專利名稱：植物中藥用的重要蛋白質(zhì)的瞬間制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在植物中大量瞬時生成蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
醫(yī)藥學(xué)上重要的重組蛋白質(zhì)通常是用微生物或哺乳動物宿主進行表達的。微生物系統(tǒng)通常在克隆和轉(zhuǎn)染細胞的速度上有優(yōu)勢。然而異種基因產(chǎn)物的量通常很高，所累積的產(chǎn)物常無生物活性，而需要高價及困難的重新折迭(re-folding)使之成為活性物質(zhì)。再者，許多在細菌類中的轉(zhuǎn)譯后修飾與在真核類中的是不同的，所以某些蛋白質(zhì)在原核系統(tǒng)中無法正確表達。
使用雜合系統(tǒng)表達醫(yī)藥學(xué)上重要蛋白質(zhì)的主要問題是由克隆基因開始到產(chǎn)生足夠量可用于相關(guān)動物模型的功能性蛋白質(zhì)所需要的時間。在多數(shù)系統(tǒng)中，這個時間可為數(shù)月至一年或更久。除了費時外，在細胞培養(yǎng)中重組蛋白質(zhì)的瞬時制造(例如，藉由COS或CHO細胞的瞬時轉(zhuǎn)染或藉由昆蟲細胞培養(yǎng)的桿狀病毒感染)通常需要特殊的設(shè)備而且該種細胞及病毒的操作也需要特殊的技術(shù)。此外，除非完成大規(guī)模制備過程，否則所取得的蛋白質(zhì)的量通常非常少(毫微克至微克量)，而大規(guī)模制備則更昂貴且需要特殊的設(shè)備及訓(xùn)練。
從1980年后期，已有多種示例揭示可在農(nóng)作物中具有成本效益地表達外來或異種蛋白質(zhì)。特別是近年來，植物成為單克隆抗體及其它醫(yī)藥學(xué)上重要蛋白質(zhì)的制造和表達系統(tǒng)。植物具有非常類似于動物細胞的蛋白質(zhì)合成途徑，而主要差異在于蛋白質(zhì)的糖化作用(glycosylation)(Fischer and Emans，Transgenic Res.9279-299(2000)；Cabanes-Macheteau，et al.，Glycobiology9365-72(1999))。此外，一些感興趣的蛋白質(zhì)已顯示在植物中能累積至高濃度。又，植物來源的抗體在功能上與藉由雜交瘤制造的抗體相同(Fischer and Emans，supra，(2000))。最后，植物來源的抗體和蛋白質(zhì)不含有其它系統(tǒng)中經(jīng)純化得來的重組蛋白質(zhì)所具有的人類或動物病原體或純化后的血源性病原體及致癌性序列(Fischer and Emans，supra(2000))。
重組蛋白質(zhì)可在轉(zhuǎn)基因植物中藉由穩(wěn)定的整合基因制備。另一種產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法是使用由異種基因形成的瞬時表達系統(tǒng)。已有多種系統(tǒng)可用于基因克隆、質(zhì)粒構(gòu)建、啟動子等，這些系統(tǒng)的最終目的是表達重組蛋白質(zhì)。特別是，原生質(zhì)粒(protoplast)的電穿孔法(electroporation)及粒子轟炸法(particle bombardment)已被廣泛使用，病毒載體也在一定程度上被應(yīng)用。
粒子轟炸法通常僅能到達少數(shù)細胞，而且為了完成轉(zhuǎn)錄，DNA必需到達細胞核(Christou，Plant Mol.Biol.35197-203(1996)；Fischer and Emans，spura(2000))。利用藉由滲入法(infiltration)傳送的農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)(農(nóng)桿菌-滲入法)可顯著地將外來基因傳送至較多數(shù)目的細胞。此外，帶有T-DNA的感興趣基因在細菌蛋白質(zhì)的協(xié)助下能有效地轉(zhuǎn)移至核(Kapila et al.，Plant Sci.122101-108(1997)；Fischer andEmans，supra(2000))。粒子轟炸法及農(nóng)桿菌-滲入法兩者皆在處理后3至5天內(nèi)產(chǎn)生異種基因表達，而病毒傳送需要2至4周。粒子轟炸法的使用對于瞬時表達不是非常有效但是對于轉(zhuǎn)基因谷類作物的再生更為重要(Christou，supra(1996)；Fischerand Emans，supra(2000))。
用經(jīng)修飾的病毒載體轉(zhuǎn)染可使病毒在多數(shù)植物細胞中廣泛擴散。導(dǎo)入基因酶細胞質(zhì)中病毒RNA復(fù)制酶(replicase)轉(zhuǎn)錄后翻譯為興趣蛋白。由于病毒復(fù)制期間濃度倍增，所以目標基因會在重組病毒載體中高濃度表達(Porta and Lomonssoff，Mol.Biotechnol.5209-21(1996))。然而，此系統(tǒng)通常限制蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量小于60至70Kd。
用于瞬時表達的農(nóng)桿菌-滲入法有數(shù)種優(yōu)勢。此方法在數(shù)天內(nèi)制造興趣蛋白質(zhì)而且蛋白質(zhì)生產(chǎn)量足以用于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性及蛋白質(zhì)功能的檢測(Fischer and Emans，supra(2000))。已有人提出農(nóng)桿菌-滲入法無須用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的植物而能放大制造數(shù)十毫克重組白質(zhì)。然而，報導(dǎo)的表達濃度(Fischer andEmans，supra(2000))并不實用于任何大規(guī)模研究，例如需要更大量蛋白質(zhì)(10至100毫克)的活體內(nèi)動物模型。
農(nóng)桿菌-滲入法用于瞬時表達最早是Kapila提出的。(Kapila et al.，supra(1997))經(jīng)開發(fā)后用于快速測定具有植物組織抗病性的蛋白質(zhì)的功能。由于全部的植物組織可用于生物檢定所以蛋白質(zhì)無須為此應(yīng)用而經(jīng)純化。
此系統(tǒng)后來用于表達醫(yī)藥學(xué)上重要的蛋白質(zhì)(Vaquero etal.，Mol.Biotechnol.5209-21(1996))。抗人類瘤胚源性抗原的嵌合抗體及抗相同抗原的重組單鏈抗體經(jīng)生產(chǎn)、純化、生化分析顯示類似動物來源蛋白質(zhì)。然而，此系統(tǒng)的產(chǎn)量仍相對較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一個無須植物生長設(shè)備，應(yīng)用現(xiàn)有的市售的植物來制造蛋白質(zhì)的更完善的方法。此方法非?？焖俚囊宰畹突ㄙM合成一定數(shù)量的，適用于動物中測試、多重分析、結(jié)晶結(jié)構(gòu)的認定、蛋白質(zhì)修飾的分析等的生物功能性蛋白質(zhì)。此方法可用于一次蛋白質(zhì)的生產(chǎn)量最少約為1毫克，至少約5毫克，至少約10毫克的生產(chǎn)。
本發(fā)明能很容易地有穩(wěn)定規(guī)模地提供滿足重復(fù)測試及醫(yī)藥學(xué)上蛋白質(zhì)的功能性評估所需要的毫克量蛋白質(zhì)。
本發(fā)明提供用于單克隆抗體及其它醫(yī)藥學(xué)上重要蛋白質(zhì)的瞬時表達的方法及試劑盒。此方法特別成功的應(yīng)用于含有整合到有或無病毒調(diào)節(jié)序列的質(zhì)粒上的興趣基因的根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)以真空-滲入的方式在萵苣中制造蛋白質(zhì)。
一方面，本發(fā)明提供的細菌/植物融合表達系統(tǒng)能非?？焖偾揖咭?guī)模的制造每公斤10至50mg/kg的蛋白質(zhì)。在優(yōu)選方面，一或多種異種基因經(jīng)由解毒或有毒的農(nóng)桿菌株傳送至植物組織。優(yōu)選的是，植物組織來自已生長的植物(例如從售貨店得到的植物)。植物組織特別優(yōu)選的來源為萵苣。本發(fā)明披露的方法具有在細菌系統(tǒng)中快速進行基因克隆和操作以及在能為準確地定靶、增殖、修飾及裝配提供所需環(huán)境的真核細胞中進行蛋白質(zhì)制造的雙重優(yōu)勢，而且無須種植植物或應(yīng)用轉(zhuǎn)基因植物。
一方面，帶有異種基因或興趣基因表達結(jié)構(gòu)的農(nóng)桿菌細胞被用于將異種基因傳送至植物組織并植物組織的細胞中及/或細胞間隙瞬時表達。一般而言，合適的表達結(jié)構(gòu)包含至少一個T-DNA邊緣序列，表達控制序列(例如，可誘導(dǎo)的，和/或組織特異性的，或可構(gòu)建的啟動子)，和一個可操作連結(jié)至表達控制序列的興趣基因。另一方面，表達結(jié)構(gòu)為載體部分，其含有一或多個復(fù)制起點，至少含有適合于在農(nóng)桿菌中復(fù)制含有表達結(jié)構(gòu)載體的一個復(fù)制起點。
培養(yǎng)的含有表達結(jié)構(gòu)的農(nóng)桿菌細胞系在表面活性劑存在下滲入植物組織。優(yōu)選地，滲入在真空下發(fā)生。在能使表達結(jié)構(gòu)在多種植物細胞中表達蛋白質(zhì)的適宜條件下孵育植物組織后，將蛋白質(zhì)從細胞中分離。為了取得約500微克至500毫克的產(chǎn)量，本方法僅需要單循環(huán)地將植物組織與含有載體的農(nóng)桿菌接觸，使載體滲入植物組織及表達異種蛋白質(zhì)。然而，想放大產(chǎn)量就要進行額外的循環(huán)。優(yōu)選地，在本方法的單循環(huán)中使用更多植物組織。
所使用的農(nóng)桿菌可為野生型(例如有毒性的)或無毒的。每種表達不同基因的多種農(nóng)桿菌株可用來制造單獨的蛋白質(zhì)或異源多體蛋白質(zhì)(例如抗體)或再生途徑，例如代謝途徑、化學(xué)合成途徑或信號途徑?？蛇x擇的是，或者為單一的農(nóng)桿菌株可含有含有不同異種基因的多個序列。不同的異種基因可包含于單一核酸分子內(nèi)(例如單一載體)或可由不同的載體提供。一方面，至少一種農(nóng)桿菌株包含根瘤土壤桿菌。
由于本發(fā)明提供了表達異種蛋白的高產(chǎn)量的表達系統(tǒng)(high throughput system)，此系統(tǒng)能用于測定基因和/或興趣蛋白質(zhì)(protein of interest)的變異對于蛋白質(zhì)功能的影響。一方面，為了評估大量變異的異種蛋白質(zhì)，大多數(shù)的表達結(jié)構(gòu)是在細菌中，使用標準的分子生物技術(shù)(例如隨機突變(randommutagenesis)，組合克隆技術(shù)(combinatorial cloning techniques)等制造的，含有編碼實質(zhì)上同一蛋白質(zhì)(例如同一性超過約50％，優(yōu)選的同一性超過75％相同，更優(yōu)選的同一性超過約90％或95％相同)的核酸，而且能使用根據(jù)本發(fā)明的瞬時表達系統(tǒng)制造用以快速篩選其生物活性。另一方面，大多數(shù)表達結(jié)構(gòu)包含的變異編碼序列約大于100、約大于500、約大于1×103、約大于1×104、約大于1×105、約大于1×106、約大于1×107、約大于1×108、或約大于1×109。
大多數(shù)的表達結(jié)構(gòu)可包含在異種多肽的編碼序列中含有隨機或半隨機變異的序列庫。此序列庫可為基于大腸桿菌的序列庫(亦即各個序列庫中成員系在大腸桿菌中經(jīng)克隆及復(fù)制)或基于農(nóng)桿菌的序列庫(亦即各個序列庫中成員系在農(nóng)桿菌中經(jīng)克隆及復(fù)制)或其結(jié)合(亦即克隆可在大腸桿菌中開始進行而序列庫成員后續(xù)地可導(dǎo)入農(nóng)桿菌細胞以進行進一步的復(fù)制及/或克隆)。在植物組織中瞬時表達后檢測序列庫各個成員的多肽功能，例如鑒定多肽是否適合較大規(guī)模的制造及/或在轉(zhuǎn)基因植物中制造。
優(yōu)選方面，此方法用于將多-次單元蛋白質(zhì)復(fù)合體的交互次單元組件(interacting subunit elements；ISEs)的功能最適化以使活性及/或結(jié)合部最適化。例如，為了最適化抗體結(jié)合部，在細菌中使用標準分子生物技術(shù)(例如隨機突變(randommutagenesis)，組合式選質(zhì)技術(shù)(combinatorial cloningtechniques)等)制備大量的具有抗體可變區(qū)的變異體。優(yōu)選的是，能制造約大于1×103、約大于1×104、約大于1×105、約大于1×106、約大于1×107、約大于1×108或約大于1×109的變異表達結(jié)構(gòu)。適當(dāng)?shù)目勺儏^(qū)序列包括抗體的輕鏈(lightchain；LC)，或重鏈(heavy chain；HC)，或輕鏈與重鏈兩者。分析含有這些序列的變異多肽中對選定抗原的特異的結(jié)合部位。變異多肽可包括全長抗體或其抗原結(jié)合片段(scFv，F(xiàn)ab’等)。不同的變異體可依前述而穩(wěn)定地克隆至農(nóng)桿菌載體上，且能快速測定HC及LC的所有結(jié)合。優(yōu)選的，測定為平行發(fā)生。
本方法能用于最合適于在生長的植物中蛋白質(zhì)表達的預(yù)篩選表達載體。一方面，本方法用于快速篩選不同的表達控制序列和/或翻譯控制序列，從而提供了最適的蛋白質(zhì)表達?；蛘撸么朔椒êY選編碼具有較高穩(wěn)定性的或其它需要的醫(yī)藥學(xué)特性的蛋白質(zhì)的序列。
本發(fā)明也提供有用于進行本方法的試劑盒。一方面，根據(jù)本發(fā)明的需要，試劑盒包括至少適用于一種農(nóng)桿菌種，例如根瘤土壤桿菌，表達的克隆/表達載體，一或多種用于從植物中滲入、萃取及/或純化所要異種蛋白質(zhì)的成分。另一方面，該試劑盒包含一或多種細菌菌株(例如大腸桿菌及根瘤土壤桿菌)。進一步，該試劑盒含有具有編碼變異異種序列的核酸的表達結(jié)構(gòu)。


本發(fā)明的目的及特征可參照下列的詳細說明及附圖而更加了解。
圖1A及1B為根據(jù)本發(fā)明一方面使用于植物組織的共滲入的質(zhì)粒pSUNP1及pSUNP2的示意圖。質(zhì)粒pSUNP1表達來自O(shè)CS3MAS啟動子的hOAT的重鏈而pSUNP2表達輕鏈。使介于TR及TL之間的所有基因移動至植物核的T-DNA邊緣被表示出來。帶有各質(zhì)粒的農(nóng)桿菌用于共-滲入植物例如萵苣中，而產(chǎn)hOAT的瞬時表達。
圖2為在植物組織中由單一質(zhì)粒藉由瞬時表達而用于表達hOAT的重鏈及輕鏈兩者的雙基因表達質(zhì)粒pSUNP4的示意圖。
圖3顯示從含有hOAT重鏈及輕鏈基因的農(nóng)桿菌滲入的萵苣中萃取的蛋白質(zhì)的溶離剖面圖。蛋白質(zhì)被施用至蛋白質(zhì)A管柱而被溶離。
圖4顯示根據(jù)本發(fā)明，蛋白質(zhì)被施用至Q瓊脂糖管柱的溶離剖面圖。所施用的蛋白質(zhì)由圖3所示的蛋白質(zhì)A管柱所得溶離液收集。
圖5A顯示在還原條件下，根據(jù)本發(fā)明所取得的hOAT蛋白質(zhì)分離液進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并且經(jīng)科麥西藍(coomassie-blue)染色的膠片。第1欄，分子量(Mr)標準品；第2欄，純化的CHO制造的hOAT；第3欄，在萵苣中表達，經(jīng)蛋白質(zhì)A管柱溶離的hOAT。圖5B顯示根據(jù)本發(fā)明，以抗H+L抗體為探針對經(jīng)SDS-PAGE-分離的蛋白質(zhì)進行蛋白質(zhì)印跡雜交。A欄，市售的IgG；B欄，純化的蛋白質(zhì)A灌注得到的hOAT；C欄，陰性對照-來自無農(nóng)桿菌-滲入的萵苣萃取液。
圖6顯示不同濃度的蔗糖對于萵苣中hOAT的表達濃度的滲入性干擾的效果。hOAT表達以每公斤用于萃取的萵苣原料所制造的抗體毫克數(shù)(以ELISA為基準)表示。
具體實施例方式
本發(fā)明提供利用在已生長，市售可得的植物中得到制造蛋白質(zhì)的方法及提供在短時間內(nèi)獲得用于生物分析中所需要量的異種蛋白質(zhì)的問題的新的技術(shù)方案。本發(fā)明的方法提供使用于需要至少約50微克至100毫克蛋白質(zhì)的分析，例如藥物篩選，蛋白質(zhì)特征化、結(jié)合分析以及動物測試的生物活性異種蛋白。
本發(fā)明的一方面，此方法包括將含有編碼異種蛋白質(zhì)的序列或其生物活性片段的表達結(jié)構(gòu)導(dǎo)入植物組織，而后在植物組織中瞬時的表達蛋白質(zhì)。此編碼序列系可操作地連結(jié)至能在植物組織細胞中及/或細胞間隙驅(qū)動編碼序列轉(zhuǎn)錄的表達控制序列。優(yōu)選地，表達結(jié)構(gòu)包含至少一個來自大的腫瘤引發(fā)(Ti)質(zhì)粒的T-DNA的T邊緣序列。同時，優(yōu)選地，表達結(jié)構(gòu)包含能在至少一種農(nóng)桿菌種中，例如根瘤土壤桿菌，復(fù)制的載體。一方面，植物組織包括來自己生長的植物(例如取得售貨店的植物)的葉組織。優(yōu)選地，此植物包含相對大的葉片(例如，在一維中至少大過約3英時)，例如該植物是萵苣(Lactuca sativa)。
定義以下是使用于下列敘述說明中的特有名詞的定義。
除非文中特別指明，使用于說明書及權(quán)利要求書中的，單數(shù)形式的「一」(a)、「一」(an)及「該」(the)包含復(fù)數(shù)的意思。例如術(shù)語「細胞」包含多個細胞的含義，包含其混合物。術(shù)語「蛋白質(zhì)」含有多數(shù)蛋白質(zhì)的含義。
用于本文的術(shù)語「植物細胞」包含植物細胞或經(jīng)分離的或半分單離的細胞?！钢参锝M織」包含植物的經(jīng)分化或未經(jīng)分化的組織，包含但不限于，根、莖、葉、花粉、及種子。
用于本文的「植物材料」包含其經(jīng)處理的衍生物，包含但不限于食品、食品原料、食品補充劑、萃取物、濃縮物、藥丸、菱形劑、可嚼組成物、粉末、配方、糖漿、糖果、餅干、膠囊及錠劑。
用于本文的「多次單元蛋白質(zhì)」為含有超過一種分開的多肽或蛋白質(zhì)鏈彼此結(jié)合形成復(fù)合體的蛋白質(zhì)，其中至少有兩種分開的多肽由不同基因編碼。優(yōu)選的，多次單元蛋白質(zhì)至少包含抗體的免疫活性部分而因此能特異地與抗原結(jié)合。例如，多次單元白質(zhì)能包含抗體分子的重鏈及輕鏈或其部分。多重抗原結(jié)合部分可由不同結(jié)構(gòu)基因編碼而產(chǎn)生多價抗體。
對于醫(yī)藥學(xué)產(chǎn)品而言，術(shù)語「充分地純化」一般是指至少90％純化，更優(yōu)選的為至少95％純化及最優(yōu)選的為至少98％純化的產(chǎn)品。
「間質(zhì)性液體」(interstitial fluid)意指由不為質(zhì)膜(plasmalemma)，亦即細胞表面膜，所包圍的所有植物區(qū)域獲得的萃取物。此術(shù)語意欲包含非細胞內(nèi)的所有液體、物質(zhì)、區(qū)域或間隔(其中細胞內(nèi)系定義為細胞膜內(nèi)的內(nèi)含物)，且包含無須顯著的細胞溶解藉由由質(zhì)膜釋放的分子。此術(shù)語的同意詞包含，但不限于「外漿」(exoplasm)、「非原質(zhì)粒」(apoplasm)、「細胞間液」(intercellular fluid)、「細胞外液」(extracellularfluid)及「吐水液」(guttation fiuid)。
術(shù)語「啟動子」系指位于基因的5’端而直接啟動基因的轉(zhuǎn)錄核苷酸序列。一般而言，為驅(qū)動連結(jié)基因的表達，啟動子序列是必要的，但不一定足夠。在啟動子/異種基因組合的結(jié)構(gòu)中，該基因的位置相對于啟動子要足夠接近且有恰當(dāng)?shù)姆较?，因而能藉由啟動子序列控制基因的表達。啟動子優(yōu)選的定位于基因的上游而且距離轉(zhuǎn)錄起始點有一定的距離，從而使啟動子及基因間的距離控制在接近其天然的設(shè)定中。正如已知的，在此距離中的一些變異不致使啟動子的功能有損失。如用于文中的術(shù)語「可操作連接」意指將啟動子連結(jié)至編碼區(qū)域以使該編碼區(qū)域的轉(zhuǎn)錄為該啟動子所控制和調(diào)節(jié)。將啟動子可操作性與編碼區(qū)域連結(jié)的方法已被本領(lǐng)域所公知。
用于文中的「表達控制序列」包括啟動子及還可包括，但不限于一或多個增強序列、轉(zhuǎn)錄終止序列、多腺嘌呤化序列、3’或5’非翻譯序列、內(nèi)含子(intronic)序列、核糖體結(jié)合位置及其它在植物細胞中能穩(wěn)定或者控制基因表達的序列。表達控制序列可為內(nèi)源的(亦即天然地在植物宿主中發(fā)生的)或外源的(并非天然地在植物宿主中發(fā)生的)。外源的表現(xiàn)序裂可為或不為植物序列因而其僅在經(jīng)選擇的條件下在植物細胞中有功用。
「異種基因」或「異種編碼序列」是指對于要被轉(zhuǎn)化或被處理的植物而言為外源的，或并非天然的，而且編碼「異種多肽」或其生物活性片段。異種基因序列包括病毒的、原核的、及真核的序列。原核編碼序列包括，但不限于，微生物序列(例如生產(chǎn)作為疫苗應(yīng)用的抗原的序列-病毒序列也能用于此目的)。真核編碼序列包括哺乳類序列，但也包括來自非哺乳類序列，甚至其它植物，包括但不限于引導(dǎo)或分泌信號序列、目標序列等。優(yōu)選的，異種基因核酸可編碼人類蛋白質(zhì)。術(shù)語「異種基因」或「異種編碼序列」包括，但不限于，天然發(fā)生的、經(jīng)突變的、變異的、化學(xué)合成的、組基因的、cDNA、或該等序列的任何組合。而「基因」是指全長的基因或其編碼生物活性蛋白質(zhì)的片段。
用于文中的術(shù)語「蛋白質(zhì)」通常指由基因編碼的完整的氨基酸序列，或其經(jīng)加工或修飾的形式或其生物活性片段(例如多肽或者肽)。
「融合蛋白質(zhì)」是指含有至少兩個不同氨基酸序列的連結(jié)于多肽的蛋白質(zhì)，其序列組合并非天然地表現(xiàn)位單一蛋白質(zhì)。
用于文中的「T DNA邊緣」(T DNA border)是指含有約25個核苷酸長序列而能被諸如根瘤土壤桿菌(A.tumefaciens)或生根土壤桿菌(A.rhizogenes)等農(nóng)桿菌株的有毒性基因產(chǎn)物識別的DNA片段，或其經(jīng)修飾或突變的形式，而且足以能用于轉(zhuǎn)移DNA序列至其所連結(jié)的真核細胞，優(yōu)選的為植物細胞的。此定義包括，但不限于，來自野生型Ti質(zhì)粒的所有天然的T-DNA邊緣，及其功能性衍生物，以及化學(xué)合成的T-DNA邊緣。一方面，本發(fā)明的表達結(jié)構(gòu)的編碼序列及表達控制序列位于兩T-DNA邊緣之間。
植物種類用于瞬時表達的農(nóng)桿菌滲入法的早期應(yīng)用系為楊樹(poplar)及豆科植物(Phaseolus)(Kapila，et al.，1997)，而后延伸至煙草，(Vaquero，et al.，1999)而楊樹及豆科植物兩者為快速發(fā)明提供了合適的植物組織來源。其它適合的植物包括，但不限于萵苣、苜宿、綠豆、菠菜、蒲公英、菊苣(radicchio)、芝麻菜(arugula)、苣菜(endive)、菊苣茅菜(escarole)、野苦苣(chicory)、朝鮮薊、玉米、馬鈴薯、米、大豆、十字花科(Crucifra)(例如芥藍菜(Brassica)，芥末(Arabidopsis))、浮萍、蕃茄及煙草。芥藍菜家族的示例包括，但不限于B.oleracea(例如包心甘藍、羽衣甘藍(collards)、花椰菜、綠花椰菜、茅甘藍(brussel sprouts)、芥藍菜(kale)、球莖甘藍(kohlrabi))；B.campestris(例如白菜、小白菜、結(jié)球白菜、包心白菜、西伯利亞甘藍、蕪菁、芥末、歐洲油菜(rape)、蕪菁甘藍(rutabaga)及蘿卜)；Brassicajuncea(例如棕與印度芥菜)；Brassica carinata(例如地中海芥菜，Abyssinian Mustard)；油菜(蕪菁甘藍(Rutabaga)、蕪菁(Swede或Swede Turnip)、西伯利亞甘藍、焊諾瓦色拉(Hanover Salad)、油菜)；Brassicanigra(例如黑芥末)；Rorippa nasturtium-aquatkum(例如西洋菜)等。特別優(yōu)選的植物原料的來源為萵苣。適合的萵苣植物包括，但不限于包被萵苣(Butterhead)、抱合萵苣(Crisphead)及葉萵苣(例如橡葉、色拉碗、修飾紅葉(frilly Read Leaf)及波狀綠葉(crinkly Green Leaf)。其它典型的萵苣種已被周知和描述，例如在http://www.thompson-morgan.com/seeds/us/list lettuce2.html優(yōu)選的，適合的植物為整年中皆從市售可得而且能支持可連結(jié)于表達控制序列的報導(dǎo)基因(例如GUS)的高濃度瞬時表達。用于文中的「高濃度瞬時表達」意指在每公斤植物組織上至少能表達約250微克、至少約500微克、至少約750微克、至少約1毫克、至少約2毫克、至少約3毫克、至少約4毫克、至少約5毫克、至少約10毫克、至少約15毫克、至少約25毫克、至少約50毫克、至少約75毫克、至少約100毫克、至少約150毫克、至少約200毫克、或至少約500毫克。用于文中的「瞬時」意指長到足以允許從植物組織中分蛋白質(zhì)的一段時間。優(yōu)選的，將表達結(jié)構(gòu)導(dǎo)入植物組織后，蛋白質(zhì)表達適當(dāng)?shù)母邼舛戎辽僖诩s1天內(nèi)、至少約2天、至少約3天、至少約4天、至少約5天。在一方面，將表達結(jié)構(gòu)導(dǎo)入植物組織后，適合地高濃度可在3至7天內(nèi)獲得而更優(yōu)選的為3至5天內(nèi)。
合適的植物組織一般指植物的任何部分。優(yōu)選的，植物組織為葉組織。一方面，植物組織為來自含有一維中至少約3英時的葉片的植物的葉組織。然而，葉的大小并無限定而且在某方面，此方法用于在阿拉伯芥中獲得瞬時蛋白質(zhì)表達。
另一方面，要選擇其細胞中含有少量或不含分解異種蛋白質(zhì)的蛋白酶的植物組織，否則，從表達異種蛋白質(zhì)的核酸導(dǎo)入到由植物組織分離蛋白質(zhì)的時間內(nèi)，少于約5％、少于約1％、少于約0.1％的在植物中表達的異種蛋白質(zhì)被蛋白酶分解。蛋白酶的濃度可用常規(guī)的方法加以分析，如異種蛋白質(zhì)表達的蛋白質(zhì)斑點印跡法。
本發(fā)明的一個特別優(yōu)勢為可用已生長的植物作為植物組織來源，包括已采收及經(jīng)儲存至少約1天、至少約2天、至少約5天、至少約1周或至少約2周的植物。因此植物組織可由任何一般商品店獲得。
因為萵苣容易取得而且提供高濃度的異種蛋白質(zhì)表達、具有穩(wěn)定性及功能性，所以萵苣特別合適提供葉組織來源以用于本發(fā)明的方法。此外，萵苣細胞含有非常低量的辨認異種蛋白質(zhì)的蛋白酶。在多種適合使用的萵苣中，特別優(yōu)選的為紅葉表現(xiàn)型(red leaf phenotype)。在萵苣中除了觀察到異種蛋白質(zhì)的高濃度表達以外，使用葉萵苣的另一優(yōu)勢為此植物在無須特別設(shè)計的裝置下能容易的長出易于操作的葉片。
玉米為最廣泛的用于由穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)醫(yī)藥蛋白質(zhì)的農(nóng)作物。應(yīng)用玉米，異種蛋白質(zhì)可產(chǎn)生并被儲存于種子中。然而，玉米難以被轉(zhuǎn)化，生產(chǎn)周期長而且難以在室內(nèi)產(chǎn)生種子。玉米為能極大的受益于瞬時表達系統(tǒng)的農(nóng)作物。目前相當(dāng)普及的使用農(nóng)桿菌進行玉米轉(zhuǎn)化，根據(jù)本發(fā)明的瞬時表達系統(tǒng)藉由處理玉米胚牙能加速由玉米生產(chǎn)蛋白質(zhì)的制造而能快速地評估及確認玉米衍生的異種蛋白質(zhì)的使用性及功能。
表達框在本發(fā)明的優(yōu)選的具體實例中，萵苣的野生型、變異或經(jīng)修飾的品種(例如，轉(zhuǎn)基因萵苣)經(jīng)處理而由所欲的DNA結(jié)構(gòu)表達興趣基因。該等結(jié)構(gòu)至少含有連結(jié)至支持基因的轉(zhuǎn)錄及最終蛋白質(zhì)的翻譯的啟動子及/或其它調(diào)控單元(亦即表達控制序列)的編碼所需蛋白質(zhì)的核酸序列。
一方面，表達結(jié)構(gòu)設(shè)計為含有下列連結(jié)在5’至3’的方向的啟動子，基因及終止子。另一方面，基因結(jié)構(gòu)包括連結(jié)在共同質(zhì)粒上或共-轉(zhuǎn)化至植物(該共轉(zhuǎn)化結(jié)構(gòu)包含于文中的名詞「基因結(jié)構(gòu)」)上的多個編碼區(qū)域。多種基因可編碼為分開的順反子(cistron)或為聚順反子單位的一部份。另一方面，基因結(jié)構(gòu)包含一或多個IRES單元。
基因結(jié)構(gòu)不需要含有選擇標記也不需要形態(tài)學(xué)上正常穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因植物的制造所需要的欠缺「腫瘤誘發(fā)」基因的DNA結(jié)構(gòu)。
蛋白質(zhì)藉由此發(fā)明而制造的蛋白質(zhì)并無預(yù)先的限制，然而本發(fā)明特別適用于在經(jīng)調(diào)控及可再現(xiàn)的條件下制得某些蛋白質(zhì)。特別是，包括用于在制造過程中必須使用優(yōu)良藥品制造規(guī)范(GoodManufacturing Practices)及認證方法的醫(yī)藥上及/或診斷上蛋白質(zhì)的所有類別。
因為有些蛋白質(zhì)是使用于人類直接攝取、注射或施用(例如局部施用)，在營養(yǎng)醫(yī)學(xué)保健或醫(yī)學(xué)美容上的用途的等蛋白質(zhì)也可被表達。用于相似經(jīng)調(diào)控的獸醫(yī)產(chǎn)品制造上的蛋白質(zhì)也可被表達。
可制造的蛋白質(zhì)的示例包括，但不限于生長因子(例如血小板增生因子(platelet-derived growth factor)、類胰島素生長因子等)，受體，配體，信號分子；激酶，酶，激素，腫瘤抑制子(tumor suppressors)，血液凝集蛋白質(zhì)，細胞周期蛋白質(zhì)-端粒(telomerases)，代謝蛋白質(zhì)，神經(jīng)蛋白質(zhì)，心肌蛋白質(zhì)，在特殊疾病狀態(tài)缺乏的蛋白質(zhì)，抗體，T-細胞受體(TCR)，主要組織兼容性復(fù)合物(major histocompatibility complexes；MHC)，抗原，對疾病提供抗性的蛋白質(zhì)，抗微生物蛋白質(zhì)，干擾素，及細胞激動素(cytokines)。
一方面，抗原編碼序列包括用于引發(fā)保護性免疫反應(yīng)的序列(例如使用于疫苗配方中)。該等適合的抗原包括但不限于微生物抗原(包括病毒抗原、細菌抗原、真菌抗原，寄生蟲抗原等)；來自多細胞生物的抗原(例如多細胞寄生蟲)；過敏原；及與人類或動物病理相關(guān)的抗原(例如癌癥、自體免疫疾病等)。在優(yōu)選方面，病毒抗原包括但不限于HIV抗原；對于天花給予保護性免疫反應(yīng)的抗原(例如疫苗病毒抗原)；炭疽抗原；狂犬病抗原等。疫苗抗原可分為多價多肽或多肽，例如在表達結(jié)構(gòu)中含有不同的或相同的重復(fù)抗原編碼序列，而且選擇地由一或多個連結(jié)子序列加以分開。
植物也可用于表達生產(chǎn)用于化學(xué)合成或用于工業(yè)合成的酵素途徑的一個或多個基因。
一方面，核苷酸序列是經(jīng)選擇以編碼所欲的蛋白質(zhì)，其中該核苷酸序列經(jīng)設(shè)計提供對于萵苣或植物為較佳的密碼子，該密碼子的選擇不會減低在瞬時系統(tǒng)的表達低于有用濃度，最后能用于所需蛋白質(zhì)的大規(guī)模制造。對于數(shù)種植物的密碼子使用的特征已可被公開且被敘述于Wada等人的著作「Codon UsageTabulated From The GenBank Genetic Sequence Data 」NucleicAcids Research19(Supp.)1981-1986(1991)。
如下所述，在一方面，本發(fā)明提供表達多種重組蛋白質(zhì)的方法。該等蛋白質(zhì)可由獨立結(jié)構(gòu)的共滲入而表達或由敘述于下的聚順反子(polycistronic)表達單位而表達。該等蛋白質(zhì)包括為了具有生物活性而需要多種結(jié)構(gòu)基因協(xié)調(diào)表達的蛋白。一方面，蛋白質(zhì)需要多個次單元的組裝而成為活化的。另一方面，蛋白質(zhì)未成熟形式被制造而需要處理，例如蛋白質(zhì)切割，或藉由一或多個外加蛋白質(zhì)而修飾(例如磷酸化、糖化、核糖化、乙?；?、法呢基化(farnesylation)等)而成為活化的。
該等蛋白質(zhì)的非限制示例包括異二元(heterodimeric)或異多元(heteromultimeric)蛋白質(zhì)，例如T細胞受體，主要組織兼容性抗原分子，或免疫球蛋白超家族(immunoglobulinsuperfamily)的其它蛋白質(zhì)(包括片段及單鏈變異體)，核酸結(jié)合蛋白質(zhì)(例如復(fù)制因子、轉(zhuǎn)錄因子等)，酶，抗體酶(abzymes)，受體(特別是可溶受體)，生長因子，細胞膜蛋白質(zhì)，分化因子，類血紅素蛋白質(zhì)，多元激酶等。
本發(fā)明的優(yōu)選方面，表達框編碼人類蛋白質(zhì)(亦即表達于人類的蛋白質(zhì))或編碼含有人類多肽區(qū)域的非人類蛋白質(zhì)。
較優(yōu)選的，表達框編碼一或多個單克隆抗體的基因。該等基因可由鼠類，人類及/或其它動物源取得?；蛘撸摰然蚩山?jīng)合成的，例如編碼抗體分子的重鏈或輕鏈組成份的基因的嵌合或修飾的形式。在結(jié)構(gòu)上編碼區(qū)域的次序，例如先重鏈而后輕鏈，或先輕鏈而后重鏈并不重要。用于編碼重及輕鏈多肽的基因(例如可變化重鏈及可變化輕鏈域(domian)多肽)可衍生自產(chǎn)生IgA、IgD、IgE、IgG或IgM的細胞。為了克隆免疫球蛋白可變化區(qū)域的基因而制備組DNA片段的方法已為此領(lǐng)域的人們熟知。參見示例，Herrmann等人的Methods in Enzymol.152180-183(1987)；Frischauf的Methods in Enzymol.152183-190(1987)；Frischauf的Methods in Enzymol152199-217(1987)。在如下所述的一個優(yōu)選的例子中，該等基因編碼聚順反子單位的一部份。
調(diào)控因子產(chǎn)生特別結(jié)構(gòu)的適合的調(diào)控因子是基于所表達的重組蛋白質(zhì)形式來選擇的。一般而言，希望能在滲入的植物組織中高濃度表達的蛋白質(zhì)。
植物啟動子所使用的基因結(jié)構(gòu)可包括基因或其編碼生物活性蛋白質(zhì)片段部分的所有基因物質(zhì)。優(yōu)選的，編碼序列與表達控制序列相連結(jié)。表達控制區(qū)域包括例如啟動子，增強子，IRES單元等序列。表達控制序列能被外來刺激引發(fā)表達，如添加特別營養(yǎng)素或藥劑，改變溫度等，也能經(jīng)設(shè)計為在植物組織的滲入及/或培養(yǎng)中立即及/或自發(fā)地表達編碼蛋白質(zhì)。
因此，構(gòu)成的或被調(diào)控的啟動子能控制編碼所欲蛋白質(zhì)的基因表達。啟動子可為經(jīng)環(huán)境信號調(diào)控者，或藉由化學(xué)引發(fā)劑或抑制劑而被控制者，而且該等藥劑可為天然或合成的，啟動子也可為天然起源或經(jīng)設(shè)計的。啟動子也可為嵌合的，亦即使用來自兩個或多個不同的天然或合成的啟動子的序列的衍生者。
優(yōu)選的，使用于結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生基因的高表達濃度的啟動子，容許蛋白質(zhì)的累積在每公斤植物組織中(亦即葉組織生質(zhì)量)至少約250微克、至少約500微克、至少約750微克、至少約1毫克、至少約2毫克、至少約3毫克、至少約4毫克、至少約5毫克、至少約10毫克、至少約15毫克、至少約25毫克、至少約50毫克、至少約75毫克、至少約100毫克、至少約150毫克、至少約200毫克、或至少約500毫克。
本發(fā)明中，優(yōu)選的為阿拉伯芥Actin 2啟動子，OCS3(MAS)啟動子，CaMV 35S啟動子，及玄參科鑲嵌(figwort mosaic virus)病毒34S啟動子。然而，其它構(gòu)成的或可引發(fā)的啟動子也能使用。例如，泛肽(ubiquitin)啟動子能由數(shù)種類克隆而用于植物中(例如，向日葵(Binet et al.，Plant Science 7987-94(1991)；及玉米(Christensen et al.，Plant Molec.Biol.12619-632(1989))。此外有用的啟動子為來自玉米的U2及U5snRNA啟動子(Brown et al.，Nucleic Acids Res.178997(1989))及來自酒精脫氫酶(alcohol dehydrogenase)的啟動子(Dennis etal.，Nucleic Acids Res.123983(1984))。
另一方面，經(jīng)調(diào)控的啟動子可操作連接至基因。經(jīng)調(diào)控的啟動子包括，但不限于，藉由外部影響的啟動子(例如藉由化學(xué)藥品、光線、溫度等外部藥劑的應(yīng)用)或藉內(nèi)部調(diào)控的啟動子，例如藉由植物的發(fā)育改變調(diào)控的啟動子。經(jīng)調(diào)控的啟動子有利于誘導(dǎo)所需基因的高濃度表達，特別是在、或接近收集的時間。其特別適用于當(dāng)所需蛋白質(zhì)會限制或抑制植物生長時，或所需的蛋白質(zhì)為某些不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)時。當(dāng)期望將表達結(jié)構(gòu)使用于轉(zhuǎn)基因植物的制造及瞬時表達分析中時，該等啟動子是所希望的。
在不同植物組織中控制轉(zhuǎn)基因表達的植物啟動子已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(Gasser & Fraley，Science 2441293-99(1989))?；ㄒ髓偳恫《?cauliflower mosaic virus)35S啟動子(CaMV)及CaMV啟動子的增強衍生物(Odell et al.，Nature，3(13)810(1985))，肌動蛋白啟動子(McElroy et al.，Plant Cell 2163-71(1990))，AdhI啟動子(Fromm et al.，Bio/Technology 8833-39(1990)，Kyozuka et al.，Mol.Gen.Genet.22 840-48(1991))，泛肽啟動子，玄參科鑲嵌病毒啟動子，甘露堿合成酵素(mannopine synthase)啟動子，胭脂堿合成酵素(nopaline synthase)啟動子及章魚堿(octopine)合成酵素啟動子及該等的衍生物皆為構(gòu)成性啟動子(consitutivepromoters)。經(jīng)調(diào)控啟動子被描述為光可引發(fā)者(例如雙磷酸核酮糖羧化酵素(ribulose biphosphatecarboxylase)啟動子的小次單元)，熱休克啟動子，硝酸鹽及其它化學(xué)性可引發(fā)啟動子(參照，例如美國專利編號5,364,780；及5,777,200)。
當(dāng)表達植物特定部分的蛋白質(zhì)時可使用組織特異性啟動子。葉特異性啟動子可包括35S增強子(Sheen，EMBO，123497-505(1993))之前的C4PPDK啟動子或任何其它特異性在葉中表達的啟動子。
一般而言，任何植物可表達的基因結(jié)構(gòu)皆合適使用于本發(fā)明的方法。根據(jù)所表達的重組蛋白質(zhì)的類型可選擇特別的啟動子。
本發(fā)明特別有趣的為衍生自O(shè)CS增強子多重單位的啟動子及衍生自MAS的核啟動子使用，而其中的OCS及MAS來自農(nóng)桿菌(Gelvin等人的美國專利號5,955,646)。在滲入及以植物荷爾蒙2，4-D處理后該啟動子顯示特別強烈，在高濃度時也可用作除草劑。
定位序列(Targeting Sequences)優(yōu)選的，表達產(chǎn)物以植物細胞中的特定位置為靶標，例如細胞膜、細胞外間隙或胞器例如葉綠體的色質(zhì)粒。優(yōu)選的，表達產(chǎn)物以細胞外間隙為靶標，因此在細胞內(nèi)液分離的基礎(chǔ)上而純化蛋白質(zhì)。參照，美國專利號6,096,546，美國專利號6,284,875及WO 0,009,725。
蛋白質(zhì)能藉由定位序列而定位于次細胞或細胞間位置。在某些情況下氨基酸序列是從多肽的氨基末端部分合成而在移位(translocation)或定位以后或其間藉由蛋白質(zhì)分解酶而裂解。例如，在真核生物中蛋白質(zhì)分泌途徑的模型是在核糖體結(jié)合至mRNA后而初生多肽鏈(nascent polypeptide chain)開始翻譯。假定蛋白質(zhì)的目的是用于分泌，則蛋白質(zhì)的氨基端會辨識信號辨識粒子(signal recognition particlel；SRP)而在mRNA、核糖體及SRP復(fù)合體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplastic reticulum；ER)接合(dock)時引來翻譯的暫時延遲。在接合后，雖然此時多肽鏈是共同位于ER腔，但恢復(fù)翻譯。
用于在內(nèi)膜系統(tǒng)中使蛋白質(zhì)至定位在濾泡中或用于分泌的信號序列在植物及動物中是相似的。信號肽可根據(jù)標準技術(shù)而適用于本發(fā)明(例如以合適端制備用于任何其它基因架構(gòu)內(nèi)克隆)。
一方面，編碼所欲蛋白質(zhì)的表達框包含融合至編碼所欲蛋白質(zhì)的信號序列構(gòu)架內(nèi)的信號序列。優(yōu)選的，信號序列能將基因表達產(chǎn)物指引導(dǎo)至分泌途徑。
由于抗體常常為分泌蛋白質(zhì)，在成熟抗體分子的制造中分泌步驟扮演重要角色。為能在植物中完成此步驟，合成或以他法取得(例如克隆)的基因或具有哺乳類固有的編碼區(qū)域信號肽，或以融合形式連結(jié)至興趣基因，在此融合形式中，植物分泌信號肽被信號肽所取代。信號肽及蛋白質(zhì)的融合應(yīng)為藉由植物處理的，而此蛋白質(zhì)的所得氨基端與人類宿主中所產(chǎn)生者相同。此外定位于葉綠體也是可預(yù)期的。
在一個優(yōu)選的具體例子中，使用來自網(wǎng)蛋白(calreticulin)信號序列(Borisjuk et al.，Nature Biotechnology17466-69(1999))。一個更優(yōu)選的具體例子是使用來自蕃茄的枯草酶(subtilase)序列(Janzik et al.，2000)。已經(jīng)證實該等植物信號肽足以將外來蛋白質(zhì)定位至植物的外質(zhì)粒間隙(參照例如Janzik et al.，2000)。其它植物蛋白質(zhì)信號肽也可使用例如經(jīng)敘述的大麥(淀粉酶(α-amylase)，During et al.Plant MolecularBiology15287-93(1990)；Schillberg et al.TransgenicResearch8255-63(1999))。
對于那些一般需要氨基端加工以達其成熟的蛋白質(zhì)而言，定位蛋白質(zhì)于植物內(nèi)膜系統(tǒng)為本發(fā)明的較優(yōu)選例，因為由此能提供蛋白質(zhì)氨基端合適的成熟度。此外，假定感興趣的蛋白質(zhì)具有或經(jīng)重組過而帶有額外的定位信息則可定位至內(nèi)膜系統(tǒng)的特定區(qū)域(參照例如敘述于Voss et al.，Mol Breeding139-50(1995)；During et al.，Plant Mol.Biol.15281-93(1990)；Baum et al.，Mol.Plant-Microbe Interact.9382-87(1996)；DeWilde et al.，Plant Sci.114231-41(1996)；Ma et al.，Immunology24131-38(1994)；Schouten et al.，Plant Mol.Biol.30781-93(1996)；Firek et al.，Plant Mol.Biol.23861-70(1993)；Artsaenko et al.，Plant J.8745-50(1995)；Conrad &Fiedler，Plant Mol.Biol.38101-09(1998))。
由于定位于如質(zhì)粒(例如葉綠體及線粒體)等細胞器是藉由氨基端信號序列所指令而后續(xù)地進行裂解作用的，因此定位于此區(qū)域也有利于達成所需的氨基端成熟。在一個優(yōu)選的具體例子中，信號肽指引表達產(chǎn)物至質(zhì)粒(例如葉綠體)或其它次細胞器。例如α核糖-雙磷酸羧化酵素的小的次單元的瞬時肽(Khoudi et al.，Gene197343-5(1997))。過氧化體定位序列(peroxisomal targeting sequence)意指任何能將蛋白質(zhì)定位至過氧化體的肽序列，可為N-端、內(nèi)部或C-端，例如植物C-端靶標三肽SKL(Banioko et al.，Plant Physiol.1071201-08(1995))。
此外，或者作為定位蛋白至特定次細胞的替代方式，一方面，將「抗原決定基標志」(epitope tags)及/或端點特異裂解點(site-specific cleavage site)加入以而設(shè)計融合蛋白質(zhì)。該等標志的功效在于能提供便利的純化機制。例如，可將含有來自生物素(biotin)用于結(jié)合抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)的重要氨基酸的小肽設(shè)計于感興趣的基因的5’端。則新合成的蛋白質(zhì)可以基于生物素抗生蛋白鏈菌素的結(jié)合被許多已知方法獲得。如果欲從蛋白質(zhì)移除類-生物素肽，也能利用蛋白質(zhì)分解酶辨認點。蛋白質(zhì)分解酶辨認點可以被插入到「抗原決定基標志」序列的下游，而就在編碼所需蛋白質(zhì)的成熟形式的序列前。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解抗原決定基標志及蛋白酶具有多種選擇(例如Xa因子、煙草蝕紋病毒蛋白酶(Tobacco Etch VirusProtease)、腸激酶(enterokinase)等)而較佳點及蛋白酶的選擇可取決于有疑問的特定蛋白質(zhì)胺基酸及DNA序列。
如前所述，啟動子、增強子、IRES單元、及信號序列等調(diào)控單元的選擇，一般而言取決于所表達蛋白質(zhì)的類型。例如，一方面，某些用于制造IgG的較佳結(jié)構(gòu)會包括具有5’OCS3MAS啟動子枯草酶(任何生物)信號肽用于編碼IgG重鏈成熟區(qū)域的基因翻譯中止信號轉(zhuǎn)錄中止及聚腺苷酸化序列，及含有前述相似成分的第二個結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)以輕鏈基因取代重鏈基因(亦即，兩載體，如用于本文的二重(binary)或雙(dual)載體)的結(jié)構(gòu)。或者，在另一優(yōu)選的具體例子中，重鏈及輕鏈基因位于相同DNA結(jié)構(gòu)。在另一具體例子中，重鏈及輕鏈基因在相同DNA結(jié)構(gòu)上由相同啟動子表達而以IRES單元分開。
其它序列表達結(jié)構(gòu)可為一部分表達載體及額外的所欲的序列例如細菌的復(fù)制起點(bacterial origins of replication)(農(nóng)桿菌及/或大腸桿菌復(fù)制起點)，能在例如細菌如農(nóng)桿菌及/或植物細胞中作用的報導(dǎo)基因(reporter gene)(例如GUS、GFP、EGFP、BFP、β-半乳糖(β-galactosidase)及其改質(zhì)型式)及可選擇標記基因(例如抗生素抗性基因等)。使用于本發(fā)明方法中的外來DNA也可包含標記基因，其能在起初的克隆階段中分離經(jīng)轉(zhuǎn)化細胞與未經(jīng)轉(zhuǎn)化細胞。該標記基因通常編碼蛋白質(zhì)使能由表現(xiàn)型而分辨經(jīng)轉(zhuǎn)化細胞與未經(jīng)轉(zhuǎn)化細胞。在植物中，可選擇性標記基因也可編碼某種除草劑抗性蛋白質(zhì)，如該等除草劑包含谷氨酸合成酵素抑制劑，例如草丁膦(phosphinothricin)(參照例如EP 0 242 236；EP 0 242 246；De Block et al.，1987，EMBO J.62513-2518)。然而，根據(jù)本發(fā)明，瞬時蛋白質(zhì)制造方法具有不需要標記基因而由經(jīng)導(dǎo)入表達結(jié)構(gòu)/載體的植物組織中分離異種蛋白質(zhì)的優(yōu)點。
能融合至編碼異種蛋白質(zhì)的序列的其它序列包括，但不限于卷曲(coiled-coil)序列(如述于Martin et al.，EMBO J.13(22)5303-5309(1994))；微體(minobody)序列或組成最小微抗體互補區(qū)域的序列(參見Bianchi et al.，J.Mol.Biol.236(2)649-59(1994))；穩(wěn)定序列、二聚作用序列、連結(jié)子序列、十四烷基化(myristilation)序列(參見如述于美國專利公開編號2002/0146710)、Fc區(qū)域(例如用于制造免疫黏附素)等表達結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)庫一方面，根據(jù)本發(fā)明的瞬時蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)中用于表達及測試中變異蛋白質(zhì)序列的大多數(shù)表達結(jié)構(gòu)包含具同一性的編碼序列(例如同一性大于50％，同一性大于75％，同一性大于90％、同一性95％或99％)。
一方面，結(jié)構(gòu)的編碼部份為隨機的。結(jié)構(gòu)可完全隨機或在其隨機中有偏差(亦即隨機或在一個或多個經(jīng)選擇位置)。一方面，產(chǎn)生表達結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)，其庫包含足夠的不同族群而使至少一個藉由表達結(jié)構(gòu)所編碼蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)的多樣性中具有所欲的生物活性(例如結(jié)合至例如抗原的特定結(jié)合搭檔的能力)。另一方面，表達結(jié)構(gòu)的多樣性包含變異編碼序列多于100，多于500，多于1×103，多于1×104，多于1×105，多于1×106，多于1×107，多于1×108，或多于1×109。優(yōu)選地，數(shù)據(jù)庫的多樣性是指包含約1×107至1×109不同變異編碼序列。蛋白質(zhì)的一個或多個胺基酸可一次隨機化。在一方面，一次約一個，約二個，約三個，約四個，約五個，或約六個或更多個胺基酸隨機化。在一方面，含有「n」個胺基酸的蛋白質(zhì)，n個胺基酸的各個獨立地隨機化而且蛋白質(zhì)被測試看是否有活性。因為異種蛋白質(zhì)的某些特定區(qū)域(例如抗原結(jié)合點或特定胺基酸)有變異而其它區(qū)域仍為不變，隨機化可有偏差。
用于蛋白質(zhì)的定向演化(directed evolution)的突變核酸序列的方法敘述于Leung et al.，Technique111-15(1989)；Cadwell and Joyce PCR Methods Appl.228-33(1992)；Shafikhani et al.，Biotechniques23304-310(1997)；Wan et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9512825-12831(1998)；You andArnold，Protein Eng.977-83(1996)；Cherry et al.，Nat.Biotechnol.17379-384(1999)；Tukey et al.，J.ImmunolMethods270(2)247-57(2002)；Cho et al.，Mol.Biol.297(2)309-19(2000)。
植物組織樣品可如后述的被多樣表達結(jié)構(gòu)滲入而表達所欲類型蛋白質(zhì)的組織/細胞及/或生物活性的程度能經(jīng)選擇用于高通量分析。在顯出所欲類型/活性的程度的樣品中，表達結(jié)構(gòu)能由樣品的一個或多個細胞中取回，并被測序或被鑒定其伴隨類型/活性的程度的變異序列。不論在結(jié)構(gòu)序列被特征化前或后，此結(jié)構(gòu)都能被再導(dǎo)入至一個或多個其它植物組織樣品以確定其結(jié)果。有偏差隨機化的第二輪可用于改變蛋白質(zhì)的未變化點及/或蛋白質(zhì)的經(jīng)選擇區(qū)域以鑒定有增強性質(zhì)的蛋白質(zhì)(例如對特定的搭檔具有增強的親和性的蛋白質(zhì))。
一方面，此方法用于模仿抗體產(chǎn)生的天然選擇步驟，亦即鑒定能結(jié)合至特定抗原的表達結(jié)構(gòu)，而后突變結(jié)構(gòu)而表達第二輪選擇性以鑒定對于特定抗原提供最高親和性的結(jié)構(gòu)。
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及培養(yǎng)制備以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物及其用于穩(wěn)定植物轉(zhuǎn)基因的產(chǎn)生已有被報道很多了。含有T-DNA邊緣序列的農(nóng)桿菌細胞與植物的交互作用導(dǎo)致農(nóng)桿菌T-DNA的單股復(fù)制物與蛋白質(zhì)復(fù)合而轉(zhuǎn)移至植物核。穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化中，T-DNA被整合至核DNA。
雖然此步驟顯然十分有效，然而未經(jīng)整合的T-DNA復(fù)制物能瞬時地轉(zhuǎn)錄而導(dǎo)致T-DNA基因與共轉(zhuǎn)化的任何其它基因的短時間表達。由于瞬時表達不依賴DNA的整合或植物的再生，因此能使用農(nóng)桿菌的更有毒性株而無需使用去毒性載體(disarmed vector)(亦即，不含有瘤產(chǎn)生基因的載體)，雖然后者也能使用。
合適的去毒性載體包括SEV系列，其中T-DNA的右邊緣與編碼細胞分裂素(cytokinin)及生長素(auxin)植物激素基因一起被移除而以細菌的康那霉素(kanamycin)抗性基因取代，而左邊緣及部份左內(nèi)側(cè)類似(Left Inside Homology；LIH)序列仍保持不變；去毒性載體還包括pGV系列，其中植物激素基因經(jīng)去除而代以部份pBR322載體序列，左，右邊緣序列及Ti質(zhì)粒的胭脂堿(nopaline)合成酶基因被保留。中間體載體可與幫助型序列(helper sequence)合并。優(yōu)選的，使用雙重載體而在其中一載體中包含T-區(qū)域，而在另一載體中包含vir區(qū)域。雙重載體在此領(lǐng)域被認知并被敘述于例如美國專利號4,940,838,EP 120516 B1，及美國專利號5,464,763。
農(nóng)桿菌的合適菌株包括野生型株(例如根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens))或一個或多個基因經(jīng)突變而增加轉(zhuǎn)化效率的菌株，例如農(nóng)桿菌中因突變或嵌合virA或virG基因的存在而改變vir基因的表達及/或其誘發(fā)(例如Chen andWinans，1991，J.Bacteriol.1731139-1144；及Scheeren-Grootet al.，1994，J.Bacteriol.1766418-6246)。在另一具體實例中，農(nóng)桿菌株包含額外的virG基因復(fù)制物，例如衍生自pTiBo542的超級virG基因，優(yōu)選的連結(jié)至多復(fù)制的質(zhì)粒中，如美國專利號6,483,013中敘述。
其它合適菌株包括，但不限于根瘤土壤農(nóng)桿菌A.tumefaciens C58C1(Van Larebeke et al.，Nature252169-170(1974))，A136(Watson et al.，J.Bacteriol123255-264(1975))；LBA401 1(Klapwijk et al.，J.Bacteriol141128-136(1980))，LBA4404(Hoekema et al.，Nature303179-180(1983))；EHA101(Hood et al.，J.Bac.1681291-1301(1986))；EHA105(Hood et al.，Trans Res.2208-218(1993))lAGL1(Lazo et al.，Bio/Technology9963-967(1991))；A281(Hood et al.，supra(1986))。
在一方面，本發(fā)明提供農(nóng)桿菌操作的簡化方法。優(yōu)選地，將農(nóng)桿菌株在合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)至600nm的波長下，光密度(optical density；O.D.)2.5至3.5。通常將細胞稀釋至2.5 O.D.。而后將農(nóng)桿菌細胞直接接觸(亦即無起始的濃縮步驟或離心步驟)植物組織，每份體積的植物組織使用約1至3份體積的農(nóng)桿菌的培養(yǎng)基懸浮液，優(yōu)選的為2至3份體積。一具體實例，每1kg植物物質(zhì)用少于約4L的菌液可提供異種蛋白質(zhì)至少約250μg，至少約500μg，至少約750μg，至少約1mg，至少約2mg，至少約3mg，至少約4mg，至少約5mg，至少約10mg，至少約15mg，至少約25mg，至少約50mg，至少約75mg，至少約100mg，至少約150mg，至少約200mg，或至少約500mg。
相較于先前使用的其它方法，本方法可在較少步驟中完成，所需人力較少而且減少15到20倍的制造成本。
真空滲入(Vacuum Infiltration)在優(yōu)選的具體實例中，表面活性劑被添加到農(nóng)桿菌懸浮液中以增加植物組織的異種蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。在一方面，農(nóng)桿菌細胞或其部份滲入宿主植物組織以用于表達結(jié)構(gòu)及/或表達載體的表達。優(yōu)選的，此步驟在真空中進行。
如用于本文，術(shù)語「表面活性劑」是指通常含有親油性部份及親水性部份的表面活性試劑(參照例如Bhairi，A.Guide tothe Properties and Uses of Detergents in Biological Systems，Calbiochem-Novabiochem Corp.1997)。表面活性劑可依其含有一個或多個電荷基團而分類為陰離子性，非離子性，兩性離子性或陽離子性。陰離子性表面活性劑帶負電荷基團而具有凈負電荷。非離子性表面活性劑含有不帶電荷極性基團而不具電荷。該等表面活性劑通常為烷氧化物與烷酚，或一級或二級醇，或胺氧化物，膦氧化物或二烷基硫氧化物的反應(yīng)產(chǎn)物。
非離子性表面活性劑的包括，但不限于第三-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100)，聚氧乙烯去水山梨醇單月桂酸酯(Tween 20)，聚氧乙烯去水山梨醇單月桂酸酯(Tween 21)，聚氧乙烯去水山梨醇單棕櫚酸酯(Tween 40)，聚氧乙烯去水山梨醇單硬脂酸酯(Tween 60)，聚氧乙烯去水山梨醇單油脂酸酯(Tween 80)，聚氧乙烯去水山梨醇三油脂酸酯(Tween 85)，(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)，三乙二醇單月桂醚(Brij 30)，及去水山梨醇單月桂酸酯(Span 20)。
兩性離子表面活性劑含有正電荷基團及負電荷基團且無凈電荷。合適的兩性離子性表面活性劑包括，但不限于甜菜堿，例如羧基甜菜堿(carboxybetaines)，磺基甜菜堿(sulfobetaines，也為sultaines)，酰胺基甜菜堿(amidobetaines)，及磺酰胺基甜菜堿(sulfoamidonetaines)，例如可含有C8-C18，優(yōu)選的為C10-C18，的烷基甜菜堿，磺基甜菜堿，及磺酰胺基甜菜堿，例如，月桂基酰胺基丙基甜菜堿(LAB)型甜菜堿，正-烷基二甲基胺甲烷羧酸鹽(DAMC)，正-烷基二甲基胺乙烷羧酸鹽(DAEC)，正-烷基二甲基丙烷羧酸鹽(DAPC)，正-烷基磺基甜菜堿，正-烷基二甲基胺烷基磺酸鹽，N-烷基二甲基胺乙烷磺酸鹽(DAES)，正-二甲基胺丙烷磺酸鹽(DAPS)及正-烷基二甲基胺丁烷磺酸鹽(DABS)，十六烷基二甲基胺丙烷磺酸鹽，正-烷基酰胺基甲烷二甲基胺甲烷羧酸鹽，正烷基酰胺基甲烷二甲基胺乙烷羧酸鹽，月桂基酰胺基丙基甜菜堿(LAB)，正-烷基酰胺基甲烷二甲基胺甲烷磺酸鹽，正-烷基酰胺基乙烷二甲基胺乙烷磺酸鹽，及正-烷基酰胺基丙烷二甲基胺丙烷磺酸鹽，3-[(3-膽烷酰胺基丙基)二甲基胺]-1-丙烷磺酸鹽(CHAPS)，及3-[(3-膽烷酰胺丙基)二甲基胺]-2-羥基-1-丙烷磺酸鹽(CHAPSO)，磷酯(例如磷酯酰乙醇胺(phosphatidylethanolamines)，磷酯酰甘油(phosphatidylglycerols)，磷酯酰肌醇(phosphatidylinositols)，二?；柞ヵＤ憠A(diacyl phosphatidyl-cholines)，二-O-烷基磷酯酰膽堿(di-O-alkyl phosphatidylcholines)，溶血磷酯酰膽堿(lysophosphatidylcholines)，溶血磷酯酰乙醇胺(lysophosphatidylethanolamines)，溶血磷酯酰甘油(lysophosphatidylglycerols)，溶血磷酯酰肌醇(lysophosphatidylinositols))，飽和及不飽和脂肪酸衍生物(例如乙基酯，丙基酯，膽固醇酯，輔 A酯，硝苯基酯，基酯，單甘油酯，二甘油酯，及三甘油酯，脂肪醇，脂肪醇乙酸酯等)，脂多醣，糖-及神經(jīng)鞘脂質(zhì)(sphingolipids)(例如神經(jīng)酰胺(ceramides)，腦酯(cerebrosides)，半乳糖基二甘油酯(galactosyldiglycerids)，神經(jīng)節(jié)甘酯(gangliosides)，乳糖腦酯(lactocerebrosides)，溶血腦硫酯(lysosulfatides)等)。
「陽離子性表面活性劑」在滲入條件下具有正電荷基團。合適的陽離子性表面活性劑的示例包括，但不限于四級胺類或三級胺類。四級胺類表面活性劑的示例包括，但不限于氯化十六烷基吡啶鹽，溴化十六烷基三甲基銨鹽(CTAB；Calibiochem#B22633或Aldrich#85582-0)，氯化十六烷基三甲基銨鹽(CTACI；Aldrich#29273-7)，溴化十二烷基三甲基銨鹽(DTAB，Sigma#D-8638)，氯化十二烷基三甲基銨鹽(DTACI)，溴化辛基三甲基銨鹽，溴化十四烷基三甲基銨鹽(TTAB)，氯化十四烷基三甲基銨鹽(TTACI)，溴化十二烷基乙基二甲基銨鹽(DEDTAB)，溴化癸基三甲基銨鹽(DIOTAB)，溴化十二烷基三苯基膦鹽(DTPB)，溴化十八烷基三甲基銨鹽，氯化硬脂四級胺(stearoalkonium chloride)，氯化油酸四級胺(olealkonium chioride)，氯化十六烷基三甲銨(centrimoniumchloride)，烷基三甲基銨甲基硫酸鹽，棕櫚酰胺基丙基三甲基氯，感光素(quaternium)84(Mackernium NLE；Mcintyre Group，Ltd)，及小麥脂質(zhì)環(huán)氧化物(Mackernium WLE；Mcintyre Group，Ltd)。三級胺類表面活性劑的示例包括，但不限于，辛基二甲基胺，癸基二甲基胺，十二烷基二甲基胺，十四烷基二甲基胺，十六烷基二甲基胺，辛基癸基二甲基胺，辛基癸基甲基胺，二癸基甲基胺，十二烷基甲基胺，氯化三乙酰基銨，氯化十六烷基三甲銨(centrimonium chloride)，及氯化烷基二甲基芐基銨。陽離子性表面活性劑的其它類別包括，但不限于磷鹽，酰膽堿鹽(imidzolines)，及乙基化胺類。
陰離子性表面活性劑一般為有機硫酸鹽及磺酸鹽的水可溶堿金屬鹽。該等包括，但不限于月桂鉀鹽，月桂硫酸鈉，十二烷基硫酸鈉，烷基聚氧乙烯硫酸鹽，褐藻酸鈉，二辛基磺基琥珀酸鈉，磷脂酰膽堿，磷脂酰甘油，磷脂酰肌，磷脂酰絲胺酸，磷脂酸及其鹽，甘油酯，羧甲基纖維素鈉，膽酸及其它膽汁酸(例如膽酸，脫氧膽酸，甘胺膽酸，?；悄懰幔拾访撗跄懰?及其鹽(例如脫氧膽鹽鈉等)。
混合表面活性劑(co-surfactants)，如乙醇，1-丙醇，及1-丁醇的短鏈醇，也可被使用。
可使用前述表面活性劑的任何組合。未特別列于前述的表面活性劑也包含于本發(fā)明的范圍中。
表面活性劑使用量可依表面活性劑的類型及欲處理的植物組織(亦即，包覆于葉片表面的蠟的厚度等)而變化。一般而言，表面活性劑使用濃度范圍為農(nóng)桿菌懸浮液體積的0.005％至約1％。優(yōu)選的，濃度范圍為0.005％至約0.5％，而更優(yōu)選的為0.005％至約0.05％。一般而言，離子性表面活性劑的使用濃度低于非離子性表面活性劑。
優(yōu)選的，使用非離子性表面活性劑，例如Tween 20。
除了加入表面活性劑外，加入滲透性沖擊步驟(osmoticshock step)以增大真空沖擊，可用于增加蛋白質(zhì)表達。因此，一方面，滲透性沖擊試劑，例如蔗糖被用于增加蛋白質(zhì)表達。滲透性沖擊試劑的合適濃度范圍由20g/L至100g/L。一方面，當(dāng)植物組織為萵苣時，約使用蔗糖60g/L。
在方法示例中，重組農(nóng)桿菌培養(yǎng)介質(zhì)(亦即含有本發(fā)明的表達結(jié)構(gòu))在經(jīng)改質(zhì)的YEB培養(yǎng)基中(酵母抽出物(yeastextract)6g/L，蛋白胴(peptone)5g/L，硫酸鎂2mM及蔗糖5g/L)生長約兩天，而該培養(yǎng)基補充有合適的抗生素以選擇載體及宿主上的抗性決定株。為了生長瞬時表達的細胞，將起始農(nóng)桿菌培養(yǎng)液以1∶50稀釋至新鮮經(jīng)改質(zhì)的YEB培養(yǎng)基。添加抗生素，50mM磷酸鉀緩沖液(pH5.8)及20μM乙酰丁香酮(acetosyringone)。于28℃下培養(yǎng)18至24小時后，細胞達到600nm的吸收度(也稱為光密度或O.D.)為2.5至3.5。優(yōu)選的，將細胞稀釋至600nm的吸收度為2.5，需要時用相同培養(yǎng)基進行稀釋。
而后將蔗糖及乙酰丁香酮補充至細胞內(nèi)而得最大值為220μM乙酰丁香酮及60g/L蔗糖的。此懸浮液于22℃下培養(yǎng)約1小時而后用于滲入。
而后在真空下將細胞直接滲入而無任何離心或濃縮步驟，刪除回溶步驟的需求。此項改變能使新鮮的已生長的農(nóng)桿菌懸浮液直接真空滲入，而刪除了由對數(shù)相培養(yǎng)基中離心細胞并將細胞回溶于Murishigi Skoog(MS)培養(yǎng)基(Kapila et al.，supra(1997))的需求。農(nóng)桿菌細胞的生長達O.D.600nm值2.5至3.5而非0.7至0.8(Kapila et al.，1997)，使用經(jīng)改質(zhì)的YEB培養(yǎng)基及磷酸鉀緩沖液取代MES，并不能改變表達濃度或滲入效率但能顯著地降低此部份步驟所需的成本及勞力。
在一方面，例如在葉片組織來自萵苣時，在一燒杯中將植物物質(zhì)與100μg/ml 2，4-D及0.005％Tween 20一起浸漬于預(yù)先培養(yǎng)的農(nóng)桿菌懸浮液。將此燒杯置于真空干燥器中并且在快速達真空而產(chǎn)生真空沖擊后維持20分鐘真空(相當(dāng)于水的29”體積或約7kPa)。如前述(Kaplia et al.，supra(1997)；Vaquero etal.，supra(1999))，相較于大量無組織的葉片，使用萵苣的完整葉球顯著地具有便利性。一般而言，相較于相等量的葉片，萵苣的完整葉球具有較佳的表達濃度。此方法可藉由同時處理多數(shù)萵苣葉球或大量葉片而輕易地放大規(guī)模。一個農(nóng)桿菌細胞懸浮液可至少使用兩次真空滲入而表達效率不會顯著降低，其更減少制造成本及勞力。
在一方面，約300至400克萵苣的完整葉球被使用。在另一方面，先期實驗中使用分離葉片于以最優(yōu)化表面活性劑及/或滲透試劑的量及組合。
優(yōu)選的，在真空滲入后，于室溫下將萵苣葉球培養(yǎng)于光照下約3至7天，而后將其均質(zhì)化而抽取蛋白質(zhì)。應(yīng)用適當(dāng)?shù)募兓襟E將單株抗體及其它醫(yī)藥學(xué)上重要的蛋白質(zhì)由植物均質(zhì)中純化出來。
相較于先前技術(shù)，此過程簡單而含有較少步驟且結(jié)果能顯著增加異種蛋白質(zhì)的表達。
蛋白質(zhì)分離在收集后，蛋白質(zhì)分離可使用此領(lǐng)域中的被熟知的方法進行。例如，至少一部份生物質(zhì)量被均質(zhì)化后，抽取重組蛋白質(zhì)并進一步純化。抽取可包含將均質(zhì)物浸泡或浸漬在合適的溶劑中。蛋白質(zhì)也可由植物的組織液分離，例如美國專利編號6,284,875所述的真空滲入方法。
純化方法包括，但不限于免疫親和純化及基于蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合體的特定大小、電泳泳動性、生物活性、及/或欲分離的異種蛋白質(zhì)的凈電荷，或基于蛋白質(zhì)中標志分子的存在的純化步驟。
分離蛋白質(zhì)的特征化可藉由免疫分析或其它熟知于此領(lǐng)域的方法進行。例如，蛋白質(zhì)可藉由蛋白質(zhì)雜交印跡法(Western Blotting)在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯基酰胺電泳凝膠上(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis；SDS-PAGE)分析，或者當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)充分地被純化后藉由科麥西藍染色分析。經(jīng)分離的蛋白質(zhì)可用于生物活性分析，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的特征化(例如在結(jié)晶分析)，在疾病的非動物人類模型中進行藥效測試，篩選最佳蛋白質(zhì)活性及/或最佳醫(yī)藥學(xué)特性等。
本說明書中引用于的所有專利及非專利文獻皆為相關(guān)于熟習(xí)此領(lǐng)域者的技藝程度。所有文獻及專利將以相同程度而合并于此作為參考文獻，特別地單獨引用的文獻或?qū)＠矊⒑喜⒂诖俗鳛閰⒖嘉墨I。
實施例本發(fā)明將以下列數(shù)個實施例加以敘述。該等實施例的目的是詳加闡明而非以任何方式局限本發(fā)明。
實施例1藉由新穎快速蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)制造hOAT本文所敘述的方法與Kapila等人(Kapila et al.，supra(1997))所教示的瞬時表達系統(tǒng)相比有顯著的改變，在低成本及較少步驟下，結(jié)果為大幅地增加高質(zhì)量產(chǎn)物的表達。


在高濃度蔗糖存在下的預(yù)處理植物表達載體的構(gòu)筑含有感興趣基因的質(zhì)粒載體可使用標準分子生物技術(shù)而構(gòu)筑?；締卧茉诖竽c桿菌及農(nóng)桿菌中復(fù)制的起始質(zhì)粒，有T-DNA的右及左邊緣夾于兩側(cè)的藉由啟動子驅(qū)動的感興趣基因及定位序列。必需單元經(jīng)組裝而構(gòu)建的質(zhì)粒顯示于圖1A及圖1B。
圖1A顯示質(zhì)粒pSUNP1，其含有2，4-D可誘發(fā)的(OCS)3Mas啟動子(Gelvin et al.，美國專利編號5,955,646)，驅(qū)動枯草酶分泌序列(Janzik et al.，Biol.Chem.2755193-5199(2000))，而能翻譯地融合至抗組織因子抗體(IgG1)的重鏈。此外此質(zhì)粒含有康那霉素抗性的選擇標記及在瞬時表達系統(tǒng)中無利用性的bialphos抗性的BAR基因。
示于圖1B的質(zhì)粒pSUNP2除了抗組織因子抗體的重鏈被相同抗體的輕鏈(卡帕；Kappa)所取代外，與pSUNP1相似。
農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化及制備將帶有所需雙重載體的農(nóng)桿菌C58/C1(Agrobacteriumtumifaciens C58/C1)在28℃下培養(yǎng)于在經(jīng)改質(zhì)的YEB培養(yǎng)基(6g/L酵母抽出物(yeast extract)，5g/L蛋白胴(peptone)，5g/L蔗糖及2mM硫酸鎂)生長兩天，而該培養(yǎng)基含有合適的抗生素(100μg/mL康那霉素，15μg/mL利法霉素(rifampicin)，25μg/mL慶大霉素(gentamycin))用于選擇質(zhì)粒及正確的細菌。用補充有抗生素，50mM磷酸鉀緩沖液(pH5.6)及20μM乙酰丁香酮(acetosyringone)的改質(zhì)的YEB培養(yǎng)基中以1∶50稀釋培養(yǎng)菌并培養(yǎng)18至24小時直到O.D.600nm為約2.5至3.5。當(dāng)需要時將細胞稀釋至O.D.600nm為2.4而后補充55g/L蔗糖及200μM乙酰丁香酮(最大量為220μM乙酰丁香酮及60g/L蔗糖)。懸浮液于室溫下(約22℃)培養(yǎng)1小時；使用前添加100μg 2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸，Sigma)及0.005％Tween 20。
與Kapila等人supra(1977)所教示的方法相比，在其方法中YEB培養(yǎng)基由5g/L牛肉抽出物，lg/L酵母抽出物，5g/L蛋白胴，5g/L蔗糖，2mM的硫酸鎂及用于選擇質(zhì)粒的合適抗生素(100μg/mL康那霉素，15μg/mL利法霉素，25μg/mL慶大霉素)組成。起始培養(yǎng)菌在補充有抗生素，10mM MES，pH5.6，20μM乙酰丁香酮的YEB培養(yǎng)基中以1∶500稀釋且培養(yǎng)18至24小時直到O.D.600nm為約0.7至1。將培養(yǎng)液離心收集細胞后回溶于含有10mM MES，pH5.6，20g/L蔗糖，及200μM乙酰丁香酮的Murashigi-Skoog培養(yǎng)基(Kapila et al.，supra(1997))，使O.D.600nm為2.4。懸浮液在室溫下(約22℃)培養(yǎng)1小時后；于使用前添加100μg2，4-D。
經(jīng)處理萵苣的真空滲入及培養(yǎng)農(nóng)桿菌懸浮液直接使用于真空滲入。在輕鏈位于一質(zhì)粒且重鏈位于另一質(zhì)粒(雙載體系統(tǒng))情況下，必需制備兩種農(nóng)桿菌培養(yǎng)液且在滲入前將其以相等比率混合。在此例中，編碼卡帕輕鏈的輕鏈載體系來自稱為hOAT的抗組織因子抗體而重鏈載體則編碼hOAT的IgG1重鏈。在2L燒杯中將萵苣的整個葉球浸漬于1.2L懸浮液中且置于真空干燥機中。使用真空(相當(dāng)于7kPa)20分鐘后以快速釋放真空進行真空沖擊。以水清洗萵苣葉球后在室溫下且在濕紙巾上于密閉透光盒中光照16小時來培養(yǎng)3至4天。在3至4天后由基部切下葉片且將其均質(zhì)化以用于蛋白質(zhì)抽取。
蛋白質(zhì)的抽取及純化蛋白質(zhì)在與葉片重量相等體積份的緩沖液(100mMTris-HCl，5mM EDTA，pH8.0，使用前添加1.5％不溶性PVP)中抽取。將葉片在Waring均質(zhì)機中以高速均質(zhì)化1分鐘后將所得的均質(zhì)物于10,000xg下離心15分鐘。將上清液與未沉淀的細胞碎渣以12層的粗棉布過濾后于20,000xg下離心15分鐘。將濾液以2mL/min填充至r蛋白A瓊脂糖快速親和管柱(5mL，樹酯得自Amersham Pharmacia Biotech AB，Sweden)。所使用的清洗緩沖液及洗提緩沖液分別為0.1M乙酸鈉及0.1M乙酸。以階梯pH梯度方式洗提蛋白質(zhì)，亦即以20％0.1M乙酸洗提2管柱體積，而后以40％、60％及100％的0.1M乙酸各洗提4管柱體積(圖3)。收集到吸收峰并使用1MTris-HCl，pH8.0，將pH調(diào)整至8.0。經(jīng)純化的抗體并以O(shè).D.280nm定量。為進一步純化，將Q瓊脂糖快速管柱(5mL，得自AmershamPharmacia Biotech AB Sweden的樹酯，)以20mM Tris-HClpH8.5平衡后而將經(jīng)ProteinA純化的抗體緩沖液與相同緩沖液交換后填充至該管柱。使用鹽階梯洗提方法洗提抗體，亦即10％的含有20mM Tris-HCl，pH8.0，1M NaCl的緩沖液洗提2管柱體積，而后以50％的該緩沖液洗提4管柱體積及100％的該緩沖液洗提2管柱體積。收集峰值部分并以O(shè).D.280nm定量(圖4)。為換液，系將Millipore Ultrafree離心過濾裝置15mL(Millipore Coporation Bedford，MA)浸泡于0.1M NaOH中至少1小時。用于經(jīng)Q瓊脂糖管柱純化的抗體的換液是以PBS進行的以取得大于1000倍稀釋。更換緩沖液的抗體用Millex-GV 0.22μm過濾器(Millipore Corporation，Bedfore，MA)過濾且以O(shè).D.280nm定量。
hOAT抗體以ELISA(Enzyme-linked immunosobent assay；酶聯(lián)免疫吸附測試法)分析定量。為了制備分析盤，制備5.5μg包覆溶液或者重組組織因子(rTF)的11mL包覆緩沖液(35mM NaHCO3，15mM碳酸氫鈉，50mM NaCl，pH9.0)。將100μL包覆溶液移至各孔中且于4℃下儲存2周。將分析盤以400μL的清洗緩沖液(Kirkegaard&Perry)清洗3次后將100μL樣品移至各孔中。于室溫下震蕩此分析盤1小時后以清洗緩沖液清洗6次。加入過氧化物酶聯(lián)接的驢抗人IgG(Peroxidase-conjugated Donkey Anti-Human IgG(H+L)(JacksonImmuno Research)，于室溫下培養(yǎng)10分鐘后以清洗緩沖液清洗6次。添加ABTS底物(BioFX)(100μL)，10分鐘后添加100μL的1％SDS中止反應(yīng)。測定450nm的吸收度。實施例1的具體方法與Kapila方法的表達濃度的比較示于表2。

如Laemmli(1970)所述，在12％Tris-甘氨酸小電泳膠上進行SDS-PAGE。將蛋白質(zhì)抽取物與填充緩沖液(4∶1，v/v)混合后于70℃加熱10分鐘而制備樣品。蛋白質(zhì)電泳帶由科麥西藍染色(第5A圖)或由電泳性地轉(zhuǎn)移至PVDF膜上來檢測。將該膜在室溫下于的含有10％脫脂牛奶的1∶10稀釋的2X PBS緩沖液中阻斷(block)1小時。在清洗后，于室溫下將該膜與聯(lián)有辣根過氧化酶(horseradish peroxidase)的抗人類IgG抗體聯(lián)合培養(yǎng)1小時。圖5B顯示根據(jù)操作者使用說明(Pierce)，將膜與增強化學(xué)發(fā)光的蛋白印記雜交所用的試劑一起培養(yǎng)而測得的IgG重鏈及輕鏈。
實施例2.蔗糖濃度的最優(yōu)化人們以意識到蔗糖濃度及蔗糖所引起滲透性沖擊的效果為增強表達的重要參數(shù)。為測試蔗糖濃度對于蛋白質(zhì)產(chǎn)物濃度的影響，依照實施例1的步驟測試蔗糖濃度的范圍對于抗組織因子抗體的表達的影響。基于圖6的結(jié)果選擇60g/L為最終蔗糖濃度作為標準方法。
實施例3.表面活性劑的最優(yōu)化為了特征化表面活性劑的效果，依照實施例1的步驟改變了表面活性劑的種類及濃度。

表3表示不同非離子性及離子性清潔劑的研究結(jié)果。該清單并不意味詳盡的而僅顯示由改變此參數(shù)而得的顯著效果。0.005％的Tween-20提供了特別高濃度的異種蛋白質(zhì)表達。
實施例4.2，4-D對于瞬時表達系統(tǒng)中籍由(OCS)3MAS啟動子的表達的效果在植物中有多種不同的啟動子(5’轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域)常常被應(yīng)用于異種蛋白質(zhì)的表達。文獻研究及有限的測試用來決定本方法的合適啟動子。表4表示使用化學(xué)誘發(fā)劑2，4-D由合成啟動子OCS3MAS的hOAT的表達。雖然已知(OCS)3MAS啟動子可由多種引起明顯傷害的因子誘發(fā)，此研究顯示使用農(nóng)桿菌的基因瞬時傳遞也引起可誘發(fā)的表達。此研究以實施例1中所述的原始Kaipla方法(MS方法)進行細菌制備及滲入，而此為其表達低于其它實施例的原因。基于此研究而選擇100μg/mL為的2，4-D最終濃度作為標準方法。

此有限的研究僅作為一個實施例，還有可能通過無氧誘發(fā)的啟動子，如由Adh基因，或者由報導(dǎo)有強啟動子作用的管家基因eIF4或由RUBISCO的小亞單位等誘發(fā)的啟動子可獲得更高的表達。
實施例5.用于hOAT瞬時表達的雙載體與雙順反子載體的比較在此實施例中，將雙載體系統(tǒng)(如述于實施例1中)的使用與重鏈及輕鏈來自單個載體(雙順反子載體)的表達相比較。質(zhì)粒pSUNP4(圖2)敘述一種在相同質(zhì)粒的T-DNA區(qū)域具有重鏈及輕鏈兩者的質(zhì)粒。(OCS)3MAS被用來驅(qū)動抗組織因子的重鏈及輕鏈的表達及編碼枯草酶的信號序列。
如實施例1中所示，萵苣以帶有雙載體的兩種農(nóng)桿菌培養(yǎng)菌或以帶有雙順反子載體pSUNP4的單一農(nóng)桿菌培養(yǎng)菌進行滲入而測定hOAT的表達濃度。使用該兩種載體系統(tǒng)的hOAT的表達濃度的結(jié)果顯示于表5。

實施例6.抗志賀毒素2(Shiga toxin 2)的重組抗體的瞬時表達在此實施例中，顯示瞬時表達可用于制造另一種抗體。cαStx2為嵌合抗體能結(jié)合且中和由腸出血性大腸桿菌所制造的志賀毒素2。將編碼cαStx2重鏈及輕鏈的基因?qū)腚p載體而產(chǎn)生相似于pSUNP1及pSUNP2的cαStx2載體。利用敘述于實施例1的方法將該等結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移至農(nóng)桿菌且用以7滲入萵苣。在瞬時表達后，由植物細胞制得抽出物和Protein A純化后取得的抗體以ELISA分析。
藉由在maxisorp 96-孔盤上包覆Stx2抗原而進行ELISA，該96-孔盤以塑料膜包覆，在使用前儲存于4℃。為測量抗體產(chǎn)物，在使用前，將孔以緩沖液清洗3次除去包覆溶液。將植物細胞抽出物或經(jīng)純化的蛋白質(zhì)溶液加至經(jīng)包覆的孔中。于室溫1孵育小時后，以緩沖液將孔清洗3次，而后添加抗-人類卡帕鏈-HRP抗體的稀釋液。于室溫下培養(yǎng)1小時后以清洗緩沖液清洗3次。為測定探針抗體的存在，添加ABTS底物試劑且于室溫下培養(yǎng)數(shù)分鐘，接著使用ABST中止緩沖液(quenchbuffer)。在自動讀取儀上讀出405nm的吸收度。
ELISA分析顯示樣品有含有功能活性cαStx2抗體的瞬時表達蛋白質(zhì)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)能辨識，或能確定，常規(guī)試驗中，與本文所述多種等同的底物及步驟。該相等物皆被認為在本發(fā)明的范疇中，且包含于權(quán)利要求書中。
雖然本發(fā)明以參考特定的具體例而說明，但應(yīng)了解該具體例僅僅為了闡明本發(fā)明的原理及應(yīng)用。因此應(yīng)了解有多種修改可用于說明實施例而其它安排皆不偏離權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明的精神與范疇。
敘述于本文中的專利，專利申請案及國際申請案及參考文獻，其全文皆合并于此。
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權(quán)利要求
1.在植物中表達異種蛋白質(zhì)的方法，包括在表面活性劑存在的情況下，用農(nóng)桿菌細胞滲入植物組織，該農(nóng)桿菌細胞包含能在植物組織細胞或/和細胞間隙中表達異種多肽的表達結(jié)構(gòu)；在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)植物組織使之表達所述的多肽。
2.在植物中表達異種蛋白質(zhì)的方法，包括用農(nóng)桿菌細胞滲入植物組織，該農(nóng)桿菌細胞包含能在植物組織細胞或/和細胞間隙中表達異種多肽的表達結(jié)構(gòu)；在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)植物組織使之表達所述的多肽；從每公斤經(jīng)處理的植物組織中分離出大約超過1毫克的多肽。
3.在植物中表達異種蛋白質(zhì)的方法，包括用農(nóng)桿菌細胞滲入植物組織，該農(nóng)桿菌細胞包含能在植物組織細胞或/和細胞間隙中表達異種多肽的表達結(jié)構(gòu)；在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)植物組織使之表達多肽；其中所用的植物組織來自至少收獲1周后的植物。
4.在植物中表達異種蛋白質(zhì)的方法，包括在培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)包含能在植物組織細胞或/和細胞間隙中表達異種多肽的表達結(jié)構(gòu)的農(nóng)桿菌細胞；在稀釋或未稀釋的步驟下，使含有農(nóng)桿菌細胞的培養(yǎng)介質(zhì)直接接觸植物組織；用含有該農(nóng)桿菌細胞的培養(yǎng)介質(zhì)滲入植物組織；在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)植物組織使之表達所述的多肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3和5中的任何一項所述的方法，其中，所述的異種多肽從植物組織中分離出來。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中的任何一項所述的方法，其中，載體含有至少一個T-DNA邊緣。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5中的任何一項所述的方法，進一步包括的步驟為把所述的載體導(dǎo)入至少一種農(nóng)桿菌細胞并進行培養(yǎng)使之獲得足夠用于植物組織滲入的細胞量。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-5中的任何一項所述的方法，其中所述的植物選自萵苣、苜宿、綠豆、菠菜、蒲公英、菊苣、芝麻菜、苣菜、菊苣茅菜、野苦苣、朝鮮薊、玉米、馬鈴薯、米、大豆、十字花科植物、浮萍、蕃茄或煙草。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述的十字花科植物包含芥藍菜或阿拉伯芥。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-4中的任何一項所述的方法，其中，所述的農(nóng)桿菌在使用前經(jīng)過夜培養(yǎng)且經(jīng)稀釋至600nm吸收度約為2.5。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-4中的任何一項所述的方法，其中，所述的農(nóng)桿菌使用真空滲入。
12.根據(jù)權(quán)利要求2-4中的任何一項所述的方法，其中，滲入是在于表面活性劑存在的情況下完成的。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，表面活性劑選自吐溫-20、吐溫-80、Triton X-100、NP-40或Silwet L-77。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述的表面活性劑選自吐溫-20、吐溫-80、Triton X-100、NP-40或Silwet L-77。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，表面活性劑為約0.005％的吐溫-20。
16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，，其中，表面活性劑為約0.005％的吐溫-20。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-5中的任何一項所述的方法，其中，滲入是在用于誘發(fā)滲透性震擾(osmotic shock)的試劑存在下進行。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，用于誘發(fā)滲透性震擾的試劑為蔗糖。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述的蔗糖的濃度約為60g/L。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-4中的任何一項所述的方法，其中，所述的蛋白質(zhì)是藉由研磨全植物或葉片而收集的。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-4中的任何一項所述的方法，其中，所述的蛋白質(zhì)是從植物的細胞間質(zhì)液收集的。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-4中的任何一項所述的方法，其中，所述的蛋白質(zhì)被定位到植物細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-4中的任何一項所述的方法，其中，多基因是藉由農(nóng)桿菌傳遞至植物的。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-4中的任何一項所述的方法，其中，多種農(nóng)桿菌菌株經(jīng)結(jié)合并被共同滲入到所要的植物中。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中，多基因是經(jīng)由農(nóng)桿菌株傳遞的。
26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中，多基因編碼能被組裝而形成多次單元蛋白質(zhì)。
27.根據(jù)權(quán)利要求1-4中的任何一項所述的方法，其中，經(jīng)表達的蛋白質(zhì)包括免疫球蛋白超級家族蛋白質(zhì)。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中，所述的蛋白質(zhì)為抗體、T細胞受體及主要組織相容性復(fù)合物、或其生物功能性片段或單鏈衍生物。
29.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中，多基因編碼包括途徑成員的蛋白質(zhì)。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中，該途徑指化學(xué)合成途徑或信號途徑。
31.根據(jù)權(quán)利要求1-4中的任何一項所述的方法，其中，所述的蛋白質(zhì)是經(jīng)糖化的。
32.根據(jù)權(quán)利要求1-4中的任何一項所述的方法，其中，進一步包括的步驟為獲得經(jīng)表達并穩(wěn)定的導(dǎo)入植物的表達結(jié)構(gòu)。
33.根據(jù)權(quán)利要求1-4中的任何一項所述的方法，其中，該植物組織來自轉(zhuǎn)基因植物。
34.篩選突變或變異序列的方法，包括在多種植物組織樣品中以多種表達結(jié)構(gòu)操作根據(jù)權(quán)利要求1-4中的任何一項所述的方法，該表達結(jié)構(gòu)包括至少約50％同一性的，與其他編碼序列相比，存在有一或多個突變的和/或編碼一個或多個變異氨基酸的編碼序列。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中，一個或多個突變包括缺失、插入、取代、或重組。
36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中，相較于不包括一個或多個突變及不包括編碼變異氨基酸序列的異種多肽而言，識別編碼具有改善性能的異種多肽的表達結(jié)構(gòu)。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中，改善性能包含增加的活性和/或穩(wěn)定性。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中，增加的活性包含異種蛋白質(zhì)增加的結(jié)合親和力，用以特異性結(jié)合所述的異種蛋白質(zhì)的結(jié)合體。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中，該蛋白質(zhì)包含免疫球蛋白超家族的成員。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中，該蛋白質(zhì)選自抗體、T細胞受體及主要組織相容性復(fù)合物、或其生物功能性片段或單鏈衍生物。
41.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中，一個或多個突變包括將人類序列插入來自非人類的動物的異種編碼序列。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于一種在真核系統(tǒng)中制備生物醫(yī)藥學(xué)蛋白質(zhì)及其它重要蛋白質(zhì)的快速且多用途的方法。本發(fā)明的特征為用于單克隆抗體及其它醫(yī)藥學(xué)上重要蛋白質(zhì)的瞬時制造的有效且不昂貴的方法，本方法為將帶有興趣蛋白質(zhì)基因的農(nóng)桿菌導(dǎo)入已生長的植物宿主中而后回收興趣蛋白質(zhì)。
文檔編號C12N15/82GK1997742SQ200380107460
公開日2007年7月11日 申請日期2003年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月23日
發(fā)明者V·內(nèi)格勞克, G·內(nèi)格勞克, N·巴斯克姆, H·李, D·泰勒 申請人:阿爾特生物科學(xué)公司