專利名稱：植物信號(hào)傳導(dǎo)配體樣蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物生長(zhǎng)和發(fā)育領(lǐng)域，尤其涉及因發(fā)育或環(huán)境刺激而產(chǎn)生的、影響構(gòu)筑或表型特點(diǎn)如分裂速度和模式、延伸方向、器官發(fā)生或分化模式的植物細(xì)胞之間的通訊。
卵子和精子融合產(chǎn)生合子(也稱為受精卵)。這個(gè)單細(xì)胞合子經(jīng)過(guò)連續(xù)細(xì)胞分裂和延伸過(guò)程，產(chǎn)生構(gòu)成植物體的大量細(xì)胞，所述植物可以是高大的樹木，也可以是小草，或是馬鈴薯或花生。植物細(xì)胞分裂是高度調(diào)節(jié)的，使每種植物或其一部分具有特異形狀或構(gòu)筑。
無(wú)疑地，植物細(xì)胞中存在調(diào)節(jié)其分裂速度和模式，延伸方向，器官發(fā)生和分化的精確發(fā)育機(jī)制。這種發(fā)育機(jī)制一般是由細(xì)胞核中的基因控制的，而較少由葉綠體和線粒體中的基因控制。在最近15年期間，已經(jīng)廣泛使用分子遺傳學(xué)方法，研究這種發(fā)育途徑，尤其在模型生物體中，如擬南芥屬(Arabidopsis)，矮牽?；?，玉米和金魚草屬植物中。
這些研究例如鑒別了調(diào)節(jié)花發(fā)育的基因(Yanofsky等，1990；Mandel等，1992；Jufuku等，1994；Weigel等，1992)，調(diào)節(jié)胚胎發(fā)生的基因(Lotan等，1998)，調(diào)節(jié)分生組織特性的基因(Long等，1996)，調(diào)節(jié)光(COP1)和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因(PIN，ETR，BRI，油菜素類固醇，GAI，Peng)等。大量這些基因的產(chǎn)物反過(guò)來(lái)成為轉(zhuǎn)錄因子，可以結(jié)合下游基因的啟動(dòng)子區(qū)域，以發(fā)起或抑制發(fā)育途徑。轉(zhuǎn)錄因子包括Myb，MADS，KNOTTED和AP2等。這些基因之一發(fā)生突變，通常導(dǎo)致從一個(gè)器官到另一個(gè)器官的同源異型轉(zhuǎn)變。這些不同基因的表達(dá)限定了器官的特性以及一些細(xì)胞類型的分化結(jié)局(fate)。
與動(dòng)物發(fā)育不同，植物細(xì)胞在發(fā)育期間不遷移，而且確定植物細(xì)胞的結(jié)局比動(dòng)物細(xì)胞的結(jié)局少。因此，一些在動(dòng)物導(dǎo)致異常生長(zhǎng)和發(fā)育的混亂，不影響正常植物形態(tài)發(fā)生。例如，細(xì)胞周期基因cyclAt的過(guò)表達(dá)提高根部的質(zhì)量，但對(duì)結(jié)構(gòu)和形態(tài)無(wú)影響，而且玉米中不能完成正?？v向細(xì)胞分裂的復(fù)雜的突變，在形態(tài)學(xué)中是相對(duì)正常的。在植物中，每個(gè)細(xì)胞均需要與其周圍細(xì)胞溝通和協(xié)調(diào)。盡管植物細(xì)胞分裂遵循某些具有可追蹤結(jié)局分布圖的模式，但激光消融實(shí)驗(yàn)已經(jīng)揭示當(dāng)殺死一或多個(gè)細(xì)胞時(shí)，與其鄰近的那些細(xì)胞能取代這些細(xì)胞，甚至源自具有不同發(fā)育起源的不同層的細(xì)胞也具有這種能力(Berg等，1995)。
因此，位置本身對(duì)植物發(fā)育就是一個(gè)非常重要的信號(hào)(Hake和Char，1997)?，F(xiàn)在出現(xiàn)的問(wèn)題是位置信號(hào)是怎樣接近的，它們?cè)诩?xì)胞間是怎樣轉(zhuǎn)移的，以及植物細(xì)胞怎樣能感受到這些信號(hào)。小信號(hào)分子如植物生長(zhǎng)素和乙烯能通過(guò)細(xì)胞壁擴(kuò)散，而受體激酶含有結(jié)合配體的胞外結(jié)構(gòu)域(Fletcher和Meyerowitz，2000)。一些蛋白質(zhì)如轉(zhuǎn)錄因子和病毒移動(dòng)蛋白，可以通過(guò)胞間連絲在細(xì)胞之間穿行(Lucas等，1995；Citovsky和Zambryski，1991)。
細(xì)胞與細(xì)胞之間通訊的另一種方式是通過(guò)類受體激酶。受體激酶基于其N末端胞外結(jié)構(gòu)域序列，現(xiàn)在已知在擬南芥屬中有4種類受體激酶。代表性的類別是豐富的亮氨酸重復(fù)(LRR)類別，是最大的類別。LRR發(fā)生在許多真核蛋白中，而且認(rèn)為參與蛋白質(zhì)之間的相互作用。LRR還存在于一些哺乳動(dòng)物的蛋白質(zhì)/肽信息的受體中，包括神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體。這個(gè)類別包括ERECTA，CLV1，CLV2和BRI1(油菜素類固醇不敏感1)。BRI1是最合適的油菜素類固醇的受體。當(dāng)前已知的受體激酶的表達(dá)模式可以用于闡述LRR的功能。
具有與蕓苔屬的S-基因座糖蛋白相關(guān)的胞外結(jié)構(gòu)域的S-結(jié)構(gòu)域類別，參與自身不相容性應(yīng)答。在擬南芥屬中發(fā)現(xiàn)三種S-結(jié)構(gòu)域RLK，但它們不參與自身不相容性應(yīng)答，因?yàn)樗鼈冊(cè)诓贿m當(dāng)?shù)奈恢帽磉_(dá)，而且所述種屬不顯示自身不相容性。
類植物血凝素結(jié)構(gòu)域類別，與豆類植物血凝素相關(guān)。它們可以結(jié)合寡糖，如衍生自真菌感染期間引發(fā)病原體或植物細(xì)胞壁衰變的因子。
EGF重復(fù)受體在擬南芥屬中通過(guò)WAK1和WAK4呈遞。胞外結(jié)構(gòu)域與哺乳動(dòng)物上皮生長(zhǎng)因子相關(guān)。
如果沒(méi)有配體，所述類受體激酶通常以單體存在于膜中。配體與其胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)合導(dǎo)致同源或異源寡聚物形成，通常是二聚體，通過(guò)蛋白質(zhì)磷酸化激發(fā)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。這種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑已經(jīng)在動(dòng)物體和酵母中進(jìn)行充分研究。自從在1989年首次報(bào)道了植物蛋白激酶(Lawton等，1989)，在植物中已經(jīng)鑒別了500多種，只在擬南芥中就鑒別了175種(Hardie，1999)。這些蛋白激酶大多數(shù)參與胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(鈣依賴型蛋白激酶)，應(yīng)激反應(yīng)(豐富亮氨酸重復(fù)受體激酶)和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)(細(xì)胞周期蛋白激酶)。一些蛋白激酶，例如兩種成分的組氨酸/天冬氨酸激酶家族成員，參與激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如乙烯和細(xì)胞分裂素(Chang和Meyerowitz，1995；Kakimoto，1996)。最近鑒別的ERECTA，BRI1，CLAVATA1，CLAVATA2和HAESA是類受體激酶的實(shí)例，其可以參與細(xì)胞-細(xì)胞之間的通訊(Ku等，1996；Clark等，1997；Jeong等，1999；Jinn等，2000)。基于對(duì)擬南芥屬進(jìn)行的基因組測(cè)序結(jié)果，預(yù)期在擬南芥屬基因組中有100種以上的類受體激酶(Fletcher和Meyerowitz，2000)。CLAVATA1，CLAVATA2和CLAVATA3的突變體示出幾乎相同的表型，分生組織的中心結(jié)構(gòu)域擴(kuò)大，及開花器官數(shù)目增加(Leyser和Furner，1992)。最近克隆的CLAVATA3，其編碼一個(gè)推定的小胞外蛋白，與任何已知的植物和動(dòng)物蛋白不具有明顯的同源性(Fletcher等，1999)?；诒硇秃蜕锘瘜W(xué)分析，確信CLAVATA1和CLAVATA3是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的不同成分，盡管還未獲得這種相互作用的直接證據(jù)(Clark等，1995；Trotochaud等，1999)?；谶@些結(jié)果，CLAVATA3非?？赡苁菑母叩戎参镏需b別的配體蛋白，其與CLAVATA1受體激酶相互作用。
本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)植物表型或構(gòu)筑的方法，例如通過(guò)影響或改變植物生長(zhǎng)，其發(fā)育或其抗外部刺激或疾病的防御應(yīng)答，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的速度或模式，延伸方向，器官發(fā)生或分化模式而進(jìn)行，包括將一種具有重組配體樣蛋白(LLP)或其功能片段提供給植物或植物材料，所述蛋白或片段至少包含一個(gè)本發(fā)明提供的LLP盒基序(box motif)，所述基序包含一個(gè)氨基酸基序XRXXXXGXXXXHX或(1)R(4)G(4)H(1)。本文提供的方法主要包括通過(guò)提供在蛋白質(zhì)上存在的LLP盒基序與其相應(yīng)的受體或結(jié)合位點(diǎn)之間的配體相互作用而調(diào)節(jié)植物表型。所述LLP蛋白或其功能片段至少包含所述LLP盒基序，當(dāng)結(jié)合時(shí)，它們提供植物發(fā)育級(jí)聯(lián)步驟中的進(jìn)一步驟，通過(guò)使用修飾的或重組的LLP蛋白，可以產(chǎn)生新的級(jí)聯(lián)，由此在植物中產(chǎn)生新的表型。
所選擇的一種優(yōu)選的氨基酸LLP盒基序包含KRXXXXGXXPXHX。特別地，一個(gè)優(yōu)選的盒包含一個(gè)共有序列，示出與優(yōu)選的共有序列KRX(V/I)(P/H)(S/T)G(P/S)(N/D)(P/H)(L/I)H(H/N)(黑體氨基酸典型地是最保守的)有至少80％同源性。這種LLP盒優(yōu)選起自KR或止于PLHN，或具有不超過(guò)10個(gè)氨基酸的C末端。另外，觀測(cè)到圖13中的大部分LLP基序具有LLP盒上13個(gè)氨基酸中的3個(gè)脯氨酸，為它們提供了功能所需的非常獨(dú)特的3D結(jié)構(gòu)。擬南芥屬之外其它物種的一些成員只具有3P殘基中的2個(gè)(中間的P是S)，而且只有一個(gè)LLP(LLP6)只具有1個(gè)P殘基。一般而言，LLP盒起自2個(gè)非常堿性的氨基酸(pK10或12)，在第四位具有一個(gè)疏水性氨基酸，隨后是一個(gè)脯氨酸(引入彎曲(bend)或結(jié)(kink))，接著是兩個(gè)小氨基酸(一個(gè)具有羥基，一個(gè)是甘氨酸)，另一個(gè)脯氨酸(或絲氨酸)，天冬氨酸或天冬酰胺，另一個(gè)脯氨酸和三個(gè)具有大側(cè)鏈的氨基酸。這個(gè)序列產(chǎn)生一種可識(shí)別的3D構(gòu)象，其參與受體配體的相互作用。LLP盒是一個(gè)氨基酸基序，其在所有的LLP基因中均存在，而且其生物學(xué)功能在信號(hào)傳導(dǎo)中很重要，例如介導(dǎo)與受體的相互作用，將配體折疊成適當(dāng)?shù)臉?gòu)象，和/或結(jié)合在信號(hào)轉(zhuǎn)播后調(diào)節(jié)翻轉(zhuǎn)的其它分子成分。表型應(yīng)答包括應(yīng)激誘導(dǎo)的，激素介導(dǎo)的和疾病介導(dǎo)的應(yīng)答，其對(duì)植物形狀，大小，生長(zhǎng)速度，繁殖能力(開花，配子和種子產(chǎn)生)，代謝，及根和莖發(fā)育有作用。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了調(diào)節(jié)植物表型的方法，包括給植物提供一種具有重組LLP蛋白或其功能片段。LLP蛋白的共同特征包括其大小，存在信號(hào)肽和保守的LLP盒。這些特征均有助于LLP蛋白在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中的作用，改變其結(jié)局，因此例如使得可以通過(guò)調(diào)節(jié)LLP基因表達(dá)水平和位置而調(diào)節(jié)植物表型。當(dāng)信號(hào)肽存在時(shí)，其有助于活性的LLP蛋白定位，并例如指導(dǎo)重組的LLP蛋白到達(dá)胞外空間，在此其可以與適當(dāng)?shù)氖荏w復(fù)合物相互作用，以將信號(hào)傳達(dá)至接收細(xì)胞。LLP盒是這種相互作用的一個(gè)最重要的特征，在LLP類蛋白質(zhì)中其是保守的，限定一個(gè)共同識(shí)別結(jié)構(gòu)域以識(shí)別植物受體激酶的適當(dāng)亞類，提供特異性受體復(fù)合物識(shí)別所需的準(zhǔn)確構(gòu)象。LLP蛋白的非保守部分(例如LLP盒區(qū)域之外的部分)提供了必需的額外特異性，以將不同類型的信號(hào)傳達(dá)至與其相互作用的特異性受體復(fù)合物。表達(dá)與重組LLP蛋白相互作用的適當(dāng)受體復(fù)合物的細(xì)胞(信號(hào)接收細(xì)胞)，通過(guò)改變其結(jié)局而響應(yīng)，使植物表型發(fā)生變化。因此，修飾LLP重組核酸的表達(dá)，位置和結(jié)構(gòu)組分可以調(diào)節(jié)植物表型。
本發(fā)明因此提供了一種從植物中分離的或重組的配體樣蛋白(LLP)或其功能片段，所述植物例如是BrassicaBrassica napus(BnLLP1，也稱為DD3-12)或擬南芥(Arabidopsisthaliana)(LLP1At)，本發(fā)明還提供所述蛋白在操縱或影響植物構(gòu)筑或調(diào)節(jié)表型中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的LLP核酸一般編碼與受體激酶相互作用的配體或其功能片段，由此產(chǎn)生植物組織中所需的表型應(yīng)答。
這些表型應(yīng)答還包括改變細(xì)胞結(jié)局，應(yīng)激介導(dǎo)的、激素介導(dǎo)的和疾病介導(dǎo)的應(yīng)答。本發(fā)明因此提供了一組配體樣蛋白(LLP)或其功能片段，其具有相似肽結(jié)構(gòu)和一個(gè)與其C末端相對(duì)鄰近的保守結(jié)構(gòu)域，例如在LLP1中所見(jiàn)，其用于操縱植物生長(zhǎng)，發(fā)育和防御應(yīng)答，本發(fā)明還提供了編碼所述配體樣蛋白(LLP)或其功能片段的分離的和/或重組的核酸。
本發(fā)明的改變的核酸序列包括不同核苷酸的缺失，插入，取代，產(chǎn)生編碼相同蛋白的多核苷酸，或功能等價(jià)物。特意(deliberate)的氨基酸取代可以基于殘基的極性，電荷，溶解性，疏水性和/或兩親性進(jìn)行，只要所述多肽的生物活性保留。本發(fā)明還包括所述多肽的等位基因。本文所用術(shù)語(yǔ)“等位基因”或“等位基因序列”是上述多肽的另一種形式。本文所闡述的“功能片段”可以是一種等位基因變體。通過(guò)突變產(chǎn)生的等位基因，例如核酸序列中發(fā)生的變化，一般產(chǎn)生變化的mRNA或多肽，其結(jié)構(gòu)或功能可以發(fā)生或不發(fā)生改變。任何給定的多肽可以沒(méi)有或有多種等位基因形式。通常產(chǎn)生等位基因的等位基因變化一般歸因于氨基酸的天然缺失，添加或取代。這些類型的變化，每一種均可以單獨(dú)發(fā)生，或與其它變化組合發(fā)生，在給定的序列中發(fā)生一或多次。
本發(fā)明的多核苷酸序列可以用作探針，以從其它基因組中分離相似的序列(例如玉米，水稻，canola，大豆，棉花等)。通過(guò)使用本發(fā)明的基因序列作探針，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲得可對(duì)比的基因序列。本發(fā)明的一方面是提供了能檢測(cè)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸序列或密切相關(guān)的分子的雜交或PCR探針，所述多核苷酸序列包括基因組序列。探針的特異性(無(wú)論其是從高度特異性區(qū)域例如5’調(diào)節(jié)區(qū)域中10個(gè)獨(dú)特的核苷酸中產(chǎn)生的，還是LLP1區(qū)域基序的核酸序列，或特異性較小的區(qū)域例如3’區(qū)域產(chǎn)生的)，雜交或擴(kuò)增的嚴(yán)格性(最大，高度，中等，低等)將確定所述探針是否只鑒別天然發(fā)生的編碼所述多肽的序列，等位基因或相關(guān)的序列。探針還可以用于檢測(cè)相關(guān)的序列及優(yōu)選含有至少50％的編碼本發(fā)明序列的任一種LLP基因的任何核苷酸。
本發(fā)明提供的的LLP核酸或其功能片段，可以在完全不同的生物學(xué)途徑中起作用，例如操縱植物構(gòu)筑(莖和根)，操縱胚-胚乳相互作用，雄性不育，開花時(shí)間的選擇和器官特性，分生組織活性，細(xì)胞程序死亡(例如胚柄vs胚)，應(yīng)激(生物性和非生物性)應(yīng)答，衰老，葉片和果實(shí)脫落，從根部攝取營(yíng)養(yǎng)素。另外，它們可以用于“再生”中。術(shù)語(yǔ)“再生”用作概括LLP基因的許多可能的應(yīng)用，如能力，生長(zhǎng)暈，根系形成，器官發(fā)生，分化，植物發(fā)育，莖尖分生組織，開花分生組織發(fā)育，腋芽形成和活化，或細(xì)胞之間通訊或器官邊界發(fā)揮作用的其它過(guò)程。
本發(fā)明還提供了分離的和/或重組的核酸，其還包含與所述LLP1和其它LLPs或其功能片段的核酸編碼區(qū)功能性連接或自然相鄰的啟動(dòng)子序列，其在植物細(xì)胞中作為調(diào)節(jié)因子，發(fā)育性調(diào)節(jié)組織或細(xì)胞特異性表達(dá)?！皢?dòng)子”是指一種足以指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。啟動(dòng)子還包括足以引起組織特異性基因表達(dá)的那些啟動(dòng)子元件；這種元件可以位于天然基因的5’或3’區(qū)域中。在植物表達(dá)載體的情況中，本發(fā)明序列的表達(dá)還可以通過(guò)許多已知的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，所述啟動(dòng)子包括可誘導(dǎo)的和發(fā)育調(diào)節(jié)啟動(dòng)子。本發(fā)明還提供了為此目的本發(fā)明的多核苷酸序列的各個(gè)啟動(dòng)子的用途(例如BnLLP1啟動(dòng)子(圖16))。
“宿主細(xì)胞”是指一種細(xì)胞，其中通過(guò)生物相互作用完成外來(lái)程序，不管所述細(xì)胞是屬于單細(xì)胞，多細(xì)胞，分化的有機(jī)體或是人造細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)物或原生質(zhì)體。本發(fā)明中“宿主細(xì)胞”還涵蓋了“植物細(xì)胞”。
“植物細(xì)胞”是指由半透膜形成邊界并含有一或多種質(zhì)體的任何自身繁殖的細(xì)胞。如果需要進(jìn)一步增殖，這種細(xì)胞通常需要一種細(xì)胞壁。“植物細(xì)胞”非限制性包括種子，懸浮培養(yǎng)物，胚芽，分生組織區(qū)域，愈傷組織，原生質(zhì)體，葉片，根，莖，配子體，孢子體，花粉和小孢子。
更優(yōu)選地，本發(fā)明的LLP在其N末端還包含一個(gè)信號(hào)肽。本發(fā)明提供了一種選擇在一或多個(gè)LLP基因內(nèi)具有一種獨(dú)特LLP基序的植物起始材料或植物的方法。這種選擇可以檢測(cè)具有所需表型的植物，例如通過(guò)選擇具有所需LLP基因型的植物(組織)培養(yǎng)起始物，如愈傷組織或植物細(xì)胞而進(jìn)行檢測(cè)?？梢员绢I(lǐng)域已知的核酸檢測(cè)方法進(jìn)行選擇，如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，或通過(guò)雜交，使用因此提供的LLP特異性探針或引物。另外，本發(fā)明還提供了用核酸序列轉(zhuǎn)化植物或植物材料，所述核酸序列編碼本發(fā)明提供的似蛋白質(zhì)物質(zhì)(蛋白質(zhì)，(多)肽及其(翻譯后)修飾物)(LLP1和其它LLP)。這種植物一般具有改變了的表型。簡(jiǎn)而言之，本發(fā)明提供了一類新的配體樣蛋白(LLP)，其是在相對(duì)接近C末端處具有一保守的LLP盒基序，及在N末端具有一種信號(hào)肽的小蛋白。這種配體樣蛋白還可以是一種融合性質(zhì)的重組蛋白質(zhì)，或者甚至就是合成的，其中它們是通過(guò)常規(guī)肽合成方法產(chǎn)生的。包含本文提供的所述盒基序的一種配體樣蛋白，可用于將一種具有所述盒基序的化合物或重組或合成的(多)肽定向到受體，由此所述化合物或多肽可以調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并干擾植物細(xì)胞之間的通訊；從而影響構(gòu)筑或表型特點(diǎn)，如分化速度和模式，伸展方向，器官發(fā)生或?qū)Πl(fā)育或環(huán)境刺激誘導(dǎo)的不同模式。這種定向還可用于將一種化合物(具有所述盒基序)定向輸送于所述受體的鄰近。
本發(fā)明還提供一種重組的編碼至少包含一個(gè)包含氨基酸基序XRXXXXGXXXXHX的LLP盒基序或肽的配體樣蛋白或其功能片段的核酸，或與其雜交的核酸，如反義RNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種LLP核酸，如圖3所示。LLP基因的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致植物構(gòu)筑發(fā)生變化，如雄性不育或不正常的根系發(fā)育(圖9-11)。本發(fā)明還提供了反義LLP核酸，引物或探針，其可以是DNA，RNA或(肽核酸)PNA，與本發(fā)明提供的核酸雜交。本發(fā)明還提供了一種核酸，其還具有或包含一個(gè)可操縱地連接于修飾的LLP核酸的啟動(dòng)子。這種序列可以指導(dǎo)基因在腋芽，開花器官原基，柱頭，和根毛區(qū)，及在成熟和發(fā)芽的種子的胚乳中表達(dá)。這種啟動(dòng)子用于驅(qū)動(dòng)相應(yīng)基因的細(xì)胞或組織特異性表達(dá)。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明核酸的一種載體或宿主細(xì)胞，及一種包含或用這種核酸或載體轉(zhuǎn)化的植物或植物材料如愈傷組織或植物細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及鑒別與LLP1結(jié)構(gòu)類似的一系列新的配體樣蛋白(LLP)。這些蛋白質(zhì)優(yōu)選具有50或60或更多個(gè)氨基酸，優(yōu)選具有75或更多個(gè)氨基酸，優(yōu)選具有85或更多個(gè)氨基酸，優(yōu)選地具有不超過(guò)250個(gè)，更優(yōu)選不超過(guò)150個(gè)氨基酸，更優(yōu)選不超過(guò)120個(gè)氨基酸；優(yōu)選地它們?cè)谄銷末端具有信號(hào)肽，所述信號(hào)肽優(yōu)選長(zhǎng)度是15-32個(gè)氨基酸，這是通過(guò)SignalP程序確定的。
這些似蛋白質(zhì)物質(zhì)在其C末端具有保守的LLP盒基序，所述基序包含氨基酸XRXXXXGXXXXHX。所給定的氨基酸是以單字母代碼表示的，X表示任何天然發(fā)生的氨基酸。這個(gè)LLP基序優(yōu)選與Brassica napus(KRIIPTGPNPLHN；LLP盒基序)提供的LLP區(qū)域基序或肽有55％或更多，優(yōu)選60％或更多，更優(yōu)選80％或更多，最優(yōu)選90％或更多同源性。在植物如擬南芥屬中發(fā)現(xiàn)的LLP盒基序或肽典型地例如是KRLVPSGPNPLHN，KRLVPSGPNPLHH，KRRVPSGPNPLHN，KRRVPSGPNPLHH，KRLVHSGPNPLHN，KRVIPSGPNPLHN，KRKVPSGPNPLHN，KRSIPSGPNPLHN，KRKVPNGPNPLHN，KRKVPRGPNPLHN，KRSIPTGPNPLHN，ERLVPSGPNPLHN，ERLVPSGPNPLHH，ARLVPSGPNPLHN，ARLVPKGPNPLHN，KRVVPSGPNPLHN，KRVVHTGPNPLHN，KRRVPSGPNPLHN，KRRVFSGPNPLHN，KRKVPKGPNPLHN，KRKVKSGPNSLHN，KRLSPGGPNPLHN，MRLVPSGPNPLHN或其變體，其中特異的氨基酸由類似的氨基酸置換(例如堿性置換堿性，大體積的置換大體積的，酸性置換酸性)，或其中例如LLP盒基序或肽中的NPLH亞基序由DPLH，NPRH或DPRH置換。包含LLP盒基序或肽的蛋白質(zhì)，可以易于例如使用LLP盒基序，通過(guò)對(duì)用本領(lǐng)域熟知重組方法產(chǎn)生的多肽序列進(jìn)行BLAST研究而發(fā)現(xiàn)(或在數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn))。變化應(yīng)優(yōu)選不功能性影響(1)R(4)G(4)H(1)位置中LLP盒基序。
一般地，LLP[LLP1bn，LLP1at，和來(lái)自其它來(lái)源的LLP同系物]具有與CLV3蛋白質(zhì)同源的限定的序列。CLV3是一種具有調(diào)節(jié)頂端分生組織中心區(qū)功能的基因，可能與CLV1受體激酶相互作用，但還沒(méi)有確鑿證據(jù)(Fletcher等，1999)。LLP1和其它LLPs一般與CLV3不同，體現(xiàn)在以下三方面的至少一個(gè)方面1)非常低的同源性，在全部蛋白質(zhì)序列中有21.1％相同性，及在LLP盒基序中同源性為54％；2)沒(méi)有KR但存在LR；3)優(yōu)選的LLP在蛋白質(zhì)C末端盡頭具有LLP盒基序，而CLV3具有更長(zhǎng)的C末端跨度。在LLP盒基序的C末端的末尾肽的長(zhǎng)度應(yīng)優(yōu)選不超過(guò)10個(gè)氨基酸，更優(yōu)選不超過(guò)5個(gè)氨基酸，及最優(yōu)選是0-2個(gè)氨基酸。
本發(fā)明還提供了一種包含啟動(dòng)子的重組核酸，所述啟動(dòng)子可操縱地或功能性地連接于LLP核酸，所述LLP核酸衍生自不同的或異源的植物物種。這種序列可以指導(dǎo)基因在分生組織，種子中表達(dá)，或應(yīng)答非生物和/或生物刺激。因此，這種啟動(dòng)子用于驅(qū)動(dòng)相應(yīng)基因的細(xì)胞特異性，組織特異性，應(yīng)激相關(guān)的表達(dá)。
本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生一種植物的方法，所述植物具有至少一或多種LLP核酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，通過(guò)異位表達(dá)，錯(cuò)置表達(dá)，過(guò)表達(dá)，共抑制或顯性陰性突變(dominant-negative mutation)進(jìn)行。在所述范圍內(nèi)也可以使用通過(guò)反義方法對(duì)這些基因的負(fù)調(diào)節(jié)。一或多個(gè)這種基因在植物中的過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)，發(fā)育和防御應(yīng)答的改變。本發(fā)明還涉及鑒別結(jié)合配體樣蛋白如LLP1和其它LLP的受體激酶。這種受體激酶通常是具有一個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域和一個(gè)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的膜結(jié)合蛋白，其現(xiàn)在可以通過(guò)與本發(fā)明提供的一種配體樣蛋白或其功能片段反應(yīng)而鑒別。
詳細(xì)描述實(shí)施例1從Brassica napus L中克隆BnLLP1基因(DD3-12)將在第一次授粉有絲分裂時(shí)期的Brassica napus cv.Topas的分離的小孢子，在32℃或18℃培養(yǎng)。較高的培養(yǎng)溫度導(dǎo)致胚形成，較低的培養(yǎng)溫度導(dǎo)致花粉成熟(圖1)。在開始培養(yǎng)后的不同時(shí)間收集樣品，并根據(jù)原料和方法章節(jié)中所述方法制備總RNA。使用mRNA差別展示RT-PCR(DDRT-PCR，Liang和Pardee，1992)，分離在胚發(fā)生條件下(32℃)特異性出現(xiàn)的cDNA克隆。圖2的DDRT-PCR凝膠示出一個(gè)PCR片段(稱為BnLLP1，箭頭所指)，其是在32℃(胚發(fā)生發(fā)育)培養(yǎng)10天(球狀胚至心形胚)和16天(心形至魚雷形胚)的小孢子樣品中發(fā)現(xiàn)的，但在新鮮分離的小孢子(t＝0)樣品，在18℃培養(yǎng)的小孢子樣品(配子體發(fā)育)或葉片樣品中沒(méi)有。從凝膠中分離這個(gè)Bn LLP1 PCR片段，并在再擴(kuò)增和克隆后測(cè)序。與NCBI基因庫(kù)中DNA序列進(jìn)行對(duì)比，表明與已知基因沒(méi)有明顯的序列同源性。
將從球狀至心形胚中制備的cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，以克隆BnLLP1的全長(zhǎng)cDNA。這樣可以鑒別全長(zhǎng)BnLLP1 cDNA(另外稱為DD3-12)，如SEQ ID No.1所示(圖3)。使用SignalP程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析這個(gè)推定的蛋白質(zhì)，表明這種蛋白質(zhì)具有一個(gè)23個(gè)氨基酸的疏水轉(zhuǎn)運(yùn)肽。這種信號(hào)肽在從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外期間被除去。因此預(yù)期這種肽的終產(chǎn)物只具有51個(gè)氨基酸。具有這種特性的蛋白質(zhì)通常發(fā)揮與細(xì)胞周圍膜中的一或一些受體激酶相互作用的配體蛋白的作用，以在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)(Jennifer和Meyerowitz，1999)。實(shí)施例2BnLLP1基因的表達(dá)通過(guò)Northern印跡分析測(cè)定的BnLLP1表達(dá)模式示于圖4。在32℃培養(yǎng)10天的小孢子胚(球狀至心形胚)中發(fā)現(xiàn)高水平的轉(zhuǎn)錄物。在根部和葉片中未檢測(cè)到信號(hào)，但在各種發(fā)育階段的花蕾混合物中出現(xiàn)微弱的信號(hào)(圖4)。從較幼小的花蕾(1-5mm)，較大的花蕾(5-8mm)和開放的花中分別取RNA樣品，表明在最幼小的花蕾中發(fā)現(xiàn)最高水平的BnLLP1轉(zhuǎn)錄物。在花內(nèi)，在雌蕊中發(fā)現(xiàn)明顯的信號(hào)，但在花藥和花瓣中沒(méi)有信號(hào)。
構(gòu)建一種BnLLP1啟動(dòng)子∷GUS融合體，并使用“花蘸”方法(ref)移至擬南芥屬中，以確定BnLLP1在Brassica的近親-擬南芥中的表達(dá)模式。將轉(zhuǎn)基因幼苗在含有卡那霉素的平板上選擇(圖6)。在晚期球狀階段胚的上部首先檢測(cè)到GUS信號(hào)。在心形胚階段，GUS表達(dá)限于頂部，但略微接近子葉的遠(yuǎn)軸側(cè)。所述胚的進(jìn)一步發(fā)育使BnLLP1的表達(dá)改變?yōu)樵谧尤~邊緣的一窄行細(xì)胞(見(jiàn)圖5)。在子葉階段，BnLLP1表達(dá)局限于在每個(gè)子葉底部的環(huán)形區(qū)域，但在包括根部和底部分生組織的胚中沒(méi)有。
令人感興趣地，在種子成熟期間，在胚乳的殘留物中可見(jiàn)BnLLP1表達(dá)，位于外種皮和胚之間有一單層細(xì)胞。GUS表達(dá)持續(xù)至種子萌發(fā)的前幾天。
在發(fā)育后期，BnLLP1表達(dá)限于腋芽，花蕾和成熟根部，在葉片，花或植物分生組織中沒(méi)有。在擬南芥屬中，每個(gè)腋芽通常形成一個(gè)新的花序，其具有2-5個(gè)莖生葉和不確定數(shù)目的花。一旦花開始形成，就不再產(chǎn)生莖生葉。通常地，每個(gè)腋芽只產(chǎn)生一個(gè)花序。在腋芽中，所述表達(dá)限于葉原基，當(dāng)葉片擴(kuò)展時(shí)迅速遷移至葉柄的遠(yuǎn)軸側(cè)(圖8C)。在花蕾中，BnLLP1表達(dá)首先見(jiàn)于3期花蕾，在花原基外周，表明萼片形成的部位。在5期花中，BnLLP1不是更多地在已經(jīng)形成的萼片中表達(dá)，其是在萼片和心皮原基之間的一個(gè)區(qū)域內(nèi)，在此萼片和雄蕊形成。在7期花中，當(dāng)雄蕊形成時(shí)，BnLLP1表達(dá)只在心皮的頂部可見(jiàn)，在此柱頭形成。BnLLP1的表達(dá)在花開之前完全關(guān)閉。
在根部，BnLLP1的表達(dá)在萌芽后6-7天在根毛形成后開始圖7)。在胚軸中無(wú)表達(dá)可見(jiàn)，胚軸和根部之間的表達(dá)差別非常明顯。在根部?jī)?nèi)，BnLLP1不在其上根毛形成的表皮層中表達(dá)。BnLLP1表達(dá)在皮層和基本組織中，至維管束，及稍后至中柱鞘逐漸關(guān)閉，然后當(dāng)根毛開始退化時(shí)完全關(guān)閉。顯然地，BnLLP1表達(dá)與成熟根部以及良好發(fā)育的根毛相關(guān)。這是根部從土壤中攝取營(yíng)養(yǎng)的主要功能區(qū)域。在側(cè)根產(chǎn)生期間見(jiàn)不到BnLLP1表達(dá)，在作為供養(yǎng)和轉(zhuǎn)運(yùn)器官的老根中也見(jiàn)不到。實(shí)施例3BnLLP1過(guò)表達(dá)的表型將增強(qiáng)兩倍的35S啟動(dòng)子用于驅(qū)動(dòng)全長(zhǎng)BnLLP1基因(也稱為DD3-12)在擬南芥屬中的過(guò)表達(dá)。使用前述花蘸方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。具有幾乎相同表型的3個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化體得自2個(gè)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。這些植物緩慢生長(zhǎng)及在種子種植后45-50天后而不是在WT中種植20天后晚期開花抽苔。這些BnLLP1過(guò)表達(dá)的戲劇性表型是其分枝模式變化(圖9)。代替在每個(gè)腋芽形成一個(gè)分枝，這些植物通常具有在莖生葉的腋芽部位產(chǎn)生的2，3，4，5，甚至7個(gè)花序。新花序的形成是漸進(jìn)的，從一個(gè)分枝開始，在植物生長(zhǎng)期間形成一個(gè)新的。這些BnLLP1過(guò)表達(dá)植物是雄性不育的，在花中不能產(chǎn)生可育的花粉?；ǚ勰乙卜浅Ｐ?，是三角形。BnLLP1過(guò)表達(dá)植物中的另一種變化是在80％的花中形成針式心皮(圖10)。這些針式心皮是細(xì)長(zhǎng)的結(jié)構(gòu)，內(nèi)部不形成胚珠。在所述心皮頂部可觀測(cè)到一個(gè)類柱頭結(jié)構(gòu)，表示BnLLP1表達(dá)可以起信號(hào)作用，提示胚珠形成，而不是柱頭組織。如果用來(lái)自野生型植物的花粉授粉，具有正常雌蕊的那些20％的花是能育的。一種仔細(xì)的細(xì)胞學(xué)分析示出BnLLP1過(guò)表達(dá)植物具有形成維管叢的缺點(diǎn)，尤其在花中(圖11)。實(shí)施例4在擬南芥屬中鑒別其它LLP使用BnLLP1 cDNA序列或蛋白質(zhì)序列對(duì)NCBI和擬南芥屬進(jìn)行BLAST或BLASTP研究，示出與任何已知的cDNA或蛋白質(zhì)序列沒(méi)有任何明顯同源。我們首先嘗試使用BLASTP在NCBI和TAIR(擬南芥屬數(shù)據(jù)庫(kù))中研究現(xiàn)有的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)SWISSPROT，示出無(wú)明顯匹配的序列。然而，基于BnLLP1和LLP1At蛋白之間的序列對(duì)比，我們發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白質(zhì)的C末端是高保守的，其可以與這些基因的重要功能相關(guān)(圖12和13)。然后我們使用所述C末端序列，對(duì)一些參數(shù)加以修改，進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)研究(圖14)。代替使用蛋白質(zhì)同源研究，我們使用C末端肽序列研究具有6框翻譯的NCBI和TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)中所有核苷酸序列。這使我們可以研究數(shù)據(jù)庫(kù)中所有可能序列。這種研究可以鑒別一組具有高保守C末端區(qū)域的蛋白質(zhì)，其中13個(gè)來(lái)自擬南芥屬(圖15)，1個(gè)來(lái)自棉花，一個(gè)來(lái)自大豆。這個(gè)盒基序之前從未鑒別。我們將其命名為L(zhǎng)LP盒基序。令人感興趣地，所有這些蛋白均非常小，在60-120個(gè)氨基酸范圍(見(jiàn)例如圖17-22)。使用這種研究標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)鑒別了屬于LLP家族的其它成員(圖23)。
具有LLP盒基序的所有這些蛋白均具有15-32個(gè)氨基酸的N末端信號(hào)肽，如SignalP分析所示(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。這種信號(hào)肽控制所有蛋白質(zhì)進(jìn)入分泌途徑至細(xì)胞外面。所述信號(hào)肽分裂，同時(shí)所述蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。這些信號(hào)肽的共同特征是具有一個(gè)正電荷的n區(qū)，后接一個(gè)疏水的h區(qū)和一個(gè)中性但極性的c區(qū)。一個(gè)(-3，-1)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定在-3和-1位(相對(duì)于分裂位點(diǎn))的殘基必須是小的和中性的，以正確發(fā)生分裂(Nielsen等，1997)。
基于這三種共同特征，愈發(fā)表明LLP是一類新蛋白質(zhì)。它們可以作為配體與相鄰細(xì)胞中的受體激酶相互作用，發(fā)揮細(xì)胞-細(xì)胞之間通訊的作用。
由于LLP基因編碼能與膜結(jié)合受體激酶相互作用的配體，以誘導(dǎo)一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)，因此能將這種相互作用用于其它目的。以這種方式重新設(shè)計(jì)一種LLP配體，在其與其受體之間發(fā)生的穩(wěn)定的無(wú)效的相互作用，將導(dǎo)致修飾的和野生型配體與受體結(jié)合之間的競(jìng)爭(zhēng)。在配體的受體相互作用結(jié)構(gòu)域中取代某些氨基酸，產(chǎn)生占據(jù)受體結(jié)合位點(diǎn)的一種穩(wěn)定的非功能性配體，導(dǎo)致一種顯性陰性突變表型，其中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)被阻斷。這可以用于改變植物構(gòu)筑。在不同的情況下也可以使用所述配體和受體的相互作用結(jié)構(gòu)域，通過(guò)將它們連接于通常不相互作用的其它蛋白質(zhì)而使用。以這種方式，可以在植物中產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間相互作用。
一些已知蛋白質(zhì)與LLP蛋白質(zhì)具有某些相似性。這些是來(lái)自擬南芥屬的CLAVATA3蛋白和來(lái)自玉米的ESR蛋白。它們也是在其N末端具有信號(hào)肽的小蛋白。這些蛋白質(zhì)示出與LLP在LLP盒基序中有一些相似性，當(dāng)然所述相似性較低。最明顯的差別是LLP盒基序的位置。CLAVATA3和ESR蛋白中一個(gè)略微相似的區(qū)域是位于比LLP更遠(yuǎn)離C末端的位置。
如上所述，所述大多數(shù)LLP蛋白均具有遠(yuǎn)離其C末端0-3個(gè)氨基酸的LLP盒基序。一種動(dòng)物蛋白，分離自小鼠的一種推定的RHO/RAC鳥嘌呤核苷酸交換因子(RHO/RAC GEF)，也示出與LLP蛋白在LLP盒基序中的某些同源性。然而，在這種情況中，假定的LLP盒基序更遠(yuǎn)離C末端，甚至接近N末端(Pasteris等，1995)。這是第一次在任何有機(jī)體中鑒別LLP盒基序。在植物中，我們發(fā)現(xiàn)這種基序通常與小胞外配體樣蛋白相關(guān)。實(shí)施例5發(fā)現(xiàn)新的LLP基因和肽根據(jù)LLP盒基序的保守性質(zhì)，對(duì)公布的序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行探求編碼含有KRX(V/I)(P/H)(S/T)G(P/S)(N/D)(P/H)(L/I)H(H/N)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的序列或推定的ORF。鑒別了一些含有ORF的擬南芥屬LLP區(qū)域。這些基序當(dāng)中有許多仍未在數(shù)據(jù)庫(kù)中注冊(cè)。由LLP區(qū)域推斷，鑒別了ORF的起始和終止密碼子。由這些ORF編碼的推定的蛋白質(zhì)的大小在100-250個(gè)氨基酸范圍，而且所有蛋白質(zhì)均具有編碼在其N末端的信號(hào)肽的高度可能性?；谕贫ǖ牡鞍踪|(zhì)的大小，氨基末端信號(hào)肽的可能性，及存在LLP區(qū)域，以下擬南芥屬ORF屬于LLP家族·來(lái)自擬南芥，位于染色體1上，在BAC克隆F23o10上，登記號(hào)AC018364(34983至34660)，·來(lái)自擬南芥，位于染色體1上，在BAC克隆F2OP5上，登記號(hào)AC002062(108432至108788)，·來(lái)自擬南芥，位于染色體1上，在BAC克隆T1K7上，登記號(hào)AC013427(8397至8759)·來(lái)自擬南芥，位于染色體2上，在BAC克隆F2I9上(染色體2的第255節(jié)段的第4節(jié)段)，登記號(hào)AC006069(55097至55786)，·來(lái)自擬南芥，位于染色體1上，在BAC克隆T7A14上，登記號(hào)AC005322(16956至17207)，·來(lái)自擬南芥，位于染色體1上，在BAC克隆F12A21上，登記號(hào)AC008113(31668至31928)，·來(lái)自擬南芥，位于染色體1上，在BAC克隆F15H11上，登記號(hào)AC008148(45836至46069)，·來(lái)自擬南芥，位于染色體1上，在BAC克隆F27J15上，登記號(hào)AC016041(90633至90932)，·來(lái)自擬南芥，位于染色體1上，在BAC克隆F9N12上，登記號(hào)AC022355(48056至48298)，·來(lái)自擬南芥，位于染色體1上，在BAC克隆F2P9上，登記號(hào)AC016662(57033至57356)。
另外，在數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的許多表達(dá)的序列標(biāo)簽(EST′s)和具有預(yù)先未知功能的基因，基于上述標(biāo)準(zhǔn)，屬于LLP家族。這些包括·thaliana，Columbia Col-0，rosette-2擬南芥cDNA克隆701546165，mRNA序列g(shù)i5845463gbAI998558.1AI998558[5845463]·thaliana，Ohio State克隆set擬南芥cDNA克隆701496429，mRNA序列g(shù)i5840376gbAI993471.1AI993471[5840376]·Zea mays endosperm cDNA library from Schmidt lab cDNA，mRN A序列g(shù)i4887284gbAI677383.1AI677383[4887284]·Z.mays mRNA for ESRal protein gi2340960embX98495.1ZMRESRA1[2340960]·Z.mays mRNA for ESR2c1 protein gi2340958embX98498.1ZMRESR2C1[2340958]·Z.mays mRNA for ESR1c1 protein gi2340956embX98496.1ZMRESR1C1[2340956]·Z.mays ESR3g2基因，克隆L42a4 gi2340954 embX99970.1ZMESR3G2[2340954]·Z.mays ESR2g2基因，克隆L42a14 gi2340952embX99969.1ZMESR2G2[2340952]·Z.mays ESR1g2基因克隆L42a6 gi2340950embX99968.1ZMESR1G2[2340950]·Z.mays ESR2g1基因gi2340948embX98499.1ZMDESR2G1[2340948]·Z.mays ESR1g1基因gi2340946embX98497.1ZMDESR1G1[2340946]·Rice cDNA from immature leaf including apical meristem Oryza sativacDNA克隆E512222Z，mRNA序列g(shù)i3763791dbjAU030543.1AU030543[3763791]·Cotton Six-day Cotton fiber Gossypium hirsutum cDNA 5′，mRNA序列g(shù)i6462118gbAW187682.1AW187682[6462118]·Soybean Glycine max cDNA克隆GENOME SYSTEMS CLONE ID:Gm-c1016-29015′，mRNA序列g(shù)i6094825gbAW119439.1AW119439[6094825]實(shí)施例6從B.napus小孢子胚發(fā)生系統(tǒng)中分離不同表達(dá)的基因如述，將在大約第一次花粉有絲分裂期分離的B.napus的小孢子在體外在32℃或18℃培養(yǎng)(Custers等，1994)。較高的溫度導(dǎo)致胚形成的較多(孢子體發(fā)育)，較低的溫度導(dǎo)致花粉成熟(配子體發(fā)育，圖1)。在開始培養(yǎng)后的不同時(shí)間點(diǎn)收集樣品(8小時(shí)，10和16天)，并使用DD-PCR分析基因表達(dá)中的變化。選擇這些適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)作為最小胚產(chǎn)生期(8小時(shí))，模式形成期(從球形轉(zhuǎn)變?yōu)樾男危?0天)和分化期(魚雷胚，16天)。為避免出現(xiàn)非胚發(fā)生但熱激相關(guān)的基因，將在41℃處理45分鐘的小孢子用作額外對(duì)照。在這種條件下，未觀測(cè)到胚發(fā)生。從DD-PCR凝膠中切除100多個(gè)示出在胚發(fā)生培養(yǎng)中表達(dá)增強(qiáng)或降低的條帶，通過(guò)PCR擴(kuò)增并用作Northern和反向Northern分析的探針。
選擇示出與原始DD-PCR表達(dá)模式一致的表達(dá)模式的擴(kuò)增片段進(jìn)行進(jìn)一步分析。從82個(gè)條帶中獲得序列信息并用于查詢可公開利用的序列數(shù)據(jù)庫(kù)。在此，我們介紹了這些分離的基因之一LLP1的進(jìn)一步的特征。實(shí)施例7鑒別LLP1，一種編碼具有信號(hào)肽的小蛋白的基因LLP1 cDNA片段在經(jīng)過(guò)在32℃誘導(dǎo)處理后10天的B.napus的小孢子產(chǎn)生的胚(球形至心形期)中表達(dá)，但在新鮮分離的小孢子中不表達(dá)(T＝0)，即不在18℃或41℃培養(yǎng)的小孢子中也不在葉片中不表達(dá)(圖2，箭頭所示)。將這個(gè)368bp DD-PCR片段在再次擴(kuò)增和克隆后測(cè)序(圖3，下面鏈)。為獲得全長(zhǎng)LLP1 cDNA，我們篩選了從球形至心形小孢子產(chǎn)生胚中制備的一個(gè)cDNA文庫(kù)，用LLP1 DD-PCR片段作為探針。鑒別了一個(gè)具有單個(gè)開放讀框(ORF)的417bp cDNA(圖3上面鏈)。這個(gè)cDNA編碼一種推測(cè)具有74個(gè)氨基酸的8.3kDa肽(圖3，下劃線處)。使用SignalP程序(http//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析LLP1蛋白，表明有99.6％可能LLP1在其N末端具有一個(gè)23個(gè)氨基酸的疏水性轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)肽(圖3A，在 之前的序列)。信號(hào)肽控制蛋白質(zhì)進(jìn)入分泌途徑(Nielsen等，1997)，并在從胞質(zhì)移至細(xì)胞外期間裂解。LLP1信號(hào)肽的裂解產(chǎn)生移至成熟的只有51個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。使用LLP1序列查詢蛋白質(zhì)和表達(dá)的序列標(biāo)記(EST)數(shù)據(jù)庫(kù)，表明與已知的蛋白質(zhì)或cDNA沒(méi)有明顯相似性。
然而，LLP1與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的DNA序列相比，表明與位于染色體3上的最近測(cè)序的擬南芥屬P1基因組克隆(MUJ8)有同源性(在物理圖譜上37cM)。擬南芥屬中基因組DNA的這個(gè)區(qū)域有一個(gè)具有三個(gè)起始密碼子的ORF。擬南芥屬ORF與B.napus LLP1基因的結(jié)構(gòu)對(duì)比提示在這個(gè)序列中第二個(gè)起始密碼子是功能性的，產(chǎn)生與LLP1對(duì)比相同長(zhǎng)度的肽(圖13，AtLLP1.PRO)。我們將此擬南芥屬直向同源物稱為AtLLP1。LLP1和AtLLP1均沒(méi)有內(nèi)含子。令人感興趣地，在擬南芥屬數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的114351個(gè)ESTs中，未發(fā)現(xiàn)與AtLLP1基因相匹配的，盡管RT-PCR示出明顯存在轉(zhuǎn)錄物(數(shù)據(jù)未示出)。LLP1是可通過(guò)Northern分析易于檢測(cè)的(見(jiàn)下文)，并歸因于其豐富性而因此不可能表現(xiàn)力低下。關(guān)于LLP1 ESTs表現(xiàn)低下的一種更可能的解釋是大多數(shù)cDNA文庫(kù)是使用級(jí)分的cDNA構(gòu)建的，因此象AtLLP1這樣具有短轉(zhuǎn)錄物的基因可以在這些文庫(kù)中以非常低的富集出現(xiàn)。另外，歸因于其小的ORF，AtLLP1基因未被擬南芥屬基因組測(cè)序計(jì)劃注釋為編碼一個(gè)基因。這是小的未知蛋白質(zhì)的通常存在的問(wèn)題。
信號(hào)P分析示出AtLLP1有99.8％的可能性在其N末端攜帶一個(gè)24個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。在225bp編碼區(qū)之上，這兩個(gè)肽在DNA和蛋白質(zhì)水平分別呈現(xiàn)76.4％和68％序列相同性。對(duì)完整的擬南芥屬基因組序列進(jìn)行Southern印跡(數(shù)據(jù)未示出)和數(shù)據(jù)庫(kù)搜索示出AtLLP1是位于染色體3上37cM位置處的一個(gè)單拷貝基因。圖中位置與得自重組近交系分析的數(shù)據(jù)一致，所述分析是在測(cè)序這部分基因組之前進(jìn)行的(數(shù)據(jù)未示出)。實(shí)施例8；LLP1呈現(xiàn)與CLV3和ZmESR蛋白質(zhì)具有序列和結(jié)構(gòu)相似性LLP1和AtLLP1之間的蛋白質(zhì)序?qū)Ρ仁境鲎铋L(zhǎng)的一段保守氨基酸序列存在于C末端(圖12)。然后使用一個(gè)31個(gè)氨基酸C末端肽序列查詢公布的數(shù)據(jù)庫(kù)，并在擬南芥屬基因組中發(fā)現(xiàn)18個(gè)其它相似基因。另外，還從擬南芥屬，番茄，大豆，苜蓿和棉花中發(fā)現(xiàn)一些匹配ESTs，和一些具有相似ORFs的基因組序列(圖12和13)。這些蛋白質(zhì)的序列對(duì)比揭示在所有4個(gè)蛋白質(zhì)中存在一個(gè)保守的基序KRXXPXGPXPLH(圖12和13)。這個(gè)基序先前未闡述。我們將其稱為L(zhǎng)LP盒。在這些相關(guān)序列的兩個(gè)基因中，先前已經(jīng)研究了來(lái)自擬南芥屬的CLV3和來(lái)自玉米的ZmESR，盡管在這兩個(gè)基因之間未觀測(cè)到有聯(lián)系。在此提供的LLP盒使我們鑒別新的基因家族。CLV3是從高等植物中鑒別的第一個(gè)蛋白質(zhì)配體，而且與CLV1/CLV2受體激酶復(fù)合物相互作用以在莖尖分生組織中介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Fletcher等，1999)。ZmESR蛋白質(zhì)是由在胚周圍的胚乳的有限區(qū)域中表達(dá)的基因編碼的(Opsahl-Ferstad等，1997)。在LLP盒外，LLP1蛋白示出與CLV3微弱的相似性(圖3B，黑體字表示)，但與ZmESR無(wú)相似性。在LLP1和AtLLP1蛋白中，LLP盒位于C末端之前的兩個(gè)氨基酸，而在ZmESR中，LLP盒位于其C末端之前的43-AA。CLV3在LLP盒后有一個(gè)額外的16個(gè)氨基酸(圖12，13)。如Fletcher等所述，CLV3基因編碼一個(gè)96個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，認(rèn)為其示出與已知功能性結(jié)構(gòu)域的其它序列或序列基序沒(méi)有可感知的相似性，從而得到對(duì)呈現(xiàn)一般特征的一組蛋白質(zhì)，稱為L(zhǎng)LP盒的認(rèn)識(shí)，并在此首次提供了一種普通的作用機(jī)制(結(jié)合受體并激發(fā)表型應(yīng)答)。CLV3的克隆因此承認(rèn)了Fletcher關(guān)于收集相互聯(lián)絡(luò)的細(xì)胞中收集的分生組織的見(jiàn)解，每中分生組織均合成和分泌其自身的蛋白質(zhì)配體，并通過(guò)其自身跨膜受體激酶的作用對(duì)其相鄰物應(yīng)答，然而，即使充分了解其它蛋白質(zhì)配體必需存在于許多蛋白質(zhì)中(分生組織內(nèi)或外)，F(xiàn)letcher等未提供發(fā)現(xiàn)或鑒別這種配體的方法。相似地，在Opsahl-Ferstad中，鑒別了許多具有特異性表達(dá)模式，信號(hào)序列和大小的玉米基因。在這些基因中發(fā)現(xiàn)的保守結(jié)構(gòu)域不包括LLP盒，其位于其中限定為可變區(qū)的區(qū)域中。作者提出的Esr的功能包括胚和胚乳(細(xì)胞壁的的一種結(jié)構(gòu)作用)的自然分離或胚的營(yíng)養(yǎng)(被攝取和消耗的)。未提及配體在指導(dǎo)胚或胚乳的分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的可能作用。實(shí)施例9LLP1在胚發(fā)育和胚發(fā)育后期間在限定的少量細(xì)胞中表達(dá)
DD-PCR實(shí)驗(yàn)示出LLP1在小孢子產(chǎn)生的胚中表達(dá)，但在小孢子/花粉和葉片組織中不表達(dá)(圖2)。然后使用Northern印跡進(jìn)一步定性LLP1在其它組織中的表達(dá)模式。
Northern印跡分析示出在球形至心形期胚中和幼花芽(1-5mm大小)中有相對(duì)多數(shù)量的LLP1 mRNA，在含有雙核至三核花粉的較成熟的花芽中(5-8mm)水平較低，而且在開花期開放的花中中幾乎檢測(cè)不到(圖4)。在花芽?jī)?nèi)，在雌蕊中檢測(cè)到表達(dá)，但在花藥和花瓣中未檢測(cè)到(圖4)。在葉片中未觀測(cè)到可檢測(cè)信號(hào)。
為更詳細(xì)研究LLP1的表達(dá)，通過(guò)基因組步查從B.napus中分離位于LLP1起始密碼子上游的一個(gè)1060bp的基因組序列(基因庫(kù)登記號(hào)AF343658，從0至1,060bp)，融合于大腸桿菌β-葡糖苷酸酶A(GUS)受體基因并轉(zhuǎn)化至擬南芥屬。
在一些轉(zhuǎn)基因擬南芥屬品系中在胚發(fā)育和胚發(fā)育后期間分析LLP1表達(dá)。結(jié)果與在不同轉(zhuǎn)基因品系之中的Northern印跡分析結(jié)果一致。為闡明LLP1在胚發(fā)生期間的精確表達(dá)模式，將來(lái)自轉(zhuǎn)基因植物的合子胚從種子中切除，然后染色分析GUS活性。Hoyer清除方法導(dǎo)致GUS染色擴(kuò)散，因此結(jié)果也是基于在解剖顯微鏡下觀測(cè)以圖示出的。如圖5A所示，LLP11表達(dá)首先在晚期球形胚的上部區(qū)域中檢測(cè)到。在心形期，GUS染色限于在頂部和子葉原基遠(yuǎn)軸側(cè)的少數(shù)細(xì)胞中(圖5A和B)。胚的進(jìn)一步發(fā)育導(dǎo)致LLP1表達(dá)轉(zhuǎn)變?yōu)樵隰~雷形胚中子葉邊緣的一窄列細(xì)胞中(圖5A)。在彎曲子葉期，LLP1表達(dá)位于在每個(gè)子葉基底的環(huán)形區(qū)，但在其自身分生組織中沒(méi)有(圖5A和D)。在種子萌發(fā)期間，LLP1表達(dá)在糊粉中觀測(cè)到，這是位于外種皮和胚之間的一層胚乳(圖5E和F)。
新萌發(fā)的幼苗示出無(wú)GUS表達(dá)。當(dāng)初生根長(zhǎng)于1cm(種植5天后)時(shí)，第一個(gè)可檢測(cè)的GUS信號(hào)見(jiàn)于根毛區(qū)。在根毛之間見(jiàn)到明顯不同的GUS染色，其染色非常強(qiáng)，而且胚軸經(jīng)常是GUS活性陰性的(圖6B)。在根內(nèi)，LLP1表達(dá)排除在表皮層外，而且在根毛中無(wú)GUS染色可見(jiàn)(圖6B和C)。偶爾，LLP1表達(dá)見(jiàn)于初生根的靜止中心(圖6D)。我們未確定其是否來(lái)自啟動(dòng)子活性或只是背景染色，因?yàn)?)其不是一致的；2)其它研人員之前觀測(cè)到之中背景活性。沿著根的長(zhǎng)軸，LLP1的表達(dá)只見(jiàn)于充分發(fā)育的根毛區(qū)，總長(zhǎng)度為1cm或更短(圖7)。根尖，延長(zhǎng)區(qū)或次生加厚區(qū)均不呈現(xiàn)任何GUS染色(圖6E和A)。盡管LLP1表達(dá)在新萌發(fā)的初生根的除了表皮之外的所有細(xì)胞層均觀測(cè)到(圖7D)，但在后期，所述表達(dá)限于木質(zhì)部外的中柱鞘層(圖7B和C)。在放射狀切片中，LLP1表達(dá)在面向原生木質(zhì)部的兩或三層中柱鞘細(xì)胞中觀測(cè)到，而與原生韌部相鄰的中柱鞘細(xì)胞中經(jīng)常是陰性的(數(shù)據(jù)未示出)。在擬南芥屬中，中柱是二原型趾，即具有兩個(gè)原生木質(zhì)部及在兩層原生韌皮部右角。在中柱最外側(cè)的中柱鞘是由一圈平均12個(gè)細(xì)胞組成的，而且側(cè)根經(jīng)常從面向原生木質(zhì)部的中柱鞘細(xì)胞發(fā)起(Dolan等，1993)。在側(cè)根發(fā)生期間，我們觀測(cè)到LLP1表達(dá)在此區(qū)域以及在與原生木質(zhì)部相鄰的細(xì)胞中完全是負(fù)調(diào)節(jié)的(圖6C)。LLP1的表達(dá)模式，結(jié)合在此層中產(chǎn)生側(cè)根的不同潛力，表明在中柱鞘環(huán)中的不同細(xì)胞可以具有與其位置相關(guān)的不同發(fā)育潛力。在側(cè)根中的表達(dá)再次假定是它們已經(jīng)足夠成熟并變得有根毛覆蓋。簡(jiǎn)而言之，LLP1在根部的表達(dá)與成熟區(qū)中的少數(shù)中柱鞘細(xì)胞相關(guān)。根部的這個(gè)區(qū)域一般是有根毛覆蓋的，而且主要有從土壤中攝取營(yíng)養(yǎng)的作用。
在地面上組織中，LLP1表達(dá)限于花和花序分生組織中。首先可檢測(cè)到的GUS信號(hào)見(jiàn)于攜帶3-4個(gè)葉片的8天齡幼苗的腋生花序(也稱為paraclade)原基中。原始的植物發(fā)生組織在轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄐ蚍稚M織之前不示出任何表達(dá)?；ㄐ蚍稚M織在腋生芽比在原始植物分生組織中出現(xiàn)的早，因?yàn)樵陂_始所有腋生芽均形成paraclade(花序莖)。在擬南芥屬中(C24)，每個(gè)腋生芽產(chǎn)生有3-5個(gè)莖生葉的一個(gè)paraclade，之后產(chǎn)生不限量的花。一旦開始形成花，就沒(méi)有額外的莖生葉產(chǎn)生。在幼腋生芽中，LLP1表達(dá)在分生組織的外周觀測(cè)到，此處莖生葉將形成(圖8)并表現(xiàn)為限于L1層。這個(gè)表達(dá)模式持續(xù)直至幼葉原基形成，并在葉片延伸之前終止(數(shù)據(jù)未示出)。中心花序分生組織經(jīng)常是LLP1表達(dá)陰性的(數(shù)據(jù)未示出)。
在花分生組織中，LLP1表達(dá)首先在2期花芽中觀測(cè)到(Smyth等，1990)，在此區(qū)域?qū)⑿纬奢嗥?數(shù)據(jù)未示出)。這個(gè)表達(dá)模式持續(xù)直至3期，此期標(biāo)記為萼片原基形成，在此我們觀測(cè)到在中央和放射狀萼片中間的不對(duì)稱的LLP1表達(dá)。LLP1表達(dá)表現(xiàn)為開始較早，而且在放射狀萼片中較強(qiáng)，在中央萼片之前也顯現(xiàn)。這種不對(duì)稱的花發(fā)育在Smyth等(1990)在擬南芥屬中進(jìn)行的形態(tài)學(xué)分析中未觀測(cè)到，但先前在B.Napus中觀測(cè)到(Polowich和Sawhney，1986)。在4期花芽中，LLP1表達(dá)限于萼片原基和中心分生組織中間的溝中，并在6期花芽中當(dāng)花瓣和雄蕊開始形成時(shí)完全消失(數(shù)據(jù)未示出)。在7-11期花芽中，LLP1表達(dá)只見(jiàn)于雌蕊頂部，在此將形成柱頭。LLP1在花芽中的表達(dá)在開花之前立即停止。實(shí)施例10擬南芥屬基因組中其它LLP1的鑒別和定性圖14示出我們用于研究各種數(shù)據(jù)庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)，圖12示出在擬南外屬基因組中鑒別的LLP蛋白。從充分測(cè)序的擬南芥屬基因組中，可以看出存在多少LLP基因。這樣鑒別了19個(gè)LLP。LLP基因的圖位示于圖32。盡管很少有LLP基因具有EST序列，但這19個(gè)LLP中無(wú)一由基因組測(cè)序小組注釋為基因。這些LLP基因的分布似乎是隨機(jī)的。在染色體1的底部，有一大群LLP基因，在染色體4中未發(fā)現(xiàn)LLP(圖33)。令人感興趣地注意到除了是這組基因是功能保守的，編碼具有N末端信號(hào)肽和C末端保守的LLP盒的小蛋白，它們中無(wú)一在擬南芥屬基因組中具有豐富拷貝(共生同源的)。換句活說(shuō)，這些LLP在肽水平無(wú)一呈現(xiàn)50％以上相同性。這可以是這組基因的性質(zhì)，可以提及的一些原因是1)這些肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)比氨基酸順序?qū)ζ涔δ芨匾?。這已經(jīng)見(jiàn)于SMC蛋白中，其具有兩個(gè)棒狀區(qū)，具有高度卷曲的卷曲結(jié)構(gòu)，但在初級(jí)序列中是可變的。2)所述序列的可變性可使與相應(yīng)受體激酶精確相互作用。3)這種蛋白質(zhì)關(guān)鍵需要植物基因組中單個(gè)拷貝。實(shí)施例11在其它植物物種中鑒別LLP基因使用我們?cè)谏鲜鲈O(shè)立的標(biāo)準(zhǔn)，在其它可利用的數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似研究。這引導(dǎo)我們?cè)谌缢?，Medicago，番茄等物種中鑒別LLP基因(圖13)。所有這些鑒別基因示出與擬南芥屬那些相似的結(jié)構(gòu)保守。實(shí)施例12擬南芥屬異常表達(dá)LLP1導(dǎo)致分生體的消耗但不影響對(duì)根和側(cè)芽的誘導(dǎo)使用一個(gè)在大多數(shù)植物組織中組成型表達(dá)的兩倍增強(qiáng)的35S啟動(dòng)子，驅(qū)動(dòng)B.napus LLP1 cDNA(35S LLP1)在擬南芥屬中的表達(dá)。在獲得的25個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化體中，有4個(gè)品系(A，B，C和D)示出相似的異常表型緩慢生長(zhǎng)和晚期開花。只在種子種植后40-45天出現(xiàn)抽苔，野生型是在20天。一個(gè)品系(D)是雄性和雌性不育的，而且沒(méi)有種子在接下來(lái)的萌發(fā)中進(jìn)一步分析。對(duì)剩余的3個(gè)品系進(jìn)行遺傳學(xué)分析表明其表型是以Mendelian方式遺傳的。將單個(gè)插入雜合系種植于卡那霉素選擇培養(yǎng)基上示出表型始終與轉(zhuǎn)基因相關(guān)，比率與在沒(méi)有卡那霉素的土壤中的表型分離一致。
在所有4個(gè)過(guò)表達(dá)品系中均觀測(cè)到根部發(fā)育的戲劇性變化。新萌發(fā)的35S:LLPI幼苗示出與野生型幼苗的微細(xì)差別。然而，在35S∷LLP1植物中根部生長(zhǎng)緩慢(圖23，A-D，12天齡)。在35S:LLPI根中根毛形成和側(cè)根發(fā)生是正常的(圖23，B和D)，側(cè)根的進(jìn)一步生長(zhǎng)在根毛形成后立即停止。因此，3581LPI過(guò)表達(dá)導(dǎo)致短根幼苗形成。在種子萌發(fā)15天后，轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)產(chǎn)生4-8個(gè)短根，平均長(zhǎng)度小于1cm，而在野生型幼苗中此時(shí)初生根達(dá)到10cm以上，并具有一些不同長(zhǎng)度的側(cè)根。在過(guò)表達(dá)品系中根毛幾乎在跟尖形成(圖23D)。與野生型根相比，35S∷LLPI根尖也表現(xiàn)出是窄而尖的。根的向地性在35S∷LLPI幼苗中不受影響(數(shù)據(jù)未示出)。
組織清除，隨后通過(guò)Nomarski顯微鏡檢35S∷LLPI根部，示出根部分生組織在根生長(zhǎng)和發(fā)育期間逐漸消耗，并用于形分化的相比。如圖11E和F所示(種植后7天)，在野生型和過(guò)表達(dá)幼苗之間觀測(cè)到根部區(qū)域中的明顯不同。在野生型根中，細(xì)胞有規(guī)律地按大小排列，而且在根帽，根部分生組織，延伸區(qū)域和成熟區(qū)域之間形態(tài)不同(圖23E)。在LLP1過(guò)表達(dá)植物中，根部分生組織區(qū)和延伸區(qū)變得較短，其隨后立即形成高度空泡的細(xì)胞，典型見(jiàn)于短根毛區(qū)(圖23F)。在此發(fā)育階段，靜止的中心始終是可識(shí)別的。在萌發(fā)處理后10天，根部分生組織幾乎完全消失(圖23G)。只有少量分生細(xì)胞存在于根尖。這些細(xì)胞與通常位于根毛區(qū)的空泡細(xì)胞相鄰。延伸區(qū)和靜止中心很難識(shí)別(圖23G)。根部分生細(xì)胞和靜止中心在2周齡的35S∷LLPI幼苗中完全消失(圖23H)。在這個(gè)區(qū)域中的所有細(xì)胞均變得高度空泡并表現(xiàn)為其細(xì)胞壁增厚。木質(zhì)部達(dá)到中心細(xì)胞區(qū)(圖23H，箭頭所示)。在根帽中也觀測(cè)到異常，盡管淀粉類谷物仍可見(jiàn)(數(shù)據(jù)未示出)。在野生型根部在此生長(zhǎng)階段未見(jiàn)到根部結(jié)構(gòu)有明顯不同(數(shù)據(jù)未示出)。在次要根中也觀測(cè)到初生根中觀測(cè)到的相同分生組織缺陷。結(jié)論是在35S啟動(dòng)子控制下LLP1的異常表達(dá)對(duì)根發(fā)生無(wú)影響，但在促進(jìn)分生組織細(xì)胞分化中具有強(qiáng)力作用，分生組織比再生的快速消耗。
LLP1的異常表達(dá)在莖和花發(fā)育中引起與在根部發(fā)育中相似的變化。所有4個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化體均示出短枝表型。品系A(chǔ)比品系B和C具有更弱的表型，并產(chǎn)生大約1-3個(gè)paraclade，共產(chǎn)生相對(duì)高數(shù)量的種子。在產(chǎn)生10個(gè)或更少的長(zhǎng)角果后，這些花序停止形成新的花，而在野生型是30-40個(gè)。品系B和C在正常生長(zhǎng)條件下幾乎完全是雄性不育的，偶爾產(chǎn)生少量的種子(少于30個(gè)/植物)。這些種子可能源自交叉授粉，因?yàn)樵谄废礏和C的花藥中未檢測(cè)到能育的花粉。對(duì)這種有限數(shù)量的種子難以進(jìn)行遺傳分析。在品系B和C植物中形成的大約1/3的花形成針式雌蕊，示出沒(méi)有胚珠發(fā)育及因此沒(méi)有種子形成(圖10)。其它2/3的花具有正常雌蕊，如果與野生型花粉授粉能產(chǎn)生種子。在品系A(chǔ)中未觀測(cè)到針式雌蕊，其具有一致弱表型。Northern印跡分析表明在所有這4個(gè)品系中LLP1 mRNA的水平均比具有野生型表型的轉(zhuǎn)基因品系高(數(shù)據(jù)未示出)。短枝和針式雌蕊表型可以是花序和花分生組織消耗的結(jié)果，與在LLP1過(guò)表達(dá)的根部分生組織中觀測(cè)到的結(jié)果相似。
另外，LLP1的遺傳表達(dá)似乎刺激從腋生芽中形成paraclade。代替從每個(gè)野生型腋生芽中正常產(chǎn)生的單個(gè)paraclade(圖9)，在35S∷ILPI過(guò)表達(dá)品系中(B和C)中一般形成多個(gè)paraclade，尤其在莖生葉的腋部(圖9B和C)。有時(shí)在一個(gè)腋部觀測(cè)到再生接近7個(gè)paraclade(數(shù)據(jù)未示出)。這些paraclade通常相繼出現(xiàn)而不是同時(shí)出現(xiàn)。末期花1突變體也示出分枝形成增多，然而在這個(gè)突變體中，在簇生葉的腋部形成多個(gè)莖，而且只是偶爾來(lái)自莖生葉(Grbic和Bleecker，2000)。實(shí)施例13LLP1的異常表達(dá)引起花中連續(xù)維管網(wǎng)的形成缺陷在35∷LLP1過(guò)表達(dá)品系中還觀測(cè)到異常的維管發(fā)育。在野生型花中，維管束是在9期形成的。從主干延伸直至花芽(圖14A)。木質(zhì)部首先在萼片中建立，隨后在雌蕊，雄蕊和花瓣中，形成完整的維管網(wǎng)。在35S∷花芽中(品系B和C)，觀測(cè)到與主干不相關(guān)的局部維管形成(圖11B和C)。不能形成維管連接似乎與針式雌蕊形成相關(guān)，因?yàn)檫@個(gè)現(xiàn)象在具有正常雌蕊的花中見(jiàn)不到。然而，不是所有具有針式雌蕊的花均具有在主干周圍的不連續(xù)的維管。一些花形成連續(xù)的木質(zhì)部連接，盡管木質(zhì)部的數(shù)量與野生型相比減少。在萼片和花瓣中均觀測(cè)到局部木質(zhì)部形成維管島(數(shù)據(jù)未示出)。這種維管島在具有正常和針式雌蕊的花中觀測(cè)到。在這些針式雌蕊中無(wú)維管束形成。實(shí)施例14LLP2基因(有義鏈)在兩倍增強(qiáng)的CaMV 35S啟動(dòng)子控制下的表達(dá)LLP2編碼區(qū)通過(guò)PCR擴(kuò)增，并在兩倍增強(qiáng)的CaMV 35S啟動(dòng)子控制下(使用上述相同的過(guò)表達(dá)載體)表達(dá)的有義和反義方向克隆。通過(guò)在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上選擇獲得轉(zhuǎn)基因植物。一種過(guò)表達(dá)植物示出再生發(fā)育缺陷(圖24A)。所述植物持續(xù)產(chǎn)生葉片。偶爾可以形成一兩個(gè)花(圖24B)。詳細(xì)的觀測(cè)示出這種花具有正常萼片和花瓣，但雄蕊數(shù)量減少而且無(wú)雌蕊(24C)。在進(jìn)一步花形成之前，花序分生組織立即停止(圖24D)。實(shí)施例15LLP1反義基因在兩倍增強(qiáng)的CaMV 35S啟動(dòng)子控制下的表達(dá)LLP2反義基因在在兩倍增強(qiáng)的CaMV 35S啟動(dòng)子控制下的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致植物具有軟而短的莖。每個(gè)花序產(chǎn)生2-6個(gè)長(zhǎng)角果而不是野生型中的25-35個(gè)。在每個(gè)長(zhǎng)角果中種子的數(shù)量也明顯減少?？赡苁荓LP2反義基因的過(guò)表達(dá)影響植物的維管結(jié)構(gòu)。遺傳分析示出所述表型與T-DNA插入有關(guān)。組織特異性啟動(dòng)子可以與LLP2反義基因組合使用，以修改其它植物種屬的維管結(jié)構(gòu)。實(shí)施例16LLP11基因在兩倍增強(qiáng)的CaMV 35S啟動(dòng)子控制下的表達(dá)LLP11編碼區(qū)是通過(guò)PCR從基因組DNA中擴(kuò)增的。所述基因在兩倍增強(qiáng)的CaMV 35S啟動(dòng)子控制下表達(dá)(使用上述相同的過(guò)表達(dá)載體)。過(guò)表達(dá)LLP11基因(有義鏈)的78％To植物示出表型。基于表型不同，To植物可以范圍3類輕度，中度和重度表型品系(圖25)?！拜p度表型”植物可以產(chǎn)生少量花序，盡管原始的那些通常過(guò)早地停止?！爸卸缺硇汀敝参锸境龌ㄐ蛐纬擅黠@減少。通?？梢援a(chǎn)生非常短或很少的花序，少量的長(zhǎng)角果?！爸囟缺硇汀敝参锊恍纬扇魏位ㄐ?，因此不能進(jìn)行接下來(lái)的再生。一些“輕度表型”植物在隨后的再生中分析，因?yàn)榭梢垣@得足夠的種子。在分析的品系中，我們觀測(cè)到兩種不同的表型，其與在To代中觀測(cè)到的表型略不同低生育力(圖26A)和低生長(zhǎng)速度及花序形成表型減少(圖26B)。在一些品系中，這兩種表型均可觀測(cè)到，而在其它品系中只觀測(cè)到一種表型。遺傳分析明顯示出低生育力和低生長(zhǎng)速度表型是由于LLP11基因過(guò)表達(dá)所致，因?yàn)檫@兩種性狀均示出是顯性的并在分離中與T-DNA連鎖。緩慢生長(zhǎng)表型可見(jiàn)于根和莖發(fā)育中，產(chǎn)生具有短根和小葉的植物。一些低生育力品系(#67-6，圖26A)示出植物生長(zhǎng)不減慢。所述植物具有長(zhǎng)的paraclade和非常少的長(zhǎng)角果(因?yàn)樵诿總€(gè)長(zhǎng)角果中沒(méi)有或只有少量種子產(chǎn)生)。LLP11基因(有義和反義方法)可以與不同的啟動(dòng)子組合使用，以控制生長(zhǎng)行為和花粉發(fā)育。實(shí)施例17使用GUS融合構(gòu)建體分析LLP12的表達(dá)模式將LLP12的啟動(dòng)子區(qū)域(在ATG之前1kb)，在PBINPLUS載體中克隆入GUS報(bào)道基因的前面。使用上述花蘸方法獲得轉(zhuǎn)基因植物。GUS表達(dá)分析在30個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因品系的葉，莖，腋芽，花和長(zhǎng)角果中進(jìn)行。結(jié)果示出GUS染色中有一些變化，LLP12在花的不成熟的花粉粒和花梗區(qū)域(花和莖之間的連接部分)中表達(dá)(由圖27中圖示示出)。在根發(fā)育中的GUS分析在不遠(yuǎn)的將來(lái)進(jìn)行。實(shí)施例18LLP12基因在兩倍增強(qiáng)的CaMV 35S啟動(dòng)子控制下的表達(dá)一些表達(dá)LLP12基因的轉(zhuǎn)基因植物示出更多或更少的相同表型。初生莖較早停止隨后多個(gè)側(cè)莖形成(圖28，A和B)。所述植物具有非常弱和少的花序，沒(méi)有(圖28B)或有少量種子(圖28A)產(chǎn)生。種子減少似乎是由于顯性不育所致，因?yàn)楫?dāng)與WT花粉交叉授粉時(shí)可以產(chǎn)生種子?；òl(fā)育是正常的。當(dāng)將種子種植于有或沒(méi)有選擇因子(Km)的萌發(fā)平板上時(shí)，在接下來(lái)的再生中可明顯見(jiàn)到表型分離。在幼苗階段，所述轉(zhuǎn)基因植物具有較小的簇生葉及根部延伸減少。當(dāng)種子直接種植于土壤中時(shí)，也可明顯見(jiàn)到所述表型分離(圖29C)。在花序發(fā)育后期，paraclade示出Z形排列(圖30，A和B)。與從花序側(cè)面形成的新花不同，在這種情況中，新花是在paraclade的末端形成的，而花序在側(cè)面產(chǎn)生?；ü?莖與化或長(zhǎng)角果之間的連接)也比WT植物中花梗更短(圖30B)。低生育力和短花梗表型似乎與LLP12基因的表達(dá)模式一致。花梗的生長(zhǎng)遲緩與一般見(jiàn)于大多數(shù)LLP基因的功能抑制相關(guān)。遺傳分析示出這種表型是顯性性狀，并與T-DNA連鎖(圖31，WT植物已經(jīng)從上面的圖中去除)。由LLP12過(guò)表達(dá)所致的雄性不育可以用于修飾繁殖行為或用于雜交種子生產(chǎn)。
用于鑒別這些LLP蛋白的標(biāo)準(zhǔn)可以用于識(shí)別出現(xiàn)在公布的數(shù)據(jù)庫(kù)中的LLP家族的新成員。實(shí)施例19 RT-PCR測(cè)試LLP ORF是否是真正的基因，以及它們?cè)诤翁幈磉_(dá)由于大多數(shù)LLP基因均是基于我們?cè)O(shè)立的標(biāo)準(zhǔn)從基因組序列中鑒別的，所以不能確定是否它們?nèi)钦嬲磉_(dá)的基因。用RT-PCR檢查這些ORF的表達(dá)譜。從擬南芥的各種組織中分離總RNA并用Dnase處理以除去基因組DNA中的污染。用聚(T)作為引物進(jìn)行RT-PCR。對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照和定量測(cè)量，使用ACTIN8基因作為陽(yáng)性對(duì)照，因?yàn)樗且环N遍在表達(dá)的基因。用位于ORF的起始處和位于終止密碼子之前的兩個(gè)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。當(dāng)用RNA進(jìn)行PCR時(shí)，未見(jiàn)到產(chǎn)物，表明基因組污染已去除。用基因組DNA進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照。這些實(shí)驗(yàn)揭示，例如，LLP2、LLP9、LLP12和LLP18是具有不同表達(dá)譜的基因。LLP2在所測(cè)試的所有組織中表達(dá)，LLP9僅在不同階段的花中表達(dá)，但在根、葉、干等中不表達(dá)，LLP12在不同階段的花中顯示出更高的表達(dá)，但是也在所測(cè)試的其它組織中有更高的表達(dá)。LLP5和LLP7兩個(gè)基因在RT-PCR分析中在所測(cè)試的組織中呈陰性?？傊?，這些RT-PCR實(shí)驗(yàn)揭示用我們建立的標(biāo)準(zhǔn)鑒別的大多數(shù)LLP基因是表達(dá)互不相同的基因。實(shí)驗(yàn)程序植物材料和小孢子培養(yǎng)如述培養(yǎng)兩倍的單倍體Brassica napus L.cv.Topas植物，及分離小孢子和花粉粒。將植物在人工氣候室中，在18℃用16小時(shí)光周期全年生長(zhǎng)。用研杵在含有13％(w/v)蔗糖(NLN13)的NLN培養(yǎng)基(Lichter，1982)中破壞花蕾，以分離小孢子和花粉。將晚期單細(xì)胞小孢子和早期雙細(xì)胞花粉在NLN13培養(yǎng)基中，以40,000個(gè)細(xì)胞/ml密度培養(yǎng)，溫度為18℃(配子體發(fā)育)或32℃(胚發(fā)生發(fā)育)。核酸分離使用一種提取緩沖液分離在18℃(8小時(shí))，32℃(8小時(shí))或41℃(45分鐘)培養(yǎng)的小孢子的總RNA，所述提取緩沖液含有苯酚，和0.1M LiCl，10mM EDTA，1％SDS，0.1M Tris-HCl(pH8.0)的1∶1混合物。將1ml熱(60℃)提取緩沖液加入小孢子球中(將近10個(gè)小孢子)，并將此勻漿在玻珠中用力旋動(dòng)。在離心后，將此水相用等體積的氯仿提取，并通過(guò)加入1/3體積的8M LiCl在-20℃沉淀所述RNA。將所述沉淀用70％乙醇沖洗，干燥并溶解于焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的水中。所有其它總RNA樣品是通過(guò)將植物材料在液氮中用研缽和研杵研磨，并隨后用TRIZOL試劑(Gibco-BRL)提取細(xì)末而獲得的。根據(jù)Fulton等，1995所述方法，從葉片組織中分離基因組DNA，并用特異性限制酶根據(jù)廠商指導(dǎo)進(jìn)行消化(Gibco-BRL)。差別展示mRNA的差別展示(Liang和Pardee，1992)是使用RNAmap試劑盒B(GenHunter，USA)根據(jù)廠商指導(dǎo)進(jìn)行的。如上述從B.napus的新鮮分離的小孢子和葉片組織中分離總RNA，所述小孢子在18℃(8小時(shí))，32℃(8小時(shí)，10天，16天)或41℃(45分鐘)培養(yǎng)，并用MessageClean試劑盒(GenHunter)處理DNAse I。在18℃和32℃單獨(dú)培養(yǎng)8小時(shí)的兩種培養(yǎng)物上進(jìn)行差別展示。在41℃處理小孢子使其真正熱休克，這是不引起這個(gè)發(fā)育節(jié)段的小孢子胚發(fā)生的條件。將無(wú)DNAse的總RNA樣品(0.2μg)用于第一個(gè)cDNA鏈的合成。將4種T12MN錨定引物(其中M是簡(jiǎn)并的A，C，G，及N是A，C，G或T)用于4種逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)中。在存在[α-P]dATP的情況下，對(duì)1/10的第一鏈合成cDNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將5種十聚體(AP6-AP10)與各自的T12MN組合使用。使用得自Perkin-Elmer的Perkin-Elmer GenAmp 9600系統(tǒng)和AmpliTaq聚合酶，進(jìn)行所有的PCR步驟。將擴(kuò)增的[α-P]dATP標(biāo)記的cDNAs在含有7M尿素的6％變性的聚丙烯酰胺凝膠上解離。在將所述凝膠在Whatman3MM紙上干燥及放射自顯影檢測(cè)條帶后，切下不同表達(dá)的cDNA，并根據(jù)廠商指導(dǎo)洗脫。然后將cDNA使用與前述相同PCR條件和引物再擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物在1.2％瓊脂糖凝膠上分析，并洗脫相應(yīng)的cDNA片段及克隆入pGEM-T載體(Promega)中。為證實(shí)所述差別展示模式，將克隆的cDNA用作RNA印跡雜交的探針。DNA和RNA凝膠印跡分析將DNA片段在1％瓊脂糖中分離并移至Hybond-N(Amersham)上過(guò)夜，用20xSSC通過(guò)毛細(xì)管印跡。針對(duì)RNA凝膠印跡分析，將10μg總RNA在電泳之前用乙二醛變性，并印跡于Hybond-N膜上。在紫外線輻射交聯(lián)后，將所述膜用BnLLP1的DD克隆的[32P]隨機(jī)引物標(biāo)記的探針雜交。將所述膜在65℃在10％硫酸葡聚糖，1％SDS，1M NaCl，50mM Tris-HCl(pH7.5)中雜交過(guò)夜，并在中等嚴(yán)格條件下(65℃，2xSSC，1％SDS)在最初的30分鐘沖洗兩次，隨后在高度嚴(yán)格條件下(65℃，0.2xSSC，0.5％SDS)沖洗30分鐘兩次。cDNA文庫(kù)構(gòu)建和篩選使用Poly(A)Quik層析柱(Stratagene)從球狀至心形B.napus小孢子胚的總RNA中分離Poly(A)RNA。將5μg poly(A)RNA用作起始物構(gòu)建一個(gè)Uni-ZAP XR cDNA文庫(kù)(Stratagene)。在嚴(yán)格條件下用通過(guò)DDRT-PCR分離的cDNA篩選將近106個(gè)噬斑(圖3)。分離一個(gè)陽(yáng)性克隆，純化并測(cè)序(圖3)。分離啟動(dòng)子序列使用通用的基因組Walker試劑盒(Clonetech)分離位于BnLLP1ATG起始密碼子上游的基因組DNA片段。構(gòu)建未克隆的連接接合體的Brassica napus cv Topas基因組DNA片段集合，并用于通過(guò)嵌套式PCR分離BnLLP1基因組序列。使用由廠商提供的外部接合體引物(AP1)和一種BnLLP1特異性引物進(jìn)行初次PCR，所述BnLLP1特異性引物具有以下序列5’-CCATTCTTCATCAGCAAACTCCGAAATGA-3’嵌套式PCR是用由廠商提供的嵌套式接合體引物(AP2)和一種BnLLP1特異性引物進(jìn)行的，所述BnLLP1特異性引物具有以下序列5’-CAGAAAAGAGGAAGCCAATATCAAACTC-3’然后將初次PCR混合物稀釋為1∶50，并用作嵌套式PCR的模板。初次PCR和嵌套式PCR均是根據(jù)廠商指導(dǎo)進(jìn)行的。將嵌套式PCR產(chǎn)物克隆入pGEMT載體(Promega)中并測(cè)序。鑒別相當(dāng)于BnLLP1cDNA的5’未翻譯基因組區(qū)域的PCR產(chǎn)物(圖16)。構(gòu)建轉(zhuǎn)化植物的質(zhì)粒如下構(gòu)建一種質(zhì)粒載體，所述載體含有在雙倍花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子控制下的BnLLP1 cDNA，所述啟動(dòng)子具有AMV翻譯增強(qiáng)子。完整的BnLLP1編碼區(qū)已經(jīng)克隆入GST融合載體pGEX4T-2(Amersham Pharmacia Biotech)中。將這個(gè)質(zhì)粒用限制酶BamHI和XhoI切割。分離231bp的BnLLP1片段，并連接入已經(jīng)用限制酶BamHI和XhoI切割的載體pGD121(含有具有AMV增強(qiáng)子的雙35S啟動(dòng)子和一個(gè)pBINplus主鏈)中。通過(guò)測(cè)序證實(shí)這個(gè)構(gòu)建體，并轉(zhuǎn)化入A.tumefaci ns C58PMP90中。啟動(dòng)子-GUS構(gòu)建體如下構(gòu)建啟動(dòng)子LLPIBn-GUS將克隆入pGEM-T(PROMEGA)的一個(gè)1060bp的BnLLP1啟動(dòng)子片段(通過(guò)基因組步查獲得)用于這種構(gòu)建。將這種構(gòu)建體用于PCR中，使用引物P312-1 5’-CGCTCTAGAGTTCTATCTTTGTCAAAAAAAA-3’在ATG之前的啟動(dòng)子上退火。P312-2 5’-ATATAAGCTTACTATAGGGCACGCGT-3’在基因組步查接合體上退火。
使用聚合酶Pfu(STRATAGENE)作為校對(duì)。PCR方案在94℃45秒，在40℃60秒，在72℃4.5分鐘(重復(fù)循環(huán)兩次)，隨后在94℃45秒，在54℃60秒，在72℃4.5分鐘(重復(fù)18次)，隨后在72℃3分鐘，及保持在4℃。
將獲得的片段用限制酶HindIII和XbaI切割，并連接于pRAP2T/GUS載體(含有GUS內(nèi)含子和NOS終止子及一個(gè)pUC載體作為主鏈)，所述載體已經(jīng)用限制酶HinDIII和XbaI消化。將這個(gè)構(gòu)建體用PacI和AscI消化，并分離含有BnLLP1啟動(dòng)子，GUS-內(nèi)含子和NOS終止子的一個(gè)片段，并連接于用PacI和AscI消化的pBINplus中。將所得載體通過(guò)測(cè)序證實(shí)并轉(zhuǎn)化入A.tumefaciensC58PMP90中。植物轉(zhuǎn)化將擬南芥生態(tài)型C24在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中用作受體。將植物使用Clough和Bent(1998)所述花蘸方法轉(zhuǎn)化。低溫電子顯微鏡檢將植物材料用傳導(dǎo)性碳膠粘合到一個(gè)銅棒上，并立即在液氮中冷凍。然后將所述樣品移至一個(gè)低溫場(chǎng)致發(fā)射掃描電子顯微鏡(LT-FESEM，JEOL JSM 6300F)，所述顯微鏡裝備有一個(gè)Oxford低溫腔。在用氬氣薄層包被后，觀測(cè)所述樣品并用數(shù)碼相機(jī)照相。
表1調(diào)節(jié)植物發(fā)育的基因的實(shí)例
參考文獻(xiàn)Aida，M.，Ishida，T.，F(xiàn)ukaki，H.，F(xiàn)ujisawa，H和Tasaka，M.(1997)，在擬南芥屬中參與器官分離的基因杯形子葉突變體的分析，植物細(xì)胞9841-857。
Chang，C.和Meyerowitz，EM(1995)，在擬南芥屬中乙烯激素應(yīng)答-一種真核性兩種成分信號(hào)系統(tǒng)，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)924129-4133。
Citovsky，V和Zambryski，P.(1991)，植物病毒核酸怎樣通過(guò)細(xì)胞間連接而移動(dòng)，生物分析13373-379。
Clark，S.E.，Williams，R.W.，Meyerowitz，E.M.(1997)，CLAVATA1基因編碼一種推定的受體激酶，其控制擬南芥屬中干和開花分生組織大小，細(xì)胞89575-585。
Clough，S.J.and Bent，A.F.(1998)，花蘸針對(duì)擬南芥.的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的簡(jiǎn)便方法，植物雜志16735-743。
Fletcher，J.C.，Brand，U.，Running，M.P.，Simon，R.和Meyerowitz，E.M.(1999)，在擬南芥屬干分生組織中通過(guò)CLAVATA3決定的細(xì)胞結(jié)局的信號(hào)化，科學(xué)2831911-1914.
Jinn，T.-L.，Stone，J.M.和Walker，J.C.(2000)，HAESA，一種擬南芥屬豐富亮氨酸重復(fù)受體激酶，控制開花器官脫落，基因和發(fā)育14108-117。
Kakimoto，T.(1996)，Ckil，一種包含于細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的組氨酸激酶同源物，科學(xué)274982-985。
Ku，T.，Mitsukawa，N.，Oosumi，T.，Matsuura，R.，Whittier，R.F.和Komeda，Y.(1996)，編碼一種具有胞外豐富亮氨酸重復(fù)的推定的受體蛋白激酶的擬南芥屬ERECTA基因，植物細(xì)胞8735-746。
Liang，P.，和Pardee，A.B.(1992)，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)真核信使RNA的不同顯示，科學(xué)257967-971。
Lichter(1982)，從Brassicia napus.的分離的花粉中誘導(dǎo)單倍體植物，Z.Pflanzen-Physiol.105427-434。
Lawton，MA，Yamamoto，RT，Hanks，SK，Lamb，CJ(1989)，編碼頂部激酶同源物的植物轉(zhuǎn)錄物的分子克隆，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)863140-3144。
Lucas W.J.，Bouche-Pillon，S.，Jackson，D.P.，Nguyen，L.，Baker，L.，Ding，B.和Hake，S.(1995)，通過(guò)胞間連絲選擇性運(yùn)輸有結(jié)的同源域蛋白及其mRNA，科學(xué)2701980-1983。
Hake S.和Char，B.(1997)，在植物發(fā)育期間細(xì)胞之間的相互作用，基因和發(fā)育111087-1097。
Sawa，S.，Watanabe，K.，Goto，K.，Kanaya，E.，Morita，E.H.，Okada，K.(1999)，絲狀花，擬南芥屬的一種分生組織和器官相同性基因，編碼具有鋅指和HMG相關(guān)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，基因進(jìn)展131079-1088。
Van den Berg，C.V.，Willemsen，V.，Hage，W.，Weisbeek，P.和Scheres B.(1995)，Cell fate in the擬南芥屬通過(guò)定向信號(hào)測(cè)定的根部分生組織中細(xì)胞結(jié)局，自然37862-65。
Fletcher，J.C.和Meyerowitz，E.M.(2000)，干分生組織中內(nèi)的細(xì)胞信號(hào)化，植物生物學(xué)通用觀點(diǎn)323-30。
Fulton，T.M.，Chunwongse和Tanksley(1995)，從番茄和其它草本植物中提取DNA的微量制備方案，植物分子生物學(xué)報(bào)道13(3)207-209。
Li，J.M.和Chory，J.(1997)，一種參與油菜素類固醇信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的推定的亮氨酸豐富的重復(fù)受體，細(xì)胞90929-938。


圖1示出我們用于鑒別參與胚發(fā)生的基因的小孢子胚發(fā)生系統(tǒng)的圖。分離自晚期的單細(xì)胞小孢子和早期的雙細(xì)胞花粉，當(dāng)在32℃培養(yǎng)時(shí)發(fā)育成胚，而相同的細(xì)胞群當(dāng)在18℃培養(yǎng)時(shí)，繼續(xù)配子體發(fā)育為成熟花粉?？梢栽谶@兩種條件下在不同時(shí)期收集胚或花粉原料以分離RNA。
圖2使用差別展示方法鑒別LLP1克隆。一部分差別展示凝膠示出在10天和16天小孢子產(chǎn)生的胚中存在LLP1 cDNA。從以下物質(zhì)中裝備RNA樣品·新鮮分離的小孢子(t＝0)；·在18℃培養(yǎng)8小時(shí)的小孢子(8h 18℃)；·在32℃培養(yǎng)8小時(shí)的小孢子(8h 32℃)；·第2泳道相同，但分離不同的RNA；·第3泳道相同，但分離不同的RNA；·在42℃熱休克處理45分鐘的小孢子(經(jīng)過(guò)這種處理沒(méi)有小孢子產(chǎn)生，45分鐘，42℃)；·分離自10天培養(yǎng)物的小孢子產(chǎn)生的胚(10天胚)；·分離自16天培養(yǎng)物的小孢子產(chǎn)生的胚(16天胚)；·葉。
注意，在這9種RNA樣品中，LLP1信號(hào)(以箭頭標(biāo)示)只見(jiàn)于其中RNA分離自培養(yǎng)10和16天的小孢子產(chǎn)生的胚的泳道。
圖3LLP1的cDNA和蛋白質(zhì)序列。上面的鏈?zhǔn)境龇蛛x自Brassicanapus″Topas″的cDNA文庫(kù)的cDNA，下面的鏈?zhǔn)境鲎畛跬ㄟ^(guò)DD-PCR分離的片段。下劃線處是編碼區(qū)和氨基酸序列，信號(hào)肽以雙下劃線示出，LLP區(qū)域基序以方框標(biāo)示。
圖4Northern印跡雜交示出LLP1基因在Brassica napus″Topas″的不同器官和組織中的表達(dá)。在凝膠上從標(biāo)記的組織中分離總RNAs，并與來(lái)自DD-PCR的標(biāo)記的LLP1片段雜交。
圖5在擬南芥的胚發(fā)生和種子發(fā)育期間LLP1基因的表達(dá)。
A.LLP1簡(jiǎn)圖示出所述基因的表達(dá)模式，通過(guò)LLP1啟動(dòng)子∷GUS融合物揭示。
B-F.晚期球狀(B)期和心形期(C)，子葉期(D)胚和成熟種子(E)及萌發(fā)后種皮(F)的GUS染色。這些結(jié)果是通過(guò)對(duì)攜帶LLP1啟動(dòng)子∷GUS融合構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行GUS染色獲得的。
LLP1基因首先在晚期球狀胚(以紅色表示)中表達(dá)，并限于子葉的頂部(如C所示)，隨后在魚雷期限于子葉邊緣。在子葉胚中所述表達(dá)限于子葉基底部，在頂端分生組織中沒(méi)有。所述表達(dá)在之后的胚中關(guān)閉。在成熟和萌發(fā)的種子中，所述表達(dá)限于剩余的胚乳(也稱為糊粉層，E和F)。
圖6在幼苗階段(萌發(fā)后10天)的LLP1啟動(dòng)子活性。
A.莖頂端；B.胚軸和根部；C.初生根和側(cè)根；LLP1基因在萌發(fā)5天內(nèi)的幼苗中不表達(dá)。在10天的幼苗中，LLP1基因開始在腋芽(A)和具有充分建立的根毛的根部(B)中表達(dá)。這種表達(dá)不包括外皮層和根毛。注意在胚軸(B)和新形成的側(cè)根(C)中無(wú)表達(dá)。
圖7在根部LLP1啟動(dòng)子活性。在種子萌發(fā)后25天，在幼苗中進(jìn)行染色。
A-E.一個(gè)根系的不同部位的一系列照片。LLP1基因在根尖中不表達(dá)(E)，在根毛區(qū)表達(dá)最高(D)，并逐漸限于維管束(C和D)，在成熟根部消失(A)。
F.LLP1在根系中表達(dá)圖示，以紅色表示。
G.根毛區(qū)上部橫切面示出所述表達(dá)主要在維管系。
圖8.在腋芽和花序中LLP1啟動(dòng)子活性(在種子萌發(fā)后25天)。
A.幼腋芽縱切面示出LLP1基因表達(dá)只在頂端分生組織的外圍。
B.發(fā)育的腋芽示出在葉原基中具有啟動(dòng)子活性，但在中心分生組織中沒(méi)有。
C.LLP1基因在成熟葉和干中不表達(dá)。
D.幼花蕾示出LLP1在幼花蕾中的萼片和葉原基之間的區(qū)域表達(dá)，然后在柱頭細(xì)胞中表達(dá)。這些細(xì)胞在初期形成兩瓣結(jié)構(gòu)，在后期形成環(huán)形結(jié)構(gòu)。
圖9.通過(guò)LLP1基因過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的擬南芥″C24″中分枝形式的變化，所述基因在35S啟動(dòng)子的控制下。
A.電子顯微鏡攝影示出野生型干具有從每個(gè)腋芽正常形成的一個(gè)莖。
B.電子顯微鏡攝影示出從一個(gè)腋芽形成3個(gè)花序。
C.在植物發(fā)育后期，從一個(gè)腋芽可見(jiàn)到6個(gè)以上莖。
圖10.由LLP1基因在擬南芥″C24″中過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的雄性不育和針式雌蕊。
A.通過(guò)電子顯微鏡觀測(cè)的野生型花。
B.來(lái)自35SLLP1轉(zhuǎn)基因植物的花示出花藥無(wú)可育花粉粒和針式雌蕊。在這種針式雌蕊內(nèi)無(wú)胚珠形成。
當(dāng)裝備電子顯微鏡檢物時(shí)，已經(jīng)除去一些花器官。
圖11由LLP1基因在擬南芥″C24″中過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的脈管發(fā)育中的缺點(diǎn)。
A.野生型花示出正常的木質(zhì)部形成B，C.來(lái)自LLP1過(guò)表達(dá)植物的花示出在花和主干之間沒(méi)有木質(zhì)部連接。
圖12.含有LLP區(qū)域基序的擬南芥屬基因圖13.具有C末端LLP盒基序的所有蛋白質(zhì)圖14.LLP蛋白的數(shù)據(jù)庫(kù)淘選標(biāo)準(zhǔn)圖15.具有C末端LLP盒基序的所有擬南芥蛋白的進(jìn)化系統(tǒng)樹圖16.BnLLP1的啟動(dòng)子序列圖17.AtLLP1位于擬南芥染色體3上，在BAC克隆P1 MUJ8上，登記號(hào)B028621(64541至65813)圖18.AtLLP11位于擬南芥染色體3上，在BAC克隆P1 MFJ20上，登記號(hào)AB026644(76090至74701)。
圖19.AtLLP12位于擬南芥染色體5上，在BAC克隆P1 MXC9上，登記號(hào)B007727(64512至66555)。
圖20.AtLLP5位于擬南芥染色體3上，在BAC克隆P1 MPE11上，登記號(hào)AB023041(28993至27277)。
圖21.AtLLP2位于擬南芥染色體1上，在BAC克隆F14K14上，登記號(hào)AC011914(54858至56409)。
圖22.AtLLP7位于擬南芥染色體5上，在BAC克隆P1 MXK3上，登記號(hào)AB019236(2356至3738)。
圖23 LLP1在擬南芥屬中的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致根分生組織的消耗A)顯示發(fā)育良好的葉和根的野生型幼苗。
B)一種LLP1過(guò)表達(dá)幼苗(與A同齡)顯示根的生長(zhǎng)降低。注意到在短根中形成根毛。
C)來(lái)自一野生型植物的根的近觀，顯示出正常根形態(tài)學(xué)。
D)來(lái)自一LLP1過(guò)表達(dá)植物的根，顯示出朝向根尖形成具有根毛的短且細(xì)的根(與D的放大倍數(shù)相同)。
E)用Hoyer清理的野生型根，并用DIC顯微鏡觀察以顯示野生型根形態(tài)學(xué)。
F)來(lái)自7日齡植物的根，顯示出根分生組織和伸長(zhǎng)區(qū)的長(zhǎng)度縮短。
G)來(lái)自10日齡幼苗的根，顯示出根分生組織和伸長(zhǎng)區(qū)的進(jìn)一步縮短。維管束由箭頭示出。
H)來(lái)自14日齡幼苗的根，顯示出根分生組織和伸長(zhǎng)區(qū)的消失。形成維管束(箭頭所示)直至中心細(xì)胞區(qū)。
圖25 LLP11過(guò)表達(dá)導(dǎo)致種子結(jié)種率(seed setting)的降低A)顯示不同程度(輕度、中度、重度)表型的三個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化體(To代)。具有“中度”或“重度”表型的植物產(chǎn)生極少或不產(chǎn)生可共進(jìn)一步分析的種子，但營(yíng)養(yǎng)性生長(zhǎng)是正常的。
B)和C)T1代“輕度”表型植物的子代分析。觀察到兩種類型表型不育(A)和生長(zhǎng)延遲(B)。B)遺傳分析顯示不育表型是T1代的顯性性狀。去除得自分離的幾個(gè)野生型植物。C)T1植物的一個(gè)家族顯示營(yíng)養(yǎng)及繁殖生長(zhǎng)延遲的表型。每一植物僅產(chǎn)生幾個(gè)長(zhǎng)角果。簇葉也較小。去除得自分離的幾個(gè)野生型植物。
圖26 擬南芥屬中LLP12基因的表達(dá)模式。結(jié)果由LLP12啟動(dòng)子∷GUS轉(zhuǎn)基因植物的分析而獲得。
A)LLP12基因在根交界處表達(dá)。表達(dá)僅限于中心維管束。
B)LLP12在葉的維管組織中表達(dá)。
C)圖表示出LLP1在花序中的表達(dá)。表達(dá)僅在花梗(主干和花之間的交界處)和花藥處可見(jiàn)。
圖27 To代植物中LLP12過(guò)表達(dá)的表型。在所顯示的兩個(gè)To轉(zhuǎn)基因植物中，初生莖(primary shoot)在早期即停止，之后形成多個(gè)側(cè)生枝(A和B)。植物具有非常細(xì)且短的花序，不產(chǎn)生(B)或僅產(chǎn)生幾個(gè)種子(A)。降低的結(jié)種率似乎是由雄性不育導(dǎo)致的，因?yàn)楫?dāng)用野生型花粉交叉?zhèn)鞣蹠r(shí)可以產(chǎn)生種子?；ǖ陌l(fā)育正常。
圖28 T1代植物中LLP12過(guò)表達(dá)的表型。
A)產(chǎn)生后20天的野生型植物。
B)產(chǎn)生后20天的LLP12過(guò)表達(dá)植物，示出枝和干的生長(zhǎng)均受抑制。
C)LLP12過(guò)表達(dá)植物在T1代的分離，示出從單插入品系產(chǎn)生的幾個(gè)野生型植物(由箭頭示出)。LLP12過(guò)表達(dá)顯示出植物生長(zhǎng)和發(fā)育的抑制。
圖29 LLP12的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致雄性不育表型和花定位的變化。
A)LLP12過(guò)表達(dá)植物的花序顯示花位于末端位置和花序位于側(cè)面位置，這與野生型形態(tài)學(xué)相反。
B)當(dāng)長(zhǎng)角果形成時(shí)也可見(jiàn)到花定位的改變。注意到花梗也較短。
圖30 LLP12過(guò)表達(dá)導(dǎo)致結(jié)種和生長(zhǎng)抑制。在這兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品系中(T1代)頂端優(yōu)勢(shì)也喪失。在上面的圖中從分離群中除去了野生型植物，但在下面的圖中沒(méi)有除去(已指出)。
圖31 LLP12反義的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致具有軟且短的干的植物。
A)To代植物，示出產(chǎn)生了具有很少長(zhǎng)角果的短花序(3月齡植物)。
B)T1代植物顯示每一植物(1月齡)產(chǎn)生很少長(zhǎng)角果。
C)在分離群中軟干是顯性性狀。
圖32 19個(gè)LLP基因在全測(cè)序的擬南芥屬基因組中的圖譜位置。注意，在染色體1的底部觀察到一大簇基因，而在染色體4上沒(méi)有這些基因。19個(gè)基因中無(wú)一被基因組測(cè)序計(jì)劃注釋。
圖33 擬南芥屬LLP基因相關(guān)表型變化的分析。
權(quán)利要求
1.一種調(diào)節(jié)植物表型的方法，包括將一種配體樣蛋白(LLP)或其功能片段提供給植物，所述蛋白質(zhì)或其功能片段至少包含一個(gè)盒(LLP盒)，所述盒包含氨基酸基序XRXXXXGXXXXHX。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述盒包含一個(gè)氨基酸序列KRX(V/I)(P/H)(S/T)G(P/S)(N/D)(P/H)(L/I)H(H/N)或與其具有至少80％同源性的基序。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述盒的C末端位于離所述配體樣蛋白或其功能片段的C末端最多大約10個(gè)氨基酸的位置。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述配體樣蛋白(LLP)或其功能片段包含一個(gè)N末端信號(hào)肽。
5.一種被提供了一種似蛋白質(zhì)物質(zhì)的植物或植物材料，所述似蛋白質(zhì)物質(zhì)包含一個(gè)包含氨基酸基序XRXXXXGXXXXHX的盒。
6.權(quán)利要求5的植物或植物材料，其中所述盒包含氨基酸序列KRX(V/I)(P/H)(S/T)G(P/S)(N/D)(P/H)(L/I)H(H/N)或與其具有至少80％同源性的基序。
7.權(quán)利要求5或6的植物或植物材料，其中所述盒的C末端位于離所述似蛋白質(zhì)物質(zhì)C末端最多大約10個(gè)氨基酸的位置。
8.權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的植物或植物材料，其中所述物質(zhì)包含N末端信號(hào)肽。
9.權(quán)利要求5-8中任一項(xiàng)的植物或植物材料，其中所述物質(zhì)包含至少大約50個(gè)氨基酸。
10.權(quán)利要求5-9中任一項(xiàng)的植物或植物材料，其中所述物質(zhì)包含最多大約250個(gè)氨基酸。
11.一種重組的核酸，其具有編碼至少包含一個(gè)盒的配體樣蛋白或其功能片段的核酸，或與其雜交的核酸，所述盒包含氨基酸基序XRXXXXGXXXXHX。
12.權(quán)利要求11的重組的核酸，其與一個(gè)啟動(dòng)子功能性地連接。
13.一種重組的核酸，其包含圖16中提供的一個(gè)啟動(dòng)子序列或其功能片段，或者一種與其功能等價(jià)的核酸。
14.權(quán)利要求11的重組核酸或其功能片段，其可操縱地連接于權(quán)利要求13的一個(gè)啟動(dòng)子或其功能片段。
15.一種載體，其包含權(quán)利要求11-14中任一項(xiàng)的核酸。
16.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求11-14中任一項(xiàng)的核酸，或權(quán)利要求15的載體。
17.一種植物或植物材料，其包含權(quán)利要求16的細(xì)胞。
18.一種似蛋白質(zhì)物質(zhì)，其由權(quán)利要求11-14中任一項(xiàng)的核酸編碼。
19.一種調(diào)節(jié)植物表型的方法，包括將權(quán)利要求11-14中任一項(xiàng)的核酸，權(quán)利要求15的載體，或權(quán)利要求18的似蛋白質(zhì)物質(zhì)提供給一種植物或植物材料。
20.一種植物，其包含通過(guò)權(quán)利要求19的方法獲得的調(diào)節(jié)的表型。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物生長(zhǎng)和發(fā)育領(lǐng)域，尤其涉及影響構(gòu)筑或表型特點(diǎn)如其分裂速度和模式、延伸方向、器官發(fā)生或分化模式的植物細(xì)胞之間的通訊。本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)植物表型或構(gòu)筑的方法，如通過(guò)調(diào)節(jié)或改變植物生長(zhǎng)、其發(fā)育或防御應(yīng)答，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂速度或模式、延伸方向、器官發(fā)生或分化模式進(jìn)行，所述方法包含將一種重組的配體樣蛋白(LLP)或其功能片段提供給一種植物或植物材料，所述蛋白質(zhì)或其功能片段至少包含本發(fā)明提供的LLP盒(LLP box)，所述的LLP盒包含氨基酸基序XRXXXXGXXXXHX。
文檔編號(hào)C07K14/415GK1469931SQ01814229
公開日2004年1月21日 申請(qǐng)日期2001年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月16日
發(fā)明者劉春明, 約翰內(nèi)斯·許貝特斯·赫拉爾杜斯·科爾德韋納, 馬蒂恩·阿德里安努斯·菲耶爾, 龍尼·維克托·路易斯·納森, 阿波洛尼婭·海倫娜·瑪麗亞·范德格斯特, 阿德里安努斯 菲耶爾, 尼婭 海倫娜 瑪麗亞 范德格斯特, 斯 許貝特斯 赫拉爾杜斯 科爾德韋納, 維克托 路易斯 納森 申請(qǐng)人:植物研究國(guó)際公司