專利名稱：通過rt－pcr對核酸的絕對定量的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學。更具體地，本發(fā)明涉及實時PCR方法以及基因表達的絕對定量。
背景技術：
基本PCR技術適用于擴增目的DNA序列。在反轉錄酶PCR(RT-PCR)中，將反轉錄步驟加入PCR方案中。這采用了用于檢測并定量具體mRNA轉錄物的基本PCR方法。因此，RT-PCR適于測定并比較基因表達水平。有用比較的實例包括在單個生物體的不同組織類型中的表達，在不同生物體的相同組織類型中的表達，以及在相同組織類型中應答于實驗處理的表達。定量可以是相對的(即表達為樣品間的倍數(shù)差異)或絕對的(即表達為RNA的實際量)。
歷史上，在反轉錄步驟中合成cDNA以后，在擴增步驟中使得PCR達到適宜的終點，隨后在分離的檢測中實施反應產物的定量(即測定步驟)。在已知為“實時”PCR(或″動力學PCR″)的各種RT-PCR中，擴增步驟與檢測步驟是結合的。PCR產物隨循環(huán)的增加(cycle-by-cycle increase)可進行實時定量。這通過在擴增反應中包括“探針”以及常規(guī)正向和反向引物來實現(xiàn)。在擴增的序列內發(fā)生雜交的所述探針通常為約20-25核苷酸長?？少彽玫腡aqMan探針(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City)CA)包括位于5′末端的熒光報道物部分(染料)和位于3′末端的猝滅部分(染料)。在完整的探針中，報道物的熒光通過猝滅部分的內部猝滅作用而受到強烈抑制。由于發(fā)展的Taq聚合酶的核酸外切酶作用消化經(jīng)雜交的探針，所述報道物不被猝滅，產生可檢測并可定量的熒光。
通過實時PCR定量mRNA可以是相對或絕對的。在每種情況下，樣品中mRNA的定量通過與適宜標準曲線進行參比來進行。如果標準曲線用于相對定量，相對于通常稱作“校準物(calibrator)”的基本樣品(basis sample)表達所述量。對于試驗樣品，從標準曲線確定靶量并除以該校準物的值。因此，所述校準物成為lx樣品，且所有其它量表達為相對與該校準物的n倍差異(n-fold difference)。例如，在關于藥物對基因表達的影響的研究中，未經(jīng)處理的對照可作為適宜的校準物。由于用實驗量除以校準量，標準曲線單位例如熒光強度降低(drop out)。這表示對于相對定量而言，制備適宜的稀釋系列(dilution series)以后，任何含有靶序列的RNA或DNA來源可用于產生標準曲線。
反之，通過實時PCR的mRNA絕對定量需要標準物，其中含靶序列的RNA的絕對定量已知是獨立的。通常，含有包含靶序列的cDNA的質粒必須獲得。含有cDNA(且沒有開放讀框)的該質粒的限制酶切片段通過凝膠純化并進行反轉錄。測定產生的cRNA的A260，并利用所述cRNA制備標準曲線。從A260以及該mRNA的分子量計算互補RNA拷貝數(shù)。這在一種基因或少數(shù)基因的表達被重復測定時幾乎沒有困難，例如在HIV患者的臨床病毒負荷測定時。然而，在大量不同靶必須通過實時PCR定量時，該絕對定量方法非常耗時費力，從而變得不可行。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了獲得用于產生校準用數(shù)據(jù)例如標準曲線的cRNA的方法，所述校準用數(shù)據(jù)用于通過RT-PCR對RNA進行絕對定量。所述方法包括以下步驟(a)提供包含擴增子和位于該擴增子3’的啟動子序列的合成的寡核苷酸；(b)通過該合成的寡核苷酸的體外轉錄合成互補RNA(cRNA)；(c)通過獨立方法定量測定所述cRNA；和(d)利用已知量的cRNA產生校準用數(shù)據(jù)。
優(yōu)選所述啟動子序列是噬菌體啟動子序列。用于本發(fā)明的啟動子序列的實例是T7啟動子序列，例如5′CCTATAGTGAGTCGTATTA3′(SEQ IDNO1)。合成的寡核苷酸可選包括與所述擴增子鄰接的2-20，優(yōu)選8-12個核苷酸的5’側翼序列。本發(fā)明一些實施方案中，所述5’側翼序列含有5-20個連續(xù)的胸腺嘧啶殘基，即寡d(T)區(qū)。合成的寡核苷酸可選包含位于所述擴增子和啟動子區(qū)之間的2-20，優(yōu)選8-12個核苷酸的3′側翼序列。
所述擴增子的長度優(yōu)選30-70個核苷酸，更優(yōu)選40-60個核苷酸。所述合成的寡核苷酸的長度優(yōu)選60-140個核苷酸，更優(yōu)選70-130個核苷酸，80-120個核苷酸或90-110個核苷酸。
本發(fā)明還說明了用于測定受試樣品中具體核酸分子例如具體的RNA轉錄物的豐度的RT-PCR法。所述方法包括以下步驟(a)提供包含擴增子和位于該擴增子3’的啟動子序列的合成的寡核苷酸；(b)通過該合成的寡核苷酸的體外轉錄合成互補cRNA；(c)利用該cRNA產生稀釋系列；(d)通過對該cRNA的反轉錄合成單鏈cDNA；(e)產生RT-PCR校準用數(shù)據(jù)；(g)從受試樣品獲得RT-PCR受試樣品；以及(h)比較PC受試樣品數(shù)據(jù)與PCR校準用數(shù)據(jù)。在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，所述cRNA通過獨立方法例如A260定量測定，并且在合成單鏈cDNA之前與異源RNA例如酵母總RNA混合。
本文術語“擴增子”指在PCR反應中擴增的具體預選出的核苷酸序列。
本文術語“側翼序列(flanking sequence)”指合成的寡核苷酸中與擴增子鄰接的核苷酸序列。5’側翼序列位于所述擴增子5′。3′側翼序列位于所述擴增子的3′。
本文中“PCR校準用數(shù)據(jù)”指利用已知量的、與靶序列相對應的核苷酸序列產生的PCR數(shù)據(jù)，為進行定量將比較該PCR校準用數(shù)據(jù)(calibrationdata)與受試數(shù)據(jù)。所述校準用數(shù)據(jù)可以是相對或絕對的。
本文術語“標準曲線”指校準用數(shù)據(jù)的曲線(通常為半-對數(shù)型)。
本文術語“合成的寡核苷酸”指含有具體核苷酸序列的核酸，其通過合成有機化學而不是酶聚合在活細胞中產生。
本文術語“靶序列”指待檢測的序列，例如目的基因、cDNA或RNA中的序列。
除非另有限定，本文所用所有技術和科學術語具有本發(fā)明所屬領域普通技術人員通常理解的含義。如果有沖突，以本發(fā)明包括定義在內為準。本文涉及的所有公開出版物，專利和其它對比文件都包含在內作為參考。
以下所述材料，方法和實例僅為示例性的，并且不是限制性的。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點從詳細描述和權利要求中也顯而易見。


圖1是本發(fā)明所用的合成的寡核苷酸的總體結構示意圖。圖1所示結果包括可選的5′和3′側翼序列。
圖2用于通過RT-PCR對mRNA進行絕對定量的標準曲線。純化的cRNA經(jīng)過六次連續(xù)1∶10逐級稀釋，并隨后置于(“加入到(spike)”)酵母總RNA背景中。cRNA的每個稀釋度都用于合成cDNA，其可用作RT-PCR的起始模板。以一式四份進行RT-PCR(R2＝.9980)。Ct值(循環(huán)閾值(cyclethreshold))是RT-PCR實驗的輸出(output)。Ct是當反應變?yōu)橹笖?shù)型(exponential)時的循環(huán)數(shù)。當出現(xiàn)這種情況時，該等式為真正的(true)Ct＝2初始量。產生未知樣品和標準品的Ct。未知樣品的Ct值隨后與Ct標準曲線進行比較。
圖3是柱圖，顯示本發(fā)明mRNA絕對定量的結果?；趫D2所示的標準曲線，在來自大鼠肺、肝、腎、心、脾、胸腺、胚胎和腦的組織中確定信使RNA的拷貝數(shù)。
發(fā)明內容本發(fā)明中，已知元件或步驟的新組合已經(jīng)被集合成簡化的方法用于獲得cRNA，所述cRNA用于產生通過RT-PCR對RNA進行絕對定量所用的PCR校準用數(shù)據(jù)。該方法的提高的效率使得其適于在涉及多種不同靶序列的高處理量(high throughput)情況下通過實時RT-PCR對mRNA進行絕對定量。因此，該方法可用于諸如基本生物研究和藥物發(fā)現(xiàn)程序的情況。
本發(fā)明優(yōu)選避免了任何獲得含有包含所述靶序列的cDNA的質粒的需要。此外，本發(fā)明避免了產生并純化含有所述cDNA(并且沒有其它可讀框)的質粒的限制酶切片段的需要。該擴增是聯(lián)合利用合成的寡核苷酸與體外轉錄步驟的結果。體外轉錄步驟以后，可在修飾后或不加修飾地使用傳統(tǒng)的實時PCR法。對于體外轉錄步驟以后的各個步驟的各個方面的詳述，通常見PCR Protocols in Molecular Toxicology，1997，CRC Press.See also，Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，1989，Cold SpringHarbor Press。
如果通過體外轉錄獲得的RNA將用于產生用于RNA的絕對定量的PCR校準用數(shù)據(jù)，對在體外轉錄步驟中獲得的樣品RNA進行定量測定。這可例如通過測定RNA溶液在260nm的吸收(A260)來進行。A260值可轉化成RNA濃度值，所述濃度值可基于計算的所涉及RNA分子的分子量轉化成拷貝數(shù)。
合成的寡核苷酸的設計是本領域熟練技術人員的能力范圍內。通常，所述合成的寡核苷酸含有擴增子，啟動子序列以及可選的擴增子-側翼序列(圖1)。合成的寡核苷酸的核苷酸序列有賴于這樣的考慮，包括擴增子序列、靶序列中該擴增子的側翼序列以及啟動子序列選擇。
所述擴增子的長度不重要。優(yōu)選所述擴增子的長度為30-70個核苷酸。更優(yōu)選，所述長度為40-60個核苷酸。具體擴增子在PCR系統(tǒng)中的擴增通過設計并合成適宜的正向引物和適宜的反向引物來實現(xiàn)。PCR引物的設計和合成是本領域已知的，引物設計軟件，試劑和工具都是可購得的。這種商業(yè)化軟件的實例是PrimerExpress(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)。
5′側翼序列和/或3′側翼序列可以以與所述擴增子相鄰的方式被包括。優(yōu)選，所述側翼序列都被包括。所述側翼序列如果存在，其序列和長度不同?？蛇x側翼序列的長度不重要。優(yōu)選每種側翼序列為2-20個核苷酸，更優(yōu)選8-12個核苷酸。側翼序列的核苷酸序列不重要。例如，其可設計為與靶基因雜交，但這種互補性不是必要的。在本發(fā)明一些實施方案中，所述合成的寡核苷酸中的5’側翼序列包括聚T尾(poly T tail)或由聚T尾組成。這導致隨后產生的cRNA中的相應聚A尾，其可用于引發(fā)反轉錄反應。適宜聚T(聚A)尾的長度為5-20個核苷酸，優(yōu)選約16個核苷酸。
啟動子序列被摻入合成的寡核苷酸。任何在體外轉錄反應中所用反應條件下有效起作用的啟動子序列可使用。噬菌體啟動子序列通常用于體外轉錄反應。用于本發(fā)明的啟動子的具體實例是T7，SP6和T3啟動子。優(yōu)選的T7啟動子序列是T7啟動子序列，例如5′CCTATAGTGAGTCGTATTA3′(SEQ ID NO1)。本領域技術人員將認識到啟動子末端不總是清楚地限定，且天然存在的啟動子序列中可出現(xiàn)較小改變并同時通?？杀Ａ?或甚至改進)啟動子功能。適宜的啟動子序列的選擇和摻入可通過本領域技術人員在適當實驗中進行。適合用于本發(fā)明的啟動子序列通常可購得。
合成的寡核苷酸的總長度(即包含擴增子，啟動子，以及可選擴增子側翼序列)必須足夠短以允許化學合成并足夠長以允許體外轉錄。在大多數(shù)情況下，所述長度為60-140個核苷酸。優(yōu)選所述長度為70-130個，80-120個或90-110個核苷酸。
合成的寡核苷酸的確切序列根據(jù)在上述亞序列組分方面進行的具體選擇來設計。一旦設計出，合成的寡核苷酸可通過本領于技術人員利用已知方法，材料和儀器來合成。適用于本發(fā)明的合成寡核苷可購得，例如購自Biosearch Technologies，Inc.(Novato，CA和Invitrogen，Inc.(Carlsbad，CA)。
應理解本發(fā)明涉及通常可用的分析法。因此，本發(fā)明并非對任何具體靶序列，擴增子或合成的寡核苷酸特異。
用于本發(fā)明的合成的寡核苷酸可通過任何適宜合成法獲得。用于合成具有超過100個核苷酸的預定序列的寡核苷酸的方法、材料和儀器是本領域已知的。見例如Cheng等，2002，Nucleic Acids Research 30(18)e93。用于本發(fā)明的常規(guī)合成的(custom-synthesized)寡核苷酸可購得，例如購自Biosearch Technologies Inc.(Novato，CA)；Invitrogen(Carlsbad，CA)。所述合成的寡核苷酸的純化可利用常規(guī)技術獲得，例如反相HPLC。合成的寡核苷酸的序列可通過標準測序技術確定。
本發(fā)明的體外轉錄步驟可利用已知方法和材料進行。所需產量的獲得可包括優(yōu)化的反應條件，所述條件用于在存在高核苷以及聚合酶濃度時的RNA合成。用于實施體外轉錄步驟的試劑以及試劑盒時可購得的。適宜的商業(yè)化試劑盒為MEGAshortscript T7試劑盒(Ambion，Inc.，Austin，TX；cat.#1354)。部分單鏈模板可用于體外轉錄反應。例如，與T7啟動子互補的引物可用于產生短的雙鏈區(qū)，T7聚合酶可與該區(qū)結合并啟動轉錄?？蛇x，雙鏈模板可使用。例如，可使得引物與合成的寡核苷酸的啟動子區(qū)退火并用DNA聚合酶例如Klenow片段延長它。隨后純化產生的雙鏈模板并用于體外轉錄。在不同的雙鏈模板法中，與合成的寡核苷酸互補的完整的第二條鏈可被合成并發(fā)生退火。cRNA產物可作為單個種類獲得。這可通過例如凝膠電泳證實。
cRNA的正確連續(xù)稀釋是產生可信的標準曲線所需的。制備和定性RNA標準品通常參見Collins等，1995，Analytical Biochemistry 226120-129。優(yōu)選的載體RNA是濃度約25ng/ml的酵母總RNA(Ambion，Inc.，Austin，TX；cat.#7118)。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中，cDNA的合成可在傳統(tǒng)的反轉錄反應中實現(xiàn)。用于反轉錄反應的方法和材料是本領域已知的。見Sambrook等(上述)。用于反轉錄反應的試劑盒可得自各商業(yè)渠道，例如High Capacity cDNAArchive Kit(Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)。
本發(fā)明還通過以下實施例說明。所述實施例完全為舉例目的。它們不限制本發(fā)明的范圍和內容。
實施例引物，探針設計和寡核苷酸模板Taqman正向和反向引物以及5′FAM標記的MGB探針利用PrimerExpress(Applied Biosystems)從Affymetrix共有序列設計。用于體外轉錄的寡核苷酸模板可如下構建向所述擴增子的5′和3′末端添加基因特異性序列的10個堿基對，然后將T7啟動子區(qū)加入3’10堿基對的外部，所述T7啟動子由5′CCTATAGTGAGTCGTATTA 3′(SEQ ID NO1)組成。
利用合成的寡核苷酸的體外轉錄利用部分單鏈寡核苷酸模板的體外轉錄反應是利用可購得的試劑盒(T7-MEGAshortscript Kit，Ambion Inc.，Austin，TX)實施的。部分單鏈模板通過使T7引物(5′AATTTAATACGACTCACTATAGG 3′)，其僅與等摩爾量(20uM)的合成的寡核苷酸模板中的T7啟動子區(qū)(在10mMTris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA，0.1 MNaCl)中)互補，加熱至95℃、5分鐘并冷卻至室溫。部分單鏈模板(1.5反應濃度)用于根據(jù)生產商(Ambion Inc.，Austin，TX)的方案，在37℃進行體外轉錄反應4小時。寡核苷酸模板DNA通過在37C加入2U無RNase DNase 1(Ambion Inc.，Austin，TX)并保持15分鐘而去除。通過加入20μl甲酰胺(50％v/v)、渦旋并在95C加熱3分鐘終止反應。體外轉錄反應通過利用可購得的試劑盒根據(jù)售出商(vendor)推薦的方案進行純化(MEGAclear KitTM，Ambion)。
cRNA的濃度通過測定260nm的uv吸收確定。cRNA的質量通過使150ng等分試樣在10％TBEurea聚丙烯酰胺(BioRad，Inc.，Hercules，CA)上進行電泳來評估。
合成用于標準曲線的cDNA在大小分級凝膠(sizing gel)上產生正確大小的單個帶的RNA制備物被加入(添加入(spike))酵母的經(jīng)剪切的RNA。首先，對cRNA進行8次連續(xù)1∶10的逐級稀釋。每個稀釋度的等分試樣被加入酵母的經(jīng)剪切的RNA(1μg/μL)(Ambionlnc.，Austin，TX)背景。在8個相應反轉錄反應(100pL)中產生的互補DNA利用10μg加入的酵母總(sheared)RNA作為模板。該反轉錄反應利用可購得的試劑盒根據(jù)售出商(High-CapacitycDNA Archive Kit，Applied Biosystems)推薦的方案進行。
從試驗樣品合成cDNA來自肺、肝、腎、心、脾、胸腺、胚胎和腦的大鼠總RNA(10Rg)(Ambion，Inc.)用作cDNA合成反應的模板，所述反應利用反轉錄試劑盒根據(jù)試劑盒售出商(High CapacitycDNA Archive Kit，Applied Biosystems)提供的方案進行。來自每種cDNA合成反應的1μl等分試樣(100ng總RNA起始模板)用作每個定量RT-PCR反應的試驗樣品。
Taqman熱循環(huán)一式四份的PCR反應(用于標準和試驗樣品)在96孔板中混合，轉入384-孔光板(optical plate)(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)。實時反應在標準7900HT熱循環(huán)儀(model 7900HT thermal cycler)(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)中循環(huán)。熱循環(huán)儀的條件為50℃、2分鐘(尿嘧啶N-去糖基酶消化)；95℃、10分鐘(Taq熱穩(wěn)定聚合物酶的活化)；以及利用900nM正向和反向引物，200nM Taqman MGB探針以及1X Universal master mix(Applied Biosystems)在95℃ 15秒、60℃ 60秒進行40個循環(huán)。在每個反應孔中，在整個反應過程中每7秒鐘測定熒光發(fā)射。從利用所述標準品獲得的PCR數(shù)據(jù)產生標準曲線(圖2)。
利用序列檢測軟件(Sequence Detection Software)(Applied Biosystems)，通過與cRNA標準曲線比較，測定每個實驗樣品的轉錄物量。多種實驗樣品的拷貝數(shù)通過比較實驗樣品PCR數(shù)據(jù)與標準曲線而獲得?？截悢?shù)結果在圖3中總結。
其它實施方案見權利要求。
序列表<110>Allaire，Normand比奧根艾迪克MA公司(BIOGEN IDEC MA INC.)<120>通過RT-PCR對核酸的絕對定最<130>2159.034PC01<140>PCT/US2003/036522<141>2003-11-14<150>10/294,781<151>2002-11-14<160>1<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成<223>合成<400>1cctatagtga gtcgtatta 19
權利要求
1.產生用于通過RT-PCR對RNA進行絕對定量的校準用數(shù)據(jù)的方法，所述方法包括(a)提供合成的寡核苷酸，其包含擴增子和位于該擴增子3’的啟動子序列；(b)通過該合成的寡核苷酸的體外轉錄合成互補RNA(cRNA)；(c)通過獨立方法定量測定所述cRNA；以及(d)利用已知量的cRNA產生校準用數(shù)據(jù)。
2.權利要求1的方法，其中所述啟動子序列是噬菌體啟動子序列。
3.權利要求2的方法，其中所述噬菌體啟動子序列是T7啟動子序列。
4.權利要求3的方法，其中所述T7啟動子序列主要由5′CCTATAGTGAGTCGTATTA 3′(SEQ ID NO1)組成。
5.權利要求1的方法，還包含5’側翼序列，所述5’側翼序列由與所述擴增子鄰接的2-20個核苷酸組成。
6.權利要求5的方法，其中所述5’側翼序列由8-12個核苷酸組成。
7.權利要求5的方法，其中所述5’側翼序列包含聚T尾。
8.權利要求1的方法，其中所述合成的寡核苷酸還包含3′側翼序列，所述3’側翼序列由在所述擴增子和所述啟動子之間的2-20個核苷酸組成。
9.權利要求8的方法，其中所述3′側翼序列由8-12個核苷酸組成。
10.權利要求1的方法，其中所述擴增子的長度為30-70個核苷酸。
11.權利要求10的方法，其中所述擴增子的長度為40-60個核苷酸。
12.權利要求1的方法，其中所述合成的寡核苷酸的長度為60-140個核苷酸。
13.權利要求12的方法，其中所述合成的寡核苷酸的長度為70-130個核苷酸。
14.權利要求13的方法，其中所述合成的寡核苷酸的長度為80-120個核苷酸。
15.權利要求14的方法，其中所述合成的寡核苷酸的長度為90-110個核苷酸。
16.測定受試樣品中核酸分子的豐度的方法，所述核酸分子包含擴增子，所述方法包括(a)提供合成的寡核苷酸，其包含擴增子和位于該擴增子3’的啟動子序列；(b)通過該合成的寡核苷酸的體外轉錄合成cRNA；(c)利用該cRNA產生稀釋系列；(d)通過該cRNA的反轉錄合成單鏈cDNA；(e)產生RT-PCR校準用數(shù)據(jù)；(g)從受試樣品獲得RT-PCR受試樣品；以及(h)比較PCR受試樣品數(shù)據(jù)與PCR校準用數(shù)據(jù)。
17.權利要求16的方法，還包括對所述cRNA進行定量。
18.權利要求17的方法，還包括在合成所述單鏈cDNA以前將所述cRNA與異源RNA進行混合。
全文摘要
公開了獲得用于產生校準用數(shù)據(jù)例如標準曲線的cRNA的方法，所述校準用數(shù)據(jù)用于通過RT－PCR對RNA進行絕對定量。所述方法包括以下步驟提供包含擴增子、位于該擴增子3’的啟動子序列的合成的寡核苷酸；通過該合成的寡核苷酸的體外轉錄合成互補RNA(cRNA)；通過獨立方法定量測定所述cRNA；以及利用已知量的cRNA產生校準用數(shù)據(jù)。
文檔編號C12P19/34GK1759190SQ200380107504
公開日2006年4月12日 申請日期2003年11月14日 優(yōu)先權日2002年11月14日
發(fā)明者諾曼德·E·阿萊爾 申請人:比奧根艾迪克Ma公司