專利名稱：使用經(jīng)遺傳工程改造的微觀藻類、藍細菌或細菌生產(chǎn)短鏈揮發(fā)烴類的制作方法
使用經(jīng)遺傳工程改造的銜見藻類、藍細菌或細菌
生產(chǎn)短鏈揮發(fā)烴類
相關(guān)申請的交叉引用
本申請要求于2006年6月29日提交的專利申請?zhí)枮?0/806,244的美 國臨時申請的優(yōu)先權(quán)，該申請以引用形式并入本文。
背景技術(shù)：
已知有多種草本植物、落葉植物以及針葉植物具有合成短鏈類異戊二
烯(例如，異戊二烯(C5H8)和甲基丁烯醇(C5H^00)并將其釋放到周圍環(huán)
境中的遺傳能力及餘波能力。這些短鏈類異戊二烯來自光合作用中早期的 卡爾文循環(huán)產(chǎn)物，并可以通過所謂的DXP-MEP途徑在某種環(huán)境壓力^Hf 下以可觀速率在草#物、落葉植物和針葉植物的葉綠體中合成。生物體 的熱應(yīng)激對在植物中誘導(dǎo)該過程特別重要，并且所得的烴類對大氣的污染 已成為本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)所關(guān)注的焦點。
異戊二烯從草本植物、落葉植物和針葉植物中的釋放是由于存在異戊 二烯合酶(/S/7S)基因，其是編碼一種位于葉綠體中的蛋白質(zhì)的核基因， 該蛋白質(zhì)催化從二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)到異戊二烯的轉(zhuǎn)化。如 上文所提到的，在葉綠體中從卡爾文循環(huán)的早期產(chǎn)物合成類異戊二烯(碳 固定和還原，參見圖l)。五碳的類異戊二烯，例如，異戊二烯(CsHs)和 甲基丁烯醇(CsHwOj為相對小的疏水分子，其直接由二曱基烯丙基二 磷酸(DMAPP)合成(圖2)。這些類異戊二烯為揮發(fā)性分子，4艮容易穿 過細胞膜并因此從葉釋放到大氣中。熱應(yīng)激-誘導(dǎo)以及植物釋放短鏈烴的過 程已經(jīng)作為有害的大氣污染在文獻中討論過。尚未有從草本植物、落葉植 物和針葉植物的葉中大規(guī)模生產(chǎn)、收集和分離這些烴類的描述。
急切需要開發(fā)可有助于滿足全球的能源需求同時不造成氣候變化的可 再生生物燃料。本發(fā)明通過提供生產(chǎn)完全來自于陽光、二氧化碳(C02) 和水的揮發(fā)性短鏈烴的方法和組合物來應(yīng)對該需求。這些烴可用作生物燃 料或合成化學(xué)工業(yè)中的原料。發(fā)明概要
本發(fā)明部分地基于以下發(fā)現(xiàn)，即經(jīng)過適當(dāng)?shù)母脑炜梢岳梦⒂^藻類
(microalgae )、藍細菌和原核生物光合作用生產(chǎn)五碳類異戊二烯(例如， 圖3)。在植物和藻類中，DXP-MEP類異戊二烯生物合成途徑是絕對需要 的，因為它導(dǎo)致許多必需長鏈細胞化合物的合成。單細胞綠藻在它們的葉 綠體中特異性的表達該途徑，并利用相應(yīng)的酶對多種分子(類胡蘿卜素、
生育酚、植醇、甾醇、激素、以及其它許多分子)進行生物合成。本發(fā)明 涉及在生產(chǎn)和收集五碳揮發(fā)性類異戊二烯化合物(例如異戊二烯和甲基丁 烯醇)中使用經(jīng)遺傳^it的銜見藻類、藍細菌以及光合和非光合細菌的方 法和組合物。這些經(jīng)遺傳改造的生物可商業(yè)性地用于封閉的大M^培養(yǎng)系 統(tǒng)，例如，為內(nèi)燃機或者在裝載改造(on-board reformation)后為燃料電 池引擎提供可再生燃料的來源；或者為用于其它化學(xué)過程(如化學(xué)合成) 中的異戊二烯提供來源。
微觀藻類、藍細菌以及光合和非光合細菌不具有異戊二烯合酶或甲基 丁烯醇合酶的基因，所述兩種酶分別催化異戊二烯(C5H8)和甲基丁烯醇 (CsI^。Oj生物合成的最后一步關(guān)鍵步驟。因此，本發(fā)明提供了遺傳改 造微生物以表達異戊二烯合酶基因(例如調(diào)整過密碼子的楊樹異戊二烯合 酶基因)使所述生物可以生產(chǎn)異戊二烯(C5H8)的方法和組合物。
另一些方面，本發(fā)明還提供了用于遺傳^it銜見藻類、藍細菌以及光 合和非光合細菌使其過表達類異戊二烯生物合成的第一關(guān)鍵步驟之內(nèi)源 基因及其所編碼蛋白質(zhì)的方法和組合物。因此，本發(fā)明還包括在所述微生 物中提高天然"m和dat基因的表達，所述微生物例如綠藻如萊茵衣藻 (C7r/"wj^/o附o麗s1 mVi^nft//);藍細菌如集胞藻(iS"ecAc^幼's1 sp.);或 者光合細菌如深紅紅螺菌(7 /i0^s/;f777/"w n/^w附)，或非光合細菌如大 腸桿菌(五sc/^n'c/^i"http://)。 Djcs和2X^編碼類異戊二烯生物合成中催化第 一關(guān)鍵步驟的酶。
在一些實施方案中，采用了銜見藻類。銜見藻類是光合作用的工廠， 其中約70%的細胞容量被葉綠體占據(jù)；綠藻葉綠體包含超過300萬的電子 傳遞鏈，每條鏈每秒鐘能夠向卡爾文循環(huán)傳遞100個電子用于將C02轉(zhuǎn)化 為GA-3-P;銜見藻類沒有根、莖、葉和花會耗費光合作用合成的資源， 因此，大部分的光*用產(chǎn)物可被引導(dǎo)至產(chǎn)生揮發(fā)性類異戊二烯；#^見藻類的生長和繁殖比任何其它陸生或水生植物都要快，生物量每天翻一番； #^見藻類無毒、無污染，因此對于大皿培養(yǎng)和商業(yè)開發(fā)是環(huán)境友好的。 因此，在一些實施方案中，本發(fā)明提供了改造微觀藻類光合作用的高效過 程的方法，以使得從陽光、C02和H20高容量地生產(chǎn)短鏈異戊二烯烴類(例 如，C5H8)。這些經(jīng)&造的樹，見藻類可以例如，在大容量(例如，1000到 1000000升)的完全封閉光反應(yīng)器中生產(chǎn)和收集揮發(fā)性短鏈異戊二烯烴類。
本發(fā)明可以幫助消除多種當(dāng)前可再生能源商業(yè)化生產(chǎn)、儲存和利用中 的障礙，包括但不限于(a)降低燃料生產(chǎn)和存儲的成本，(b)提高燃料 的重量/體積比，(c)改善燃料生產(chǎn)/存儲的效率，U)提高燃料儲存的耐 久時間，(e)使燃料自動補給時間最小化，(f)在車輛可接受的范圍內(nèi)提 供充足的燃料儲存，(g)生產(chǎn)適于再生過程的燃料，(h)在生產(chǎn)或存儲階 段，燃料不受氧氣的干擾。
一方面，本發(fā)明提供了在選自^U見藻類、藍細菌或光合細菌的微生物 中生產(chǎn)異戊二烯烴類的方法，所述方法包括將包含編碼異戊二烯合酶的 核酸序列的表達盒引入所述微生物中；在編碼異戊二烯合酶的核酸得到表 達的條件下培養(yǎng)所述微生物。在一些實施方案中，所述微生物是微觀藻類 如綠藻，如菜茵衣藻、斜生柵藻、小球藻或鹽生杜氏藻。在另一些實施 方案中，所述微生物為藍細菌，如集胞藻。在另外一些實施方案中，所述 微生物為光合細菌，如深紅紅螺菌?？商娲?，在一些實施方案中，所述 微生物可以是非光合細菌，如大腸桿菌。
在一些實施方案中，引入到微生物中的核酸包含編碼異戊二烯合酶多 肽的序列，所述多肽具有SEQIDNO:2所示序列，或具有SEQ ID NO:2 所示序列但缺少轉(zhuǎn)運肽區(qū)域。異戊二烯合酶多肽可以例如包含SEQ ID NO:2的53-595號^J^酸^，或SEQ ID NO:2的38-595號^J^酸殘基。 在一些實施方案中，所述核酸包含SEQIDNO:l所示序列。在另一些實施 方案中，所述核酸包含SEQ ID NO:3中所示異戊二烯合酶的核苷酸編碼序 列；或所述核酸包含SEQ ID NO:5中所示異戊二烯編碼序列。
另一方面，本發(fā)明提供了選自微觀藻類細胞、藍細菌細胞以及光合細 菌細胞或非光合細菌細胞的微生物，其中所述微生物包含與啟動子有效連 接的編碼異戊二烯合酶的異源核酸。所述啟動子可以是組成型啟動子或是 可誘導(dǎo)啟動子，在一些實施方案中，所述微生物為綠藻，如萊茵衣藻、斜 生柵藻、小球藻或鹽生杜氏藻。在其它一些實施方案中，微生物為藍細菌、如集胞藻。在其它一些實施方案中，微生物是光合細菌，如深紅紅螺菌。 在一些實施方案中，所述異源核酸包含編碼異戊二烯合酶基因的序列，所
述異戊二烯合酶具有SEQ ID NO: 2中所示序列，或具有SEQ ID NO: 2 中所示序列但缺少轉(zhuǎn)運肽。該異戊二烯合酶多肽可以例如包含SEQ ID NO: 2的53-595號氨基酸殘基，或SEQ ID NO: 2的38-595號殘基。在 一些實施方案中，所述核酸包含SEQIDNO: 1中所示序列。在其它一些 實施方案中，所述核酸包含SEQIDNO: 3中所示異戊二烯合酶的核苷酸 編碼序列；或所述核酸包含SEQ ID NO: 5所示的異戊二烯編碼序列。
另一方面，本發(fā)明提供了一種在包含編碼異戊二烯合酶的異源基因的 微生物中生產(chǎn)異戊二烯烴類的方法，所述微生物選自孩O見藻類、藍細菌、 光合細菌和非光合細菌，所述方法包括在表達所述異戊二烯合酶基因的 條件下，在封閉生物反應(yīng)器中大皿培養(yǎng)所述微生物；收集所述微生物所 生產(chǎn)的異戊二烯烴類。在一些實施方案中，所述微生物是^bf見藻類，所述 ^bi見藻類是綠藻如萊茵衣藻、斜生柵藻、小球藻或鹽生杜氏藻?？商娲兀?所述微生物可以是藍細菌，如集胞藻。在另一些實施方案中，所述微生物 為光合細菌，如深紅紅螺菌。在另一些實施方案中，所述微生物為非光合 細菌，如大腸桿菌。
在本發(fā)明大M^養(yǎng)方法的一些實施方案中，所述編碼異戊二烯合酶 的異源基因包括編碼具有SEQ ID NO:2中所示序列或具有SEQ ID NO:2 中所示序列但是缺少轉(zhuǎn)運肽的異戊二烯合酶基因的序列。所述異戊二烯合 酶多肽可以例如包含SEQ ID NO:2的53-595^&酸^1^,或SEQ ID NO:2 的38-595號M酸戎基。所述核酸可以包含例如SEQ ID NO:l中所示的 序列。在另一些實施方案中，所述核酸包含SEQ ID NO:3中所示的異戊二 烯合酶的核苷酸編碼序列；或SEQ ID NO:5中所示的異戊二烯編碼序列。
在本發(fā)明的方法和組合物的一些實施方案中，IspS核酸編碼包含SEQ ID NO:8的^tJ^酸序列或包含SEQ ID NO:8的46-608號氨基酸的蛋白質(zhì)。


圖1.光^ft用的卡爾文循環(huán)中二氧化碳固定和還原的途徑以及有機 碳通過脫氧木酮糖/曱基赤蘚糖醇(DXP/MEP)生物合成途徑從普遍存在 的3-磷酸甘油醛(GA-3-P)到類異戊二烯的傳遞途徑的示意圖。
圖2.(左圖)分別在草本/落葉樹木以及美國松樹的葉綠體中生物合成異戊二烯和曱基丁烯醇的單步酶催化反應(yīng)。(右圖)異戊二烯(C5H8)和 甲基丁烯醇(C5H1()0)的化學(xué)式。
圖3.由大量葉綠體代謝物3-磷酸甘油醛(GA-3-P)和丙酮酸形成揮 發(fā)性類異戊二烯的DXP/MEP生物合成途徑。從GA-3-P和丙酮酸合成異 戊二烯需要七步不同的,化反應(yīng)。單細胞綠藻、藍細菌、光合細菌和某
些非光合細菌具有這些基因中的前六個，但是缺少異戊二烯合酶或曱基丁 烯酸合酶基因。
圖4.用新型0-/印^基因進行綠藻(例如萊茵衣藻)葉綠體DNA的 共轉(zhuǎn)化和同源重組。該構(gòu)建物包括a^4啟動子(PatpA),該啟動子融合 到密碼子優(yōu)化的三拷貝血凝素(HA)表位標(biāo)簽DNA的5， UTR末端。該 DNA序列之后為編碼區(qū)，之后為fl爾j 3， UTR。
圖5.通過基因組DNAPCR篩選萊茵衣藻/s/;S (0/sp51)轉(zhuǎn)化子。 引物N和C代表用于擴增的引物對，其退火位置如圖4所示。
圖6.A.用基因組DNA的Southern印跡分析檢測O/s/^轉(zhuǎn)基因的完 整性。用OA/^ DNA探針檢測濾膜。與0-/^;5<編碼區(qū)中放射性標(biāo)記的 Ndel/Xbal片段雜交僅僅在0-/s/^轉(zhuǎn)化體弁9系中鑒定出3.0 kbp條帶，而 在弁7對照系泳道中觀察不到可檢測條帶。B.溴化乙錠染色以測試A中加 載等量DNA。
圖7. A.密碼子優(yōu)化的帶3xHA標(biāo)簽的0-/^5基因的示意圖。 B. OJs/^基因表達的驗證。用特異性多克隆抗HA抗體對相當(dāng)于10或 20照葉綠體的可溶性蛋白質(zhì)級分進行SDS-PAGE和Western印跡分析。
圖8. pIspS質(zhì)粒的組件和結(jié)構(gòu)。其密碼子用法祐i殳計成用于在藍細菌 (例如集胞藻)中表達的新型異戊二烯合酶基因(&-75/^),其包含氨卡 青霉素抗性基因?；跅顦洚愇於┖厦傅鞍踪|(zhì)的M酸序列模板設(shè)計出 此新型5^-/^5*DNA序列，其設(shè)計原則符合集胞藻的密碼子偏好性。引入 限制性位點以方便克隆。合成該新型DNA序列并克隆到質(zhì)粒/^/75" 中用于在大腸桿菌中增殖。
圖9.用于轉(zhuǎn)化藍細菌(如集胞藻)的pAIGA質(zhì)粒的構(gòu)建。采用來自 集胞藻的，M3基因的側(cè)翼序列進行質(zhì)粒的同源重組，隨后用強啟動子驅(qū) 動5s-Js/^基因的表達。將慶大霉素抗性盒引入到質(zhì)粒中^-Js/^基因的3' 末端以用作選擇標(biāo)記。將基因克隆至Ncol和Pstl限制性位點之間。
8圖10.雙重同源重組。通過雙重同源重組和用5"s-i5/^ Gm抗性構(gòu)建 物替換天然/wMJ基因來轉(zhuǎn)化集胞藻的原理示意圖。
圖ll.用于在細菌(如大腸桿菌)中過表達重組蛋白質(zhì)的帶His標(biāo)簽 包含的質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。引入N-末端組氨酸標(biāo)簽以方便重組蛋白質(zhì)的 純化。向液體細胞培養(yǎng)物中加入IPTG來誘導(dǎo);U^桿菌的表達。
圖12.細菌(如大腸桿菌)中帶組氨酸標(biāo)簽的5^-75/^重組蛋白質(zhì)的 表達的證據(jù)?？捡R斯染色的SDS-PAGE分離的來自攜帶pETIspS質(zhì)粒的 大腸桿菌細胞提取物的總蛋白質(zhì)。第一泳道未誘導(dǎo)的對照培養(yǎng)物。2-4 和6-10泳道誘導(dǎo)過的大腸桿菌培養(yǎng)物。5泳道蛋白質(zhì)分子量大小標(biāo)準(zhǔn) 參照物。
圖13.四種已知異戊二烯合S^白質(zhì)的Clustal比對。 發(fā)明詳述
定義
"微觀藻類"、"藻類(alga)"等，指屬于菌藻植物門(phylum Thallophyta)的藻亞門(subphylum Algae)的植物。所述藻類是單細胞 的光合生氧藻類，為非寄生植物，無才艮、莖和葉；它們具有葉綠素并且尺 寸大小各異，從m^見藻類到大型的海藻。綠藻，屬于真核生物(Eukaryota) 畫植物界(Viridiplantae)腸綠藻門(Chlorophyta)-綠藻綱(Chlorophyceae )， 可以在本發(fā)明中使用。然而，本發(fā)明中可用的藻類也可以是藍綠藻、紅藻 或棕色藻，只要該藻類能夠?qū)嵤┨峁┊愇於┥a(chǎn)的底物的必要步驟。
本發(fā)明文中的"揮發(fā)性異戊二烯烴類"是指五碳的短鏈類異戊二烯，例 如異戊二烯或甲基-丁烯醇。
術(shù)語"核酸"和"多核普酸，，以相同含義使用，指從5，端到3，端閱讀的脫 氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基的單鏈或雙鏈聚合物。本發(fā)明中的核酸一 般包含磷酸二酯鍵，盡管在一些情況下，可使用可能具有替代主鏈的核酸 類似物，其包括例如，殺J^磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和O-甲基 亞磷酰胺連接(參見Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press );以及肽核酸主鏈和連接。其它核酸 類似物包括具有帶正電主鏈、非離子主鏈和非核糖主鏈的那些。因此，核酸或多核苷酸還可能包含經(jīng)修飾的核苷酸，其允許被聚合酶正確閱讀。"多 核苷酸序列"或"核酸序列，，包括作為單獨單鏈或在雙鏈體中的核酸的有義 鏈和反義鏈。如本領(lǐng)域的人員可以理解的，對單鏈的說明還限定了互補鏈
的序列；因此本文中所描述的序列也提供它的互補序列。除非另外i兌明， 具體的核酸序列也隱含地涵蓋了其變體(例如簡并密碼子取代物)和互補 序列，明確說明的序列。核酸可以是DNA,包括基因組和cDNA、 RNA 或雜交體，其中核酸可能包含脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的組合，以及 堿基的組合，其包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、肌苷、 黃嘌呤次黃嘌呤、異胞嘧啶、異鳥噤呤等。
詞組"編碼......的核酸序列"指包含結(jié)構(gòu)RNA (如rRNA )、 tRNA序列信息或者具體蛋白質(zhì)或多肽的一級氨基i^列信息或者反式作用調(diào)控因 子結(jié)合位點的序列信息的核酸。該表述特別地涵蓋了天然序列的筒并密碼 子(例如，編碼單個M酸的不同密碼子)，其可以被引入序列以符合特 定宿主細胞中的密碼子偏好性。在本發(fā)明語境中，當(dāng)涉及核酸參考序列(例 如SEQ ID NO:3、 5或7)使用時，術(shù)語"IspS編碼區(qū)"指編碼該蛋白質(zhì)的 核酸區(qū)域。
本發(fā)明語境中的/s/^"基因"指編碼IspS蛋白質(zhì)或其片段的核酸。因此， 這些基因經(jīng)常是編碼IspS的cDNA序列。在其它一些實施方案中， 基因可包括在cDNA中不會出現(xiàn)的序列，如內(nèi)含子。
術(shù)語"啟動子"或"調(diào)控元件"指位于轉(zhuǎn)錄起點上游或下游的指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的 區(qū)域或序列決定區(qū)。如本文中所使用的，啟動子包括臨近轉(zhuǎn)錄起始位點的 必需核酸序列，例如，在II型聚合酶啟動子的情況下有TATA元件。啟動 子也可任選地包括遠程元件，其位于距轉(zhuǎn)錄起始位點多至幾千個4^對的 位置。"組成型"啟動子是在大多數(shù)環(huán)境和發(fā)育M下都有活性的啟動子。 "可誘導(dǎo)"啟動子是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)控下有活性的啟動子。術(shù)語"有效連接" 指核^達控制序列(如啟動子)和第二核酸序列(如IspS基因)之間的 功能性連接，其中所^達控制序列指導(dǎo)對應(yīng)于所述第二序列的核酸的轉(zhuǎn) 錄。"藻類啟動子"或"細菌啟動子"是能夠分別在藻類和/或細菌細胞中啟動 轉(zhuǎn)錄的啟動子。因此，該啟動子在銜見藻類、藍細菌或細菌細胞中^1有活 性的，但不必來源于該生物體。應(yīng)理解，在不破壞調(diào)控元件生物功能的情 況下，可以對其作出有限的l務(wù)飾，并且與野生型藻類調(diào)控元件相比，這些 有限修飾可以使藻類調(diào)控元件具有基;M目同的或提高的功能。這些修飾可以是故意的，如通過定點誘變，或者也可以是偶然的，如通過帶有所述調(diào) 控元件的宿主中的突變。只要基本保留賦予在單細胞綠藻中表達的能力， 藻類調(diào)控元件的定義中就包括所有這些經(jīng)1務(wù)飾的核苷酸序列。
或Dat基因的"提高"或"增強，，活性或表達指Dxs或Dxr的活性的 變化。這種提高的活性或表達的實例包括下列。Dxs或Dxr的活性或者 或Zbr基因的表達提高至野生型非轉(zhuǎn)基因?qū)φ瘴⑸锏乃街?即Dxs 或Dxr的活性或者2Xo或Z)at基因的表達的量提高)。Dxs或Dxr的活性 或者Dxs或Djcr基因的表達是在其野生型非轉(zhuǎn)基因細胞中通常檢測不到上 述活性或表達的細胞中進行的(即Dxs或Dxr基因的表達提高)。當(dāng)細胞 中存在Dxs或Dxr的活性或者Djcs或"at基因表達的時間比野生型非轉(zhuǎn)基 因?qū)φ罩懈L(即Dxs或Dxr的活性或者Dxy或Dxr基因的表達的持續(xù)時 間增長)時，則Dxs或Dxr活性或者表達也^^提高的。
在本發(fā)明中基因的"表達"通常是指向細胞中引入/^S基因，所 述細胞例如微觀藻類(如綠色#^見藻類)、藍細菌、或者光合或非光合細 菌，所述基因通常不在這些生物體中表達。因此，IspS活性或表達的"提 高"通常是同不具有IspS活性的野生型細胞(例如，銜見藻類、藍細菌或 者光合或非光合細菌)相比較確定的。
如果多核苷酸序列來源于外源物種或者若來源于相同物種但經(jīng)itA類 作用而從其原始形式進行了修飾，則它是第二核苷醋列的"異源"核普酸 序列。例如，與啟動子有效連接的異源編碼序列是指其來源物種不同于啟 動子來源物種的編碼序列，或者，如果來源于相同物種，則編碼序列不同 于任何天然等位基因變體。
"IspS多核苷酸"是SEQIDNO: l或SEQIDNO: 7的核酸序列，或 者SEQ ID NO : 3或SEQ ID NO : 5的IspS編碼區(qū)域；或者是與SEQ ID NO: l基;M目似的核酸序列或者與SEQ ID NO : 3或SEQ ID NO : 5 的IspS編碼區(qū)^Jj^目似的核酸序列；或者編碼SEQIDNO : 2或SEQ ID NO : 8的多肽或者編碼與SEQ ID NO : 2或SEQ ID NO : 8基杣目 似的多肽或者其片段或結(jié)構(gòu)域的核酸序列。因此，IspS多核普酸1)包 含SEQ ID NO: l或SEQ ID NO: 7中的或者SEQ ID NO: 3或5之IspS 編碼區(qū)域中的約15到約50、 100、 150、 200、 300、 500、 1000、 1500或 2000或更多個核苷酸，有時約20或約50到約1800個核普酸，有時約200 到約600或約1500個核苷酸的區(qū)域;或者2 )在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 7或者與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5的IspS編碼 區(qū)域或者與其互補序列雜交；或者3)編碼IspS多肽或編碼IspS多肽(例 如，SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 8)的至少50個連續(xù)氨基酸通常至少 100、 150、 200、 250、 300、 350、 400、 450、 500、 550或更多個連續(xù)殘基 的片段；或者4)編碼與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:8或在SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 8的至少100、 200、 300、 400、 500或550個^J^酸殘 基的比較窗口上具有至少55%,通常至少60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、卯％、 95Y?；蚋嘁恢滦缘腎spS多肽或片段；或者5)具有與SEQ ID NO: l或SEQ ID NO: 7有大于約60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、卯％、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或更高核普酸序列一致性的 核斷列，在SEQ ID NO: l或SEQ ID NO: 7的或者SEQIDNO: 3或 SEQ ID NO: 5之IspS編碼區(qū)域的至少約50、 100、 200、 500、 1000或更 多核苷酸的比較窗口上具有至少80%、85%、卯％或至少95%、96%、97%、 98%、 99%或更高一致性；或者6 )是由針對SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 7的或者針對SEQ ID NO: 3或SEQIDNO: 5之IspS編碼區(qū)域的引物所 擴增的。術(shù)語"IspS多核苷酸"是指雙鏈或單鏈的核酸。本文中所用的IspS 核酸編碼催化二甲基烯丙基二磷酸底物向異戊二烯轉(zhuǎn)化的活性IspS。
"IspS多肽，，是具有SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 8 ^J^紗列的 ^&酸序列，或是與SEQIDNO: 2或SEQ ID NO: 8基^目似的氨基酸 序列，或其片段或結(jié)構(gòu)域。因此，IspS多肽可以1)與SEQ ID NO: 2 或SEQ ID NO: 8，或者是在SEQIDNO: 2或8的至少100、 200、 250、 300、 350、 400、 450、 500或550個氨基酸的比較窗口上，有至少55%的 一致性，通常至少60%、 65%、 70%、 75%、 80%、 85%、卯％、 95%或 更高的一致性；或者2)包含SEQIDNO: 2或8的至少100，通常至少 200、 250、 300、 350、 400、 450、 500、 550或更多個連續(xù)^^酸；或者3) 結(jié)合針對包含SEQ ID NO: 2或8之M酸序列的免疫原及其保守修飾變
體所產(chǎn)生的抗體。本發(fā)明中的IspS多肽是催化二甲基烯丙基二磷酸底物向 異戊二烯轉(zhuǎn)化的功能性蛋白。
如本文中所使用的，特定的75/^基因(例如，SEQIDNO: 1)的同 源物或直系同源物例如是同一植物類型或不同植物類型中與所述第一基 因中序列基本一致(如下所述確定)的第二基因。
術(shù)語"Dxs"和"Dxr"核酸和多肽是指片段、變體等。示例性Dxs和Dxr序列包括公開于美國專利申請公開No. 20030219798中所公開的核酸和多 肽Dxs和Dxr序列，例如衣藻(C7^附j(luò)^wffwios)序列。美國專利申請乂> 開No. 20030219798中所述的Dxs和Dxr序列以引用形式并入本文。
"表達盒"是指核酸構(gòu)建物，當(dāng)引入到宿主細胞中時，其導(dǎo)致RNA或 多肽的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
在轉(zhuǎn)基因表達的情況下，技術(shù)人員能夠認(rèn)識到插入的多核苷^列不 需要與該序列所來源的基因序列一致，而是可以"基本一致"。如下所解釋 的，本術(shù)語具體地涵蓋了這些變體。
在插入的多核苷酸序列被轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生功能性多肽的情況下，技術(shù) 人員會了解，由于密碼子的簡并性，有一些多核苷酸序列會編碼相同的多 肽。術(shù)語"IspS多核苷酸序列"或"IspS基因"具體地涵蓋了這些變體。
當(dāng)兩序列中的核苷酸序列或氨基酸殘基序列如下所述地進行最大對應(yīng) 性比對時是相同的，則這兩種核酸序列或多肽被稱為"一致的"。本文中所 用的術(shù)語"互補于"意味著該序列互補于參考多核苷酸序列的全部或部分。
用于比較的最佳序列比對可以通過局部同源性算法(Smith和 Waterman Add. APL. Math . 2 :482 ( 1981 ))、同源性比對算法(Needle man和WunschJ. Mol. Biol. 48:443 (1970))、相似度檢索方法(Pearson和 Lipman Proc. Natl. Acad. Sd. (U.S.A.) 85: 2444 (1988))、這些算法的計算機 化形式(GAP、 BESTFIT、 BLAST、 FASTA和TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI)或通過檢查來進行。
"序列一致性的百分比"是通過在比較窗口上比較兩個最佳比對的序列 來確定的，其中相比于用于兩序列最佳比對的參考序列(不含有添加或缺 失)，所述比較窗口中的多核香酸序列部分可以包含添加或缺失(即缺口 )。 所述百分比如下進行計算確定兩序列中一致的核酸威基或氨基酸殘基的 位置的數(shù)目，得到匹配位置數(shù)，然后用匹配位置數(shù)除以比較窗口中位置總 數(shù)再乘以100，就可以得到序列一致性百分比。本文所使用的"比較窗口" 包括涉及任一連續(xù)位置數(shù)目的區(qū)段，例如20到600，通常約50到約200, 更通常為約100到約150，其中在兩序列最佳地比對之后，序列可以與具 有相同連續(xù)位置數(shù)的參考序列相比較。
在多核苷酸或Jl^酸序列的上下文中術(shù)語"基本一致"意為多核苷酸或多肽包含與參考序列有至少50%序列一致性的序列?？商娲?，百分比一 致性可以為從50%到100%的任何整數(shù)。示例性實施方案包括用本文中所 述的程序與參考序列相比具有至少55%、 57%、 60%、 65%、 70%、 75%、 80、 85%、卯％、 95%或99%的一致性；所述程序優(yōu)選如下所述釆用標(biāo)準(zhǔn) 參數(shù)的BLAST。因此，本發(fā)明的IspS序列包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 7或者與SEQIDNO: 3或SEQ ID NO: 5的IspS編碼區(qū)J^本 一致的核酸序列。如上所提到的，本發(fā)明中的IspS多肽序列包含與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 8基本一致的多肽序列。
如上所提到的，除了不一致的殘基位置可能由于保守的氛基酸變化而 不同外，"基4^目似"的多肽具有共有的序列。保守M酸替換是指具有相 似側(cè)鏈的殘基的互換性。例如，具有脂肪族側(cè)鏈的M酸組為甘氨酸、丙 氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂肪族羥基側(cè)鏈的JL^酸組為絲 氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺側(cè)鏈的M酸組為天冬酰胺和谷氨酰胺；具有 芳香基側(cè)鏈的M酸組是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有堿性側(cè)鏈的氨 基酸組為賴氨酸、精氨酸和組氨酸；具有含硫側(cè)鏈的M酸組為半胱氨酸 和甲硫氨酸。示例性保守Jl&酸取代組為纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙 氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、天冬氨酸-谷氨酸和天冬酰 胺-谷氨酰胺。
核苷酸序列基本一致的另 一個指示是兩個分子在嚴(yán)謹(jǐn)條件下是否可以 相互雜交或可以與第三核酸雜交。詞組"嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件，，是指探針可以與其 靶標(biāo)子序列(通常是在核酸的復(fù)雜混合物中)雜交，但是不與其它序列雜 交的條件。嚴(yán)謹(jǐn)M是依賴于序列的，并且在不同的環(huán)境中有所不同。更 長的序列在更高的溫度下特異性雜交。對核酸雜交的詳細指導(dǎo)可以參照 Tijssen， Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)。通常，選擇在限定的離子強度和pH 值下比該特定序列的熱熔解溫度(Tm)低約5-10。C的嚴(yán)謹(jǐn)條件。Tm值為 平衡時(由于耙序列過量存在，在Tm溫度下，平衡時占用了 50%的探針) 互補于靶標(biāo)的探針中的50%與乾序列雜交的溫度(在限定的離子強度、pH 值和核酸濃度下)。嚴(yán)謹(jǐn)條件是pH值7.0到8.3時鹽濃度小于約1.0 M的 鈉離子，通常約0.01到l.OM鈉離子濃度(或其它鹽類)，以及溫度對于短 探針(例如10到50個核苷酸)至少約30'C，對于長探針(例如大于50個核普酸)至少約60°C。也可以通過添加如甲酰胺的去穩(wěn)定劑實現(xiàn)嚴(yán)謹(jǐn)條 件。對于選擇性或特異性雜交，陽性信號為背景的至少兩倍，任選地為背 景雜交的10倍。示例性嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件可以為如下所示50%曱酰胺、 5xSSC、 1。/。SDS在42。C下孵育，或者5xSSC、 1% SDS、在65。C下孵育， 用0.2xSSC和0.1% SDS在55。C、 60。C或65。C下清洗。這些清洗可以實 施5、 15、 30、 60、 120分4中或更長時間。
如果所編碼的多肽基本一致，則在嚴(yán)謹(jǐn)條件下不互相雜交的核酸仍然 是基本一致的。這會在一些情況下發(fā)生，例如，當(dāng)用遺傳密碼所允許的最 大密碼子簡并性產(chǎn)生核酸拷貝時。在這種情況下，該核酸通常在中等嚴(yán)謹(jǐn)
的雜交條件下雜交。例如，也可以通過其在嚴(yán)謹(jǐn)條件下(例如，Tm~40°C) 與具有SEQIDNO: l或SEQIDNO: 7序列的核酸探針雜交的能力鑒定 IspS多核苷酸。相對于所選擇的核酸探針，該IspS核酸序列可以有例如 約25-30%或更低的磁《^錯配。SEQ ID NO: 1是一個示例性IspS多核苷 酸序列。示例性"中等嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件"包括在40%甲酰胺、1M NaCl、 1% SDS的緩沖液中在37'C下的雜交，以及在45。C下用lxSSC清洗。這些清 洗可以實施5、 15、 30、 60、 120分鐘或更長時間。陽性雜交是背景的至少 兩倍。那些普通的技術(shù)人員會4^易了解另外的雜交和清洗條件可用來提 供相似嚴(yán)謹(jǐn)條件。
當(dāng)用于核酸或蛋白質(zhì)時，術(shù)語"分離的"表示該核酸或蛋白質(zhì)基本上不 含在自然狀態(tài)下與其相關(guān)聯(lián)的其它細胞組分。優(yōu)選地，其處于均一的狀態(tài)， 并且可以是干燥形式或在水性溶液中。純度和均一性通常采用分析化學(xué)技 術(shù)確定，如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜。作為主要物質(zhì)存在于制 劑中的蛋白質(zhì)是基本上純化的。特別地，分離的基因與位于所逸基因側(cè)翼 并且編碼目的基因之外蛋白質(zhì)的開放讀碼框相分離。
如本文中所使用的，"大規(guī)模培養(yǎng)，，是指大量培養(yǎng)已經(jīng)過改造而表達 i5/^基因的微觀藻類、藍細菌、或者光合或非光合細菌。"大量"通常是在 約100升到約1500000升的范圍，或更多。在一些實施方案中，在模塊化 生物反應(yīng)器中大量培養(yǎng)該微生物，所述每個反應(yīng)器的容量為約1000到約 1000000升。
本發(fā)明中的"生物反應(yīng)器"為^XC藻類、藍細菌或者光合或非光合細菌
在其中生長的任何密閉的大容量容器。本發(fā)明中的"大容量容器，，可以容納
約100升，通常為約500升，或約1000升到約1000000升，或更多。
15如本文所使用的，"收集"揮發(fā)性異戊二烯烴類是指在密閉的或容納的 環(huán)境中捕獲或隔離這些烴類。
本發(fā)明中采用了多種常規(guī)的重組核酸技術(shù)。總的來說，以下所述的重
組DNA技術(shù)中的術(shù)語和實驗室程序都是公知的并且在本領(lǐng)域普遍采用。 許多指導(dǎo)實施重組DNA操作的手冊都是可以獲得的，例如，Sambrook& Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd Ed， 2001);和 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al" eds" 1994-1999)。
IspS核酸和多肽序列是本領(lǐng)域已知的。IspS基因已從楊樹和山楊樹(兩 種相關(guān)的樹種)以及葛藤(藤a物)中分離出來并測序。通過登錄號在 下文中給出所涉及的物種及可從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得的序列，其每一個都 以參考形式并入本文
銀白楊(戶印m/"sfl幼fl) (white poplar)的異戊二烯合酶的IspS mRNA; 登錄號AB198180;
美洲山楊(/^戸/"s "e附m/wV/es) (quaking aspen)的異戊二烯合酶(IspS ); 登錄號AY341431 (完整cds);
4艮白楊美洲山楊雜交種(尸0/7M/mS a/6flXPo^w/ms "^wm/wV/eS )的IspS
mRNA;登錄號AJ294819;
黑楊(尸o/ m/ms "/gm) (Lombardy poplar)的異戊二烯合酶的mRNA (IspS 基因)；登錄號AM410988。
山葛膝野變種(戶MminVi附o她"a iyw: /otofl) (kudzu vine)的異戊二蹄合 酶(IspS);登錄號AY316691 (完整cds.)。
對這些IspS序列的檢查表明了高度的核苷酸和Jl^酸序列一致性，例如，楊樹和山楊樹雜交種的cDNA序列在多肽和核苷酸水平上具有98 %的 一致性(參見，例如，Sharkey et al， Plant Physiol. 137:700-712， 1995 )。山 楊樹異戊二烯合酶的核苷酸編碼序列與葛藤基因有65%的一致性，而蛋白 質(zhì)序列(不包括葉綠體轉(zhuǎn)運肽)有57 %的一致性。
楊樹的IspS蛋白在所述蛋白質(zhì)羧基端一半上有高密度的半胱氨酸和 組氨酸。例如，就Cr-IspS蛋白(SEQIDNO: 4)的591個^J^酸序列來 說，其中半胱氨酸位于34、 326、 378、 413、 484、 505和559號位置，即 7個半胱氨酸中有6個位于蛋白質(zhì)的后45 % 。同樣也觀察到在所述蛋白的 C端一半多個位置處有另外的成簇組氨酸。已知組氨酸和半胱氨酸參與了 蛋白質(zhì)適當(dāng)?shù)恼郫B和催化位點的結(jié)構(gòu)，并且對于酶活性來說是重要組成部 分。圖13中提供了對四種已知IspS蛋白質(zhì)的比對，其表明在所述分子的 C端部分中半胱氨酸的高度保守。在一種情況下，葛藤蛋白質(zhì)中有被絲氨 酸取代的另外保守的半胱氨酸(圖13的clustal比對中銀白楊或黑楊或美 洲山楊的Cys-509-Ser序列)。絲氨酸對于半胱氨酸來說是高度保守的取代， 因為這兩種M酸唯一的不同在于用-OH基取代了-SH基。事實上，對四 種IspS序列的檢查揭示了在包含所述蛋白質(zhì)的C端一半中許多保守絲氨 酸的額外性質(zhì)。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明中所4吏用的核酸編碼IspS 多肽，其包含SEQIDNO: 2之C端的45。/。，并保持了催化二曱基烯丙 基二磷酸(DMAPP)轉(zhuǎn)化為異戊二烯的活性。也有其它實例，其中在一 種微生物(例如綠色#^見藻類)中的相關(guān)蛋白質(zhì)缺少所述蛋白質(zhì)N端的基 本部分(相對于例如細菌的另一種微生物中存在的蛋白質(zhì)形式)，但對活 性沒有有害作用(參見，例如Melis和Happe， Plant Physiol. 127: 740-748， 2001 )。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明中所使用的IspS核酸編碼包含 SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 8的從約330號氨基酸殘基到C末端的多 肽。在一些實施方案中，IspS核酸編碼的IspS多肽包含SEQIDNO: 2或 SEQ ID NO: 8的從約300號氨基酸殘基到C末端的多肽。在一些實施方 案中，IspS序列可以另外缺少SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 8的最后 10、 15或20個殘基。
IspS蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運肽最低限度地包含1-37號氨基酸(對于楊樹和山楊 樹)以及l(fā)-45號氨基酸(對于葛藤)。據(jù)此分析，成熟的蛋白質(zhì)以氨基酸 序列"CSVSTEN..."等起始。本發(fā)明中所使用的IspS核酸序列不需要包含 編碼轉(zhuǎn)運多肽的序列，并且還可以省略額外的N-末端序列。例如，實施例部分所提到的Ss-IspS構(gòu)建物缺少編碼合成基因DNA中的52個氨基酸。 IspS蛋白質(zhì)的合成和積累沒有影響。
在本發(fā)明的一些實施方案中，使用編碼楊樹或山楊樹IspS多肽(例如， SEQ ID NO: 2)的核酸序列，在另外一些實施方案中，使用編碼葛藤IspS 多肽(例如，SEQ ID NO: 8)的核酸序列。由本發(fā)明的方法中所用核酸 編碼的IspS多肽具有催化DMAPP轉(zhuǎn)化為異戊二烯的活性。通常地，活性 水平與楊樹或山楊樹IspS多肽(例如，SEQ ID NO: 1所編碼的)或天然 葛藤IspS多肽(例如，SEQ ID NO: 7所編碼的)所顯示的活性相當(dāng)。
示例性Dxs和Dxr序列包括美國專利申請No. 20030219798所公開的 Dxs和Dxr的核酸和多肽序列，例如，衣藻(CMfl附j(luò)^tow卵fls)的序列。 美國專利申請No. 20030219798中的Dxs和Dxr序列以引用形式并入本文。
可采用多種技術(shù)來實現(xiàn)A/;51、 或"jcs多核苷酸序列的分離和生成。 該技術(shù)的克隆和表達在有關(guān)IspS基因的部分中有所涉及。然而，也可以采 用同樣的技術(shù)分離和表達Dxr或Dxs多核苷酸。例如，基于本文所公開序 列的寡核苷酸探針可用于從所需植物物種的cDNA或基因組DNA文庫中 鑒定所需的多核苷酸。然后可以使用基于所克隆的IspS基因序列(例如 SEQ ID NO:l或SEQ ID NO:7)的探針篩選這些cDNA或基因組文庫。探 針可以用于與基因組DNA或cDNA序列雜交，以分離相同或不同植物物 種中的同源基因。
可替代地，可使用擴增技術(shù)從核酸樣本中擴增目的核酸。例如，可以 采用PCR直接從mRNA、 cDNA、基因組文庫或cDNA文庫中擴增所述基 因的序列。PCR和其它體外擴增方法也可例如用于克隆編碼待表達的蛋白 質(zhì)的核酸序列，用于制備用作檢測樣本中期望mRNA存在情況之探針的核 酸，用于核酸測序中或其它一些目的。
可以從本文所提供的序列比較中產(chǎn)生用于從植物細胞(例如楊樹或另 一落葉樹)中鑒定IspS基因的合適的引物和探針。對PCR技術(shù)的整體概 述可以參見PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, (rnnis， M, Gdfand， D.， Sninsky， J. and White, T.， eds.)， Academic Press, San Diego (19卯)。在實施例中提供了用于擴增IspS核酸序列的示例性的PCR。
本發(fā)明中所使用的IspS核酸序列的種類包括用例如雜交和/或序列分 析的技術(shù)使用示例性核酸^列(如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 7)和蛋白質(zhì)序列(如SEQIDNO: 2或SEQIDNO: 8)鑒定或表征的基因和或基 因產(chǎn)物。
重組載體的制備
為了在上述的技術(shù)中使用分離的序列，制備了適于綠藻、藍細菌和光 合或非光合細菌細胞轉(zhuǎn)化的重組DNA載體。轉(zhuǎn)化的技術(shù)是眾所周知的， 并在科技文獻中已有說明。例如，編碼/s/^基因的DNA序列(在以下內(nèi) 容中會進一步詳細說明)可以與轉(zhuǎn)錄調(diào)控或其它調(diào)控序列結(jié)合，這些序列 會指導(dǎo)來自該基因的序列在轉(zhuǎn)化的藻類、藍細菌或細菌中的預(yù)期細胞中進
行轉(zhuǎn)錄。在一些實施方案中，包含了含有/^y基因^達盒的表達載體還
包含有效連接于75/^基因上的啟動子。在其它一些實施方案中，指導(dǎo)/^S" 基因轉(zhuǎn)錄的啟動子和/或其它調(diào)控元件對該微生物而言是內(nèi)源性的，并通過
例如同源重組引入包含/^S基因的表達盒，從而異源T5/;5"基因與內(nèi)源啟 動子有效連接，并由內(nèi)源啟動子驅(qū)動表達。
調(diào)控序列包括可以是組成型或者可"i秀導(dǎo)型的啟動子。在一些實施方案 中，啟動子可以在環(huán)境條件改變的影響下用于指導(dǎo)/s/^核酸的表達?？捎?響可誘導(dǎo)型啟動子轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的例子包括厭氧條件、升高溫度或存在
光。在暴露于化學(xué)試劑時可誘導(dǎo)的啟動子也可用于/^y核酸的表達。其它
有用的可誘導(dǎo)調(diào)控元件包括銅-誘導(dǎo)型調(diào)控元件(Mett et al， /Voc A^/.
USA 90:4567-4571 (1993); Furst" CW/ 55:705-717 (1988));四 環(huán)素和氯-四環(huán)素-謙導(dǎo)型調(diào)控元件(Gatz " "/.，戶/"W丄2:397-404 (1992); R6der C A/o/' 243:32-38 (1994); Gatz， AfW/i. CW/
50:411-424 (1995));蛻皮素資導(dǎo)型調(diào)控元件(Christopherson W 胸/. USA 89:6314-6318 (1992); Kreutzweiser W fl/，
五mwVwi. 28:14-24 (1994));熱應(yīng)激誘導(dǎo)型調(diào)控元件(Takahashi"
戶/"W戶/i"/0/. 99:383畫3卯(1992); Yabe " iVfl^ CW/ TV^s/o/. 35:1207-1219 (1994); Ueda W /, Afo/. GWi. G^fi". 250:533- 539 (1996));以 及乳糖操縱子元件，其與組成型表達的lac阻抑蛋白一起用于提供例如 IPTG畫誘導(dǎo)型表達(Wilde W "/，五AffiO / 11:1251-1259 (1992))。誘導(dǎo)型調(diào) 控元件也可以是例如從菱菜硝酸鹽還原酶基因中衍生的(Back W"/., i，/fl^ AW. 17:9 (1991))硝酸鹽-誘導(dǎo)型啟動子，或光-誘導(dǎo)型啟動子如與 RuBP羧化酶的小亞基或LHCP基因家族有關(guān)的啟動子(Feinbaum W /.,ikfe/ GWi. G^/iW. 226:449 (1991); Lam and Chua, 5We"" 248:471 (19卯))， 或光。
在一實施例中，可以使用對光有反應(yīng)性的啟動子序列來驅(qū)動引入到暴 露于光的衣藻(C7f/fl附j(luò);^wo"fls)中的/sp51核酸構(gòu)建物的表達(例如， Hahn， Cm t Ge/i" 34:459-66,1999; L叩pes, /VflWMo/fi/< / 45:215-27, 2001; Villand，5/oc/ie附/327:51-7， 1997)。也可以4吏用其它光-誘導(dǎo)型啟動子系 統(tǒng)，例如光敏色素/PIF3系統(tǒng)(Shimizu曙Sato, 7V"f丑,V tecA/^/ 20):1041國4， 2002 )。另外，可以采用對熱有反應(yīng)性的啟動子來驅(qū)動藻類(如衣藻 (CMi附j(luò)^"腳腿))中的表達(Muller, G謝111: 165-73, 1992; von Gromoff，Mo/CW/所o/9:3911-8， 1989)。其它的啟動子，例如在藻類(如綠 微觀藻類)中的表達，包括RbcS2和PsaD啟動子(參見，例如，Stevens" /， MoZ G饑G^威251: 23-30, 1996; Fischer & Rochaix, Af。/ G謝f GWio附/cs 265:888-94， 2001 )。
在一些實施方案中，啟動子可來自與待轉(zhuǎn)化物種或另一物種中的光合 成有關(guān)的基因。例如，來自一個物種中的這種啟動子可以用于指導(dǎo)經(jīng)轉(zhuǎn)化 藻類細胞或另一光合水生生物細胞中的蛋白質(zhì)表達?？苫趤碜云渌夂?生物的已知序列來分離或合成出合適的啟動子。優(yōu)選的啟動子是來自其它 光合物種的與待轉(zhuǎn)化水藻宿主的光合基因同源的基因的那些。例如，已在 三角褐指藻(/，/^e<w/flc&/"m加Vw7iw似附)中鑒定出一系列來自褐藻素葉 綠素結(jié)合蛋白的光捕獲啟動子(參見例如Apt, W fl/. MoJ 252:572-579,1996)。在其它一些實施方案中，可以采用類胡蘿卜素葉綠體 結(jié)合蛋白質(zhì)啟動子，例如多曱藻(黃)素葉綠素結(jié)合蛋白質(zhì)啟動子。
在一些實施方案中，用于驅(qū)動異源A/^基因表達的啟動子為組成型啟 動子。用于銜現(xiàn)藻類中的組成型強啟動子的例子包括例如《^4、 fl^B和 Wd基因的啟動子。也已知在藍細菌中有活性的多種啟動子。這些啟動子 包括，如藍細菌中的/;^A 基因(組成型)啟動子和例如美國專利申請 No. 20020164706中所提到的那些啟動子，它們都以參考形式并入本文。也 可以在藻類中使用其它一些在植物中有效的啟動子，例如，來源于植物病 毒中的啟動子，如CaMV35S啟動子。
在一些實施方案，通it^t相應(yīng)于A/^基因的基因組克隆的5'端序列進 行分析來鑒定啟動子。啟動子序列的特征性序列可用于鑒定所述啟動子。啟動子可以通過例如測試啟動子在期望引入/s/^表ii^J建物的植物細 胞例如綠藻中驅(qū)動表達的能力進^Sf價。
包含75/75*核酸序列的載體通常會包含能夠賦予藻類或細菌細胞可選擇 表型的標(biāo)記基因。這些標(biāo)記都是已知的。例如，所述標(biāo)記可以編碼抗生素 抗性，例如卡那霉素、G418、博萊霉素、潮霉素等等的抗性。在一些實施 方案中，用于衣藻的選擇標(biāo)記可以是具有壯觀霉素抗性(Fargo, Mo/ CW/ 說W 19:6980-卯，1999)、卡那霉素和阿米卡星抗性(Bateman, Ge/fC 263:404-10, 2000 )、 zeomycin 和腐草霉素抗性(Stevens,腸/ Ge" 251:23- 30， 1996 )、巴龍霉素和新霉素抗性(Sizova， (7e"e 277:221-9, 2001)的標(biāo)記。
本發(fā)明中的/s/^核酸序列在微生物中(例如銜見藻類、藍細菌或者光
合或非光合細菌)重組表達。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，可以考慮如i5/^ 核酸將在其中表達的微生物的密碼子用法頻率等性質(zhì)來設(shè)計表達構(gòu)建物。
可釆用已知的方法(參見，例如，NakamuraWfl/.JVi/c/.J"Vfei d 28:292， 2000 )列出密碼子用法頻率表。密碼子用法頻率表，包括^Jf見藻類和藍細 菌的那些表，也可以從本領(lǐng)域中獲得(例如，在KazusaDNA研究所的植 物基因組研究部的密碼子用法數(shù)據(jù)庫中，www,kazusa,or,jp/codon )。
細菌和藍細菌的細胞轉(zhuǎn)化方法以及選擇標(biāo)記在本領(lǐng)域中是眾所周知的 (Wirth， A/o/G^iC 1989 March; 216(1):175-7; Koksharova， J/ / / Af/cn^/o/丑/otec/mo/ 2002 February; 58(2): 123-37; Thelwell )。用于細菌的 轉(zhuǎn)化方法和可選擇標(biāo)志物也是眾所周知的(參見，例如，Sambrook""A， sw/;ni )。
在微觀藻類(如綠色微觀藻類)中，其核、線粒體和葉綠體基因組通 過多種公知的方法轉(zhuǎn)化，包括通過微粒轟擊或使用玻璃珠的方法(參見， 例如，Kindle, / CW/ fi/r / 109:2589-601, 1989; Kindle, A^/爿cflrf 5W USA 87:1228-32， 19卯；Kindle, 7Voc iVW/USA 88:1721-5, 1991; Shimogawara， GewWcs 148:1821-8, 1998; Boynton, Sc/^i" 240:1534-8, 1988; Boynton， M^/wA五"z^附o/ 264:279-96, 1996; Randolph-Anderson, MoJ Ge 236:235-44， 1993 )。在一些實施方案中，將/，S基因引入
到銜見藻類的葉綠體中。在其它實施方案中，將/s/;51基因引入到細胞核中。
本文中所述的用于在銜!見藻類、藍細菌或者光合或非光合細菌中獲得
21和表達/sp51核酸序列的技術(shù)也可以用于表達Z)at或核酸序列。
可以作為目標(biāo)的微生物
A/^可以在期望在其中生產(chǎn)異戊二烯的多種孩吏觀藻類(如綠藻)、或藍 細菌、或者光合或非光合細菌中表達。表達異源7s/^基因的經(jīng)轉(zhuǎn)化的微觀 藻類、藍細菌或細菌(光合細菌或非光合細菌)在用于烴類(例如，用作 燃料來源或合成化學(xué)的原料)生產(chǎn)的大目培養(yǎng)的條件下培養(yǎng)。經(jīng)轉(zhuǎn)化的
生物體在提供容納所述烴類的密閉環(huán)境的生物反應(yīng)器或發(fā)酵罐中培養(yǎng)。在 大自培養(yǎng)的典型實施方案中，所述微觀藻類、藍細菌或細菌在密閉的反
應(yīng)器中生長，其容量為至少約500升，通常為至少約1000升或更大，在一 些實施方案中，其容量為約1000000升或更大。
在一些實施方案中，/s/^在微觀藻類中表達。藻類等是指屬于菌藻植 物門藻亞門的植物。所述藻類是單細胞的光合生氧藻類，它們是非寄生植 物，無根、莖、葉；它們包含葉綠素并且大小各異，>^銜見級別的到大型 的海藻都有。具有葉綠素a和葉綠素b的生氧光合單細胞真核生物的綠藻， 屬于真核生物(Eukaryota )-植物界(Viridiplantae )-綠藻門(Chlorophyta) -綠藻綱(Chlor叩hyceae )，通常^l^優(yōu)選的靶標(biāo)。例如、/s/^可以在萊侖衣 藻(C. mVi/i"f浙/)中表達，其分類為團藻目(Volvovales)-衣藻科 (Chlamydomonadaceae)。本發(fā)明中可以用到的藻類林包括，例如，萊茵 衣藻(CM鵬j^wio憩s1 m7i/^n/板)、斜生樹藻(5^w^fes附ws1 oA/一ws)、 小 球藻((7似01^//" w/g"n's)、布朗葡萄藻(fiWf"a ccMS 6m簡//) 、 5W，C0ccws
SMflfeftV^ 、 鹽生杜氏藻(2>"腦//"〃" 5 //聰)和雨生紅球藻(份fl挑"似"07"51
大皿培養(yǎng)藻類的方法是已知的。例如，藻類可以生長于高密度光生 物J^應(yīng)器(參見，命J如,Lee & fl/"5/0e"g/weenVig 44:1161-1167， 1994; Chaumont， J^/;/ /. iV^c"/^j; 5:593-604， 19卯)、例如那些用于污水或 廢7JC處理的生物反應(yīng)器(例如，Sawayama " j/7p/. 丑/ofec/i" 41:729-731,1994; Lincoln, De Z/iVi^&m^ (Monaco),
12:109-115,1993 )，其可以大，涪養(yǎng)用于從受污染的水中消除重金屬(例 如，Wilkinson, 5,》tec/i. i^股rs, 11:861-864， 1989 )，可以大M^培養(yǎng)以用于 生產(chǎn)P-胡蘿卜素(例如，Yamaoka， 5W6wtew-A(^flA:M J^/W/, 72:111-114， 1994)、氫氣(例如，美國專利申請No. 20030162273 )和藥物化合物(例如，Cannell, 1990 )、以及人和動物使用的營養(yǎng)補充劑(Becker, 1993， 丑w,/C/zi Dd'/"s故"f 6>mi ogm/7/r/《Me (Monaco), 12， 141-155 )和生產(chǎn)其它 有營養(yǎng)價值的化合物。
以上出于示例性目的所說明的培養(yǎng)表達/^51的藻類或細菌的條件在本 領(lǐng)域中是已知的(參見例如本文中引用的示例性參考)?？梢圆捎靡阎?技術(shù)收集由^it過的微生物所生產(chǎn)的揮發(fā)性異戊二烯烴類。異戊二烯烴類 不能與水混合，它們上升至并飄浮于微生物生長培養(yǎng)基的表面。從該表面 將它們吸取后放置于合適的容器內(nèi)。另外，根據(jù)微生物大M^莫培養(yǎng)時的主 要溫度，異戊二烯可以在反應(yīng)器容器內(nèi)的^養(yǎng)基上以蒸氣形式存在(異 戊二烯的沸點為T=34。C)。從生物反應(yīng)器容器內(nèi)將異戊二烯蒸氣抽走并通 過冷卻或低程度壓縮將其凝結(jié)成為液體燃料形式。
實施例
本文中所描述的實施例是以說明性的方式而非限制性的方式提供。本 領(lǐng)域中的技術(shù)人員會很容易了解可以改變或修改多個非關(guān)鍵參數(shù)以獲得 本質(zhì)上相似的結(jié)果。
實施例1.用于在微觀藻類中生產(chǎn)異戊二烯烴類的新型Cr-IspS基因的 i殳計和表達
根據(jù)已知的核編碼的銀白楊(i^/^/ws "/6fl)"異戊二烯合酶"IspS蛋白 質(zhì)序列，生成了調(diào)整了密碼子的合成DNA構(gòu)建物。采用該M酸序列(SEQ ID NO: 2 )作為模板用于從頭設(shè)計/s/^DNA序列以用于在模式微觀藻類 萊茵衣藻(C似fl附j(luò);甴附卵fls fr!7i/^n/故)的葉綠體中表達所述基因。出于 本發(fā)明的目的，將該基因稱為0-75pS。該基因的特征包括(l)密碼子用 法不同于楊樹的密碼子用法，并具體地選擇成適合萊茵衣藻 (C7i/fl附j(luò)vto附oiifls fe/"/mn/故)葉綠:體的密碼子用法；(2 ) >^新型O-A/^ 基因的設(shè)計中省略了所述蛋白質(zhì)的楊樹葉綠體靶向序列。(3)將編碼血凝 素(HA)表位標(biāo)簽的經(jīng)過密碼子優(yōu)化的基因的三個拷貝融合到所述75/;X 基因的上游。
CV-A/^ DNA序列(SEQ ID NO: 3 )設(shè)計成特異性地在^UC藻類(如 萊茵衣藻(CM"附j(luò);^附^w^ "/"/iflnfti7))的葉綠體中編碼異戊二烯合Sl^
23白(SEQIDNO: 4)。根據(jù)萊茵衣藻(CM"wy;^附做"s "/"Afln/放)葉綠 體6803的密碼子用法表，調(diào)節(jié)了用于在衣藻(C7f/"附，yrfo附卵fls)葉綠體中 表達所述基因的密碼子用法，所述的密碼子用法表列于以下鏈接 http:〃www.bio.net/bionet/mm/chlamv/1997-March/000843.htm1.
SEQIDNO: 4也包含血凝素標(biāo)簽的三個拷貝，其在該序列的N-末端 一側(cè)用下劃線標(biāo)出。在0-is/^DNA序列的末端引入限制性內(nèi)切酶的識別 位點以方便克隆該基因，合成整段序列并克隆到載體質(zhì)粒中。
生成了表達密碼子優(yōu)化的重組異戊二烯合酶基因(0-75/^)的轉(zhuǎn)基因 萊茵衣藻(CMfl附j(luò)^o附o"fls wViAflnft,7)葉綠體。該過禾呈是通過構(gòu)建包含 fl伊J啟動子(PatpA)的嵌合基因(圖4上部，實現(xiàn)的，所述啟 動子融合至密碼子優(yōu)化的三拷貝血凝素(HA)表位標(biāo)簽DNA的5，UTR 末端(圖4)。該DNA序列之后是CV-i5/^編碼區(qū)(圖4)，再之后是fl伊J 3'UTR(圖4， TatpA)。通過使用基因槍轉(zhuǎn)化和同源重組實現(xiàn)所構(gòu)建的嵌 合基因在萊茵衣藻(CM"附j(luò)vto附o"flsre/"Aflf浙7)葉綠體基因組中的整合， 其要求轉(zhuǎn)化載體和葉綠體基因組之間的序列同源性(Boynton Wfl/.， 240:1534-1538,1988)。出于此目的，采用了載體p322，其包含用作同源重 組耙標(biāo)的部分萊茵綠藻(C似fl附j(luò);^附""^ M/"/^MYfe7)葉綠體基因組
(Franklin C iV朋Z / ， 30:733-744, 2002 )。如圖4中所示，將嵌合0-75/75" 基因連接至p322的BamHI位點以生成質(zhì)粒pApISAt。通過顆粒轟擊
(Boynton " a/" 5We/ice， 240:1534-1538, 1988 )的方法，將所述pApISAt 構(gòu)建物與包含賦予壯觀霉素抗性(Franklin " "/., /，/aW /.， 30:733-744， 2002 )的經(jīng)修飾16S核糖體基因的質(zhì)粒p228共轉(zhuǎn)化到萊茵綠藻
(CM"附j(luò);^附卵fls r"7i/ifln/故)CC503林的葉綠體中。圖4中的引物N和 C標(biāo)記用于后續(xù)在分離的壯觀霉素抗性轉(zhuǎn)化體中進行PCR篩選的引物的 退火位置。
圖5.提供了對原代轉(zhuǎn)化體進行基因組PCR篩選分析的例子，將所述原 代轉(zhuǎn)化體在包含壯觀霉素的培養(yǎng)基上進行篩選以檢查嵌合基因的 N-末端或C-末端區(qū)域是否存在，從而篩選萊茵衣藻(C. mVi/ifln/故)0-75/^ 轉(zhuǎn)化體。對超過100個萊茵綠藻(《/"附>^ 附< "^ w/"/^/vfc7)的壯觀霉 素抗性轉(zhuǎn)化體集落進行了分離和測試，從中發(fā)現(xiàn)了兩個獨立的林系(#9和 #20 )在其葉綠體DNA中明確包含穩(wěn)定整合的O- 75/^基因。采用 一個壯 觀霉素抗性轉(zhuǎn)化體(#7，未顯示)作為PCR分析的陰性對照，并將pApISAt質(zhì)粒做為陽性對照的^^L。引物N和C代表用于擴增的引物，圖4示出了 它們的退火位置。
用BamHI對來自萊茵衣藻(C7i/fl附j(luò)^o附柳fls ir/"/ifln^/)對照(#7 ) 和推定的O- /^S1轉(zhuǎn)化體#9系的基因組DNA進行消化，并在瓊脂糖^ 上分離，進行Southern印跡分析以檢測0-A/^轉(zhuǎn)基因的完整性。與CV-A/^ 編碼區(qū)的放射性標(biāo)記的Ndel/Xbal片段的雜交鑒定出在0*-/s/^轉(zhuǎn)化體#9 系中特有的 3.0kbp的條帶，而在#7對照系的泳道上沒有觀察到可檢測到 的條帶(圖6A)。這些結(jié)果驗證了在萊茵衣藻(C7f/"附j(luò)^附卵"sfW"/i"nft//) 轉(zhuǎn)化體#9系的葉綠體基因組中穩(wěn)定整合了 0-/s/^，并與PCR分析的結(jié)果 一致(圖5)。對瓊脂糖皿進行溴化乙錠染色(圖6B)以確定有等量的 DNA加載。在轉(zhuǎn)化體#20系中也得到了相似的結(jié)果(未顯示)。
為了證明O-is/^基因表達，用Western印跡分析(圖7)證實了在萊 茵衣藻轉(zhuǎn)基因#9系中Cr-IspS蛋白的積累。采用抗-HA標(biāo)簽抗體U-HA) 檢測重組Cr-IspS蛋白的存在及其細胞濃度。將血凝素(HA)標(biāo)簽的三拷 貝引入至編碼成熟蛋白質(zhì)的OJs/^基因之前的位置(圖7A)，用作檢測 Cr-IspS蛋白積累的方便的表位。在50mMHEPES緩沖液(pH7.0)中， 將萊茵衣藻細胞濃縮至50(^106個細胞/毫升，并用玻璃珠攪拌5分鐘進行 破碎以釋放葉綠體的可溶性級分。用特異性多克隆抗血凝素抗體，對相當(dāng) 于10或20照葉綠體的可溶性蛋白質(zhì)級分進行SDS-PAGE和western印跡 分析。在加載了來自萊茵衣藻(C7ita^to附tm"s m>i/^inft,7)轉(zhuǎn)化體弁9系 的樣品的泳道中約67 kD條帶處觀察到了明顯的抗體蛋白質(zhì)交叉反應(yīng)，但 在對照中(C#7)未觀察到(圖7B)。另外，在約38 kD處也觀察到了抗 體蛋白質(zhì)交叉反應(yīng)，如圖5B中加星號處所示。38kD條帶的Cr-IspS蛋白 的積累可能表示0-75/;5 mRNA翻譯的提前終止，或?qū)λ鲋亟M蛋白質(zhì)的 特異性降解活性。在對照泳道(C#7)中沒有可檢測的67kD或38kD條帶。 對應(yīng)于34kD蛋白質(zhì)的明顯交叉反應(yīng)可能是針對萊茵衣藻(C7i/fl附j(luò);^w卵fls 蛋白質(zhì)的第一或第二抗體的非特異結(jié)合。在轉(zhuǎn)化體#20系中也 檢測到了 Cr-IspS蛋白(未顯示)。
實施例2.用于在藍細菌中生產(chǎn)異戊二烯烴類的Ss-IspS基因的設(shè)計和表
逸
為了在藍細菌中表達產(chǎn)生異戊二烯烴類，基于銀白楊(i^/m似sfl/M)
25的已知異戊二烯合酶IspS蛋白序列生成了調(diào)整了密碼子的合成DNA構(gòu)建物。使用此M酸序列作為模板從頭設(shè)計/sp51 DNA序列用于在藍細菌(如集胞藻(^""/^o;s船sp.))中表達所述基因。根據(jù)集胞藻(5y""/^qv幼:s)PCC 6803的密碼子用法表，調(diào)整了用于在藍細菌中表達基因的密碼子用法，所述密碼子用法表列于以下鏈接http:〃gib.genes.nig,ac.iD/single/codon/main.php spid=Svne PCC6803。
本文中所述調(diào)整了密碼子的基因是指5^-^^。該基因的特征包括(1)密碼子的使用不同于楊樹的密碼子用法，其具體地選擇為適合集胞藻(5y麼c/^o^/s)的密碼子用法；(2)在新的5^-A/^基因的設(shè)計中省略了所述蛋白質(zhì)的楊樹葉綠體耙向序列。所述DNA序列^t設(shè)計成特異性地在藍細菌(如集胞藻(5>mc/^o^&))中編碼異戊二烯合酶蛋白質(zhì)。SEQIDNO: 5的第一段下劃線序列代表(反向互補)P-內(nèi)酰胺酶基因，而第二段下劃線序列是5^/s/^ DNA。另外，斜體序列為起始和終止密碼子，加粗的序列為克隆用限制性位點。在新i殳計的5^-75/^DNA序列的末端引入限制性酶識別位點以幫助克隆所述基因，合成所述整個序列并克隆至載體質(zhì)粒中(圖8)。
將經(jīng)過密碼子優(yōu)化、長度調(diào)節(jié)且化學(xué)合成的5^/s/^基因克隆至集胞藻(5y""/ioo;幼's)的/w^43啟動子區(qū)的下游，與/w^43基因的ATG起始密碼子同一讀碼框。^-A/;5"基因之后是轉(zhuǎn)錄終止子和慶大霉素抗性盒，其后是緊接在戸M5基因下游的集胞藻(5y""力"c^他)序列。
該新的構(gòu)建物允許同源重組，即經(jīng)雙重同源重組通過替換內(nèi)源戶^43基因，DNA序列插入到集胞藻基因組中(圖10)?？梢葬娪脩c大霉素(Gm)作為選擇標(biāo)記來選擇集胞藻(^"ec/^o^/s)轉(zhuǎn)化體，強的啟動子驅(qū)動基因的表達。
為了用5^-/spS構(gòu)建物轉(zhuǎn)化集胞藻(^""/^o^/s )，集胞藻(^""/^o;幼's sp.)細胞生長于存在5 mM葡萄糖的基本BG11生長培養(yǎng)基，直到細胞密度達到約5(^106個細胞/亳升(0073。=0.5)。接著收集細胞并濃縮至101()個細胞/亳升，與pAIGA質(zhì)?；旌嫌糜谵D(zhuǎn)化并孵育4-6個小時，然后將混合物涂布在含BG11的瓊脂平板上的濾膜上，所述平板還含有0.5Hg/mlGm、 0.3%硫代硫酸鈉和10mMTES-NaOH， pH8.0。
將Petri平板在低光密度下保持1-2天，隨后轉(zhuǎn)移到正常生長M。每周一次將濾膜轉(zhuǎn)移到包含慶大霉素的新鮮平板上。分離Gm選擇標(biāo)記存在下形成的菌落，然后重新在新鮮濾膜上劃線，隨后在存在Gm的連續(xù)選擇條件下，將其轉(zhuǎn)移到液體BG11生長培養(yǎng)基中。
實施例3.大腸桿菌中帶組氨酸標(biāo)簽的/幼S的表達
為構(gòu)建在大腸桿菌中表達帶組氨酸標(biāo)簽的/sp5"基因的載體，使用引物IspS一F一NdeI， 5，-CTGGGTCATATGGAAGCTCGACGAA-3'
和IspS_R_HindIII， 5，-ATGGAAAACCTGAAGCTTTTAACGTTCAA-3，；通過PCR^T增經(jīng)過密碼子優(yōu)化用于在藍細菌中表達的DNA,其分別在所U因5'和3，末端引入Ndel-位點和HindlII-位點。使用這些位點將所述基因克隆至pET1529表達載體內(nèi)構(gòu)成栽體pETIspS,所述栽體pETIspS攜帶了位于蛋白質(zhì)N-末端的組氨酸標(biāo)簽(圖11 )。
為了證明在大腸桿菌中重組的帶組氨酸標(biāo)簽的的表達，用pETIspS質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，所絲粒包含5^/s/^基因和位于A-75/^基因5，未端的組氨酸標(biāo)簽編碼DNA。加入0.1 mM IPTG到液體細胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)該His-5^-/s/^基因在大腸桿菌中的成功表達。收集細胞并通過SDS-PAGE和考馬斯染色分析其蛋白質(zhì)含量(圖12 )。證明了攜帶pETIspS質(zhì)粒的所有克隆表達 65 kD的His-5^-7s/^蛋白質(zhì)(圖12， ~ 65 kD條帶)。
釆用經(jīng)過密碼子優(yōu)化而在單細胞綠藻(如萊茵綠藻(C7m附j(luò)7^附o艦sM/"Aanfe7))中表達0-/^75*基因也類似地進行了細菌(如大腸桿菌)中7sp51基因的表達和重組IspS蛋白質(zhì)的積累的相似工作和證明(結(jié)果未顯示)。
本說明書中引用的所有出版物、登錄號和專利申請以引用形式并入本文，每個單獨的出版物或?qū)＠暾埗际蔷唧w地并單獨地指明以引用形式并入本文。
示例性IspS序列
SEQ ID NO:l銀白楊(戶o/7"/ws "/6")異戊二烯合酶的cDNA，登錄號No.AB198180<formula>formula see original document page 28</formula>1021gtaaca^tcsttgatgatatctatgatgtttatggtactctggacgagttggagctattt
1081acagatgctgttgagagatgggatgttaatgccatcaatgatcttccggattatatgaag
1141ctctgcttcctagctctctacaacactatcaatgagatagcttatgacaatctgaaggac
1201ssgggggaaaacattcttccatacctaacaaaagcgtgggcagatttatgcaatgcattc
1261ctacaagaagcaaaatggttgtacaataagcatttgatgactatttcgga
1321aatgcatgga33tC3tCCtCagggcctcttcaactagtttttgcctactttgccgtggtt
1381agaaagaggaaattgaaaacttacaaaagtatcatgataccatcagtagg
1441ccttcccacatctttcgtctttgcaacgacctggcttcagcatcggctgagatagcgaga
1501ggtgaaacagcgaattctgtatcatgctacatgcgtacaaaaggcatttctgaggagctt
1561gctactgaatccgtaatgaacttgatcgacgaaacctggaaaaagatgaacaaagaaaag
1621cttggtggctctttgtttgcaaaaccttttgtcgaaacagCt3tt33CCttgcacggcaa
1681tcccattgcacttatcataacggagatgcgcatacttcaccagacgagctaactaggaaa
1741cgtgtcctgtcagtaatcacagagcctattctaccctttg
SEQ ID NO:2銀白楊(i^/ w/ws 異戊二烯合酶的多肽序列(來自登
錄號No. AB198180 )。所述蛋白的下劃線部分表示葉綠體轉(zhuǎn)運肽。
MATELLCLHRPISLTHKLFRNPLPKVIOATPLTLKLRCSVSTENVSFTETETEARRSAN
DQNGNFLENLKEDIKAILSLYEASFLALEGENILDEAKVFAISHLKELSEEKIGKELAE
ETSRWWRRVGLATKLHFARDRL正SFYWAVGVAFEPQYSDCRNSVAKMFSFVT皿D
IYDVYGTLDELELFTDAVERWDVNA函LPDYMKLCFLALYNTINEIAYDNLKDKGE
NILPYLTKAWADLCNAFLQEAKWLYNKSTPTFDDYFGNAWKSSSGPLQLVFAYFAV
VQNIKKEEffiNLQKYHDTISRPSHIFRLCNDLASASAE證GETANSVSCYMRTKGISE
ELATESV畫LIDETWKKMNKEKLGGSLFAKPFVETAINLARQSHCTYHNGDAHTSP
DELTRKRVLSVITEPILPFER
SEQ ID NO: 3用于在單細胞綠藻中進行轉(zhuǎn)化/表達的Cr-IspS基因和血凝素標(biāo)簽。/s/^核苷酸序列由下劃線"CCA"密碼子開始
說明書第27/32頁
AAAACTAGTTTACATGGTACTGCTTTAAGTTTTCGTTTACTTCGTCAACATGGTTTTGAAG
GGTTATATAATAAATCAACACCAACATTTGATGATTATTTTGGTAATGCTTGGAAAAGTTCATCTGGTCCATTACAATTAGTTTTTGCTTATTTTGCTGTTGTTCAAAATATTAAAAAAGA
TACAGAACCAATTTTACCATTTGAACGTTAA
SEQ ID NO:4用于Oi5/;51異戊二烯合酶基因的多肽序列。下劃線表示血凝素HA標(biāo)簽的三個拷貝。該異戊二烯合酶序列缺少楊樹IspS蛋白序列的葉綠體靶向序列。該IspS序列由"CS......"開始，如字體的改變所示。
FVSSGGFDAVTKTSLHGTALSFRLLRQHGFEVSQEAFSGFKDQNGNFLENLKEDIKAILSLYE ASFLALEGENILDEAKVFAISHLKELSEEKIGKELAEQVNHALELPLHRRTQRLEAVWS正AY
KSSSGPLQLVFAYFAWQNIKKEE正NLQKYHDTISRPSHIFRLCNDLASASAEIARGETANSV
SCYMRTKGISEELATESVMNLIDETWKKMNKEKLGGSLFAKPFVETAINLARQSHCTYHNGD
AHTSPDELTRKRVLSVITEPILPFER
SEQ ID NO:5 5^-/^5 DNA以及用于藍細菌的質(zhì)粒pIspS的核普酸序列。 SEQIDNO:5的第一個下劃線序列表示(反向互補)p-內(nèi)酰胺酶基因，而 第二個下劃線是Ss-IspS DNA。另外，斜體序列A^始密碼子和終止密碼 子，粗體序列是克隆用限制性位點。
>pIspS
gccttctgcttagtttgatgcctggcagttccctactctcgccttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgct cggtcgttcggc仁gcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggata
tccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggac
tctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctgg
31aagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctag
二c
gtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaa agcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggc agcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtc attctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatag
atccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtg
aaataaacaaataggggtc atatggctcataac
ggtccatgrgaagctcgacgaagcgctaattatgaaccaaatagttgggactacgattttctattatcctctgata cggatgagtccat
cgaccgcactcagttttcggctattacgtcaacacggtttcgaagtgagtcaagaggcgtttagtggcttcaaag atcaaaatggcaattttctggaaaacttgaaagaagacacaaaagctatcctaagtttatacgaagctagttttc
aaaagattggcaaagaactcgccgaacaggtaaatcacgccttggaactgcccctccatcgtcgtacccaacgat tggaagctgtgtggagtatcgaagcctatcgcaagaaagaagacgctaaccaagttttgttggaactggccatct tggattataacatgattcaatccgtatatcsigcgcgatctacgtgaaacgtctcggtggtggcggcgtgttgggc tcgctactaaattacattttgcaaaggatcgactcattgaatccttttattgggccgtcggggtggcttttgaac cccagtacagcgattgccgtaattctgtagcaaaaatgttttctttcgttacaattattgatgacatttatgacg tttacggcaccctcgacgaactggaattgttcactgacgctgtggaacgttgggacgtaaatgccattaatgacc tgccagattacatgaagttgtgttttctcgcgttatataacaccattaatgaaattgcatacgacaatttaaagg
tccaactgatttttgcttattttgcggtagtacaaaacattaagaaagaagagattgaaaatttgcaaaagtacc
gtggcgaaacagctaatagtgtgagttgttacatgcgcacaaagggcatttccgaagaactagctacggaaagtg tcatgaacctgattgacgagacttgcaagaaaatgaataaggaaaaattgggcgggtccctatttgccaaaccct
atgaattaacccgtaaacgagttctgtctgtgattactgaacccattttgccctttgaacgttaaaagtaacagg
SEQ ID NO:6來自藍細菌質(zhì)粒的預(yù)期65kD翻譯后Ss-IspS蛋白的^&酸
32序列
1MEARRSANYEPNSWDYDFLLSSDTDESIEVYKDKAKKLEAEVRREI麗EK
51AEFIiTLjIiEIiIDNVQRIjGIiGYRFESDIRRALiDRFVSSGGFDGVTKTSLHAT
101ALjSFRIiljRGHGFEVSQEAFSGFKDQNGNFIiENLKEDTKAIIjSIjYEASFIjA
151LjEGENIIjDEARVFAISHLjKELSEEKIGKELAEQVNHALELPIjHRRTQRIjE
201AVWSIEAYRKKEDANQVIjliELAILDYNMIQSVYGRDLiRETSRWWRRVGIA
251TKLHFAKDRLIESFYWAVGVAFEPGYSDCRNSVAKMFSFVTIIDDIYDVY
301GTLDEIjELFTDAVERWDVNA工NDLPDYMKLCFLALYNTINEIAYDNLKDK
351geni:lpyIjTKAWADLCNAFIjQEAKWLYNKSTPTFDDYFGNAWKSSSGPLG
401LIFAYFAWQNIKKEEIENLQKYHDIISRPSHIFRIjCNDIjASASAEIARG
451ETANSVSCYMRTKGISEEIjATESVMNLIDETCKKMNKEKIjGGSIiFAKPFV
501ETAINLARQSHCTYHNGDAHTSPDELTRKRVLSVITEPIIjPFER*
SEQ ID NO :7山葛膝野變種(i^min'fl附卵," v"r. 涵似)異戊二烯合酶 (IspS);登錄號AY316691 (完整cds.) .atg起始密碼子由下劃線表示， 其表明cDNA的蛋白質(zhì)編碼區(qū)域的起點。1 aatcaatata taatatttac ggaagatttg 61 ccctgcataa aataattgtg gtcaccgtac 121 actagcaagc aaggtataat cattcatcta 181 caattttcgt gtgttttatt ttagtgtcct 241 atggcatcgc aattttagag catatcattg 301 gtctaataaa ttatcgtccc ccacaccaac 361 cttcatcaca caaaaaacat ctcttgccaa 421 gagctctcaa tttacccaaa taacagaaca 481 aaacctctgg aattttgaat ttctgcagtc 541 tatattccag ttaatttttc tttttttctt 601 gaaagtattt tttttatttg cacttttaat 661 tctattcatt ttcaaaattt tacatagaaa 721 attttcatta tttctcaaat caaacggtat 781 cttttaattt tattttttta caataatggg 841 gttatttttt ttttataata ttgttcttat 901 agagaaggca acaaagctag aggaggaggt 961 accattaagc ttactagaat tgatcgacga 1021 tgagaaggac ataatcaaag cccttgagaa 1081 taaaagtgac ctccatgcta ctgctctcag 1141 ggtttcccaa ggtatttatg tatatatatg 12 01 atattatgat tcactgacca tgcatgtggt
12 61 gagggaggtt tcagtggtga acttaaaggt 1321 gcatcctatc ttggctttga gggagaaaat
13 81 acacatctca agaacaacct aaaagaagga 1441 catgcactgg aacttcccta tcatcaaaga 1501 gacaaatatg aaccaaagga accccaccat 1561 ttcaatatgg tgcaaacatt gcaccagaaa 1621 tcaattctca agtaattatt acctcataag 1681 agagatttcc aattaaaaat taacatacga 1741 tactaatgaa atatatgcta ggtggtggac 1801 tgtccgagac agattaatgg aagtgtattt 1861 attcggtgaa tgtcgtaaag ctgtcactaa 1921 tgtatatgac gtttatggta ctttggatga 1981 gttcgtaatt gatttcagtc tcgattcagt 2 041 acttgcgtac atgcatacac acagatggga 2101 catgaagttg tgcttcctag cactttataa
atgcctttcc tgattttaat ttatttttat actgttcttg tcacttggac aagaaatttg aacttatggt gatttattgc cccacctcat tggatcctcg ttccaatata aaaggagaac aaaagtcatg gcaaccaacc ttttatgctt accaagtact agatttccac aaagtaagaa tcccaaacct tggcgagtta tttgtgctac taatagtcgg cgttcagcta attaccagcc tctggaaaat gaccttaagg tgattataca ttgtgatttt taaggaatca tttagtttgg tataaaaatg ttatatcatt ttcacttttt acagtaaatt ttttattttt tttattttct taaagcataa acaaagaaat taatattgtt aacgattata tattaggctg accttaataa tgtaacctaa cgacaggtgg aaaaactaga acgatgcatg atcaacagag tagacacaca tgtccagcgt ctaggattga cctacaagtt tattgttttg ctggatgaga ataagaaaaa cttccgttta cttagacaac atggctttga ttacccactt agcaacatat atatatatat gcagatgtgt ttgagagatt taaggacaag gatgtgcaag ggttgctgag tctatatgaa ctcttggagg aggcaaggac attttcaata ataaacacca aagtggcaga acaagttagt ttgcatagac tagaagcacg atggttcctt cagttactac tcgagcttgc aaagctagat gaactgcaag acctgtcaag gttagaaatt aaattaaata acaataacaa tattgagtgt gaggatcaat atatattctt aggtatgtgg ggagatgggg ctagcaagca agctagactt ttgggcgttg ggaatggcac ctgatcctca aatgtttgga ttggtcacca tcatcgatga gctacaactc ttcactgatg ctgttgagag tggaatttaa ttattgctta attaataata cgtgaatgcc ataaacacac ttccagacta caccgtcaat gacacgtctt atagcatcct2161 taaagaaaaa ggacacaaca acctttccta 2221 atctccttgg ttgattaatt agtttagttt 2281 aatattatat atggatgttg acagtggcgt 2341 aaatggtcga acaacaaaat cattccagca 2401 tcctcctccg gtgtggcttt gcttgctcct 2461 gatatctcag accatgctct tcgttcttta 2521 tgcgtcattt tcagactctg caatgatttg 2581 taattaattt gtaacacttg ttagactaat 2 641 gctgagctag agaggggtga gacgacaaat 2701 ggcacttctg aagagcaagc acgtgaggag 2761 aagatgaacc gagagcgagt ttcagattct 2821 gctgttaaca tggctcgagt ttcgcattgc 2 881 ccagactacg ccacagagaa tagaatcaag 2 941 caactaatgt acgtgtaaca acacaatata 3001 atttcggtgt tgaattaggg gtcaacacag 3061 aatctgataa gagaaaaaaa ataaaaataa 3121 agatatcaag ttt
tttgacaaaa tctgtacata tatactaatt agtttagttg gtatgtcaac acaattaatt gagttatgca aagcattcct tcaagaagca tttagcaagt acctggaaaa tgcatcggtg tcctacttct cagtgtgcca acaacaagaa actgatttcc atggccttgt gcgctcctca gctacctcag cggtgtgtaa ttaattacct atatataggt gtgtctgtta attactacag tcaataatat cttatatgca tgagaatgac ttgagaaaat tgatcgatgc agagtggaag acactactcc caaaagcttt tatggaaata acataccaat atggagacgg acttggaagg ttgctactta tagacccctt tccaatcaat aacacttttc tacaagtata tatttgttta ctatatatac ttcaatggac caactcaacc ggttaggtta actttgtata aatccaagtt
SEQ ID NO:8山葛藤野變種(尸i/^yw7Vi /wo/i似/ifl v"r. /M"似)異戊二烯合酶 多狀序列
MATNLLCLSNKLSSPTPTPSTRFPQSKNFITQKTSLANPKPWRVICATSSQFTQITEHN
SRRSANYQPNL麗FEFLQSLENDLKVEKLEEKATKLEEEVRCMINRVDTQPLSLLELI
DDVQRLGLTYKFEKDIIKALE雨LXDENKKNKSDLHATALSFRLLRQHGFEVSQDV
FERFKDKEGGFSGELKGDVQGLLSLYEASYLGFEGENLLEEARTFSITHLKNNLKEGI
NTKVAEQVSHALELPYHQRLHRLEARWFLDKYEPKEPHHQLLLELAKLDFNMVQTL
HQKELQDLSRWWTEMGLASKLDFVRDRLMEVYFWALGMAPDPQFGECRKAVTKM
FGLVTEDDVYDVYGTLDELQLFTDAVERWDVN趣TLPDYMKLCFLALYNTVNDT
SYSILKEKGHNNLSYLTKSWRELCKAFLQEAKWSNNKIIP馬KYLENASVSSSGVAL
LAPSYFSVCQQQEDISDHALRSLTDFHGLVRSSCVIFRLCNDLATSAAELERGETTNSI
ISYMHENDGTSEEQAREELRKLIDAEWKKMNRERVSDSTLLPKAFMEIAVNMARVS
HCTYQYGDGLGRPDYATENRIKLLLIDPFPINQLMYV
3權(quán)利要求
1. 一種在選自微觀藻類、藍細菌或光合細菌的微生物中生產(chǎn)異戊二烯烴類的方法，所述方法包括向所述微生物中引入包含編碼異戊二烯合酶的核酸的表達盒；和在表達所述編碼異戊二烯合酶之核酸的條件下，培養(yǎng)所述微生物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中所述微生物為微觀藻類，該 微觀藻類是綠藻。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中綠藻選自萊茵衣藻(C/r/fl附j(luò)Wo附o/ifl51 mViAflnfti7 )、斜生掛藻(5cew^/e膽MS1 o緒《wws1 )、 小 球藻(C/r/ore〃" y"/^a".s)或鹽生杜氏藻(Z>M"fl//e〃" sa/zVf")。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述微生物為藍細菌。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4中所述的方法，其中所述藍細菌為集胞藻 (5)7lec^c"ris sp.)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l中所述的方法，其中所述微生物為光合細菌。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6中所述的方法，其中所述光合細菌為深紅紅螺 菌(7 /ro^s/7zW〃M附rM6ra附)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中所述核酸編碼包含SEQID NO: 2之53-595號氨基酸殘基的異戊二烯合酶。
9. 一種選自微觀藻類細胞、藍細菌細胞和光合細菌細胞的微生 物，其中所述微生物包含編碼異戊二烯合酶并與啟動子有效連接的異源 核酸。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的微生物，其中所述微生物為微觀藻類， 該微觀藻類是綠藻。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的微生物，其中所述綠藻選自萊茵衣藻、 斜生柵藻、小球藻或鹽生杜氏藻。
12. 根據(jù)權(quán)利要求9中所述的微生物，其中所述微生物是藍細菌。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12中所述的微生物，其中所述藍細菌為集胞藻。
14. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的微生物，其中所述微生物為光合細菌。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14中所述的微生物，其中所述光合細菌為深紅紅螺菌。
16. 根據(jù)權(quán)利要求9中所述的微生物，其中所述異源核酸編碼包含 SEQIDNO: 2之53-595號氨基酸殘基的異戊二烯合酶。
17. —種在包含編碼異戊二烯合酶之異源核酸的微生物中生產(chǎn)異 戊二烯烴類的方法，該微生物選自微觀藻類、藍細菌、光合細菌和非光 合細菌，所述方法包括在表達所述異戊二烯合酶基因的條件下，在封閉的生物反應(yīng)器中大 規(guī)模培養(yǎng)所述微生物；和收集由所述微生物生產(chǎn)的揮發(fā)性異戊二烯烴類。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述微生物為微觀藻類， 該微觀藻類為綠色微觀藻類。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18中所述的方法，其中所述綠藻選自萊茵衣藻、 斜生柵藻、小球藻或鹽生杜氏藻。
20. 根據(jù)權(quán)利要求17中所述的方法，其中所述微生物為藍細菌。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述藍細菌為集胞藻。
22. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述微生物為光合細菌。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22中所述的方法，其中所述光合細菌為深紅紅 螺菌。
24. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述微生物為非光合細菌。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述非光合細菌為大腸桿 菌(五sr/rer/c/r/fl co// )。
26. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述異源核酸編碼包含 SEQ ID NO: 2之53-595號氨基酸殘基的異戊二烯合酶。
全文摘要
本發(fā)明提供了從微觀藻類、藍細菌以及光合和非光合細菌中生產(chǎn)異戊二烯烴類的方法和組合物。
文檔編號C12N9/02GK101479378SQ200780024683
公開日2009年7月8日 申請日期2007年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月29日
發(fā)明者阿納斯塔西奧斯·梅利斯 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會