結(jié)合的配體是受體介導的內(nèi)吞作用的底物。現(xiàn)已將這些方法用于促進 反義寡核苷酸和dsRNA試劑的細胞穿透。例如，現(xiàn)己將膽固醇與多種反義寡 核苷酸結(jié)合，從而產(chǎn)生與其非結(jié)合類似物相比，更具活性的化合物。參見 M. Manoharan ^"他erae c& AWe/c j"'ci Z>t/g Deve/opwe"f 2002, ", 103 。與寡核苷酸結(jié)合的其它親脂性化合物包括l-芘丁酸、1,3-雙-0-(十六垸基)甘油和
甲醇。用于受體介導的內(nèi)吞作用的配體的一個實例是葉酸。葉酸通過葉酸受
體介導的內(nèi)吞作用進入細胞。帶有葉酸的dsRNA化合物可通過葉酸受體介導的內(nèi)吞作用有效地被運輸?shù)郊毎小i及其同事報道將葉酸結(jié)合到寡核苷酸的3'-末端導致所述寡核苷酸的細胞吸收增加8倍(Li, S.; Deshmukh, H. M.;Huang, L.戶/2am2. 7 饑1998, 75, 1540)。與寡核苷酸結(jié)合的其它配體包括聚乙二醇、糖簇(carbohydrate cluster)、交聯(lián)劑、卟啉偶聯(lián)物、運載肽和例如膽固醇的脂類。
在某些情況下，陽離子配體與寡核苷酸的結(jié)合導致對核酸酶的抗性提高。陽離子配體的代表性實例是丙基銨和二甲基丙基銨。令人感興趣的是，有報道稱當陽離子配體分散于整個反義寡核苷酸時，所述寡核苷酸保持了其對mRNA的高結(jié)合親禾卩力。參見M. Manoharan ^wfeerae jVi/c/e/c爿c/c/ Z)n/gDeve/o戸e" 2002, "， 103及其參考文獻。
可使用具有反應性官能團側(cè)鏈的dsRNA (例如，將連接分子連接到dsRNA而得到的dsRNA)來合成與配體結(jié)合的本發(fā)明dsRNA。這種反應性寡核苷酸可直接與商購的配體反應，其中所述配體經(jīng)合成而具有多種保護基團，或該配體具有與其結(jié)合的連接部分。在一些優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的方法通過使用已經(jīng)適當?shù)嘏c配體結(jié)合并且可進一步結(jié)合固體支持物的核苷單體來促進與配體結(jié)合的dsRNA的合成?？筛鶕?jù)本發(fā)明方法的一些優(yōu)選實施方案通過選定的血清結(jié)合配體與位于核苷或寡核苷酸的5'-位連接部分之間的反應來制備此類任意結(jié)合到固體支持物上的配體-核苷酸偶聯(lián)物。在某些情況下，首先通過長鏈氨烷基基團將單體構(gòu)件單元(monomer building block)共價結(jié)合到可控孔度玻璃支持物上，從而制備3'-末端結(jié)合有芳垸基配體的dsRNA。隨后，通過標準固相合成技術使單體構(gòu)件單元與結(jié)合在固體支持物上的核苷酸相結(jié)合。所述單體構(gòu)件單元可以是核苷酸或適合于固相合成的其它有機化合物。
可通過熟知的固相合成技術便捷且常規(guī)制備用于本發(fā)明偶聯(lián)物的dsRNA。有多個供貨商銷售用于此類合成的設備，包括例如AppliedBiosystems (Foster City, CA)?？深~外地或任選地采用其它本領域已知的合成技術。還已知使用類似技術制備其它寡核苷酸，例如硫代磷酸酯和垸基化衍
19生物。
可在以下美國專利中找到關于合成特定修飾寡核苷酸的教導美國專利
第5,138,045號和第5,218,105號，涉及結(jié)合多胺的寡核苷酸；美國專利第 5,212,295號，涉及用于制備具有手性磷連接的寡核苷酸的單體；美國專利第 5,378,825號和第5,541,307號，涉及具有修飾骨架的寡核苷酸；美國專利第 5,386,023號，涉及骨架經(jīng)修飾的寡核苷酸和其通過還原性偶聯(lián)的制備方法； 美國專利第5,457,191號，涉及基于3-氮雜嘌呤環(huán)系統(tǒng)的修飾核堿基及其合 成方法；美國專利第5,459,255號，涉及基于N-2取代嘌呤的修飾核堿基； 美國專利第5,521,302號，涉及具有手性磷連接的寡核苷酸的制備方法；美國 專利第5,539,082號，涉及肽核酸；美國專利第5,554,746號，涉及具有(3-內(nèi) 酰胺骨架的寡核苷酸；美國專利第5,571,902號，涉及合成寡核苷酸的方法和 材料；美國專利第5,578,718號，涉及具有垸硫基基團的核苷，其中所述基團 可用作接頭以與結(jié)合至所述核苷酸其它各位點的部分連接；美國專利第 5,587,361號和第5,599,797號，涉及具有高手性純度的硫代磷酸酯鍵的寡核 苷酸；美國專利第5,506,351號，涉及制備2'-0-烷基鳥嘌呤核苷和包括2,6-二氨基嘌呤化合物的相關化合物的方法；美國專利第5,587,469號，涉及具有 N-2取代嘌呤的寡核苷酸；美國專利第5,587,470號，涉及具有3-氮雜嘌呤的 寡核苷酸；美國專利第5,223,168號和美國專利第5,608,046號，均涉及結(jié)合 有4'-去甲基核苷的類似物；美國專利第5,602,240號和第5,610,289號，涉及 骨架經(jīng)修飾的寡核苷酸類似物；美國專利第6,262,241號和第5,459,255號， 特別涉及合成2'-氟-寡核苷酸的方法。
在本發(fā)明的與配體結(jié)合的dsRNA以及具有序列特異性連接核苷的配體 分子中，可使用標準核苷酸或核苷前體，或者已經(jīng)具有連接部分的核苷酸或 核苷偶聯(lián)物前體、已經(jīng)具有連接分子的配體-核苷酸或核苷-偶聯(lián)物前體，或 者具有配體的非核苷構(gòu)件單元在合適的DNA合成儀上組裝寡核苷酸和寡聚 核苷。
在使用已經(jīng)具有連接部分的核苷酸偶聯(lián)物前體時，通常要完成序列特異 性連接核苷的合成，隨后使配體分子與連接部分反應以形成結(jié)合有配體的寡 核苷酸。先前己描述過具有多種分子(例如，類固醇、維生素、脂質(zhì)和報告分 子)的寡核苷酸偶聯(lián)物(參見Manoharan et al.， PCT申請WO 93/07883)。在優(yōu)選的實施方案中，通過使用衍生自配體-核苷偶聯(lián)物的亞磷酰胺以及可商購并 常規(guī)用于寡核苷酸合成的標準亞磷酰胺和非標準亞磷酰胺在自動合成儀上合 成本發(fā)明的寡核苷酸或連接核苷。
向寡核苷酸中的核苷中引入2'-0-甲基、2'-0-乙基、2'-0-丙基、2'-0-烯 丙基、2'-0-氨烷基或2'-脫氧-2'-氟代基團可增強所述寡核苷酸的雜交性質(zhì)。 此外，包含硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸具有增強的核酸酶穩(wěn)定性。因此，本 發(fā)明的官能化的連接核苷(linked nucleotide)可進一步包括硫代磷酸酯骨架和 2'-O-甲基、2'-0-乙基、2'-O-丙基、2'-0-氨烷基、2'-0-烯丙基或2'-脫氧-2'-氟 代基團中的一種或兩種。例如，可在PCT公開WO 200370918中找到本領域 已知的一些寡核苷酸修飾的總結(jié)表。
在一些實施方案中，使用DNA合成儀制備在5'-末端具有氨基基團的本 發(fā)明的官能化核苷序列，并隨后與選定配體的活性酯衍生物反應。所述活性 酯衍生物為本領域技術人員所熟知。代表性的活性酯包括N-羥基琥珀酰亞胺 酯、四氟酚酯、五氟酚酯和五氯酚酯。所述氨基基團與所述活性酯發(fā)生反應 生成寡核苷酸，其中所述選定配體通過連接基團結(jié)合到5'-位點。5'-末端的氨 基基團可使用5'-氨基-修飾劑C6試劑制備。在一個實施方案中，可通過使用 配體-核苷亞磷酸酰胺將配體分子結(jié)合到寡核苷酸的5'-位點，其中所述配體 直接地或通過接頭間接地連接到5'-羥基基團。通常在自動合成程序結(jié)束時使 用此類配體-核苷亞磷酸酰胺以獲得在5'-末端具有配體的配體結(jié)合的寡核苷 酸。
修飾的核苷間連接鍵或骨架的實例包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代 磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它垸基膦 酸酯(包括3'-亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、亞膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基垸基氨基磷酸酯)、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基膦酸烷 基酯、硫羰基烷基磷酸三酯和具有正常3'-5'連接鍵的硼烷磷酸酯及其2'-5'連 接的類似物，以及具有反極性的那些類似物(其中相鄰核苷單位對的連接由 3'-5'變成5'-3'或由2'-5'變成5'-2')。還包括各種鹽、混合鹽和游離酸形式。
涉及制備上述含磷原子連接鍵的代表性美國專利包括但不限于美國專利 第3,687,808號、第4,469,863號、第4,476,301號、第5,023,243號、第5,177,196 號、第5,188,897號、第5,264,423號、第5,276,019號、第5,278,302號、第
215,286,717號、第5,321,131號、第5,399,676號、第5,405,939號、第5,453,496 號、第5,455,233號、第5,466,677號、第5,476,925號、第5,519,126號、第 5,536,821號、第5，541，306號、第5,550,111號、第5,563,253號、第5,571,799 號、第5,587,361號、第5,625,050號和第5,697,248號，所述各專利均通過引 用并入本文。
其中(即，寡聚核苷中)修飾核苷間連接鍵或骨架不包含磷原子的實例具 有通過短鏈烷基或環(huán)烷基糖間連接鍵、混合的雜原子和烷基或環(huán)烷基糖間連 接鍵，或者一個或多個短鏈雜原子或雜環(huán)糖間連接鍵形成的骨架。這些包括 具有嗎啉代連接鍵(部分由核苷的糖部分形成)的骨架；硅氧烷骨架；硫化物、 亞砜和砜骨架；formacetyl禾卩thioformacetyl骨架；methyleneformacetyl和 thioformacetyl骨架；含有烯烴的骨架；氨基磺酸酯骨架；亞甲基亞胺和亞甲 基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；和其它具有混合的N、 O、 S 和CH2組成部分的骨架。教導制備上述寡聚核苷的代表性美國專利包括但不 限于美國專利第5,034,506號、第5,166,315號、第5,185,444號、第5,214,134 號、第5,216,141號、第5,235,033號、第5,264,562號、第5,264,564號、第 5,405,938號、第5,434,257號、第5,466，677號、第5,470,967號、第5,489,677 號、第5,541,307號、第5,561,225號、第5,596,086號、第5,602,240號、第 5,610,289號、第5,602,240號、第5,608,046號、第5,610,289號、第5,618,704 號、第5,623,070號、第5,663,312號、第5,633,360號、第5,677,437號和第 5,677,439號，所述各專利均通過引用并入本文。
在某些情況下，可通過非配體基團修飾寡核苷酸?，F(xiàn)已將多種非配體分 子與寡核苷酸結(jié)合以改善所述寡核苷酸的活性、細胞分布或細胞攝取，而且 可從科技文獻中獲得進行此類結(jié)合的方法。這些非配體部分包括脂質(zhì)部分， 例如膽固醇(Letsinger et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553)，膽酸 (Manoharan et al.， Bioorg. Med. Chem. Lett.， 1994, 4:1053);硫醚，例如己基-S-
三苯甲基硫醇(Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992， 660:306; Manoharan et al,, Bioorg. Med. Chem. Let" 1993, 3:2765);硫代膽固醇 (Oberhauser etal.,Nucl. Acids Res.， 1992,20:533);脂肪族鏈，例如，十二烷基 二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kaba麗et al" FEBS Lett., 1990， 259:327; Svinarchuk et al" Biochimie， 1993,75:49);磷脂，例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基銨1,2-二-0沖六烷基-外消旋-甘油-3-H-磷酸酯(Manoharan et al., Tetrahedron Lett.， 1995, 36:3651; Shea et al.， Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777);多胺或聚乙二醇鏈(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969)或金剛烷乙酸(Manohar肌et al., Tetrahedron Lett., 1995， 36:3651);棕櫚基部分(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995， 1264:229)或十八胺或己胺-羰基氧基膽固醇部分(Crooke et al.， J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923)。上文已經(jīng)列出了教導此類寡核苷酸偶 聯(lián)物的制備方法的代表性美國專利。典型的結(jié)合方法包含合成在序列中一個 或多個位點具有氨基接頭的寡核苷酸。隨后，使用合適的偶聯(lián)或活化試劑使 氨基基團與將要被結(jié)合的分子反應。所述結(jié)合反應可在寡核苷酸仍結(jié)合在固 體支持物時進行，或者在寡核苷酸被切割至溶液相后進行。通常通過HPLC 純化寡聚核苷酸偶聯(lián)物以獲得純的偶聯(lián)物。特別優(yōu)選使用膽固醇偶聯(lián)物，因 為此部分(此基團)能夠增強對肝細胞的耙向性，而肝細胞是PCSK9的表達 位點。
編碼RNAi試劑的載體
本發(fā)明的dsRNA也可以由重組病毒載體在體內(nèi)細胞中表達。本發(fā)明的重 組病毒載體包含編碼本發(fā)明dsRNA的序列以及任意適合于表達所述dsRNA 序列的啟動子。合適的啟動子包括，例如，U6或HlRNApo1 III啟動子序列 和巨細胞病毒啟動子。對其它合適啟動子的選擇屬于本領域的技術范圍。本 發(fā)明的重組病毒載體也可包含可誘導的或可調(diào)控的啟動子，以在特定組織或 特定細胞內(nèi)環(huán)境中表達dsRNA。下文中更詳細地討論了重組病毒載體在將本 發(fā)明dsRNA遞送至體內(nèi)細胞中的用途。
本發(fā)明的dsRNA可以由重組病毒載體表達為兩個分離的互補RNA分子 或具有兩個互補區(qū)域的單個RNA分子。
可以使用能夠接受表達dsRNA分子的編碼序列的任何病毒載體，例如衍 生自腺病毒(AV)、腺相關病毒(AAV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(如慢病毒(LV)、棒狀病毒、 鼠白血病病毒)、皰疹病毒和類似病毒的載體?？蛇m當?shù)赝ㄟ^使用來自其它病 毒的包膜蛋白或其它表面抗原對病毒載體進行假型化或通過取代不同的病毒 衣殼蛋白，從而改變所述病毒載體的趨向性。
例如，可使用來自于皰疹性口腔炎病毒(VSV)、狂犬病毒、埃博拉病毒、
23Mokola病毒和類似病毒的表面蛋白對本發(fā)明的慢病毒載體進行假型化?？赏?br> 過對載體進行基因改造以表達不同的衣殼蛋白血清型而使本發(fā)明的AAV載 體耙向不同的細胞。例如，表達2型血清型基因組上的2型血清型衣殼蛋白 的AAV載體被稱為AAV 2/2?？梢杂?型血清型的衣殼蛋白基因取代AAV 2/2 載體中的此類2型血清型衣殼蛋白基因以產(chǎn)生AAV 2/5載體。構(gòu)建表達不同 衣殼蛋白血清型的技術屬于本領域的技術范圍；參見，例如RabinowitzJEet al. (2002), J Virol 76:791-801，其公開的全文通過引用并入本文。
適合本發(fā)明使用的重組病毒載體的選擇、將表達dsRNA的核酸序列插入 載體內(nèi)的方法和將病毒載體遞送至目標細胞的方法都屬于本領域的技術范 圍。參見，例如Dornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis M A (1988)， Biotechniques 6: 608-614; Miller A D (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14; Anderson W F (1998), Nature 392: 25-30;禾卩Rubinson D A et al., Nat. Genet. 33: 401-406，其公開的全文通過引用并入本文。
優(yōu)選的病毒載體是那些衍生自AV和AAV的載體。在尤其優(yōu)選的實施方 案屮，本發(fā)明的dsRNA可以由重組AAV載體表達為兩個單獨且互補的單鏈 RNA分子，其中所述重組AAV載體包含例如U6或H1 RNA啟動子，或巨 細胞病毒(CMV)啟動子。
適合于表達本發(fā)明dsRNA的AV載體、構(gòu)建重組AV載體的方法和將所 述載體遞送至靶標細胞的方法描述于Xia H et al. (2002)， Nat. Biotech. 20: 1006-1010。
適合于表達本發(fā)明dsRNA的AAV載體、構(gòu)建重組AV載體的方法和將 所述載體遞送至靶標細胞的方法描述于Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996)， J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826;美國專利第5,252,479號；美國專利第5,139,941 號；國際專利申請W094/13788和國際專利申請W093/24641中，其公開的 全文通過引用并入本文。
III.包含dsRNA的藥物組合物
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含如本文所述的dsRNA和藥學上可 接受載體的藥物組合物。所述包含dsRNA的藥物組合物可用于治療與PCSK9基因的表達或活性相關的疾病或病變，例如，由PCSK9基因表達下調(diào)介導的 病理過程的治療，例如高脂血癥。此類藥物組合物根據(jù)給藥方式進行配制。 一個實例是配制成經(jīng)非腸道給藥而遞送至肝臟的組合物。
以足夠抑制PCSK9基因表達的劑量施用本發(fā)明的藥物組合物。本發(fā)明人 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，因為其效力得到提高，包含本發(fā)明dsRNA的組合物能夠以意想不 到的低劑量施用。每天5 mg dsRNA/kg受試者體重的劑量足以抑制PCSK9 基因的表達，并且可向患者全身給藥(系統(tǒng)給藥)。
通常，dsRNA的合適劑量是每天0.01至5.0 mg/kg受試者體重，通常為 每天l昭至lmg/kg體重。藥物組合物可以每天施用一次，或者可以在一天 內(nèi)以適當?shù)拈g隔分兩個、三個或多個亞劑量施用dsRNA，或者甚至通過連續(xù) 輸注或通過控釋制劑遞送給藥。在這種情況下，每個亞劑量中所包含的 dsRNA必須相對較少以達到每天的總劑量。也可將劑量單位組合以用于數(shù)天 的給藥，例如使用常規(guī)持續(xù)釋放制劑以在數(shù)天內(nèi)提供持續(xù)釋放的dsRNA。持 續(xù)釋放制劑是本領域所熟知的技術。
熟練的技術人員可以理解某些因素可能影響有效治療受試者所需要的劑 量和時間，所述因素包括但不限于疾病或病變的嚴重程度、先期治療、受試 者的綜合健康度和/或年齡以及存在的其它疾病。此外，使用治療有效量的組 合物對受試者進行的治療可以包括單次治療或一系列治療。如本文其它部分 所述，可以使用常規(guī)方法學或者使用合適的動物模型在體內(nèi)檢測的基礎上評 估本發(fā)明所涵蓋的單個dsRNA的有效量和體內(nèi)半衰期。
隨著小 鼠遺傳學的進展，已經(jīng)產(chǎn)生了用于研究多種人類疾病(例如，可 由PCSK9基因表達下調(diào)介導的病理過程)的多種小鼠模型。此類模型可用于 dsRNA的體內(nèi)檢測以及確定治療有效劑量。
可使用任何方法向哺乳動物施用本發(fā)明的dsRNA。例如，可直接服用、 口服或經(jīng)胃腸外(例如，通過皮下、心室內(nèi)、肌肉或腹膜內(nèi)注射或通過靜脈點 滴)施用?？煽焖偈┯?例如，通過注射)或在一段時間內(nèi)進行施用(例如，通過 慢速輸注或施用緩釋制劑)。
通常，在治療患有高脂血癥的哺乳動物時通過胃腸外途徑全身施用 dsRNA分子。例如，可以經(jīng)靜脈向患者施用使用或不使用脂質(zhì)體制備的結(jié)合 或未結(jié)合的dsRNA。因此，可將dsRNA分子制備成組合物，例如滅菌和未滅菌的水溶液、非水溶液(如在常規(guī)溶劑(例如，醇類)中的非水溶液)、或者 其為在液態(tài)或固態(tài)油基質(zhì)中的溶液。此類溶液也可包含緩沖劑、稀釋劑和其 它適合的添加劑。在經(jīng)腸胃外、鞘內(nèi)或心室內(nèi)施用時，可將dsRNA分子制備 成組合物(例如滅菌水溶液)，所述組合物也可包含緩沖劑、稀釋劑和其它適 合的添加劑(例如，促透劑、載體化合物和其它藥學上可接受的載體)。
此外，可通過如美國專利第6,271,359號所述的生物或非生物方式向哺乳 動物施用dsRNA分子。非生物給藥可通過多種方法完成，包括但不限于(l) 將本發(fā)明提供的dsRNA酸分子負載到脂質(zhì)體，禾n(2)將dsRNA分子與脂質(zhì)或 脂質(zhì)體復合以形成核酸-脂質(zhì)或核酸-脂質(zhì)體復合物。所述脂質(zhì)體由常用于體 外細胞轉(zhuǎn)染的陽離子脂質(zhì)和中性脂質(zhì)組成。陽離子脂質(zhì)可復合(例如，電結(jié)合) 帶負電的核酸以形成脂質(zhì)體。陽離子脂質(zhì)體的實例包括但不限于lipofectin、 lipofectamine、 lipofectace和DOTAP。形成脂質(zhì)體的方法是本領域熟知的， 例如，可由卵磷脂、二肉豆蔻酰卵磷脂、二棕櫚酰卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂 酰甘油或二油酰磷脂酰乙醇胺形成所述脂質(zhì)體組合物?？缮藤彾喾N親脂性試 齊1」，包括Lipofectin.RTM. (Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad， Calif.)禾口 Effectene.TM. (Qiagen, Valencia, Calif.)。此外，可使用商購的陽離子脂質(zhì)(例 如，DDAB或DOTAP)優(yōu)化全身性給藥方法，其中分別將各陽離子脂質(zhì)與中 性脂質(zhì)(例如，DOPE或膽固醇)相混合。在一些情況下，可使用如Templeton et al. (Nature Biotechnology, 15: 647-652 (1997))中所述的那些脂質(zhì)體。在其它 實施方案中，可使用如聚乙烯亞胺的聚陽離子完成體內(nèi)和轉(zhuǎn)體Ox wVo)給藥 (Boletta et al., J. Am Soc. Nephrol. 7: 1728 (1996))。關于使用脂質(zhì)體遞送核酸 的其它信息可在美國專利第6,271,359號、PCT公開WO 96/40964和Morrissey, D. et al. 2005. Nat Biotechnol. 23(8): 1002-7中找到。
生物遞送可通過多種方法完成，包括但不限于使用病毒載體。例如，可 使用病毒載體(例如，腺病毒和皰疹病毒載體)向肝細胞遞送dsRNA分子。可 使用標準的分子生物學技術將一條或多條本文所提供dsRNA引入到早期開 發(fā)的用于向細胞遞送核酸的多種不同病毒載體之一中。例如，可使用所得的 這些病毒載體通過轉(zhuǎn)染將一條或多條dsRNA遞送到細胞中。
可在藥學上可接受的載體或稀釋劑中制備本發(fā)明的dsRNA。所述"藥學 上可接受的載體"(本文中也稱為"賦形劑")為藥學上可接受的溶劑、懸浮劑或任意其它藥學上惰性的載體。所述藥學上可接受的載體可以是液體或固 體，并可根據(jù)所計劃的施用方式進行選擇以提供所需的體積、稠度和其它相 關的輸送性質(zhì)和化學性質(zhì)。通常的藥學上可接受的載體包括但不限于例如水、 鹽溶液、粘合劑(例如，聚乙烯吡咯垸酮或羥丙基甲基纖維素)、填料(例如， 乳糖和其它糖、明膠或硫酸鈣)、潤滑劑(例如，淀粉、聚乙二醇或乙酸鈉)、 崩解劑(例如，淀粉或淀粉乙醇酸鈉)和濕潤劑(例如，十二烷基硫酸鈉)。
此外，可將耙向PCSK9基因的dsRNA制備成包含所述dsRNA的組合物， 其中所述dsRNA與其它分子、分子結(jié)構(gòu)或核酸混合物相混合、包封、結(jié)合或 聯(lián)合。例如，包含一種或多種靶向PCSK9基因的dsRNA的組合物可包含其 它治療劑，例如其它降脂劑(例如，他汀類)。
可受PCSK9表達下調(diào)調(diào)節(jié)的疾病的治療方法
本文所述的方法和組合物可用于治療可受PCSK9基因表達下調(diào)調(diào)節(jié)的 疾病和病癥。例如，本文所述的組合物可用于治療高血脂癥和其它形式的脂 質(zhì)失衡，例如高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥以及與這些病變相關的病理癥 狀，例如心臟和循環(huán)系統(tǒng)疾病。
抑制PCSK9基因表達的方法
另一方面，本發(fā)明提供了抑制哺乳動物中PCSK9基因表達的方法。所述 方法包含向哺乳動物施用本發(fā)明的組合物，從而沉默靶基因PCSK9的表達。 因為其高特異性，本發(fā)明的dsRNA特異性地靶向于靶基因PCSK9的RNA (初 級RNA或加工過的RNA)?？筛鶕?jù)本文其它部分的描述實施利用dsRNA抑 制這些PCSK9基因表達的組合物和方法。
在一個實施方案中，所述方法包括施用包含dsRNA的組合物，其中所述 dsRNA包含與待治療哺乳動物的PCSK9基因RNA轉(zhuǎn)錄物的至少一部分互補 的核苷酸序列。當待治療生物體為哺乳動物(例如，人類)時，可以通過本領 域已知的任意方式施用所述組合物，包括但不限于經(jīng)口或非腸道途徑，包括 經(jīng)靜脈、肌肉、皮下、透皮、氣管(氣溶膠)施用。在優(yōu)選的實施方案中，通 過靜脈輸注或注射施用所述組合物。
除非另有定義，否則本文所使用的所有科技術語與本發(fā)明所屬領域中普通技術人員通常所理解的意思相同。雖然在本發(fā)明的實施或檢驗中可以使用 與本文所述的類似或等價的方法和材料，但下文仍闡述了合適的方法和材料。 本文提及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻，包括定義均通過 參考方式將其全文并入本文。在有沖突的情況下，以包括定義的本說明書為 準。另外，所述材料、方法和實施例的目的僅在于進行說明而不具有限定性。
實施例
PCSK9基因的基因步移(genewalking)
進行siRNA設計以在兩個單獨的篩選組中進行鑒定
a) 靶向人和小鼠或大鼠PCSK9 mRNA的siRNA，禾口
b) 預測對靶基因PCSK9具有特異性的所有反應性人siRNA。 使用了人類、小鼠和大鼠PCSK9的mRNA序列。在全部siRNA選擇過
程中使用人類序列NM—174936.2作為參照序列。
19-mer延伸片段在人類和小鼠中是保守的，在第一步中鑒定出人和大鼠 的PCSK9 mRNA序列，產(chǎn)生人-小鼠交叉反應性siRNA以及人-大鼠靶標交 叉反應性siRNA的篩選組。
在第二個篩選中鑒定特異靶向人PCSK9的siRNA。摘錄所有可能的人 PCSK9的19-mer序列并將其定義為候選靶序列。表1和表2列出了所有與 人、猴有交叉反應的序列，以及對小鼠、大鼠、人和猴有交叉反應的序列。 表1和表2以及附圖2-8的實例中還列出了這些序列的化學修飾變體及其在 體外和體內(nèi)試驗中的活性。
為了對候選靶序列及其對應siRNA進行分級并選擇適合的候選序列，采 用經(jīng)預測的所述siRNA與無關靶標相互作用的潛力(脫靶潛力)作為分級參 數(shù)。將具有低脫靶潛力的siRNA定義為優(yōu)選并假定其具有較高的體內(nèi)特異 性。
為了預測siRNA特異性脫靶潛力，提出了一下假定
1) 鏈中第2至第9位(由5'向3'計數(shù))(種子區(qū))對脫靶潛力的貢獻可能大 于其余序列(非種子區(qū)和切割位點區(qū))
2) 鏈中第10和第11位(由5'向3'計數(shù))(切割位點區(qū))對脫靶潛力的貢獻
可能大于非種子區(qū)3) 每條鏈中的第1和第19位與脫靶相互作用無關
4) 可基于siRNA鏈序列與基因序列的互補性以及錯配位點計算各基因 和各鏈的脫靶分數(shù)
5) 對于脫耙潛力必須考慮預測脫耙數(shù)量以及最高脫靶分數(shù)
6) 認為脫耙分數(shù)與脫耙潛力的關聯(lián)性高于脫靶數(shù)量
7) 假設通過引入內(nèi)在修飾可能終止正義鏈活性，那么siRNA的脫靶分 數(shù)僅與反義鏈的脫靶潛力相關
19-mer候選序列與可公開獲取的人mRNA序列進行同源性檢索，從而 鑒定潛在的脫靶基因。
摘錄每條19-mer輸入序列，針對各脫耙基因的以下脫靶性質(zhì)以計算脫靶
分數(shù)
非種子區(qū)中的錯配數(shù)量
種子區(qū)中的錯配數(shù)量
切割位點區(qū)中的錯配數(shù)量
參考第1-3條假設按下式計算脫耙分數(shù)
脫靶分數(shù)=種子區(qū)錯配數(shù)XIO +切割位點區(qū)錯配數(shù)X1.2 +非種子區(qū) 錯配數(shù)X1
將每條對應于19-mer輸入序列的siRNA的最相關脫耙基因定義為具有 最低脫靶分數(shù)的基因。因此，將最低脫靶分數(shù)定義為各siRNA的相關脫靶分數(shù)。
dsRNA合成
試劑來源
在本文中未明確指出試劑來源時，可以從任意分子生物學試劑供貨商處 獲得符合分子生物學應用的質(zhì)量/純度標準的所述試劑。 siRNA合成
使用Expedite 8909合成儀(Applied Biosystems， Applera Deutschland GmbH, Darmstadt, Germany)并使用可控孔度玻璃(CPQ 500A, Proligo Biochemie GmbH, Hamburg, Germany)作為固相支持物，通過l p摩爾規(guī)模的固 相合成產(chǎn)生單鏈RNA。分別使用相應的亞磷酰胺和2'-0-甲基亞磷酰胺(ProligoBiochemie GmbH, Hamburg, Germany)通過固相合成產(chǎn)生RNA和含2'-0-甲基 核苷酸的RNA。利用標準的核苷亞磷酰胺化學法(例如，Current protocols in nucleic acid chemistry, Beaucage, S丄.et al. (Edrs.)， John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA所述)，將這些構(gòu)件單元引入寡核苷酸鏈序列中的選定位 點。將碘氧化劑溶液替換成Beaucage試劑(Chruachem Ltd, Glasgow, UK)的乙 腈溶液(1%)以引入硫代磷酸酯鍵。其它助劑可由Mallinckrodt Baker (Griesheim,Germany)獲得。
根據(jù)常規(guī)方法，通過陰離子交換HPLC進行寡核苷酸粗品的脫保護和純 化。利用分光光度計(DU 640B, Beckman Coulter GmbH, Unterschlei!3heim, Germany)通過在260nm波長下各RNA溶液的UV吸收測定收率和濃度。通 過在退火緩沖液(20mM磷酸鈉，pH6.8; 100 mM氯化鈉)中混合等摩爾互補 鏈，在85-90。C的水浴中加熱3分鐘并在3-4小時內(nèi)冷卻至室溫，生成雙鏈 RNA。退火的RNA溶液在-2(TC儲存直至使用。
為了合成3'偶聯(lián)膽固醇的siRNA(本文中稱為-Chol-3')，在RNA合成中 使用適當修飾的固體支持物。通過以下方法制備所述修飾的固體支持物
2-氮雜丁垸-l，4-二羧酸二乙酯AA
將4.7M的氫氧化鈉水溶液(50 mL)加入到經(jīng)攪拌、冰冷卻的甘氨酸乙酯 鹽酸鹽(32.19g,0.23摩爾)的水溶液(50mL)中。隨后，加入丙烯酸乙酯(23.1 g, 0.23摩爾)并在室溫下攪拌混合物直至通過TLC確認反應完成。19小時后， 使用二氯甲垸(3X100mL)使溶液分層。使用無水硫酸鈉干燥有機層、過濾并 蒸除溶劑。蒸餾殘留物以獲得AA(28.8 g, 61%)。
3-{乙氧基羰甲基-[6-(9H-芴-9-基-甲氧基羰基-氨基)-己?；鵠-氨基}-丙酸 乙酯M
30將Fmoc-6-氨基-己酸(9.12 g， 25.83 mmol)溶解于二氯甲烷(50 mL)中，并 用冰冷卻。在0。C下，向所得溶液中加入二異丙基碳二亞胺(3.25 g, 3.99 mL, 25.83 mmol)。隨后，加入氮雜丁烷-1,4-二羧酸乙酯(5 g, 24.6 mmol)和二甲基 氨基吡啶(0.305 g,2.5mmo1)。使所得溶液達到室溫，并進一步攪拌6小時。 通過TLC確定反應完成。真空濃縮反應混合物并加入乙酸乙酯以沉淀二異丙 基脲。過濾懸浮液。使用5%鹽酸水溶液、5%碳酸氫鈉和水清洗濾液。使用 硫酸鈉干燥合并的有機層并將其濃縮，得到粗產(chǎn)物，通過柱層析(50% EtOAC/ 己烷)純化粗產(chǎn)物獲得11.87gAB (88%)。
3-[(6-氨基-己?；?-乙氧基羰甲基-氨基]-丙酸乙酯AC
在(TC下，將3-{乙氧基羰甲基-[6-(姐-芴-9-基甲氧基羰基-氨基)-己?；鵠-氨基}-丙酸乙酯AB (11.5 g， 21.3 mmol)溶解于含20%哌啶的二甲基甲酰胺溶 液中。將溶液持續(xù)攪拌l小時。真空濃縮反應混合物，向殘留物中添加水并 使用乙酸乙酯萃取所得產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成其鹽酸鹽而進行純化。
3-({6-[17-(1，5- 二 甲 基-己基 )-10,13- 二 甲 基 -2，3,4,7,8，9,10,11,12,13,14,15，16,17-十四氫-^-環(huán)戊二;1;希并|^]菲畫3-基-氧基宇發(fā)
基氨基]-己酰基}乙氧基羰甲基-氨基)-丙酸乙酯ADAD
將3-[(6-氨基-己?；?-乙氧基羰甲基-氨基]-丙酸乙酯AC的鹽酸鹽(4.7 g， 14.8mmol)加入二氯甲烷中。將懸浮液在冰上冷卻至0°C 。向懸浮液中添加二 異丙基乙胺(3.87 g, 5.2 mL, 30 mmol)。向所得溶液中添加氯甲酸膽固醇酯 (6.675 g， 14.8mmo1)。將反應混合物攪拌過夜。使用二氯甲烷稀釋反應混合物 并使用10%鹽酸洗滌。通過快速層析純化產(chǎn)物(10.3g,92M)。
1-{6-[17-(1，5- 二 甲 基-己 基 )-10,13- 二 甲 基 -2,3，4,7,8，9,10,11,12，13,14，15，16，17-十四氫-111-環(huán)戊二烯并間菲-3-基-氧基羰 基氨基]-己?；鶀-4-氧代-吡咯烷-3-羧酸乙酯AE
在30mL干甲苯中使叔丁醇鉀(l.l g， 9.8 mmol)成漿狀。將所得混合物在 冰上冷卻至0"，并在攪拌下于20分鐘內(nèi)加入5g(6.6mmol)AD二酯。在添 加過程中將溫度保持在5°C以下。在(TC下持續(xù)攪拌30分鐘，并加入lmL冰 醋酸，隨后立即加入含4 g NaH2P04'H20的40rnL水。將所得混合物由二氯 甲烷萃取兩次(每次100mL)，使用磷酸鹽緩沖液將合并的有機萃取物洗漆兩次(每次10mL)，干燥并蒸發(fā)至干。將殘留物溶解于60mL甲苯中，冷卻至0 。C并由三份50mL pH9.5的冷碳酸鹽緩沖液進行萃取。使用磷酸將水性萃取 物調(diào)整至pH3，并使用5份40mL氯仿進行萃取，將萃取液合并、干燥并蒸 發(fā)至干。使用25%乙酸乙酯/己垸通過柱層析純化得到1.9gb-酮酯(39%)。菲-3-基酯M
在1小時內(nèi)將甲醇(2 mL)滴加到含b-酮酯AE (1.5 g， 2.2 mmol)和硼氫化 鈉(0.226 g， 6 mmol)的四氫呋喃(10 mL)回流混合物中。在回流溫度下持續(xù)攪 拌l小時。冷卻至室溫后，加入lNHCl(12.5mL)，用乙酸乙酯(3X40mL) 萃取所得混合物。使用無水硫酸鈉干燥合并的乙酸乙酯層，真空濃縮，柱層 析(10% MeOH/CHCl3)純化，得到產(chǎn)物(89%)。
(6_{3_[雙_(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基甲萄-4-羥基-吡咯烷-1-基}-6-氧 代-己基)-氨基甲酸17-(1,5- 二甲基-己基)-10,13- 二甲基 -2，3,4，7,8,9,10,11,12,13,14,15，16,17-十四氫-111畫環(huán)戊二烯并[3]菲-3-基酯AS
33<formula>formula see original document page 34</formula>
在真空下與吡啶(2X5 mL)—起蒸發(fā)從而干燥AF 二醇(1.25 gm 1.994 mmol)。在攪拌下加入無水吡啶(IO mL)和4，4'-二甲氧基三苯甲基氯(0.724 g， 2.13 mmd)。在室溫下反應過夜。通過加入甲醇終止反應。真空濃縮反應混 合物，并向殘留物加入二氯甲垸(50mL)。用1M碳酸氫鈉水溶液洗滌有機層。 使用無水硫酸鈉干燥有機層、過濾并濃縮。通過與甲苯進行蒸發(fā)除去殘留的 P比啶。通過柱層析(2。/oMeOH/氯仿，在5。/。MeOH/CHCl3中，Rf-0.5)純化粗 產(chǎn)物(1.75 g， 95%)。
琥珀酸單-(4-[雙-(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基甲基]-1-{6-[17-(1,5-二甲 基-己基)-10,13-二甲基-2,3,4,7，8，9，10,ll,12，13，14，15，16，17-十四氫-lH-環(huán)戊二 烯并[a]菲-3-基-氧基羰基氨基]-己酰基p比咯垸-3-基)酯AH
<formula>formula see original document page 34</formula>AH
將化合物AG (1.0 g, 1.05 mmol)與琥珀酸酐(0.150 g, 1.5 mmol)和DMAP(0.073 g, 0.6 mmol)混合并在4(TC下真空干燥過夜。將所得混合物溶解于無水 二氯乙烷(3mL)中，加入三乙胺(0.318g, 0.440 mL, 3.15 mmol)，并在室溫和 氬氣氣氛中將所得溶液攪拌16小時。隨后，使用二氯甲烷(40 mL)稀釋，并 使用冰冷的檸檬酸水溶液(5 wt%, 30 mL)和水(2X20 mL)洗滌。使用無水硫酸 鈉干燥有機相，并濃縮至干。將所得殘留物直接用于下一個步驟。
膽固醇衍生的CPGAI
將琥珀酸酯AH (0.254 g, 0.242 mmol)溶解于二氯甲烷/乙腈的混合物(3:2， 3 mL)中。向所得溶液中連續(xù)加入DMAP (0.0296 g， 0.242 mmol)的乙腈溶液 (1.25 mL)、 2，2'-二硫代-雙(5-硝基吡啶)(0.075 g， 0.242 mmol)的乙腈/二氯乙烷 (3:1, 1.25 mL)溶液。向所得溶液中加入三苯基膦(0.064 g, 0.242 mmol)的乙腈 溶液(0.6ml)。反應混合物的顏色變?yōu)榱脸壬?。使用手動震蕩器短暫地攪拌?液(5分鐘)。加入長鏈垸基胺-CPG(LCAA-CPG)(1.5g,61mM)。將懸浮液攪 拌2小時。通過燒結(jié)漏斗過濾CPG，并依次使用乙腈、二氯甲烷和乙醚洗滌。 利用乙酸酐/吡啶掩蔽未反應的氨基基團。采用UV測量法計算所獲取的CPG 的載量(37mM/g)。
根據(jù)WO 2004/065601中的描述合成具有5'-12-月桂酸雙癸酰胺基團(本 文稱為"5'-C32-")或5'-膽固醇基衍生基團(本文稱為"5'-Chol-")的siRNA，
不同的是，對于膽固醇基衍生物，使用Beaucage試劑進行氧化步驟以在核酸 寡聚物的5'末端引入硫代磷酸酯鍵。
使用標準命名法，特別是表1-2的縮寫來表示以下核酸序列。表1-2:在核酸序列表示法中所使用的核苷酸單體的縮寫?？梢岳斫膺@ 些單體存在于寡核苷酸中時通過5'-3'-磷酸二酯鍵相互連接。
縮寫a核苷酸
A, a2'-脫氧-腺苷-5'-磷酸酯，腺苷-5'-磷酸酯
C,c2'-脫氧-胞苷-5'-磷酸酯，胞苷-5'-磷酸酯
Gg2'-脫氧-鳥苷-5'-磷酸酯，鳥苷-5'-磷酸酯
T，t2'-脫氧-胸苷-5'-磷酸酯，胸苷-5'-磷酸酯
U,u2'-脫氧-尿苷-5'-磷酸酯，尿苷-5'-磷酸酯
N,n任意2'-脫氧-核苷酸/核苷酸(Q A, C,或T, g， a， c或u)
Am2'-0-甲基腺苷-5'-磷酸酯
Cm2'-0-甲基胞苷-5'-磷酸酯
Gm2'-0-甲基鳥苷-5'-磷酸酯
Tm2'-6>-甲基-胸苷-5'-磷酸酯
Um2'-0-甲基尿苷-5'-磷酸酯
Af2'-氟-2'-脫氧-腺苷-5'-磷酸酯
Cf2'-氟-2'-脫氧-胞苷-5'-磷酸酯
Gf2'-氟-2'-脫氧-鳥苷-5'-磷酸酯
Tf2'-氟-2'-脫氧-胸苷-5'-磷酸酯
Uf2'-氟-2'-脫氧-尿苷-5'-磷酸酯
A, C, G, T, U， a, c, g, t,下劃線核苷-5'-硫代磷酸酯
am, cm, gjn, tm, um下劃線2-0-甲基-核苷-5'-硫代磷酸酯
大寫字母表示2'-脫氧核糖核酸(DNA)，小寫字母表示核糖核酸(RNA)
在HuH7、 HepG2、 Hela和猴原代肝細胞中進行的PCSK9 siRNA篩選
發(fā)現(xiàn)了高活性序列
HuH-7細胞從JCRB Cell Bank (Japanese Collection of Research Bioresources) (Shinjuku, Japan, cat. No.: JCRB0403)獲取。在37。C和5% C02 氣氛的力n濕培養(yǎng)箱(Heraeus HERAcell, Kendro Laboratory Products,
36Langenselbold, Germany)中培養(yǎng)補充有10。/。胎牛血清(FCS) (Biochrom AQ Berlin, Germany, cat. No. SO 115)、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 pg/ml (Biochrom Berlin, Germany, cat. No. A2213)和2mM L-谷氨酰胺(Biochrom AG Berlin, Germany, cat. No K0282)的Dulbecco，s MEM培養(yǎng)基(Biochrom AG， Berlin, Germany, cat. No. F0435)中的HuH-7細胞。HepG2細胞和Hela細胞從 American Type Culture Collection (Rockville, MD, cat No. HB-8065)獲取，并在 37t:禾Q 5% C02氣氛的加濕培養(yǎng)箱(Heraeus HERAcell, Kendro Laboratory Products, Langenselbold, Germany)中于補充有10。/o胎牛血清(FCS) (Biochrom AG, Berlin, Germany, cat. No. S0115)、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 |ig/ml (Biochrom Berlin, Germany, cat. No. A2213)、 1 X非必需氨基酸(Biochrom Berlin, Germany, cat. No. K-0293)和ImM丙酮酸鈉(Biochrom Berlin, Germany, cat. No. L陽0473)的MEM (Gibco Invitrogen， Karlsruhe, Germany, cat. No. 21090-022)中培養(yǎng)。
為了進行siRNA轉(zhuǎn)染，將HuH7、HepG2或Hela細胞以2.0 X 104細胞 /孔的密度接種到96孔板中，并直接轉(zhuǎn)染。根據(jù)制造商的描述使用 lipofectamine 2000 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany, cat. No. 11668-019) 進行siRNA(30nM的單劑量篩選)的轉(zhuǎn)染。
轉(zhuǎn)染24小時后，裂解HuH7細胞和HepG2細胞，并根據(jù)實驗方案使用 Quantigene Explore試齊U盒(Genosprectra, Dumbarton Circle Fremont, USA, cat. No. QG-000-02)對PCSK9 mRNA水平進行定量。相對于GAP-DH mRNA的 水平對PCSK9 mRNA水平進行標準化。對每條siRNA記錄8個單獨的數(shù)據(jù) 點。使用與PCSK9基因無關的siRNA雙鏈作為對照。給定PCSK9特異性 siRNA雙鏈的活性表示為經(jīng)處理細胞中的PCSK9 mRNA濃度相對于使用對 照siRNA雙鏈處理的細胞中的PCSK9 mRNA濃度的百分比。
由/" vzTro Technologies, Inc. (B〃/".wore， Maryland, USA， cat No M00305) 獲得獼猴原代肝細胞(冷凍保藏)并于37"C和5% C02氣氛的加濕培養(yǎng)箱內(nèi)、 在InVitroGRO CP培養(yǎng)基(catNo Z99029)中培養(yǎng)。
為了進行siRNA轉(zhuǎn)染，將獼猴原代細胞以3.5 X 104細胞/孔的密度接 種到骨膠原包被的96孔板(Fisher Scientific, cat No. 08-774-5)中，并直接轉(zhuǎn) 染。根據(jù)制造商的描述使用lipofectamine 2000 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe,-019)進行siRNA (從30nM開始進行8次2倍系列稀釋)的轉(zhuǎn)染，每個濃度做兩份。
轉(zhuǎn)染后16小時，將培養(yǎng)基替換成添加Torpedo Antibiotic Mix WfraTechnologies, Inc, cat. No Z99000)的新鮮InVitroGRO CP培養(yǎng)基。
更換培養(yǎng)基24小時后，裂解獼猴原代細胞，并根據(jù)實驗方案使用Quantigene Explore試齊U盒(Genosprectra， Dumbarton Circle Fremont, USA, cat.No. QG-000-02)對PCSK9 mRNA水平進行定量。相對于GAP-DH mRNA的水平對PCSK9 mRNA水平進行標準化。隨后，比較標準化的PCSK9/GAPDH比值和作為對照組lipofectamine 2000的PCSK9/GAPDH比值。
表l-2 (和圖6)總結(jié)了所得結(jié)果并提供了以不同劑量在不同細胞系中進行體內(nèi)篩選的實例。將PCSK9轉(zhuǎn)錄本的沉默表示為給定劑量下殘留轉(zhuǎn)錄本的百分比。高活性序列是在使用小于或等于lOOnM劑量的給定siRNA處理后殘留的轉(zhuǎn)錄本小于70%的序列。極高活性序列是在使用小于或等于100nM劑量的給定siRNA處理后殘留的轉(zhuǎn)錄本小于60%的序列?；钚孕蛄惺窃谑褂酶邉┝?100nM)的給定siRNA處理后殘留的轉(zhuǎn)錄本小于85%的序列。還使用下文所述的脂質(zhì)體制劑在小鼠體內(nèi)對活性siRNA進行了篩選。在體外具有活性的序列通常也在體內(nèi)具有活性(參見圖6)。
PCSK9 siRNA的體內(nèi)功效篩選制劑的制備過程
使用lipidoid LNP-01'4HC1 (MW 1487)(圖1)、膽固醇(Sigma-Aldrich)和PEG-神經(jīng)酰胺C16 (Avanti Polar Lipids)制備脂質(zhì)-siRNA納米顆粒。分別制備以下乙醇儲備溶液LNP-01 133mg/mL，膽固醇25mg/mL， PEG-神經(jīng)酰胺C16 100 mg/mL。隨后，以42:48:10的摩爾比混合LNP-01 、膽固醇和PEG-神經(jīng)酰胺C16的儲備溶液。將混合的脂溶液與siRNA水溶液(乙酸鈉水溶液，pH5)迅速混合，使乙醇終濃度為35-45%，乙酸鈉終濃度為100-300 mM。通過混合自然形成脂質(zhì)-siRNA納米顆粒。根據(jù)所需的粒徑分布，在某些情況下使用熱桶擠出機(thermobarrel extruder) (Lipex Extruder, Northern Lipids, Inc)將所得納米顆粒混合物擠過聚碳酸酯膜(截留值為100 nm)。在其它情況下，可以省略擠出步驟。通過透析或切向流動過濾除去乙醇并同時完成緩沖液的更換。將緩沖液更換成磷酸鹽緩沖液(PBS) pH 7.2。
制劑的表征
由相似的方式表征經(jīng)標準方法或無擠出方法制備的制劑。首先通過目視檢査來表征所述制劑。所述制劑應該是沒有聚集或沉積的白色半透明溶液。
使用Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, USA)通過動態(tài)光散射測定脂質(zhì)納米顆粒的粒徑和粒徑分布。粒徑應該為20-300 nm，理想地是40-100 nm。粒徑分布應該為單峰分布。采用染料排斥試驗評估制劑中以及誘捕部分中的總siRNA濃度。在存在或不存在破壞制劑的表面活性劑0.5% Triton-X100的條件下，將制備的siRNA樣品與RNA結(jié)合染料Ribogreen (Molecular Probes)一起溫育。通過將由包含表面活性劑的樣品產(chǎn)生的信號與標準曲線相比較來測定制劑中的總siRNA。從總siRNA含量中減去"游離"siRNA含量(由不存在表面活性劑時的信號所測定)確定誘捕部分。誘捕siRNA的百分比通常>85%。
單次，農(nóng)注給藥(bolus dosing)
使用27G針通過尾靜脈注射對C57/BL6小鼠(每組5只，8-10周齡，Charles River Laboratories, MA)進行siRNA制劑的單次濃注給藥。將siRNA以0.5 mg/ml的濃度制備成LNP-01制劑(隨后使用PBS透析)從而能夠以10|il/g體重遞送5mg/kg的劑量。給藥前將小鼠在紅外線燈下放置約3分鐘以便
于注射。
給藥48小時后，通過C02窒息處死小鼠。通過眼球后部放血收集0.2 ml血液，收集肝臟并在液氮中冷凍。將血清和肝臟在-80。C下保存。
使用6850 Freezer/Mill Cryogenic Grinder (SPEX CentriPrep, Inc)粉碎冷凍的肝臟，并在分析前將粉末保存在-8(TC下。
根據(jù)實驗方案，使用來自QuantiGene Reagent System (Genospectra)的基于分支DNA技術的試劑盒檢測PCSK9 mRNA水平。在65"C下，將10-20mg冷凍肝臟粉末在含0.16 ug/ml蛋白酶K (Epicentre,弁MPRK092)的600 ul組織和細胞裂解溶液(Epicentre,弁MTC096H)中裂解3小時。隨后，將10 ul裂解物加入到90ul裂解工作液(含1倍體積裂解存儲混合液的2倍體積水)中，并在具有小鼠PCSK9特異性探針組和小鼠GAPDH或親環(huán)素B特異性探針組的Genospectra捕獲板上于52。C下溫育過夜。在軟件QuantiGene ProbeDesigner
39Software 2.0 (Genospectra, Fremont, CA, USA, cat. No. QG-002-02)的協(xié)助下從PCSK9、 GAPDH和親環(huán)素B的核酸序列中選擇用于捕獲增補劑(CaptureExtender (CE))、標記增補劑(Label Extender (LE))和封閉(BL)探針的核酸序列。在Victor2-Light(PerkinElmer)上讀取化學發(fā)光作為相對光單位。對各實驗組肝臟裂解物中PCSK9 mRNA與GAPDH或親環(huán)素B mRNA的比值計算平均值，并將其與使用PBS的對照組或不相關siRNA (凝血因子VII)的對照組進行比較。
根據(jù)制造商的說明書，使用StanBio Cholesterol LiquiColor試劑盒(StanBio Laboratoriy， Boeme, Texas, USA)測定小鼠血清中的總血清膽固醇。使用Victor2 1420 Multilabel Counter (Perkin Elmer)在495 nm處進行測定。
實施例
在小鼠模型體內(nèi)檢測制備于LNP-01脂質(zhì)體中的32種PCSK9 siRNA。所述試驗在5mg/kg siRNA劑量下進行，并且與經(jīng)PBS處理的對照組相比，至少10種PCSK9 siRNA顯示出大于40%的PCSK9 mRNA敲除，而經(jīng)不相關siRNA (凝血因子VII)處理的對照組沒有任何影響(圖2-5)。 PCSK9轉(zhuǎn)錄本的沉默還與這些動物中膽固醇的降低相關(圖4-5)。此外，具有體外活性的分子與具有體內(nèi)活性的分子之間具有密切相關性(圖6)。對包含不同化學修飾的序列也進行了體夕卜(表1和表2)和體內(nèi)篩選。例如，在體外(猴原代肝細胞)測試了在LNP-01中制備的較低修飾序列9314和9318以及序列9314的較高修飾型(10792、 10793和10796)和序列9318的較高修飾型(10794、 10795、 10797)，或在體內(nèi)測試了制備在LNP-01中的序列(9314和10792)。圖7(也可參見表1和表2)表明在體外親本分子9314和9318以及其修飾型均具有活性。作為實例的圖8表明在體內(nèi)親本9314和其較高修飾的10792序列均具有活性，其使小鼠內(nèi)源PCSK9沉默50-60%。圖9進一步例證出親本9314和10792的其它化學修飾型的活性。
dsRNA表達載體
在本發(fā)明的另一方面，由插入到DNA或RNA載體的轉(zhuǎn)錄單位表達調(diào)節(jié)PCSK9基因表達活性的PCSK9特異性dsRNA分子(參見，例如Couture, A, etal., 77G (1996), 12:5-10; Skillem, A.， et al.，國際PCT
發(fā)明者凱文·菲茨杰拉德, 埃金·阿肯克, 威克特·E·考特廉斯基, 帕梅拉·譚, 比吉特·布拉姆利奇, 瑪麗亞·弗蘭克-卡米尼斯基 申請人:阿爾尼拉姆醫(yī)藥品有限公司